Facultad de Medicina “Alberto Hurtado”
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA MÉDICA,
ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLINICO
GUÍA DE PRÁCTICA
QUIMICA CLINICA GENERAL
TEMA N°1
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN QUÍMICA CLÍNICA
Uso y aplicación de la Fotocolorimetría. Condiciones de instalación,
verificación y desempeño. Documentación.
2025-I
Lima – Perú
INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS DE QUIMICA CLINICA
El objetivo del curso está orientado a desarrollar en los alumnos las competencias para el manejo e
interpretación de las pruebas de Química Clínica en la ayuda al diagnóstico basado en el
laboratorio clínico, con énfasis en conocer los fundamentos de los diferentes métodos y técnicas de
laboratorio, seleccionar, desarrollar, comprender los conceptos biológicos y fisiológicos de los
resultados y su validación analítica en los principales métodos utilizados, en la determinación de:
enzimas, carbohidratos, proteínas, lípidos, función hepática y función renal a través de métodos
manuales, semiautomatizados y automatizados
DEFINICIONES
1.- Química Clínica
La química clínica es el área del Laboratorio Clínico que realiza el análisis bioquímico de los fluídos
corporales, con el fin de describir como ocurren los procesos biológicos en el organismo. Utiliza
reacciones químicas y enzimáticas para determinar los niveles de concentración de compuestos
químicos que pueden ser enzimas, carbohidratos, proteínas, lípidos en los líquidos corporales:
sangre, orina y fluidos; con relación a su actividad y función en el organismo. Las técnicas tales
como espectrofotometría, immunoensayos y electroforesis son muy utilizadas en química clínica.
2.- Interferencia
Es la modificación que una sustancia causa en la medición de la concentración o actividad
enzimática de un analito, realizado en una muestra y con un método analítico particular. Cada
Interferencia es un efecto único, como resultado de la interacción: interferente- analito-muestra-
método.
Las interferencias son importantes en Química Clínica, porque cuando se obtiene un valor de
concentración o actividad enzimatica de un componente o analito en la evaluación clínica,
diagnóstico, control de tratamiento, pronóstico, etc., este resultado se correlaciona con datos del
paciente y el clínico plantea un diagnostico médico, por tanto si hay una Interferencia se
modificará el valor hallado y puede llevar a un diagnóstico médico erróneo.
Según el mecanismo general las interferencias, se dividen en:
Interferencia analítica: Es dependiente del método de medición utilizado. Ejemplo: la absorción a
la longitud de onda del método, por causar turbidez o precipitados que alteran la señal medida,
algunos analitos que se dosan como ion, etc.
Interferencia biológica: Es independiente del método de medición utilizado. La sustancia
interferente modifica el metabolismo del analito a dosar: altera su nivel de absorción, de síntesis o
catabolismo, de secreción o excreción, del analito a dosar en el paciente. Este cambio altera la
concentración o actividad catalítica del analito en el especimen en que se realiza su medición.
Ejem: - ciertos hipotensores disminuyen la excreción de metabolitos y se falsean sus niveles
urinarios. Algunos diuréticos producen una marcada pérdida de potasio por orina.
Según su origen: Interferencias endógenas e interferencias exógenas
Interferencias endógenas: La sustancia interferente es un componente normal del espécimen,
pero se encuentra en nivel elevado respecto al habitual, en tal medida que genera una interferencia
analítica. Los interferentes más comunes son: bilirrubina, hemoglobina, quilomicrones,
inmunoglobulinas, proteínas plasmáticas y cuerpos cetónicos.
Interferencias exógenas: Se pueden dividir en tres categorías: 1- Interferencias por
medicamentos, 2- Interferencias por aditivos 3- Interferencias por materiales de prueba
3.- Selección del método: Las características metodológicas ideales permitirán que el método
seleccionado tenga buena probabilidad de exactitud en el laboratorio, estas características
incluirán: la metodología de elección, que tendrá potencialmente la especificidad química
necesaria (libre de interferencias) y sensibilidad química (capacidad de detectar cantidades
pequeñas o pequeños cambios en la concentración del compuesto analizado). También es
importante la capacidad de usar calibrador, la elección de reactivos, temperatura, tiempo de
reacción, tiempo de medición y tipo de medición (métodos de determinación de un punto, dos
puntos o cinéticos), son características de un método que deben definirse. La IFCC (Internacional of
Federation Clinical Chemistry and laboratory Medicine) y la AACC (Asociación Americana de
Química Clínica) han desarrollado una serie de recomendaciones para los métodos empleados en
química clínica. El operador del procedimiento del método debe familiarizarse con la estabilidad
de los calibradores, controles y reactivos; con la linealidad de la respuesta a través de todo el
intervalo de trabajo.
