< casH FLow TÉ CNICAS INS TR UIIIENTAL ES
TEMA 8
Técnicas de neütralización
Se basan en la nedida de la capacidad que tienen
algunos anticuerpos para neulraliza¡ el efecto tóxico de
El inmunoanál¡is utiliz , en general, al a¡ticuepo los microoÍganismos.
como reactivo pam cuanrifica¡ las concent¡aciotes de Se prcparan diluciones del suero problema inactivado
anfgeDo. (cale¡tamiento a
56 'C) y
se incuban con el
Dos camct€risticas de los a¡ticue¡pos son miüoorganismo (generalmente virus) en las
condiciones apropiadas. Después se inocula ¿n
o Especificidad: s€ refiere a la capacjdad de un animales de experimentacjón una cantidad igual de
a¡ticüerpo para recoDocer a más de un antigeno.
o A¡¡jC¡d: s€ deñne corho la tue¡za de una sola Los resultados se evalúan a partir de la evolución del
unión antlgeno-anlicuerpo. Cuando el antiSeno es animal de experim€ntación
multivalenle se habla de avidez, que depeDde de la
afinidad de cada una de las uniones pero es mayo¡ Técnicas con reactivos msrcados
que la suma de estas,
l. Enzinoi¡munoanálisis (EIA)
2. Inmunofluorescenci¿
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS 3. Rádioinmunoanálisis (RIA)
INMIJNOLÓCICAS
Técn¡cas de precipitacióÍ en gel
L lnmunoditusión doble (IDD)
2. I'ununoelecb-oforesis (IE) La formación de inmucomplejos oridna un reticulado
3- Coniainmu¡oelectroforcsis (CIE) que puede exterioriza¡se por prccipitación si su tamaño
es sufici€¡ie. La precipitación es máxima cüando el
Técnicas de aglütinación a¡tigeno y
el anticuerpo están en co¡centraciones
simila¡es y se i¡¡ibe por exceso d€ antigeno (y de
1. Aglutinación diecta anticuerpo, aunque menos frecuentemente):
2. Hemagluti¡ación
3. Aglutinación en iátex Puede realizars€.
Técnicas d€ fijación del conrplemento 1 En gel. Se originan líneas o a¡cos de
precipitación sobre el gel que faciiitan
Estas pruebas se ¡ealiza¡ en dos etapas:
. Prüneroi Se incuba el suero probl€ma (calentado 2. Tienen una aplicación tundamentalmente
preüamente par¿ inactivar el complemento) con el cualitativ4 aunqu€ la inmunodifrsió¡ radial
simple (IDR) es una técnica muy ütilizad¿ en
antígeno problema y üna cantidad conocida de
la cua¡tiñcación de a¡ticuerpos séricos.
conplern€nto (de cobaya).
. S€gu¡do: Se añad€ el sistema indicador (glóbulos
rojos sensibiiizzdos con el a¡ticuerpo). TNMUNODIFUSIÓN DOBLE (IDD, Oüchlerlony)
Si en el suero del paciente existen anticuerpos el Es unatécnica de precipitación en gel-
complemento se consume en la primera etapa y Do se Consiste en poner soluciones de antig€no y anticuerpo
p¡oduce la lish de los eritrocitos. Prueba positiva. en pocillos separados dispuesros eD una placa de aga¡.
Si en el süero del paciente no existen anticuerpos €l El aígeno y el anticuer?o difinden atavés del r¡edio
complemeDto no se consume en la primera fase y se y forma¡ ii¡eas de precipitación, La iDtensida4 forma
producc la lisis de los hehaties. Prueba negativa. y localización (próximas al pocii¡o que esté a en menor
Estas p¡uebas se rcaliz n pa¡a el diagnóstico de concentración ¡elativa) de estas llneas nos infoma de
¡ubéol4 citomegalovi¡us (CMV), etc. ia natuIaleza y concenFación de anticuerpo.
C/ Montess, 20 - 28006 MADRID -Tfno: 9r 309 36 46 - [Link]-oposicion€[Link] i8
M CASH FLOW r É cut c.¿s tNs rn uaz¡v rtt es
Se utiliza pa¡a enfrentar un antige¡o a distinros resto de p¡opiedades.
anticuerpos y viceversa. La IgM es mejo¡ anticuerpo aglutj¡ante que la Igc.
