BENEMERITA UNIVERSIDAD
AUTONOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
GENERAL
REPORTE DE PRACTICA 3:
AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS
DC: MARIA SEBASTIANA PEDRAZA
CHAN
INTEGRANTES DE EQUIPO:
ANDREA EMILHY CASTAÑOS BARBA
202329390
ILIANA MORENO CARMONA 202340279
ITZEL RIOS TELLEZ 202353153
LUIS FERNANDO AQUINO FLORES
202328880
IZEL CHACON MIRANDA 202120874
SECCION: 002-NRC: 51230
RESUMEN
La tinción de Gram es una de las técnicas más utilizadas en microbiología
para la identificación y clasificación de bacterias en dos grandes grupos:
Gram positivas y Gram negativas. Este método se basa en las diferencias en
la composición de la pared celular bacteriana, lo que determina la
capacidad de las células para retener el colorante primario (cristal violeta) o
perderlo tras la decoloración con alcohol-acetona.
En esta práctica, se realizó la tinción de Gram en diferentes muestras
bacterianas proporcionadas por el profesor. Se siguieron los pasos del
procedimiento, incluyendo la fijación de los frotis, la aplicación de los
colorantes y la observación microscópica. Los resultados permitieron
diferenciar con claridad las bacterias Gram positivas, que conservaron la
coloración azul/violeta debido a su gruesa capa de peptidoglicano, y las
bacterias Gram negativas, que se tiñeron de rojo/rosado tras perder el
colorante primario y absorber la safranina.
Esta técnica es esencial en microbiología, ya que permite la clasificación
rápida de microorganismos, lo que facilita su estudio y su posible
identificación en procesos clínicos o ambientales. Además, su correcta
aplicación es fundamental para evitar errores en la interpretación de los
resultados.
INTRODUCCION
La mayoría de los microorganismos son incoloros y presentan poco
contraste cuando se observa directamente al microscopio. Cuando los
microorganismos son teñidos antes de observarlos, aumenta grandemente
el contraste de las células y su medio.
Antes de teñir es necesario hacer frotes y fijarlo. Un frote es una delgada
capa de células que cubre un área de un portaobjetos, este frote debe ser
secado al aire y fijado por calor o químicamente por alcohol. La fijación se
da como resultado de la coagulación del protoplasma y adherencia al
portaobjetos. Así los frotes no fijados son “lavados” en el proceso de tinción.
Son varias las técnicas usadas en microbiología para la observación de los
microorganismos para la observación de los microorganismos: simple
(directa), diferencial, tinción de estructura, negativas y tinción de material de
reserva.
La tinción más usada en microorganismos es la Gram y se considera una
tinción diferencial.
Los microorganismos difieren entre si desde el punto de vista químico y
físico por lo que reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las
tinciones diferenciales ocupan dos colorantes; el primero (cristal violeta) y
uno de contraste (safranina) y clasifica a los m.o según su capacidad de
retener el colorante primario Gram (+) o el colorante de contraste o
secundario Gram (-)
OBJETIVO
Conocer y manejar la técnica de tinción de Gram de acuerdo con la
estructura celular de las bacterias Gram (+) y Gram (-)
MATERIAL Y EQUIPO
Cepas (proporcionadas por el profesor)
Mechero Bunsen
Porta Objetos
Cubreobjetos
Microscopio
REACTIVOS
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol-Acetona
Safranina
PREPARACION DE REACTIVOS
CRISTAL VIOLETA
1gr ------ 100 Ml alcohol
LUGOL
2 gr Kl + 1 gr l metalico 300 Ml alcohol
ALCOHOL CETONA
80 Ml alcohol + 20 Ml acetona
SAFRANINA
1gr safranina 100 mL alcohol
PROCEDIMIENTO
Técnica de tinción de Gram. Hacer un frotis de cada uno de los m.o. y
dejarlos secar al aire. Fijar los brotes al calor. Cubrir los frotis con
cristal violeta y dejarlos actuar durante un minuto. Escurrir el colorante
y lavar con chorro suave de agua corriente. Cubrir los frotis con lugol,
dejarlos un minuto, escurrir y lavar. Decolora con alcohol-cetona
(proporción de 50% cada uno) de 5-30 seg. escurrir y lavar con chorro
suave de agua corriente. Cubrir los frotis con safranina y dejarla
durante 10 seg. escurrir y lavar con chorro suave de agua corriente.