Precisión, Veracidad y Exactitud: Nos permiten medir aspectos importantes del método.
La precisión se define como la concordancia entre las medidas de una misma magnitud realizadas,
esto quiere decir que el equipo es capaz de reproducir un mismo valor varias veces en un punto muy
cercano entre sí, este puede o no ser cercano al valor verdadero
La veracidad se define como la cercanía de la media de un grupo de mediciones independientes al
valor verdadero en condiciones estipuladas.
La exactitud es el grado de concordancia existente entre el resultado del ensayo y un valor aceptado
como referencia.
Sensibilidad y especificidad de un método analítico: Es importante a considerar al
evaluar la validez de un método: su sensibilidad y su especificidad.
Sensibilidad del método: se refiere a la capacidad del método de medir una cantidad de
sustancia.
Límite de detección o límite inferior de cuantificación (LIdQ): cantidad mínima de
sustancia que puede ser cuantificada por el método.
Límites de cuantificación (LoQ): se puede definir como el valor más pequeño que
excede significativamente las medidas de una muestra con el blanco. Así, el límite se
estima en base a las mediciones repetidas de una muestra blanca y se reporta como la
media más 2 o 3 SD de las mediciones de los blancos. En el intervalo entre LoD y LIdD,
el resultado debe informarse como "detectado", pero no debe proporcionarse un resultado
cuantitativo.
Especificidad analítica: capacidad para medir únicamente la sustancia que quiere
estudiarse, sin interferencia de otras sustancias que puedan encontrarse en la muestra. La
especificidad está a menudo ligada a la sensibilidad. Es posible reducir la sensibilidad de
un método de tal forma que la presencia de interferencias afecte en menor grado al
resultado final y el método pueda considerarse como especifico, aunque menos sensible
para la sustancia problema.
4.- Proceso del Análisis Clínico
La meta fundamental del laboratorio clínico es proporcionar datos confiables acerca de
la composición de las muestras obtenidas de pacientes, para contribuir al diagnóstico,
tratamiento y seguimiento de diversas enfermedades. Para obtener los datos
verdaderamente confiables, requieren de la rigurosa aplicación de diferentes técnicas de
control de calidad, teniendo siempre presente que el mejor sistema de control es el que
permite prevenir, identificar y corregir los errores, para este propósito es necesario el uso
de programas de control de calidad interno y externo en todo tipo de sistemas analíticos:
manuales o automatizados. La meta de un sistema de control de calidad deberá ser que:
“La variación en las determinaciones que se llevan a cabo en el laboratorio sea lo
suficientemente pequeña para que no se afecte su utilidad” por lo que se requiere
controlar el proceso total del análisis de laboratorio clínico, incluyendo las etapas pre-
analítica, analítica y post-analítica.
5.- Sistema de Aseguramiento de la Calidad
Conjunto de acciones sistemáticas encaminadas a proporcionar la adecuada confianza en
los servicios del laboratorio para satisfacer las condiciones de calidad determinadas o
exigidas, mejorando así la atención al usuario.
Garantía de la Calidad
Es el conjunto de actividades sistemáticas, planificadas, aplicadas en el sistema de
gestión de la calidad, para los requisitos de calidad de un producto o servicio.
Políticas de Calidad
Son las intenciones y dirección de una organización, como las expresa formalmente su
alta dirección, relativa a la calidad”.