En u¡ pocillo central se coloca el antigeno a esrudia¡ y Para la realizaciór práctica de estas pruebas es
en los demás pocillos, situados en disposición ¡adiat, necesa¡io conside¡a¡ los siguientes aspec¡os:
los distintos anticuerpos o disainras dilucio¡es de un
mismo a¡ticuerpo (titulo). Cuando se alcanzan las L Se deben emplear diariamenle conrrole, posiri!os y
propo¡ciones óptimas aparcce u¡a linea de negativos. En las suspensiones de látex se deben
precipitació¡. realiza¡ pruebas mezcla¡do estas con solución
calina y observando si exisre o no aglurinacion.
INMUNOELECTROFORESIS (IE) 2. Todos los ¡eactjvos deben €star a temperatura
Es una electroforesis segr.¡;da de una i¡.'nunodifusión. 3. Pueden producir falsos posirivos:
L La fase inicial consiste en realizar una
. Sueros conraminados, muy lipémicos o con
electrofo¡esis sobre el sue¡o del paciente. Esro gran canridad de fibrinóqeno.
permite la sepaÉción de las prorelnas séricas , Contaminación bact€¡iana de las
y
en gener¿I, anticuerpos en partjcular, en suspensiones, muesrras o solución salina.
fuDción de su carga eléctrica_ EI suero se
. AutoagluriDación de las soiuciones
deposita sobre los pocillos det get. antigénicas (po¡ bajas remperaruras).
2. La segunda fase consiste en la adición de un 4. Pueden producir falsos negativos:
anti-ariticuerpo (o anrigeno) especlfico. S€
forma un arco de precipitación cua¡do el , Suspensionesant:genicdscaducadas.
anticuerpo y al antianticuerpo (o antigeno) . Pacie es con tratamienro aniibiótico.
especificos difu¡den y alca¡zan la zona de
. Infecciones precoces o individüos
equivalencia. i¡munodeprimidos.
3. El anti"anticuerpo (o antígeno) se deposjta en
los surcos del ge¡
TIPOS DE AGLUTINACIÓN
Tiere aplicación en el esrudio de la hidaridosis. Se
realiza una IE del suero del paciente tente al a¡ltigeno AGLUTINACIÓN EN TUBO
hjd¿tÍdico. La aparición del arco 5 se consider¿
especilico de la hidaiidosis. Prueba de Widal: Es una prueba muy utilizada en el
diagnorico de fiebrc se origen desconocido y
e¡fermedades entéricas.
CONTRAINMI]NOELECTROFORESIS (CIE) Se mezclan diluciones seriadas de suero con a¡rtseno
problema conplero {anrigenos H y Or. Tras un pe;odo
Es una irünunodifusión dobte en el seno de un campo de incubación se lee la dilució¡ más alta donde €xista
eléctsico. aglutinación.
LI anliSeno (nomalmenre con carga neg¿tjvar y el
AplicacióD: estudio de salmonelosis y brucerosis.
anllcuerpo rnormajmenre con carq" posiliva, se siru¿n
en dos pocillos forzándose su mig¡ación por acción de Prueba de Weil-Felix: Es lna pmeba utilizada en €l
u¡ canpo elécFico. En el punto de equivatencia se estudio dc infecciones por rickeísias.
origma úa Iinea de inmunoprecipitación. Se emplea de una suspensjón de antlgeno jncompleto.
Tieoe aplicación €n la derección de antieenos 6enre A determinadas c€pas de Proleus se les elimi¡a el
estreprococos del gnpo B. Haemophijus innuenzae, anrígeno H tProEus OX,. Las rickensia, [Link]
elc. Su uso está descendienrlo reacción cruzada faglulinación posiriv¿) con el
antigeno O de estas cepas.
3. RXACCIONES DE AGLUTINACIóN Aglütinación del lntigeno Vi
AGLUTINACIÓN EN PORTA: Permite un
FTNDAMENTO. ASPECTOS PRÁCTICOS diagnóstico rápido.