Dejar secar al aire Observar los frotis con el objetivo de inmersión.
Hacer anotaciones y dibujos a colores de las observaciones que
efectúe
Observación de la técnica de Gram en cada uno de sus pasos. Hacer 4
frotis con las cepas proporcionadas y fijarlos al calor. Teñir los frotes
según la técnica de Gram, deteniéndose en cada uno de los pasos
importantes, de tal manera que tenga un frotis teñido hasta el paso 3,
4, 5, 6. Examinar a inmersión cada uno de los frotis
TABLAS EXCEL
RESULTADOS
Tras realizar la técnica de tinción de Gram en las cepas proporcionadas,
se pudo observar una diferenciación clara entre bacterias Gram positivas
y Gram negativas.
Gram positivas: Se identificaron bacterias con una coloración azul/violeta,
lo que indica la presencia de una pared celular con una capa gruesa de
peptidoglicano capaz de retener el cristal violeta.
Gram negativas: Se observaron bacterias con una coloración roja/rosada,
evidenciando la pérdida del colorante primario tras la decoloración con
alcohol-acetona y la posterior tinción con safranina.
Los resultados obtenidos fueron consistentes con la teoría, permitiendo
una correcta identificación y diferenciación de los microorganismos
presentes en las muestras analizadas.
DISCUSION
La tinción de Gram es una de las técnicas más utilizadas en microbiología
debido a su capacidad para diferenciar bacterias en función de su estructura
celular. En este experimento, se pudo comprobar la efectividad de esta técnica
y la importancia de seguir correctamente cada uno de sus pasos para obtener
resultados precisos.
Un aspecto clave en la tinción de Gram es el proceso de decoloración. Si el
tiempo de exposición al alcohol-acetona es demasiado prolongado, incluso las
bacterias Gram positivas pueden perder el colorante primario, dando un falso
negativo. Por otro lado, una decoloración insuficiente puede hacer que las
Gram negativas retengan el cristal violeta, generando errores en la
identificación.
Además, factores como el grosor del frotis, la correcta fijación por calor y la
frescura de los reactivos pueden influir en la calidad de la tinción. Durante la
observación microscópica, se pudo constatar que las bacterias Gram positivas
tendían a agruparse en racimos o cadenas, mientras que las Gram negativas se
mostraban en formas más dispersas, lo cual es característico de su morfología.
CONCLUSIONES
1. La tinción de Gram es una herramienta fundamental en microbiología
para la identificación de bacterias según la estructura de su pared celular.
2. Se logró diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas en base
a su capacidad para retener o perder el colorante primario.
3. La correcta aplicación de los reactivos y el tiempo de decoloración son
esenciales para obtener resultados confiables y evitar errores en la
clasificación bacteriana.
4. El análisis microscópico posterior confirmó las diferencias morfológicas
y estructurales entre ambos tipos de bacterias, reforzando la importancia
de esta técnica en el diagnóstico microbiológico.
CUESTIONARIO
¿Qué importancia tiene la técnica de Gram? Escribe 4 ejemplos de
bacterias Gram (+) y 4 Gram (-).
La técnica de Gram es un procedimiento de tinción que se utiliza en
microbiología para clasificar las bacterias en dos grandes grupos según
las características de su pared celular: Gram positivas (Gram +) y Gram
negativas (Gram -). Este método es de gran importancia porque ayuda a
identificar el tipo de bacteria, lo que influye directamente en la elección
del tratamiento antimicrobiano, ya que las bacterias Gram positivas y
Gram negativas tienen diferentes estructuras celulares que afectan su
respuesta a los antibióticos.