Control de Calidad
Si tenemos en consideración que se ha establecido apropiadamente todos los parámetros
previos entonces podremos controlar el sistema
El control de calidad en el laboratorio de análisis clínico, es una herramienta que permite
detectar y corregir posibles deficiencias analíticas del proceso antes de emitir un
resultado, básicamente nos ayuda a medir la precisión y exactitud del proceso analítico y
con el fin de aumentar la calidad y confiabilidad de los resultados obtenidos por uno o un
conjunto de procedimientos que se utilizan en una misma técnica, y verificar que el
resultado se mantiene invariable a lo largo del tiempo o bajo condiciones operativas
diferentes.
Se hace uso de un material de control (controles) sobre el cual se realiza una serie
de determinaciones al comienzo de cada analítica, cada vez que un instrumento recibe
servicio técnico, cada vez que se cambia un lote de reactivos, o si se preparan en el
laboratorio de análisis clínicos, cada vez que se prepara un nuevo lote, tras cada
calibración, y cada vez que un resultado parezca inapropiado.
Los resultados de Laboratorio se valoran sobre los límites de control de + 2 DS a partir del
valor medio del control utilizado para el método, cuando se establece en el laboratorio, o
sobre el valor medio asignado por el fabricante cuando aun no se ha implementado en el
laboratorio.
6.- Como medir la concentración de componentes en Química Clínica
Cuando se desea determinar la concentración de un componente de una solución
mediante el uso de un espectrofotómetro o fotocolorímetro, se deben considerar
varias mediciones que nos permiten evaluar el método, evaluar los reactivos,
calcular y obtener la concentración de la muestra finalmente nos permite validar
nuestros resultados, como son: Medición del blanco, medición del
estándar/calibrador, medición de los controles y la medición de la muestra, la misma
que puede hacerse en tubo, cubeta o celda en equipos manuales,
semiautomatizados y automatizados
“Medición del Blanco” Es la medición contenida en un tubo, celda, o cubeta que
permite eliminar el color si es en el espectro visible o la actividad si es un espectro UV,
contiene diluyente, estabilizadores químicos del pH, reactivos, colorantes y todos los
ingredientes que sean necesarios para la técnica o procedimiento analítico, esta lectura
se realiza antes de que se inicie la reacción.
Existen varios tipos de “blanco”:
a) Blanco de aire: Verifica que el haz de luz que pasa y se absorbe o trasmite
adecuadamente, sea 100% si se trata de transmitancia o 0% si se trata de absorbancia.
En los fotocolorímetros es de utilidad para evaluar las condiciones de cada filtro.
b) Blanco de reactivo: Verifica la lectura del reactivo y su actividad que esta descrita por
el fabricante, antes de que tenga reacción con alguna sustancia. Tiene un valor limite,
que nos dice que ya no se debe utilizar por deterioro o contaminación.
c) Blanco de muestra: Es el color propio de la muestra que en algunos procedimientos es
valioso identificar. Debe ser medido para eliminar ese color que puede generar
interferencia o sobreestimación de la medición.
d) Blanco de cubeta: esta lectura nos permite evaluar la calidad de la cubeta y poder
identificar si existe alguna dañada para su remplazo.
“Medición del Estándar” Contiene el reactivo del analito a realizar y se le agrega el
estándar (solución acuosa que tiene el analito a investigar en concentración conocida y
exacta) en la misma condición de la muestra con la finalidad que bajo las mismas
condiciones reproduzca un valor que servirá de base para elaborar la curva de
Calibración, después será comparado para obtener la concentración del analito a
investigar en la muestra.
“Medición del Calibrador” Contiene el reactivo del analito a realizar y se le agrega el
calibrador (solución de matriz proteica similar al suero humano que contiene el analito a
investigar en concentración conocida y exacta) en la misma condición de la muestra con
la finalidad que bajo las mismas condiciones reproduzca un valor que servirá de base
para elaborar la curva de Calibración, después será comparado para obtener la
concentración del analito a investigar en la muestra.
“Medición del Control” Contiene el reactivo del analito a realizar y se le agrega el
control (solución de matriz proteica similar al suero humano que contiene el analito a
investigar con un rango de valor asignado en nivel patológico y no patológico en un rango
aceptable +/- 2DS) en la misma condición de la muestra con la finalidad que bajo las
mismas condiciones reproduzca un valor que servirá para evaluar la curva de Calibración.
