UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA
Y PARASITOLOGÍA

Caracterización de bacterias del género Azotobacter

aisladas de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. y
su potencial como promotoras de crecimiento en plantas

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN

BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA - PARASITOLOGÍA

PRESENTADO POR:

Br. Anthony Smith Esqueche Berrú

Br. Genesis Abigail Quispe Sandoval

LAMBAYEQUE, PERÚ

2017
 Caracterización de bacterias del género Azotobacter
aisladas de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. y su
potencial como promotoras de crecimiento en plantas

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA - PARASITOLOGÍA

APROBADO POR:

Mblga. María Silva García

PRESIDENTA

Dra. Gianina Llontop Barandiaran

SECRETARIA

Lic. Julio Silva Estela

VOCAL

Dra. Carmen Carreño Farfán

PATROCINADORA

LAMBAYEQUE, PERÚ

2017
 AGRADECIMIENTOS

Estas lineas servirán para expresar nuestro más grande y

sincero agaradecimiento a todas aquellas personas que con su
ayuda han colaborado en la elaboracion del presente trabajo.
Un agradecimiento muy especial a nuestra asesora la Dra.
Carmen Rosa Carreño Farfán quien se comprometio con
nosotros desde el inicio transmitiéndonos su conocimiento y
sobre todo por su paciencia y dedicación por ser la gran
persona y amiga y por forjarnos para dar por terminado
nuestros objetivos.
Especial reconocimiento merece al grupo de amigos que
iniciamos este proyecto y por habernos brindado su apoyo
incondicional.
A nuestra amiga Marleny del Socorro Mija Huaman
que con sus consejos y apoyo en la presente tesis.
 DEDICATORIA

A Dios por haberme acompañado y guiado en todo este

tiempo en la realización de la tesis.
A mis padres Patricia Elizabeth Berrú Saavedra y Elmer
Antonio Esqueche Sipión por haberme brindado la mejor
educación y lecciones de la vida e impulsándome a ser mejor
cada dia los amo infinitamente.
A mis hermanos y abuelos queridos Yamely, Joan y Luiggi,
Manuel y Domitila por su apoyo moral y su cariño brindado
constantemente.
A mis grandes amigos de la universidad que inicamos
este proyecto y a mis amigos de mi código 2011-I son
los mejores.
ANTHONY SMITH ESQUECHE BERRU
 DEDICATORIA

La presente tesis se la dedico en primera instancia a Dios por

haberme acompañado y guiado en la realización.
A mis padres Sonia Edith Sánchez Díaz y Segundo Quispe
Manayay por su infinito amor y comprensión, por haberme
proporcionado la mejor educación y lecciones de la vida e
impulsándome a ser mejor cada dia los amo infinitamente.
A mis hermanos queridos Teresa, Mariajose, Jesus y Angela
por su apoyo moral y su cariño brindado constantemente, son
los mejores hermanos que puedo tener.
A mis grandes amigos de la universidad que inicamos
este proyecto y a mis amigos de mi código 2011-I son
los mejores.
GENESIS ABIGAIL QUISPE SANDOVAL
 Índice

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
II. MARCO TEÓRICO .............................................................................................. 4
2.1 Antecedentes de la investigación .............................................................................................. 4
2.2 Base teórica ......................................................................................................................................... 8
2.2.1 Asparagus officinalis L………………………………….…….……………..11
III. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 14
3.1 Material ................................................................................................................................................ 14
3.1.1 Muestra biológica…………………….…………………..……………….….14
3.1.2 Población y muestra ............................................................................... 14
3.2 Métodos............................................................................................................................................... 14
3.2.1 Variable de la fase descriptiva ................................................................ 15
3.2.2 Variables de la fase experimental .......................................................... 14
3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis ......................... 17
3.2.4 Lugar de muestreo ................................................................................. 17
3.2.5 Obtención de muestras .......................................................................... 19
3.2.6 Aislamiento e identificación fenotípica de Azotobacter spp……………..19
3.2.7 Mantenimiento de cultivos de Azotobacter spp……………………………23
3.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles
producidos .............................................................................................. 26
3.2.9 Selección de Azotobacter spp ................................................................ 31
3.2.10 Efecto de Azotobacter ssp. en plantas de espárrago ........................... 31
3.2.11 Análisis estadisticos de los datos ........................................................ 35
IV RESULTADOS.................................................................................................. 39
4.1 Bacterias del genero Azotobacter aisladas e identificadas en el rizoplano y
rizósfera de Asparagus officinalis L ...................................................................................... 39
4.2 Nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos por Azotobacter
spp. ...................................................................................................................................................... 45
4.3 Cultivos de Azotobacter spp. seleccionados ..................................................................... 61
4.4 Efecto de Azotobacter spp. en la altura y numero de tallos de Asparagus
officinalis L. ………………………………………………………………………….61
V. DISCUSIÓN ...................................................................................................... 78
VI. CONCLUSIONES ............................................................................................ 84
VII. RECOMENDACIONES ................................................................................... 85
VIII. RESUMEN ..................................................................................................... 86
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 87
X. ANEXOS ........................................................................................................... 97
 Índice de tablas