La clasificación se basa en la cantidad de peptidoglicano en la pared
celular. Las bacterias Gram positivas tienen una capa gruesa de
peptidoglicano, lo que permite que retengan el tinte cristal violeta
durante la tinción. En cambio, las Gram negativas tienen una capa más
delgada de peptidoglicano y una membrana externa adicional, lo que
impide que retengan el tinte, resultando en un color rosado tras la
tinción.
Ejemplos de bacterias Gram positivas:
1. Staphylococcus aureus
2. Streptococcus pyogenes
3. Bacillus anthracis
4. Clostridium botulinum
Ejemplos de bacterias Gram negativas:
1. Escherichia coli
2. Salmonella enterica
3. Neisseria gonorrhoeae
4. Pseudomonas aeruginosa
Cada grupo tiene implicaciones en su patogenicidad, resistencia a
antibióticos y la forma en que interactúan con el sistema inmunológico.
Cite tres razones por lo cual los microorganismos deben teñirse.
Facilitar la observación bajo el microscopio: Muchos microorganismos son
microscópicos y transparentes, lo que hace difícil observarlos sin un tinte.
La tinción aumenta el contraste, permitiendo que las estructuras celulares
sean más visibles bajo el microscopio, lo que facilita su identificación y
estudio.
Diferenciación de tipos celulares: La tinción permite distinguir entre
diferentes tipos de microorganismos o entre distintas estructuras dentro
de una célula, como la pared celular, el núcleo o las inclusiones. Técnicas
como la tinción de Gram, por ejemplo, permiten clasificar las bacterias en
Gram positivas y Gram negativas según las diferencias en su pared celular.
Detección de características específicas: Algunas tinciones pueden resaltar
estructuras específicas de los microorganismos, como esporas, cápsulas o
pigmentos, lo cual es crucial para la identificación precisa de la especie y
para comprender mejor su biología y patogenicidad.
¿Por qué las bacterias Gram (-) se tiñen rojas y las Gram positivas
azules?
La diferencia en la coloración de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas se debe a las características estructurales de sus paredes
celulares y la forma en que interactúan con los reactivos de la técnica de
Gram.
Bacterias Gram positivas (se tiñen azules/púrpuras):
Pared celular gruesa: Las bacterias Gram positivas tienen una capa
gruesa de peptidoglicano en su pared celular. Esta capa es muy densa y
retiene el tinte cristal violeta que se utiliza en el proceso de tinción.
Durante el proceso de tinción, el cristal violeta se une fuertemente a
esta capa gruesa de peptidoglicano, formando un complejo que es difícil
de eliminar. Luego, el yodo se usa para fijar el tinte, y cuando se enjuaga
con alcohol (o acetona), la estructura gruesa de la pared celular retiene
el tinte y no pierde color.
Como resultado, las bacterias Gram positivas mantienen el color del
cristal violeta, que es azul/púrpura.
Bacterias Gram negativas (se tiñen rojas/pink):
Pared celular delgada: Las bacterias Gram negativas tienen una capa
delgada de peptidoglicano, pero además poseen una membrana
externa adicional, que rodea la pared celular.
Durante el proceso de tinción, el cristal violeta no se adhiere
fuertemente a la delgada capa de peptidoglicano, y cuando se les aplica
el alcohol o acetona, la membrana externa se desintegra, y el tinte
cristal violeta se pierde.
Después, se aplica un tinte de contraste, como la safranina, que tiñe las
bacterias Gram negativas de un color rojo o rosado, ya que no
retuvieron el cristal violeta.
BIBLIOGRAFIA
: Prescott. L. M., Harley, 1999, Microbiología. Cuarta Edición. Graw Hill.
Interamericana, México. Zinsser 1994, Microbiología. Ed.
Panameriacana. Veinteaba edición