“Medición de la Muestra” Contiene el reactivo del analito a realizar y se le agrega la
muestra para medir la determinación del paciente.
Debe ser determinado en la condición que propone el fabricante como: longitud de onda,
volumen reactivo, volumen de muestra o calibrador, temperatura y tiempo con la finalidad
que todo el proceso se produzca bajo las mismas condiciones y que reproduzca el mismo
desempeño establecido por el fabricante.
La concentración del analito en la muestra se calculará con el valor de lectura corregida
obtenido y el valor del factor colorimétrico que se obtiene de la curva de Calibración.
ESPECTROFOTOMETRÍA
INTRODUCCIÓN:
La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a distintas moléculas.
Los fundamentos fisicoquímicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna.
La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada uno de los
cuáles tiene una energía:
Efotón = h⋅ν = h⋅c/λ
Donde: c= velocidad de la luz
ν= frecuencia
λ= longitud de onda
h= 6.6 x 10 -34 J⋅s (Constante de Planck)
Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda λ, esto
significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de
onda.
Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado
espectrómetro, constan de una fuente de luz “blanca” caracterizada por un espectro
de emisión continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda (en nuestro caso
325 nm-900 nm) y de un monocromador que actúa como filtro óptico transmitiendo un
haz de luz de longitud de onda fija λ e intensidad I0. Este haz de luz penetra en la
cubeta de análisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide
la intensidad del haz a la salida If.
ESPECTROS DE ABSORCIÓN:
Los compuestos tienen espectros de absorción en la región visible y ultravioleta, esto
hace posible la identificación de dichos materiales en una mezcla. Por ejemplo, las
proteínas: los aminoácidos triptófano y tirosina absorben a 280 nm por lo tanto esto
es la base o fundamento de una técnica muy sensible para determinar proteínas sin
que se destruya la muestra. Las proteínas también absorben en el ultravioleta lejano,
debido a los enlaces peptídicos.
La diferencia del espectro de absorción de cada molécula nos permite
diferenciar sus componentes y comprender la diferencia entre un
espectrofotómetro y un fotómetro o fotocolorímetro.
Comprendiendo que la diferencia básica consiste en que mientras en el
espectrofotómetro se utiliza un prisma que le permite identificar una longitud de
onda exacta un fotómetro utiliza filtros y por lo tanto la lectura se realiza en el
rango que presenta el filtro estos rangos se basan en las regiones del espectro
de luz.
Como utilizar un espectrofotómetro
o fotómetro para la medición de una
determinación en Química Clínica
La luz blanca que emite la lámpara se hace pasar a través de un prisma, el cual
descompone la luz, separándola en sus colores constituyentes (según su longitud
de onda), formando un abanico de colores. Para cada cifra programada
corresponde diferente color. El rayo de luz es dirigido hacia una rejilla metálica
(monocromador), por la cual podrá pasar la luz del color que en ese momento se
haya escogido. Simultáneamente, cuando cambia el color, aparece en la ventana
de lectura la longitud de onda del color que estamos usando.
LEY DE BEER: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que
la concentración del medio absorbente aumenta.
LEY DE LAMBERT: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de
un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a
medida que la longitud del medio absorbente aumenta.
La combinación de ambas leyes puede expresarse en forma integral de
la manera siguiente:
Io (Luz inicial antes de atravesar la
muestra)
I (Luz luego de atravesar la
muestra)
e (Coeficiente de absortividad
molar)
C (Concentración molar)
L (Longitud de la cubeta)
Donde “Io” es la intensidad de la luz incidente (que va llegando a la cubeta óptica), “I” es
la intensidad de la luz emergente o transmitida (que atravesó la cubeta óptica y se dirige
a la foto celda), “e” es el coeficiente de absorción molar (en unidades de litros por mol por
cm.) el cual varía según la naturaleza específica de cada sustancia, “C” la concentración
de la especie absorbente en moles por litro y “L” (longitud = 1cm), el espesor de la muestra
absorbente en centímetros.
La Ley de Beer-Lambert supone que la luz incidente es paralela y monocromática
y que las moléculas del solvente y el soluto están orientadas al azar, de manera
uniforme.
