UNIVERSIDAD MAYOR, REAL Y PONTIFICIA DE SAN FRANCISCO
XAVIER DE CHUQUISACA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERIA AGRONÓMICA
MATERIA: MICROBIOLOGIA
CURSO: 4 SEMESTRE
GESTIÓN 02/2023
GUÍA DE LA PRACTICA N° 1
CULTIVO Y ESTUDIO DE LAS BACTERIAS
DOCENTE: Ing. Miriam Velazco
ESTUDIANTES:
Huarachi Caihura Emerson Jhonny
Mancilla Cortez Jean Carlos
Colque Chumacero Gimel Brenda
Rios Ortega Manuel Jherson
Maita Padilla Juan Gabriel
Sucre – Bolivia
2023
CULTIVO Y ESTUDIO DE LAS BACTERIAS
1 INTRODUCCIÓN
Hace trescientos años Anton van Leeuwenhoek observó por primera vez en un
microscopio unos “pequeños animáculos” que ahora se conocen como
microorganismos. Los microorganismos son los seres más primitivos que existen en la
Tierra, los cuales tienen la capacidad de colonizar cualquier tipo de ambiente. Estos
microorganismos también participan de forma vital en todos los ecosistemas y están en
interacción continua con las plantas, los animales y el hombre. Los microorganismos
son clave para el funcionamiento de los sistemas biológicos y el mantenimiento de la
vida, pues participan en diversos procesos metabólicos, ecológicos y biotecnológicos.
Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario cultivarlo y
posteriormente separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin se
emplean técnicas de aislamiento que conducen a la obtención de un cultivo para su
posterior observación e identificación mediante pruebas morfológicas, bioquímicas y
moleculares. En la práctica se realizó el aislamiento de microorganismos de tres
ambientes distintos: Tierra, Agua y Aire mediante siembra en medios de cultivo no
selectivos donde crece todo tipo de microorganismos (Agar nutritivo y MacConke) y se
realizó una posterior caracterización macro y microscópica de los mismos; evidenciando
como resultado la presencia de diversos tipos de bacterias y hongos en los ambientes
estudiados, determinando así la importancia de realizar este tipo de procedimientos para
conocer a fondo los diversos microorganismos a los que estamos expuestos a diario, y
por ende, como afectan y benefician a nuestro entorno.
2 OBJETIVO
• Cultivar y estudiar a las bacterias
3 OBJETIVO ESPECIFICO
• Preparación y esterilización
• Preparación de los medios de cultivo
• Aislamiento de bacterias de diferentes muestras
• Identificación de las baterías a través de la morfología y reacción de tinción
4 MARCO TEÓRICO
a) Glosario de términos
Séptica: Que contiene gérmenes patógenos.
Aséptica: Que no tiene gérmenes que puedan provocar una infección.
Tinción: Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una
superficie.
Esterilización: Se denomina esterilización al proceso por el cual se obtiene un producto
libre de microorganismos.
Desinfección: Procedimiento, que, utilizando técnicas físicas o químicas, permite
eliminar, matar, inactivar o inhibir a un gran número de microorganismos encontrados
en el ambiente.
Inhibir: Eliminación de microorganismos de objetos inanimados que pueden causar
enfermedad.
Aerobio: Que necesita respirar oxígeno para vivir o desarrollarse.
Anaerobio: Que es capaz de vivir o desarrollarse en un medio sin oxígeno.
Axénico: Que se desarrolla en un ambiente donde no hay ningún otro organismo vivo.
Inocular: Introducir en el organismo por medios artificiales el virus o la bacteria de una
enfermedad contagiosa.
Microbiano: De los microbios o relacionado con ellos.
Dilución: Una dilución es un procedimiento, cuya finalidad es disminuir la cantidad de
soluto por unidad de volumen de dilución.
Cepa: Grupo de microorganismos, como bacterias o virus, que pertenecen a la misma
especie y comparten ciertas características que no se encuentran en otros miembros de
la especie.
Clon: grupo de organismos o células que son idénticos desde el punto de vista genético
y que se originan a través de una reproducción de carácter asexual.
Frontis: extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con
objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados
en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.
b) Conceptos
Cultivo microbiano: El cultivo es el crecimiento microbiano en un medio nutritivo sólido
o líquido; el aumento del número de microorganismos facilita su identificación. El cultivo
también facilita la realización de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.
