UNIDAD DIDACTICA 5
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
GENERALIDADE
S SOBRE
HIBRIDACIÓN
Unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, por complementariedad de
su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria.
Detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) mediante el empleo de
fragmentos complementarios o sondas que se marcan para poder ser visualizados.
Secuencia diana
Sonda
Muestra problema 3
Muestra problema
Secuencia diana: secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema
Sonda: secuencia de bases nitrogenadas complementaria a la secuencia diana
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CONCEPTOS DEL PROCESO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
DESNATURALIZACIÓN RENATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN
Separación de las dos cadenas de una Dos cadenas de una molécula de ADN Formación de un híbrido
molécula bicatenaria de ADN por completamente separadas mediante sonda/secuencia diana. Tiene las
ruptura de los puentes de hidrógeno desnaturalización térmica vuelven a mismas propiedades que una molécula
entre las bases nitrogenadas reasociarse hasta formar la doble hélice bicatenaria de ADN en cuanto a
complementarias. original. desnaturalización y renaturalización.
[Link]
[Link]
[Link] 5
• Los ácidos nucleicos tienen su pico máximo de absorción a la longitud de onda de 260 nm.
• Los ácidos nucleicos de cadena simple absorben mayores cantidades de radiación de 260 nm que los de doble cadena.
• El ADN desnaturalizado (dos cadenas simples por separado) absorbe más radiación de 260 nm que el ADN en
conformación nativa/“natural” (doble hélice).
ZONA A
Tramo recto, sin pendiente
Amáx
La Tª no alcanza un valor suficiente como para romper
puentes de H y desnaturalizar una doble hélice .
DESNATURALIZACIÓN (%)
ABSORBANCIA
Amáx
T temperatura de fusión
m
T ZONA C
Tramo recto, sin pendiente
m
TEMPERATURA (ºC) La A se mantiene constante aunque aumente la Tª.
El ADN se mantiene desnaturalizado al 100%.
PROFUNDIZANDO SOBRE TEMPERATURA DE FUSIÓN (Tm)
Tm (melting point) = temperatura de fusión
Tª donde el valor de A es la mitad entre el valor basal y el valor máximo 🡪
50% ADN desnaturalizado
¿Cómo varía la Tm?
DESNATURALIZACIÓN (%)
• Moléculas de menos de 500
ABSORBANCIA
pb: a mayor longitud, mayor
Tm
Para alcanzar un 50% de
desnaturalización, cuanto más larga sea la
molécula más temperatura se habrá de
aplicar.
• Moléculas de más de 500 pb:
Tm a mayor %G-C, mayor Tm
TEMPERATURA (ºC) Para alcanzar un 50% de 7
(condiciones de hibridación)
Las condiciones en que se lleva a cabo la hibridación determinan la
unión entre los ácidos nucleicos de la muestra y la sonda.
RESTRICTIVAS PERMISIVAS
Solo se unirán secuencias Se pueden unir secuencias
completamente homólogas parecidas, no totalmente idénticas
• FUERZA IÓNICA [sales]: fuerza iónica alta estabiliza la unión de secuencias parecidas.
*Los cationes monovalentes en solución neutralizan las cargas negativas de los fosfatos, consiguiendo estabilizar el híbrido.
Si aumenta la fuerza iónica, aumenta la estabilidad, aumenta la Tm
• AGENTES DESNATURALIZANTES: desestabilizan los puentes de hidrógeno y facilitan la ruptura del
híbrido. Ejemplos: dimetilsulfóxido (DMSO) y formamida.
Si hay agentes desnaturalizantes, disminuye la estabilidad, disminuye la Tm
• % BASES NO COMPLEMENTARIAS (mismatch): la formación de híbridos imperfectos (secuencias
parecidas, no iguales) supone menor nº de puentes de H, y el híbrido es menos estable.
Si hay mismatch, disminuye la estabilidad, disminuye la Tm
CARACTERÍSTICAS DE LAS SONDAS
• ESPECIFICIDAD: capacidad de una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que
🡪
hibridar. MÍNIMO 16 BASES secuencias inferiores a 16 bases tienen una elevada probabilidad de
encontrarse repetidas aleatoriamente a lo largo del genoma (hibridarían inespecíficamente).
