Tema 10: CULTIVOS CELULARES
1. INTRODUCCIÓN
Cultivo celular: conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de
células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
1.1. Tipos de cultivos celulares
Se pueden diferenciar 3 tipos de cultivos
- Cultivos de órganos
Consiste en mantener un órgano entero o parte de él, en la interfase entre un medio de
cultivo artificial y una atmósfera controlada.
Pueden ser fragmentos de hígado (cultivos de ganglios, fragmentos hepáticos), piel,
médula ósea… que se mantienen vivos durante un tiempo limitado.
No pueden propagarse → sus células no se multiplican.
Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas a estímulos
y sustancias, estudios regenerativos…
- Cultivos de explantes
Son proporciones de tejidos.
Consiste en adherir un fragmento de tejido a una superficie (placa/frasco de cultivo) y
nutrir lo con un medio de cultivo.
Las células periféricas se multiplican y proliferan, migrando por la superficie del soporte.
- Cultivos de células
Se realiza a partir de suspensiones celulares, que se introducen en un recipiente
adecuado junto con un medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas para
que las células proliferen. Pueden ser: cualquier tipo de tejido, restos ovulares, liquido
amniotico,sangre periférica, células hematopoyéticas, células madre, etc.
Se realizan a partir de muestras de cualquier tipo de tejido.
Según la procedencia de la suspensión celular de partida:
▪ Cultivo celular primario: la suspensión celular se obtiene disgregando a partir de células
de un tejido, con una mezcla de células.
▪ Cultivo celular secundario:
a partir de un cultivo
primario/secundario,
mediante un subcultivo o
"pase".
1.2. Aplicaciones de los cultivos celulares
- Investigación básica:
a. Metabolismo celular.
b. Interacciones celulares.
- Investigación aplicada:
a. Producción de Ac monoclonales.
b. Producción de vacunas.
c. Producción de fármacos.
d. Estudios de citotoxicidad, carcinogénesis…
e. Producción in vitro de tejidos y órganos para injertos y trasplantes.
2. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
Tras añadir el medio de cultivo a las células en suspensión, se introducen en un recipiente
adecuado (frasco de cultivo) y se incuban en condiciones óptimas de temperatura y
humedad, las células empiezan a crecer.
2.1. La curvatura de crecimiento de cultivo
Curva sigmoidea, representación gráfica, de la dinámica de crecimiento de 1 cultivo →
concentración de células por los días de evolución del cultivo.
➢ Fase de latencia: 24h, sin crecimiento.
➢ Fase de crecimiento: 6-7 días.
➢ Fase estacionaria: sin crecimiento.
2.2. Formas de crecimiento
- Crecimiento en monocapa
Consiste en que las células crecen adheridas sobre una superficie sólida (plástico/vidrio).
Son dependientes de anclaje →necesitan 1 superficie para crecer.
Etapas:
1. Adhesión a una superficie: fase de latencia.
2. Proliferación y formación de colonias: fase de crecimiento exponencial.
3. Inhibición por contacto: fase estacionaria. Las células ocupan toda la superficie y
detienen su crecimiento.
- Crecimiento en suspensión
Las células no necesitan pegarse a una superficie para crecer, por lo que se mantienen
dispersas en el seno del medio de cultivo y proliferando.
Son células sanguíneas, hematopoyéticas y algunas células tumorales y transformadas.
Etapas:
1. Adaptación al medio: fase de latencia.
2. Proliferación en suspensión: fase de crecimiento.
3. Inhibición por densidad: fase estacionaria.
2.3. Comportamiento vital tras sucesivos pases
Tras sucesivos pases, a partir de un cultivo primario podemos obtener:
- Línea celular primaria
Se obtiene a partir de un tejido/órgano mediante un cultivo primario y que se mantiene en
cultivo mediante pases seriados durante un tiempo limitado.
La población celular aumenta en cada pase (se multiplica el no de frascos de cultivo) y a
partir del tercer pase se estabiliza.
Las células se hacen uniformes y homogéneas, ya que el tipo celular con mayor tasa de
crecimiento se impone al resto.
Estas líneas tienen una vida limitada a un no determinado de pases (20-100), dependiendo
de las células.
Fase de senescencia: etapa vital en la que las células van perdiendo su capacidad de
dividirse y el cultivo acaba muriendo. Está relacionado con el acortamiento de los
telómeros.
Se puede conservar una línea celular mediante congelación, en cualquier caso se debe
anotar el no de pases realizados para conocer cuántos pases quedan antes de que el
cultivo muera.
- Línea celular continua
Son aquellas que se obtienen a partir de un cultivo primario y que se mantienen en cultivo
por tiempo ilimitado mediante pases seriados.
Aparecen espontáneamente en algunos cultivos, que se mantienen durante + pases de
los esperados.
Han perdido los mecanismos de control celular:
❖ Crecen indefinidamente en cultivo (inmortales).
❖ Pierden la dependencia de anclaje.
❖ Pierden la inhibición por contacto.
❖ Pueden invadir tejidos y producir tumores.