La comunicación con el laboratorio tiene una importancia esencial. Aunque la mayoría
de las muestras se cultivan en medios generales (por ejemplo, agar con sangre o
chocolate), algunos patógenos requieren la inclusión de nutrientes o inhibidores
específicos (ver tabla Medios selectivos para el aislamiento de bacterias comunes) u
otras condiciones especiales para la incubación, por ejemplo, una temperatura
específica, concentración de oxígeno o dióxido de carbono, o duración).
4.1 MARCO CONCEPTUAL
El siguiente trabajo se realizó en el Centro de Investigación e Innovación de Ciencias
Agrarias Villa Carmen, CIICA-VC USFX de Yotala en el laboratorio de microbiología,
donde se efectuó la esterilización de los materiales como una primera práctica, pasando
una semana se realizó a la preparación de cultivos como una segunda práctica, a la
siguiente semana se realizó a la cultivación de las distintas muestras agua guano y
dedos como una tercera práctica, un cuarta practica se realizó la tinción de Gram y
finalmente se realizo en la quinta semana la observación y clasificación de las bacterias.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES EN GENERAL
Materiales:
• Horno estufa
• Tubos de ensayo
• Papel madera
• Tijeras
• Papel de aluminio
• Detergente
• Cepillos, esponja
• cajas Petri de la práctica N° 3
• Asa de microbiológica e isopos desechable
• Marcador resistente al alcohol
• Cajas de Petri estériles (12 cm de diámetro)
• Recipientes
• Estufa de incubación
• Mechero
• Espátula
• Balanza digital
• Asa de platino
• Probeta (100), pipetas
• Microscopio
• Asa de inoculación
• Porta y cubre objetos
• Gotero
• Alcohol
• Marcador resistente a alcohol
• Cultivos de la practica 4
Muestra para la siembra:
• Muestra de agua De tierra
• Muestra de agua de manantial
• Muestra de estiércol
• Muestra de dedo
Reactivos:
Colorantes para tinción de Gram
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol acetona
• Safranina
• Aceite de inmersión
• Medio no deshidratado (caldo nutritivo: Extracto de carne 0,3%.
• Peptona (1%).
• cloruro de sodio (0,5%)
• agua destilada 1.000 ml, para solido adicionar 2% de agar (Agua
destilada).
➢ Practica de material de vidrio y esterilización
Procedimiento:
• Limpieza del material para la esterilización
• Lavado de material de vidrio Utilizando escobillones para pipetas y detergente.
Preparación del material.
✓ Envolvimos las 6 cajas de Petri con papel madera siguiendo las indicaciones del
docente. Anotamos en el papel, la cantidad de cajas envueltas y grupo.
✓ Esterilización
✓ Precalentar el horno a 170°C, colocar el material preparado para esterilizar y
esperar que la temperatura se vuelva a ajustar a 170 °C, en este momento
empezar a contar el tiempo de 1 h.
➢ Preparación de los medios de cultivo:
Metodología:
• La descripción de las colonias se las realizo de la siguiente manera dónde
identificó sus formas, dimensión, borde, aspecto físico, consistencia y su
pigmentación.
• Para la identificación, seleccionamos algunas colonias y realizamos pruebas de
acuerdo a lo que se requiera.
➢ Practica de medios de cultivo y métodos de siembra
Metodología:
• Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para
preparar la cantidad de los dos medios indicados que son el agar nutritivo y el
agar macconkey para las cajas Petri.
• Colocamos en el medio en un recipiente del doble de volumen y adicionar el
agua necesaria.
• Calentamos suavemente hasta disolverlo completamente.
• Vaciamos el agar nutritivo en 3 cajas de Petri y otros tres de agar macconkey.
• Etiquetar las cajas de Petri.
• Esterilizar en autoclave a una temperatura de 121° C durante 15 minutos y 15
libras de presión).
• Enfriar el matraz hasta 45° C, por debajo de esta temperatura el agar solidificará.
• En condiciones asépticas, transferir del recipiente de 15 a 20 ml de cada medio
en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
• Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja)
colocar el masking tape o con marcador indeleble.
• Métodos de siembra:
• Tomamos el asa de platino ó acero y quemarla al rojo vivo en la flama del
mechero para esterilizarla.
• Tomar una pequeña muestra del material.
• Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la
flama del mechero.
• Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.
• Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
• Destapar la caja Petri con agar nutritivo o MacConkey y sembrar al
microorganismo por el método por estría.
• Quemar el asa cada vez que se realiza una estría.
• Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante
24 horas.
• Practica de desarrollo de los micro organismos y aislamientos de colonias
➢ Practica de métodos de observación y clasificación microscópicas
de bacterias.
