PRACTICA No 3
DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN
Procedimientos:
Preparación de la fuente enzimática (Polvos acetónicos):
Los hígados recientemente extraídos de 4 pichones son homogeneizados en 10 volúmenes de
acetona fría durante un minuto, luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo obtenido es
secado a temperatura ambiente obteniéndose así polvos secos, fáciles de conservar.
El día de la práctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetónicos con 7 ml de agua
destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta el
sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada.
La acetona por su acción deshidratante facilita la extracción de enzimas de los tejidos. En esta
forma la acetona reduce la desnaturalización de las (enzimas) proteínas y concomitantemente
produce la desintegración de las estructuras celulares y la disrupción de los enlaces
lipoproteicos.
Preparación del experimento de la transaminación.
En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HNO3 concentrado, medir
lo siguiente :
SISTEMAS
REACTIVOS I II III IV
Alanina 0.05 M 0,2 ml - - -
Glutamato 0.05 M - 0,2 ml - -
Aspartato 0.05 M - - 0,2 ml 0,2 ml
alfa-cetoglutarato 0.1 M 0,2 ml - 0,2 ml 0,2 ml
Piruvato 0.1 M - 0,2 ml - -
Extracto enzimático 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml -
Extracto enzimático hervido - - - 0,2 ml
Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en baño maría a 37 oC durante una hora
Identificación de los productos de la reacción por cromatografía en capa fina :
Cada grupo dispondrá de una placa de vidrio con Silica Gel, de 200 x 200 mm, en la que se
han marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de
25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de experimento y tres
para los tres estándares de : Alanina, Glutamato y Aspartato. Estos sistemas estándares
deberán ser preparados de la siguiente manera:
Medir 0.2 ml del Aminoácido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que previamente se
encuentra a concentración 0.05 M y agregar 0.8 ml de agua.
PUNTOS DE ORIGEN
Muesta o Estandar Estandar Estándar
Sistema No 1 2 3 4 Alanina Glutámic. Aspártico
Rf x 100
Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 10 ul
de cada sistema incubado y 2 ul de las soluciones estándar de aminoácidos en alícuotas de no
más de 1 ul cada vez, dejando secar cada área después de cada aplicación. Al final, colocar la
placa en la cámara cromatográfica conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenol y 25 de
agua.
La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la línea marcada a 10 cm de los
puntos de origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 ºC por 3 minutos, y
revelar el cromatograma rociando una solución de ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado
con agua y luego dejarla secar. La representación esquemática de los resultados obtenidos
luego de revelar el cromatograma se muestra en la página siguiente.
EXPERIMENTO 2
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA
(TGP) EN SUERO SANGUINEO
Procedimiento:
REACTIVOS
R1 Tampón TRIS pH 7,8 Lactato deshidrogenasa (LDH) L-Alanina 100 mmol/L 1200 U/L
500 mmol/L
R2 Substrato NADH α-Cetoglutarato 0,18 mmol/L 15 mmol/L
1. PREPARACIÓN del Reactivo de trabajo (RT):
a) Mezclar: 0.5 ml. de (R2) Substrato + 2 ml. (R1) Tampón.
b) Pipetear en un tubo, mezclar, incubar 1 minuto.
2. Condiciones del ensayo:
a) Longitud de onda: . . . . . . . . . .. 340 nm
Cubeta:. .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . 1 cm paso de luz
Temperatura constante . . . . . . ...37ºC
Colocar en una cubeta las soluciones preparadas y llevar al espectrofotómetro
Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la
absorbancia cada minuto durante 3 minutos.