La expresión log (Io / I) se denomina “ABSORBANCIA” y se designa por A. Es la
base matemática que permite calcular cuánta energía puede haber sido
absorbida por la sustancia que se estudia. Es importante observar que cada
milímetro de espesor de una solución absorbente en una cubeta óptica de 1.0
cm. (medida estándar de todas las cubetas que usaremos en nuestras prácticas
de laboratorio) no absorbe una cantidad constante de la luz incidente. Sin
embargo, con una capa absorbente de espesor constante (como será nuestro
caso cada vez que hagamos uso del procedimiento fotométrico), la absorbancia
(A) es directamente proporcional a la concentración de la solución absorbente.
CONSIDERACIONES PARA LA INSTALACIÓN DEL FOTOCOLORÍMETRO
Identificar los métodos de medición que dispone tu equipo:
Cinético con chequeo lineal
Cinético con chequeo lineal y blanco de reacción
Cinético de dos puntos con y sin reactivo blanco
Punto final con y sin reactivo blanco
Punto final Bicromático con y sin reactivo blanco
Punto final con blanco de reacción, con y sin reactivo blanco·
En qué condiciones deberá ser instalado, ejemplo: Sistema eléctrico: 110-240 VAC,
50-60Hz, 100 VA máx. Otros: Mesa estable, no permitir la entrada directa de los
rayos del sol, el equipo no debe estar expuesto a vibraciones, temperatura del
ambiente: 10 -35 ° C, máxima humedad relativa: 80 %
El usuario debe disponer de la siguiente documentación:
• Copia del acta de Entrega
• Factura o guía de Compra
• Procedimiento de mantenimiento Preventivo
• Cronograma del Mantenimiento Preventivo
• Datos del proveedor
• Manual de uso del equipo
• Capacitación del uso del equipo (documentada
También se debe conocer las verificaciones necesarias, así como su frecuencia
programada según el uso previsto:
• Control de la exactitud de la longitud de onda: Grado de concordancia entre la
longitud de onda que indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia
requerida. Se expresa en nm.
• Exactitud fotométrica: es el grado de concordancia entre la absorbancia real y la
absorbancia medida. El error cometido al leer una absorbancia respecto de una
de referencia se denomina entonces “inexactitud fotométrica”.
• Control de la Linealidad Fotométrica: Capacidad de respuesta lineal de un
espectrofotómetro a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla la
ley de Beer.
• Control de la presencia de luz parásita: Se denomina luz parásita a toda
radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el
monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada por el
instrumento.
• Control de la Precisión Fotométrica: Se denomina precisión fotométrica a la
medida de la dispersión de una serie de mediciones de transmitancia o
absorbancia alrededor de la media y se expresa como coeficiente de variación
porcentual.
• Control de la Estabilidad Fotométrica: Se denomina estabilidad fotométrica a la
capacidad del instrumento de mantener constante la absorbancia en función del
tiempo. Cuando se producen variaciones constantes y continuas hacia valores
superiores o inferiores de absorbancia se habla de deriva fotométrica y cuando
se producen variaciones al azar se está en presencia de ruido fotométrico.
Además de una ficha de identificación del equipo:
CUESTIONARIO
1. Levante la información del equipo que se le asigne en la clase práctica y elabore
su Ficha técnica.
2. Elija un inserto de algún analito de química clínica e identifique todas las
definiciones explicadas en la presente guía.
BIBLIOGRAFÍA
• Pilar Roca, Jordi Oliver y Ana M. Rodríguez. Bioquímica. Técnicas y Métodos.
Madrid. Editorial Hélice (2003)
• Anderson, SC y Cockayne, S. Química Clínica. México. Interamericana /
McGraw-Hill. (1995)
• González de Buitrago, JM, Ferreiro, EA., Rodríguez-Segade, M. y Sánchez,
PA. Bioquímica Clínica. España. McGraw-Hill / Interamericana. (1999)
• Skoog, D., Holler, J. y Nieman, TA. Principios de Análisis Instrumental.
España. McGraw-Hill. (2001)
• Carl A. Burtis y David E. Bruns. Tietz Fundamentos de Química Clínica y
Diagnóstico Molecular. Brasil. Elsevier (2016)