Tabla 1. Lote de procedencia demuestras de raíces con suelo rizosferico de

Asparagus officinalis L. en el fundo Josymar, Viru, La
Libertad……………………………………………………………………... 18
Tabla 2. Analisis físico – químico de suelo rizosferico de Asparagus officinalis L.
en Viru, La Libetad, 2016 …...…………………..………………………….. 20
Tabla 3. Características diferenciales de Azotobacter spp………………………… 43
Tabla 4. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Azotobacter spp. de
Asparagus officinalis L. en medio Ashby Sacarosa ……………………… 49
Tabla 5. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Azotobacter spp. de
Asparagus officinalis L. en medio LG…………………………………….... 51
Tabla 6. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilizacion por Azotobacter spp.
aisladas de Asparagus officinalis L. en medio Ashby
Sacarosa…………………………………………………………………........ 53
Tabla 7. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilizacion por Azotobacter spp.
aisladas de Asparagus officinalis L. en medio LG ……………………….. 55
Tabla 8. Indoles producidos (ppm) por Azotobacter spp. aisladas de Asparagus
officinalis L. en medio Ashby Sacarosa……………………………..……... 56
Tabla 9. Indoles producidos (ppm) por Azotobacter spp. aisladas de Asparagus
officinalis L. en medio LG………………………………………………........ 60
Tabla 10. Valores (ppm) de amonio, fósforo soluble e indoles correspondientes a
cultivos de Azotobacter spp. seleccionados…………………................... 62
Tabla11. Índices de efectividad (%) de Azotobacter spp. en altura de Asparagus
officinalis L. a los 30, 45 y 60 días……………………………………....... 64
Tabla 12. Índices de efectividad (%) de Azotobacter spp. en el número de tallos
de Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días………………………... 65
Tabla 13. Pueba de Tukey de la altura de las plantas de Asparagus officinalis L.
a los 30, 45 y 60 días después de lainoculacion de Azotobacter spp… 77
 Índice de figuras

Figura 1. Cultivo de Asparagus oficcinalis L. Virú, región La Libertad,

2016……………………………………………………………………… 15

Figura 2. Diseño completamente aleatorio para determinar el efecto de

Azotobacter spp. en Asparagus officinalis L. ………………………...
17

Figura 3. Ubicación de la provincia de Virú, región La Libertad, abril 2016

(https://www.google.com.pe/maps/place/Vir%C3%BA/@-
8.5664616,78.794859,10z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b039
18
1:0x6c172095672753ce!8m2!3d-8.5528417!4d-78.6254767)...........

