Universidad de Guadalajara
CUCEI
Practica 4
PCR-RFLP
Amplificación del gen humano asociado a detección de PTC
Nombre: _____________________________ Equipo: ___ Grupo: ___ Cal: ___
Objetivo: Utilizar la técnica de PCR para amplificar la región que contiene un polimorfismo
asociado con la capacidad de detección del sabor de la feniltiocarbamida (PTC). Detectar mediante el
análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (en inglés “RFLP”) y
electroforesis, un polimorfismo asociado con la capacidad de detección del sabor de la
feniltiocarbamida (PTC).
Material
*Las muestras y los reactivos se deben mantener en frio hasta que se utilicen
Microtubo con mezcla de iniciadores (1 tubo para el grupo)
Tubo con 14µl dela mezcla para PCR (cada Equipo)
Un contenedor o gradilla con hielo
Un tubo eppendorf estéril de 1.5 ml con 5 µl de la mezcla de enzima Hae III (mantenerla en el hielo)
Equipo
• Termociclador
• MIcropipetas de 10µl, 100μl o 200μl
• Termoblock o Baño a 37º C
Procedimiento para PCR:
1. Marcar con su nombre o número el tubo y agregar 14 µl de la mezcla de PCR (mezcla taq)
2. Tomar 3µl de la mezcla de iniciadores y transferirlos con cuidado, dejando caer el líquido por
una pared al tubo marcado que contiene la mezcla de PCR
3. Tomar 3 µl del extracto obtenido en la practica 3 (DNA de células bucales) y transferirlos al tubo
marcado que contiene la mezcla de PCR (se puede mezclar con la misma pipeta o agitar levemente)
4. Tapar muy bien los tubos para que no se evaporen y centrifugarlos 2 sg
Los 3 µl de la muestra se deben tomar de la parte superior para evitar tomar perlas de
Chelex (inhiben la PCR).
5. colocarlos en el termociclador.
6. Arrancar el programa de amplificación de PTC (Tomar nota del tiempo de duración del programa)
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Procedimiento parar RFLP:
1. Marcar con su nombre o número el tubo con la mezcla de enzima Hae III
2. Transferir 5 µl del producto de PCR (el de la practica 4) en el tubo que contiene la enzima.
3. Centrifugar las muestras a 14,000 rpm durante 10 segundos
4. Colocar los tubos en el baño o termoblock a 37º C
5. Incubar de 30 a 60 minutos
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Reporte de la práctica
Calcule las condiciones finales de la reacción de amplificación con un volumen final de 20 µl
Reactivo [inicial] volumen [Final]
Buffer 10x 2µl
MgCl2 50mM 0.6µl
Iniciadores 10µM 0.4 µl
dNTPs 10mM 0.4 µl
Anote el programa de amplificación:
Desn. Inicial
Desnaturalización # Ciclos:________
Alineamiento
Extensión
Extension Final
Flujograma
Realiza un flujo grama del procedimiento realizado
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Observaciones:
Conclusiones:
Actividades
Para contestar las siguientes preguntas tendrá que buscar la secuencia que se amplifico utilizando Blast.
1. Mencione cual es el gen que se está amplificando (responsable de la detección del sabor del
PTC) y en que cromosoma se localiza
2. Mencione de qué tamaño es el producto amplificado
3. Investigue y anote ¿Cuál es el sitio que reconoce la enzima Hae III?
4.
Para buscar el gen que se amplifico
1. Ingrese al sitio [Link]
2. Seleccione la opción “nucleotide blast”
3. Ingresar cada una de las secuencias de los iniciadores en la sección “Primer Parameters” en las ventanas
correspondientes
Forward CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTG
Reverse AGGTTGGCTTGGTTTGCAATCATC
NOTA: Debido a las restricciones del programa, debe ingresar solamente las primeras 24 bases
del iniciador Forward
4. En la sección de “primer pair Specificity checking parameters” seleccione la base de datos apropiada, en este caso debe
ser “genome (chromosomes from all organisms)” o “Genome (reference assembly from selected organisms) “
5. En la siguiente hoja le dará los resultados de la búsqueda, presione (“click”) sobre el nombre del gen para obtener la
secuencia completa.