❖ Acumulan anomalías genéticas.
Tambien se puede inducir:
o Métodos fisicos: irradiación del cultivo.
o Métodos quimicos: productos carcinogénicos.
o Métodos biológicos: virus, transfección de ADN.
3. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO
3.1. El soporte físico
La mayor parte de las células crecen en monocapa adheridas a la superficie. Por ello, se
debe tener en cuenta diferentes aspectos relativos a los recipientes:
- Materiales para cultivo: debe permitir la adhesión de las células y calidad óptica.
a. Vidrio: reutilizables (se limpia y esteriliza fácilmente), tiene buena calidad óptica.
b. Plástico desechable: fácil esterilización, buena calidad óptica, ahorro de tiempo y
trabajo al ser desechable y menor riesgo de contaminación.
c. Matrices tridimensionales: para cultivar células que crecen organizándose de
manera parecida a como lo harían en el tejido.
d. Microesferas sephadex o poliacrilamida: crecen adheridas a microesferas
suspendidas en el medio de cultivo → aumentando la superficie de crecimiento.
e. Metales: aplicaciones muy concretas → células de la glía.
- Tipos de recipientes: el parámetro + imp en todos los dif tipos es la superficie de
cultivo → permite calcular la cantidad de células sembradas y prever el no aprox
final de células.
a. Placas multipocillo: tienen 1 no variable de pocillos con tapa no hermética. Se
emplean en experimentos puntuales simultáneos, no se emplean para el
mantenimiento de líneas celulares por su riesgo de contaminación.
b. Placas de Petri: placas de cultivo circulares con tapa de dif tamaño. Tienen las
mismas utilidades y lim que las placas multipocillo.
c. Frascos/botellas Roux: frascos planos con tapón de rosca, de dif tamaño y
superficie de crecimiento. Sirven tanto para cultivos en suspensión como en
monocapa. Permiten el intercambio gaseoso con la atm evitando la
contaminación.
d. Botellas tipo Roller: botellas cilíndricas, de dif tamaños. Se cultivan sobre
rodillos que giran y las células crecen en toda la superficie int de la botella.
- Tratamiento de las superficies: mejora la adhesión de las células a la superficie.
Pueden ser proteínas de la matriz extracelular (colágeno) o proteínas naturales o
sintéticas (gelatina).
3.2. Composición y propiedades del medio de cultivo
Medios nutritivos que sustituyen al medio natural en el que se encuentra la célula
fisiológicamente.
Además deben tener todas las sustancias necesarias para el desarrollo de las células.
Características físico-químicas:
- Condiciones microambientes adecuadas.
- Se pueden acumular temporalmente pdto de desechos.
- Composición del medio de cultivo
1. Sales minerales: solucion salina equilibrada donde se disuelven el resto de
componentes.
2. Tampón: para mantener el pH. HEPES (actualidad), bicarbonato: influye la
concentración de CO2 en el pH.
3. Glucosa: fuente de energía.
4. Aa: como min los esenciales.
5. Vitaminas.
6. Suplementos orgánicos de bajo peso molec: ácidos grasos esenciales y lípidos,
nucleosidos…
7. Indicador de pH: avisa de cambios en el pH que pueden poner en riesgo el cultivo.
8. Hormonas y factores de crecimiento: suele añadirse suero descomplementado (medios
no definidos) → se inactivan las proteínas del complemento (56oC, 45’).
9. Antibióticos y antifúngicos.
- Características físico-químicas de medio de cultivo
1. pH: rango entre 7.2-7.6, se fija con tampones y se controla con un indicador de pH.
2. Osmolaridad: isotónicos o ligeramente hipotónicos.
3. Viscosidad: ligeramente elevada tiene un efecto protector en los pases (tripsinización y
agitación del cultivo).
4. Tensión superficial: debe mantenerse baja. En cultivos donde se burbuja CO2, se
añaden antiespumantes para evitar espuma.
3.3. La atmósfera gaseosa
Mezcla de gases en que se mantienen los cultivos. Los componentes más importantes
son:
• O2: todas las células lo requieren para vivir. La concentración de la atmósfera es
suficiente, pero algunos cultivos de órganos requieren una mayor concentración.
• CO2: parte está disuelto en el medio y en equilibrio con el bicarbonato, y puede influir en
el pH del medio si el tampón es bicarbonato.
Cada medio de cultivo tiene % de CO2 recomendado, entre 2-8% (+ habitual: 5%).
La concentración es suministrada por el incubador.
3.4. Condiciones de incubación
El incubador es responsable de mantener condiciones amientales optimas para el
crecimiento de células. Dos parámetros:
▪ Ta óptima: del organismo del que proceda.
▪ Humedad: debe ser elevada para evitar la evaporación del medio. El incubador inyecta
H2O estéril para conseguir una humedad relativa del 95%.
4. PROCEDIMIENTOS DE CULTIVO CELULAR
4.1. Disgregación celular
- Métodos de disgregación celular
➢ Métodos mecánicos: se basan en cortar, picar o triturar el órgano/tejido, se filtra
para retirar restos de tejido y se lava con tampón/medio de cultivo.