Figura 4. Raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L.

deshidratadas…………………………………………………..……….. 21

Figura 5. Suspensión de raíces y suelo rizosférico de Asparagus officinalis

L. en solución salina esterilizada………………..…………………….. 21

Figura 6. Placa de Petri con medio LG para el aislamiento de Azotobacter

spp. ……………………………………………………………………….. 22

Figura 7. Siembra en medio LG mediante la técnica de agotamiento y

estría………………………………………………………………………. 22

Figura 8. Enriquecimiento de bacterias en caldo Ashby Sacarosa para el

aislamiento de Azotobacter spp. ………………………………………. 24

Figura 9. Placas de Petri con medio Ashby Sacarosa para el aislamiento de

Azotobacter spp. ………………………………………………………… 24

Figura 10. Medios de cultivo líquidos para la identificación del genero

Azotobacer………………………........................................................ 25

Figura 11. Cultivos puros de Azotobacter spp. en agar nutritivo…………..……. 25

Figura 12. Caldo extracto de suelo cultivado con Azotobacter spp.………........ 27

Figura 13. Caldo extracto de suelo con cloruro de potasio……………..……….. 27

Figura 14. Adición de solución alcohólica de fenol al caldo de extracto de

suelo ……………………………………………………………………… 28
Figura 15. Caldo National Botanical Researech Institute’s phosphate cultivado
con Azotobacter spp. …………………………………………………… 30

Figura 16. Caldo tripticasa soya suplementado con triptófano cultivado con
Azotobacter spp. ………………………………………………………… 30

Figura 17. Coronas de Asparagus officinalis L. ………………………………….. 32

Figura 18. Suelo agrícola, arena de rio y humus…………………………………. 32

Figura 19. Suelo experimental contenido en macetas de arcilla………………... 33

Figura 20. Inmersión de coronas de Asparagus officinalis L. en solución salina

esterilizada ……………………………………………………………... 33

Figura 21. Inoculo de Aztobacter spp. solución salina esterilizada…….………. 34

Figura 22. Inoculo bacteriano asperjado en coronas de Asparagus officinalis

L. ………………………………………………………………………….. 36

Figura 23. Medicion de altura de tallos de Asparagus officinalis L..................... 36

Figura 24. Conteo del número de tallos de Asparagus officinalis L. …………… 37

Figura 25. Colonias de bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias aisladas en a

medio Ashby Sacarosa………………………………………………… 40

Figura 26. Colonias de bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias aisladas en a

medio LG ……………………………………………………………….... 40

Figura 27. Colonias bacterianas grandes, cremosas y consistencia mucosa 41

seleccionadas en medio Ashby Sacarosa………………...................

Figura 28. Colonias de bacterias grandes, cremosas y consistencia mucosa

seleccionadas en medio LG……………………………………………. 41

Figura 29. Bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias subcultivadas en medio 42

Ashby Sacarosa…………………………………………………............
Figura 30. Bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias subcultivadas en medio
LG…………………………………………………………………………. 42

Figura 31. Bacilos Gram negativos del genero Azotobacter…………………….. 43

Figura 32. Bacterias enquistadas del genero Azotobacter………………………. 44

Figura 33. Acidificación de glucosa, sacarosa, fructosa y reducción de

nitratos……………………………………………………………………. 44

Figura 34. Frecuencia de Azotobacter spp. en bacterias rizosfericas fijadoras

de nitrógeno aerobias aisladas en el medio Ashby Sacarosa…….... 46

Figura 35. Frecuencia de Azotobacter spp. en bacterias rizosfericas fijadoras

de nitrógeno aerobias aisladas en el medio LG ……………………... 46

Figura 36. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus

officinalis L. positivas al aislamiento de Azotobacter spp. en medio
Ashby Sacarosa ………………………………………………………… 47

Figura 37. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus

officinalis L. positivas al aislamiento de Azotobacter spp. en medio
LG…………………………………………………………………………. 47

Figura 38. Coloración observada en la cuantificación de amonio ……………… 48

Figura 39. Porcentaje de Azotobacter spp. aisladas en medio LG que

solubilizaron fosfato in vitro ……………………………………………. 52

Figura 40. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble ……... 52

Figura 41. Porcentaje de Azotobacter spp. aisladas en medio Ashby 56

Sacarosa que produjeron indoles in vitro ……………………………..