Metodología:
Una gota del cultivo liquido es depositada sobre el portaobjetos, Luego se colocamos el
cubreobjetos y el preparado se coloca al microscopio para observar con poca luz.
Preparación de frotis:
a) Lavamos perfectamente los porta objetos, secarlos con papel y marcarlos con
marcador indeleble.
b) Encendemos el mechero y esterilizamos el asa en la flama hasta que se ponga
al rojo vivo. Dejamos enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los
microorganismos.
c) Acercar la caja de Petri con el cultivo e introducir el asa para tomar la muestra.
Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extendimos suavemente en
área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa.
Tinción de Gram:
• Para la tinción de Gram se hizo en cuatro muestras de portaobjetos con
diferentes reactivos.
• En el primer portaobjetos se puso 1 gota de cristal violeta durante 60 segundos.
• En el segundo portaobjeto se puso 1 gota de Lugol por 2 minutos.
• En el tercer portaobjeto se puso 1 gota de decolorante (alcohol acetona) por 15
segundos.
• Y en el último portaobjeto se puso 1 gota de safranina durante 30 segundos.
• Después de esperar el tiempo determinado se lo Lava de nuevo con agua, quitar
el exceso de agua y dejar secar al aire.
Observación al microscopio:
Por último, observamos en el microscopio colocando los portaobjetos en la platina y
localizando la preparación con el objetivo de 10X, después pasar al de [Link]
una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
6. RESULTADOS
En la muestra 4 colonia redonda y colonia reactante se logro ver que la colina redonda
sintetizaba algún tipo de antibiótico ya que inhibía a la otra colonia de bacterias.
Cultivo bacterias
Muestra Muestra Cultivo
1 Agua de tierra Agar nutritivo
2 Agua de manantial Agar nutritivo
3 Estiércol Agar MacConke
4 Dedos Agar MacConke
Cultivo bacterias
Muestra Colonia Tipo de colonia
1 1 mucoide
1 2 rugosa
2 1 mucoide de color rojizo
2 2 mucoide blanquecino
3 1 liso ovoide
3 2 blanquecino con relieve
4 1 colonia redonda
4 2 colonia reactante
Cultivo bacterias
Muestra Colonia Morfología Gram
1 1 Bacilos Positivos
1 2 Bacilos Negativos
2 1 Cocos Negativos
2 2 Bacilos Positivos
3 1 Bacilos Negativos
3 2 Bacilos Negativos
4 1 Bacilo cocos Negativos
4 2 Bacilos Positivos
7. CONCLUSIONES
Durante la práctica se logró identificar tres tipos de bacterias por su morfología, como
también por la tinción de Gram por su pared celular, nos ayuda a comprender la
importación de los microorganismos benéficos o maléficos en los diferentes entornos.
Con más estudios más específico podríamos determinar cómo afectan los organismos
en el suelo y crecimiento de los vegetales o como también estudiar algunos patógenos.
También adquirir los conocimientos necesarios para realizar la esterilización adecuada
de los materiales con el fin de no contaminar el medio de cultivo como también se realizó
la técnica del estriado para la plantación de las bacterias y la clasificación de ellas.
8. BIBLIOGRAFÍA
[Link]
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[Link]
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9. ANEXOS
• PREPARACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO Y ESTERILIZACIÓN
Lavado de material de vidrio e instrumental Utilizando escobillones para pipetas, tubos
y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental
metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes que no dejan
residuos Enjuagar suficientemente con agua del grifo Enjuagar con agua destilada,
escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
• MEDIOS DE CULTIVO Y METODOS DE SIEMBRA
Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo.
• Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.
• Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)
• En el caso de medios deshidratados, el medio debe de guardarse en su frasco y en
lugares frescos.
• DESARROLLO DE LOS MICROORGANISMOS Y AISLAMIENTO DE
COLONIAS E IDENTIFICACIÓN
Para la identificación, juntamente con la docente seleccionaran algunas colonias
y se realizaran pruebas de acuerdo a lo que se requiera.
Colonial representativa de cada cultivo microbiano de acuerdo con los criterios
indicados.
• Colonia
MÉTODOS mucoide blanquecina en elMICROSCÓPICA
DE OBSERVACIÓN agar nutritivo en elDE
agar MacConke colonia
BACTERIAS
ovoides
.
En un microscopio ver cada muestra preparada para identificar los tipos de bacteria
Bacterias Gram negativas en muestra de Estiércol
Colonia rugosa y mucoide, muestra mal teñida
Colonia liso ovoide y blanquecino con relieve
bacterias Gram positivas, en la imagen de la derecha observamos dos tipos de
bacterias unas mas grandes que las otras.