• SENSIBILIDAD: probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-secuencia diana, y va
en relación al número de moléculas marcadoras que lleva la sonda.
TIPOS DE SONDAS
Sondas de ADN Sondas PNA
son ++++ sensibles
Sondas de ARN Sondas LNA
(ribosondas) son ++++ sensibles
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Sondas PNA Sondas LNA
Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) son Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) son
oligómeros sintéticos donde se sustituye el oligómeros sintéticos de ribonucleótidos
esqueleto azúcar-fosfato unido mediante donde se forma un enlace de oxígeno entre
enlaces fosfoéster es sustituido por un los carbonos C2 y del C4 de la ribosa.
esqueleto de aminoetil-glicina unido por
enlaces amida. Se mantiene la base
nitrogenada.
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DETECCIÓN DIRECTA DEL HÍBRIDO
• Sondas marcadas con isótopos radioactivos
Los isótopos radioactivos son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones.
Lo más habitual es usar 32P, que se incorpora a los nucleótidos de la sonda formando el grupo fosfato.
• Sondas marcadas con moléculas fluorescentes
Los fluorocromos son compuestos químicos que emiten luz de color al ser excitados por radiación UV.
Lo más habitual es usar fluoresceína o rodamina incorporada en un sitio de la base nitrogenada de la
sonda que no interfiera con la formación de puentes de H.
• Sondas marcadas con enzimas
Las enzimas son proteínas que catalizan una reacción química.
Lo más habitual es usar la fosfatasa alcalina y la peroxidasa, las cuales incorporadas a los nucleótidos
de la sonda catalizan una reacción que produce un producto cromogénico.
DETECCIÓN INDIRECTA DEL HÍBRIDO
• Sondas marcadas con haptenos
Los haptenos son moléculas de pequeño tamaño que se revelan aplicando sobre ellos métodos de
acoplamiento de moléculas de afinidad química o métodos inmunológicos.
Lo más habitual es usar digoxigenina o biotina.
Todas las técnicas de hibridación se pueden dividir en cuatro fases
genéricas:
1. PREHIBRIDACIÓN: preparación de la muestra y el soporte.
2. HIBRIDACIÓN: formación del híbrido sonda-secuencia diana.
3. LAVADO DE POSHIBRIDACIÓN: eliminación de híbridos imperfectos.
4. DETECCIÓN DEL HÍBRIDO: detección de híbridos específicos a través del marcaje de
la sonda.
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TÉCNICAS
DE
HIBRIDACIÓN
• SOUTHERN BLOT Secuencia diana
• NORTHERN BLOT fijada al soporte
EN MEDIO SÓLIDO
• DOT BLOT
Una de las moléculas implicadas (sonda Sonda fijada al soporte
o diana) se inmoviliza sobre un soporte • MICROARRAYS
sólido previo a la hibridación.
• TÉCNICA DE CAPTURA DE HÍBRIDO
EN MEDIO LÍQUIDO
• TECNOLOGÍA DE ADN RAMIFICADO
El híbrido sonda-diana se forma en
solución dentro de una placa
microtiter. Para su detección se fija a la
pared del pocillo.
• FLUORECENTE (FISH)
IN SITU • CROMOGÉNICA (CISH)
Permiten detectar y localizar secuencias
de ácidos nucleicos sobre cromosomas
metafásicos, células y tejidos.
En medios sólido y líquido es
indispensable purificar los ANs. 14
HIBRIDACIÓN DE TIPO SHOUTHERN BLOT la secuencia diana es ADN
PREHIBRIDACIÓN:
A) El ADN es digerido con una o
varias enzimas de restricción en
pequeños fragmentos y es
desnaturalizado con NaOH. Estos
fragmentos son separados por
electroforesis en gel de agarosa.
B y C) El ADN separado en el gel se
transfiere a una membrana de
nailon por capilaridad.