Figura 42. Porcentaje de Azotobacter spp. aisladas en medio LG que

produjeron indoles in vitro ……………………………………………… 56

Figura 43. Coloración observada en la cuantificación de indoles ……..……….. 57

Figura 44. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra
de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.12-17ASHBY, d) Azotobacter sp.16-28ASHB……………..……… 62

Figura 45. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.25-60LG, d) Azotobacter sp.95-221ASHBY ……………...…….. 63

Figura 46. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.76-165LG, d) Azotobacter sp.21-42ASHBY …………..………….. 63

Figura 47. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 30 días después de la

inoculación de Azotobacter spp ……………………………………….. 64

Figura 48. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 30 días después de

la inoculación de Azotobacter sp………………………………………. 65

Figura 49. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.16-28ASHBY ……………………………………………………….... 66

Figura 50. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.12-17ASHBY ………………………………………………………… 66

Figura 51. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.95-215ASHBY ………………………………………………….……. 67

Figura 52. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.76-164LG……………………………………………………………… 67

Figura 53. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.76-165LG …………………………………………………………….. 68

Figura 54. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp.21-42LG.………………………………………………………………. 68
Figura 55. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra
de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp. 95-221ASHBY ………………………………………………………. 69

Figura 56. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter
sp. 25-60LG ……………………………………………………………… 69

Figura 57. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 45 días después de la

inoculación de Azotobacter spp ……………………………………….. 70

Figura 58. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 45 días después de

la inoculación de Azotobacter spp …………………………………….. 72

Figura 59. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp. 95-215ASHBY ………………………………………………………. 72

Figura 60. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp.95-221ASHBY ………………………………………........................ 73

Figura 61. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp.12-17ASHBY ………………………………...………………………. 73

Figura 62. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp. 21-42LG ……………………………………………………………… 74

Figura 63. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp. 76-164LG ……………………………………………………………. 74

Figura 64. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp. 16-28ASHBY ………………………………………………………... 75

Figura 65. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra

de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp. 76-165LG ……………………………………………………………. 75
Figura 66. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra
de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter
sp. 25-60LG ……………………………………………………………… 76

Figura 67. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 60 días después de la

inoculación de Azotobacter spp ……………………………………….. 76

Figura 68. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 60 días después de

la inoculación de Azotobacter spp. ………………………………….. 77
 I. INTRODUCCIÓN

El cultivo de Asparagus officinalis L. “espárrago” lidera los productos

alimenticios de exportación en el Perú (Reyes, 2006; Albuquerque, 2014) y al
igual que en otros países, el rendimiento está relacionado con la aplicación de
fertilizantes químicos en las épocas de mayor demanda de las plantas (Delgado,
2007). Estos insumos reponen los nutrientes removidos del suelo y contribuyen
significativamente a la productividad agrícola; no obstante, la eficacia de
recuperación o porcentaje de fertilizante que es absorbido por las plantas es en
promedio 50, 30, 60% para el N, P, K (SAGARPA, 2010). El resto, se pierde e
inclusive contamina el ambiente (Pedraza et al., 2010).

En la agricultura sostenible los requerimientos nutricionales de los cultivos

agrícolas como el espárrago, pueden ser proporcionados por las rizobacterias
promotoras de crecimiento en plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria,
PGPR), que incluyen especies del género Azotobacter (Kizilkaya, 2009; Guzmán
et al., 2012; Obando, 2012). Las PGPR benefician a las plantas a través de
mecanismos directos e indirectos. La promoción directa es consecuencia de la
síntesis de metabolitos facilitando la disponibilidad de nutrientes a las plantas,
mientras que en la promoción indirecta las PGPR disminuyen o previenen el
efecto deletéreo de los fitopatógenos (Delgado et al., 2003; Hernández et al.,
2006; Bhattacharyya & Jha, 2012).

1
 Las bacterias del género Azotobacter tienen potencial para la promoción de
crecimiento en plantas, debido a que fijan nitrógeno (Obando, 2012); producen
ácido indolacético (Guzmán et al., 2012), giberélico y abscísico (Naz et al., 2012),
solubilizan fosfatos (Escobar et al., 2011) e inclusive presentan efecto antagónico
a hongos fitopatógenos (Rojas, 2013). Ensayos con Azotobacter spp. en
condiciones de invernadero y campo demostraron incremento en el desarrollo
vegetativo y rendimiento de cultivos de importancia económica como Solanum
tuberosum L “papa” (Rico, 2009) y Zea mays L “maíz” (Ashrafi & Seiedi, 2011); sin
embargo, también se han reportado resultados contradictorios, en los que no se
ha obtenido la respuesta esperada, posiblemente porque las bacterias no se
adaptaron a las condiciones del suelo, muy diferentes a las de su procedencia o
no compitieron exitosamente con la biota nativa (Gonzáles et al., 2003).