➢ Métodos enzimáticos: se basan en tratamiento del tejido con enzimas proteolíticas
(tripsina), puede combinarse con EDTA.
- Selección de células
Tras la disgregación de un tejido se obtiene una mezcla de células, pero en ocasiones
interesa obtener un solo tipo de células. La selección se basa en:
o Propiedades específicas: separación por su distinta adhesión a sustratos.
o Métodos inmunológicos: Ac específicos anclados que retienen las células de interés.
Varias posibilidades:
a. Recubrir pocillos.
b. Esferas inertes que son filtradas.
c. Esferas magnéticas.
4.2. Recuento y viabilidad celular
Tras obtener la suspensión celular se debe conocer su densidad celular y su viabilidad
celular. Ambos procesos se realizan simultáneamente diluyendo las células con un
colorante vital y contándolas en un cámara de recuento.
- El colorante vital
Permite distinguir las células vivas de las muertas.
Se emplea Azul tripan, que penetra en las células con la membrana dañada (no viable).
- El contaje
Consiste en el proceso de recuento de las células blancas (viables) y azules (no viables).
Se emplea la cámara de Neubauer. Procedimiento:
1. La suspensión celular se diluye al 50% con 1 don de azul de tripán.
2. Se monta la cámara de Neubauer.
3. Se cargan 10 microlitros de suspensión: el vol de cada cuadrado de las
esquinas es:
0.1mm3 o 10-4ml (1mm x 1mm x 0.1mm).
4. Se deja reposar y se visualiza.
5. Se cuentan las células viables y no viables de las 4 esquinas.
6. Se calcula la densidad celular (viables, no viables y totales): (no de
células/4) x D(2) / vol contado (10-4ml).
4.3. Descongelación de células
Sirve para iniciar cultivos secundarios. Procedimiento:
1. Descongelar el vial en 1 baño a 37oC.
2. Limpiar la superficie del vial con etanol 70%.
3. Transferir el vial a un tubo falcon y añadir 10ml medio de cultivo.
4. Centrifugar.
5. Eliminar el sobrenadante (DMSO).
6. Añadir 4-5ml de medio de cultivo.
4.4.Inicio del cultivo (siembra)
A partir de una suspensión celular:
1. Elegir el recipiente.
2. Determinar el nº de células a sembrar.
3. Recuento de células viables y determinar del vol a sembrar.
4. Diluir las células con medio de cultivo e introducirlas en el recipiente.
5. Incubar en condiciones adecuadas.
4.5. Mantenimiento del cultivo
Consiste en diferentes operaciones para el control de la viabilidad y crecimiento.
- Control periodico microscopico
Se retira el cultivo del incubador y se examinan con 1 microscopio invertido → se observa
el crecimiento y apariencia de las células.
- Cambio de medio
Sirve para renovar los nutrientes y retirar pdtos de desecho, suele realizarse cada 2-3 días
o si cambia el pH, y se realiza en cabina de clase II.
- Subcultivo o pase
Cada 6-7 días.
o Cultivos en suspensión: se realiza 1 recuento de viables y dilución necesaria para
reiniciar un cultivo.
o Cultivos en monocapa: tripsinización → para despegar las células → hacer un recuento
y reiniciar el cultivo con la densidad adecuada.
4.6. Conservación de células
El método habitual de conservación de líneas celulares es la congelación. Se procede
como si se fuera a realizar un pase:
1. Tras obtener la suspensión de células, se lavan con medio de cultivo y se hace 1
recuento de viables.
2. Centrifugar y retirar el sobrenadante (medio de cultivo).
3. Se añade el medio de conservación adecuado (suero animal con 10% de DMSO)
para obtener 1 densidad adecuada.
4. Se alícuota en microtubos y se procede a 1 congelación progresiva:
a. -20ºC, 24h
b. -80ºC, 24h
c. Nitrogeno liquido indefinidamente.
5. CONTAMINANTES
5.1. Bacterias, levaduras y hongos
Son +habituales, crecen + rápido que las células del cultivo → las matan.
Fuente de contaminación: ambiental o por mala praxis. Aunque se añaden
antibióticos/antifúngicos, no es suficiente, se debe:
- Trabajar siempre en cabina (clase II).
- Extremar las precauciones en las manipulaciones fuera de un ambiente esteril.
- Limpiar superficies de viales y recipientes con alcohol al 70%.
- Cambiar las bandejas con H2O de las incubadoras.
- Eliminar los cultivos contaminados.
5.2. Micoplasmas
Son organismos procariotas sin pared celular, el origen está en las propias líneas
celulares/sueros.
Detección: no es fácil: observación de gránulos intracelulares confirmados por otras
técnicas. Se debe eliminar el cultivo infectado, aunque se puede rescatar aislandolo y
tratándolo con antibióticos.
5.3. Virus
Se debe a los sueros animales. Detección: efecto citopático de cada virus. Se debe
eliminar el cultivo infectado.