HIBRIDACIÓN (D): La membrana de
nailon se incuba con la sonda APLICACIÓN
marcada, normalmente con Detectar cambios que afectan a fragmentos
radioactividad (radioisotopos 32P). producidos por la digestión (mutaciones que
LAVADO POSHIBRIDACIÓN: Se lava crean o destruyen sitios de restricción),
la sonda no unida obteniéndolos por separado.
DETECIÓN DEL HÍBRIDO (E): Se
realiza la detección por
autorradiografía.
HIBRIDACIÓN DE TIPO NORTHERN BLOT la secuencia diana es ARN
Protocolo idéntico al anterior, a excepción de que en la APLICACIÓN
PREHIBRIDACIÓN no se realiza una restricción enzimática. Estudiar la expresión génica: si un determinado gen se
¿Por qué? Son fragmentos cortos de ARNm. expresa o no (si es trascrito a ARNm se expresa),
obteniéndolo por separado.
[Link]
HIBRIDACIÓN DE TIPO DOT BLOT la secuencia diana es ADN o ARN
Protocolo simplificado respecto a los dos anteriores 🡪 en la PREHIBRIDACIÓN:
• En el caso del ADN, no se realiza una restricción enzimática
• En ningún caso, no se realiza una separación electroforética
Sino que se deposita toda la muestra de ANs sobre la membrana de nailon directamente directamente.
APLICACIONES
Realizar un screening o rastreo de secuencias de interés:
-Como en el Northern Blot se puede estudiar la expresión génica, pero en este caso solo de forma cualitativa.
- Detectar secuencias extrañas en muestras biológicas de forma cualitativa (presencia de virus, bacterias o parásitos).
En ningún caso se obtienen los híbridos sonda-diana de forma diferencial.
EJEMPLO DOT
BLOT
La primera fila muestra ocho círculos en los que se hace
caer una gota de ADN de ocho individuos distintos (en su
interior está la secuencia diana).
Se pretende conocer los dos alelos (heredados de
padre y madre) que presenta cada individuo para un
gen.
En la segunda fila se muestra la incubación con una sonda
cuya secuencia es complementaria a la forma alélica
sana. Solo se detecta marcaje por formación de híbrido
sonda-diana en cinco de ellos.
Los individuos 1, 2, 4, 5 y 7 poseen al menos un alelo sano
para dicho gen.
En la segunda fila se muestra la incubación con una sonda
cuya secuencia es complementaria a la forma alélica
mutante. Solo se detecta marcaje por formación de
híbrido sonda-diana en cinco de ellos.
Los individuos 1, 3, 4, 6 y 7 poseen al menos un alelo
mutante para dicho gen.
¿QUÉ INDIVIDUOS POSEEN DOS FORMAS ALÉLICAS SANAS, CUÁLES MUTANTES Y CUÁLES UNA SANA Y UNA MUTANTE?
MICROARRAYS la secuencia diana es ADN o ARN
Array es una cuadrícula formada por puntos/pocillos, cada uno de los cuales posee una sonda distinta fijada al soporte.
• Cada array posee una colección completa de sondas.
• En un mismo chip pueden haber distintos arrays.
Se pueden analizar muestras de ANs distintas según el número de arrays que posea el chip. En cada array se inocula una
muestra distinta, para la cual se analiza la presencia de tantas secuencias diana como sondas haya en la colección del
array.
Un microarray detecta simultáneamente miles de secuencias distintas en una
muestra de ANs realizando un único proceso de hibridación.
DIFERENCIAS respecto técnicas de blotting
1. Sonda fijada al soporte (siempre ADN) | En cambio, en las técnicas de blotting se fija la secuencia diana al soporte
2. Secuencia diana con el marcaje | En cambio, en las técnicas de blotting se marca la sonda
APLICACIONES
Hibridación genómica comparada: permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en
pérdida/ganancia de material genético por comparación del ADN de una muestra (secuencia diana) con
un ADN de referencia (sonda).
Estudiar la expresión génica: si un determinado gen se expresa o no (si es trascrito a ARNm se expresa),
obteniéndolo por separado.
EJEMPLO
MICROARRAY
Si se quiere estudiar qué genes se expresan más en un tumor
que en células normales…
1. Se obtiene ARNm de las dos formas celulares: ARNm de
células tumorales y ARNm de células sanas.