Son re¿cciones que difieren de la precipiración en el Aglutinación en porta con suspensio¡es de látex: Se
lamaño del antigeno (o anricLrerpot que es paniculado.
emple¿n para e¡ diag¡ósüco de cienas infecciones
La formacion de inmunocomplejos es visjble a sinple febriles coño la salroDelosir ) l¿ brucelosi(.
vista, por lo que son mucho más sensibles que las Ios sueros se e¡sayan fenLe a Ios anligenos Droblema,
reacciones de precipjtación, pe¡o simila¡es a ellas en el
la presencia de aglurinación ind c¿ qi. t" p-.t" .,
C/ Montesa,20 - 28006 MADRID - Tfno: 9l 30S ¡e ¿r - w,nw.";shn;;;;i";;;;; 39
E CASH FLOW rÉ c Nt c¿,s INs rnuan Nrtt e s
positiva. Es una prueba de delec(ión selectiva e" la
fase aeuda de Ia enfermedad Si el suero contiene anticuerPos
Rosa de Bengrla: Se emplea como an!ígeno una reaccionan coD el antlgeno Y no se produce
l
susDensión de brucellas (PH de 6) teñid¿< con rosa de aglutinación. Reacción positiva-
Be¡gal¿. Es úril para el
d;agnósLico ráPido de Si el suero Do contien€ anticuerPos antiviricos los
brucelosis debido a que tiene muy Pocos falsos hematles aglutinan. Reacción negativa.
positjvos y negativos.
CoNGLUTINACIÓN (CoA): La téCniCA d€
.oaslurinación más utiliada es la est¿filocócica Se
AcLUTh{AclóN MICRoTITER
..fr.u putu Ia jdenrificación de gonococo y
HaemoDhilus influenzae
Se emDlean como antlgenos suspensiones inactivadas'
y
coloreadas. Son útiles para el A u¡a suspensióo del anligeno se le aiade una
nor-uiirrdu, en¡iquecida con protema A
diag¡óstico d€ infec€io¡es tificas' Pa¡atificas y susDensión de erafilococos
brucelosis,
(qu; fiia al estafilococo lgc por la Éacc¡óD constante
Requierer müy poca caltidad de müestra y Ia d¿iando libre el delerminante antigetico). La presen€ia
aglutinación se obs€n'a fácilmente. de coaqlurinación indica que la prueba es positrva
I rÉ.ñ[Link] coN REACTfvos MARCADoS
AGLUTINACIÓN DIRECTA: SC PTOdUCE IA
aglutinación directa del microorganismo al añadir el ENZIMOINMUNANALISIS (EIA)
Se emplea en Ia ide¡tificación de los est¡eptococos Es la técnica innunoanalítica más usada actualmente
por su sensibilidad y sencillez.
Grupot. Se usa en gr¿n cantidad de deteminaciones cualitativas
(lepatitis, virus HIV, etc.) y cuantitativas (marcadores
HEMoAGLUTINACIÓN (HA): Los aDtigenos se f¡an
a hematies que aglutinan al añadi¡ el antjcuerpo. tumo¡ales. hormonas. etc.)
Detecta c¿¡tidades de anticuerpo inferiores a I Fglml. Se ca¡acteíza por utilizar un ma¡cador €nzimático
([Link], fosfatasa alcalina) €uya actividad info¡ma
Desv€Dtajas: Fijación poco homogénea Los hematies
de la concent-¿ción de antíge¡o (anticueryo).
se estabilizan con ácido tánico, slutaraldehldo o
fo¡malina.
EIA Het€¡oséneo IELISA)
AGLUTINACIóN EN LÁTEX (LA): LoS ANIIgCNOS SE
fijan a paficulas de látex que aglutinan al añadi¡ el Se realiza en fase sólida donde se une el andgeno o
articue¡po. a¡ticuerpo.
Ventajas: El tamaño y la forma de las pa¡dculas es Requiere ü¡a etapa de separación del reactivo nátcádo
constante. son biológicamente inactiYas y la estabilidad no unido.
de unión látex-antlgeno es total. Puede ser:
Se emplea en el diagnóstico de salúonelosis,
b¡ucelosis, infección poryersinia, etc. Competitivo
ASLO: Prueba d€ detección de aniicuePos anti
estreptolisi¡a oen el diagnóstico de una infección El antjcuerpo (eñ cantidad limitante) es adsorbido
activa por esEeptococo tipo A. sobre una fasc sóiida (tubo, pocillo, etc.). se añaden
simultáDearnente el antigeno problema y el antigeno
INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN GHA): marcado de forma que ambos compit€n por la unión al
Müchos virus tienen capa€idad pa¡'¿ aglutrnar hcmaties anticüerpo. Tr¿s la eliminación del antigeno no unido
humanos. En esta prueba se mide la capacidad de (lavado) se alade el süstrato d€l enzima.
inlibicióD de la HA por la presencia de anricue¡pos T¡as parar la
¡€acción se realiza una )ectura
a¡rtivficos en el suero, especaofotométrica, de forma que la conceñación de
El suero del paciente se i¡cuba coD la suspensión vtal producto fmal es inve¡sañente proporcional la a
y posteriormente se añade el sistema i¡dicado¡ concent¡ación de andgeno.
oo
(heñaties humanos).