2. El ARNm se retrotranscribe a ADNc (ADNcodificante).
3. Estos ADNc se marcan fluorescencia: ADNc de células
tumorales con fluoroforo rojo y ADNc de células sanas con
fluoróforo verde
4. Se mezclan cantidades iguales de ADNc de tumor y sano.
5. Se usa un array con una colección de sondas
complementarias a todos los ADNc expresados, en células
tumorales y sanas.
PUNTOS ROJOS: en la muestra tumoral habrá mayor
expresión para ese gen🡪 se formarán más híbridos
ADNc-sonda que ADNc-sonda.
PUNTOS AMARILLOS: en ambas muestras (tumoral y
PUNTOS VERDES: en la muestra sana habrá mayor sana) no habrá diferencia de expresión para ese gen 🡪
expresión para ese gen🡪 se formarán más híbridos se formarán híbridos ADNc-sonda y ADNc-sonda por
ADNc-sonda que ADNc-sonda. igual, la mezcla de colores es amarilla.
HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH) la secuencia diana es ADN o ARN
In situ: la secuencia diana se va a localizar en el sitio en que se
encuentra fisiológicamente: CROMOSOMAS METAFÁSICOS, NÚCLEOS
INTERFÁSICOS, EXTENSIONES CITOLÓGICAS, FFPE.
• Si el marcaje de la sonda es cromogénico 🡪 CISH, se visualiza con microscopio de campo claro (A)
• Si el marcaje de la sonda es fluorescente 🡪 FISH, se visualiza con microscopio de fluorescencia (B)
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APLICACIONES
Identificación de cromosomas: combinando el bandeado cromosómico (citogenética) + FISH se
pueden generar patrones polimórficos para identificar y diferenciar cromosomas.
Técnica GISH: modificación de FISH que permite colorear cada cromosoma parental (por
parejas homólogas) de forma distinta, para tratar de dilucidar el origen de especies.
Mapeo físico de secuencias de ADN: localización de secuencias específicas.
Detección de aneuploidías y traslocaciones
TÉCNICA GISH MAPA DE SECUENCIAS 21
EJEMPLO CISH(A)/FISH(B)
Corte de tejido tumoral donde se busca el número de
genes (por amplificación) C-MYC.
- En verde/azul: se marca el centrómero del
cromosoma 8 (normal = dos CRH8 = dos marcas por
célula)
- En rojo: se marca cada forma génica C-MYC (normal
= dos alelos para un gen, uno en cada CHR8 = dos
marcas por célula)
El exceso de color/fluorescencia roja indica que el
gen C-MYC está amplificado.
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PROTOCOLO GENERALIZADO para FFPE
PREHIBRIDACIÓN
1. Desparafinado (xilol) + rehidratación (alcoholes de gradación decreciente hasta agua.
[Link]ón enzimática con proteasas (proteinasa K), para liberar los ANs de histonas (ADN) y
otras proteínas = permeabilización del tejido
HIBRIDACIÓN
3. Sobre la preparación se depositan unas gotas (5 μL) de sonda marcada.
[Link] de la preparación a 95ºC durante 5-10 minutos 🡪 Tª elevada = favorece la
desnaturalización de ADN (para secuencias de ARN no es necesario)
[Link] a Tª ambiente para la formación de híbridos sonda-diana🡪 Tª baja =
favorece la renaturalización de ADN (con la sonda)
LAVADO POSHIBRIDACIÓN
6. Inmersión de las preparaciones en solución de lavado.
¡¡CONTRATINCIÓN!!, para analizar el resultado en su contexto morfológico
- DAPI: tinción fluorescente azul de núcleos (FISH)
- Hematoxilina de Mayer: tinción violeta claro de núcleos (CISH)
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La amplificación del gen HER2 viene dado por el ratio entre:
• El número de señales de hibridación del propio gen HER2, que aparece con un marcaje rojo.
• El número de señales de hibridación del centrómero del cromosoma 17(CEN17), que aparece en azul.
¿Cuál está amplificada?
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