YY -Y Y
Tfno: 9l 309 36 [Link]-oPosic io n€s'co m 40
C/ Montesa, 20 - 28006 MADRID - ¿6 -
[ü CASH FLOW TÉ CNI CAS INS TRUM EN TALES
No ColIlpetitivo CriPo Sándwich) anricuerpo marcado enziúaticamente (conjugado)- Se
welve a lavar y se añade el sust¡aio del enzima. Tras
Este tipo de ensayo es válido solo pam ¿ntig€nos parar la reaccjó¡ se realiza una lectura
(s¡ticuerpos) polivatentes. espectrofolométrica, d€ foÍna que la concenFación de
produclo final es proporcional a la concentración de
El anticuerpo en fase sólida está en exceso. Se anade el antígeno,
oc
antigeno problema Y trar lavar se aiade un segundó
.) co(t, ..-..
YY YY YY
rY^ AA
YY
f,IA Homoqóneo Tras un periodo de incubación se lava y se mide Ia
No requiere la sepamción del ¡eactivo marcado y no
lnmunonuorescenci¡ indirecla 0FI)
El tipo más común es el EMIT, ensayo competitivo El antfgeno unido a una lase sólida se incuba con
donde la actividad del enzima marcador se modifi¡a [Link] no marcado, Fas u¡ Periodo de incubación
por la unión del antlgeno al anticuerpo. La formacjón (fo¡mación de un inmunocomplejo no marcado) se
det i¡munocomplejo inactiva el e¡zima" por t¿nfo la anade un anti-aniicuerpo marcado con fluore<cerna.
medid¿ de actividad enzimática es inversañeñie
proporcional a la concenúación de anllgeno. Después de un nuevo periodo de incubaciór y nar
lavado se mide la fluorescencia.
W€stern Blot Polarización de fl uor€scencia
CombiDa ia elecüoforesis con el ELISA. Se basa en Ia disrinta polarjzación de fluorescenci¿ que
presentan una molecula pequeña tAgri y una gr¿nde
Los antígenos son p¡evi¿mente separados por
iae'-4.u.).
€lectroforesis (Page SDS) y transferidos ¿ la fase sólida
(membÉna de niaocelulosa) por acción de un campo Tras un ensayo de tipo comperitivo se mide Ia
eléct¡ico sobre la que se realiza un ELISA. pola¡ización de fluorescencia que ser¿ inrersamenle
propo¡cional a la co¡cenlxación d€ antígeno.
INMUNOFLUORESCENC1A (IF)
Estas técnicas utilizan un úarcado¡ fluorescente RADIOINMLNOANÁLISIS (}lA)
(Fluor€sceina). La preparación se observa e¡ un
microscopio de fl uorescencia. Estas técnicas utilizzn un matcador radjactivo ('?5D.
Distinguimos:
En el RIA clásjco competitivo, el antígeno problema y
Inmunoflüorescencia direct¡ (IFD) el aDtlgeno marcado compiteD en su unión a un
anticuerpo en fase sólida-
El antigeno, !¡ido a ü¡a fase sólida (portaobjetos,
esfera de vid¡io, etc.) s€ pone e¡ coniacto con el En la técnica IRMA un antlgeno inmovilizado compite
aDticuerpo ma¡cado con lluoresceina.
con el antig€no er su utión al anticuerpo marcado,
C/ Montesa,20- 28006 MADRID Tfno: 91 309 36 46 *\[Link]'[Link] 4l
- -
EO GAAH FLOTñ' TÉ CNI CAS INS TRAMEN TALE S
La er¡isión radiactiva cs i¡vc¡sama¡tc P¡opo¡cion¿l a
la concc¡f¿ció¡ dc entf8ano.
ED el RIA Do ¿ompctitivo, ¿l snticüctpo i¡movilizado
sc te aladc cl afil8cüo y polc¡lormcnto .l a¡ticuc¡po
úarcado,
Lr ¿misión ñdiactiva cs di¡€[Link] propo¡cionql ¿ l¡
conccntracióD dc ¡¡tigcno.
TÉC?,ncAS INSÍRAM ENTALES (TE,1A S)
C/ Montasg, 20 - 23006 MADRID - Tfnor 91 3{r9 36 46 - ww\[Link]¡[Link]