El éxito de la inoculación de las PGPR como Azotobacter spp. reside en la

investigación de bacterias compatibles y muchas veces específicas al cultivo y
condiciones ecológicas del suelo (Reyes et al., 2008). Las especies de
Azotobacter son fáciles de aislar y cultivar en sustratos de bajo costo. Asimismo,
forman quistes que permanecen viables bajo condiciones desfavorables, por lo
que se consideran apropiadas para constituir biofertilizantes que pueden ser
aplicados a las semillas o el suelo, con éxito en la sobrevivencia y establecimiento
de las bacterias. En el rizoplano y rizósfera de los cultivos de espárrago se
encuentran especies de Azotobacter; sin embargo, no se ha realizado
investigación para aislarlas, caracterizarlas y determinar su efecto en los cultivos
agrícolas.

La presente investigación permitirá identificar especies de Azotobacter

propias de la región, con potencial para la biofertilización, generando valor
agregado a la biodiversidad regional, a la vez que se disminuye el riesgo de la
salud de los seres vivos y el efecto negativo de los insumos químicos en el
ambiente. Por lo expuesto, se planteó el siguiente problema ¿Cuáles son las
características de las bacterias del género Azotobacter aisladas del rizoplano y
rizósfera de espárrago y cuál es su potencial como promotoras de crecimiento en

2
plantas?. El objetivo general fue: Aislar e identificar bacterias del género
Azotobacter en el rizoplano y rizósfera de espárrago y determinar su potencial
como promotoras de crecimiento en plantas.

Los objetivos específicos fueron: aislar e identificar fenotípicamente

bacterias del género Azotobacter en el rizoplano y rizósfera de plantas de
espárrago, cuantificar el nitrógeno fijado, fosfato solubilizado y los indoles
producidos in vitro por las bacterias, seleccionar los ocho cultivos de bacterias con
los mayores valores en el nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles
producidos y determinar el efecto de las bacterias seleccionadas en la altura y
número de tallos de plantas de espárrago. La hipótesis planteada fue: Las
bacterias del género Azotobacter aisladas del rizoplano y rizósfera de espárrago
fijan nitrógeno, solubilizan fosfatos, producen indoles e incrementan el desarrollo
vegetativo de las plantas de espárrago.

3
 II. MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes de la investigación

El género Azotobacter pertenece al dominio Eubacteria, phylum,
Proteobacteria, clase Deltaproteobacteria y familia Azotobacteriaceae. Las
bacterias son quimio-organótrofas, catalasa positivas y Gram negativas.
Usualmente son ovoides y grandes, con 1,5-2,0um de diámetro, pero también se
pueden observar pleomórficas. No producen endosporas, pero si forman quistes.
Se mueven por flagelos peritricos, son aerobias, pero pueden crecer en
concentraciones bajas de oxígeno. Fijan nitrógeno inclusive con oxígeno, en
contraste con otras bacterias diazótroficas que lo fijan sólo en anaerobiosis o en
microaerófilia. Son capaces de utilizar gran cantidad de fuentes de carbono como
azúcares, alcoholes y sales de ácidos orgánicos. Fijan al menos 10mg de N2 por
gramo de glucosa consumida. En presencia de nitrógeno combinado crecen en
suelos con pH de 4,8-8,5 y cuando fijan el nitrógeno el pH es de 7,0-7,5 (Agüero,
2009; Obando, 2012).

Las bacterias del genero Azotobacter son de vida libre, presentes en la

mayoría de suelos, con un promedio de 104 g-1 de suelo y son capaces de fijar en
promedio 20Kg N h-1 año -1. A. chroococum es la especie más predominante,
pero también se han descrito A. agilis, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. insignis, A.
macrocytogenes y A. paspali (Kizilkaya, 2009). Se han reportado aislados en
suelo rizosférico de cultivos de Musa paradisiaca “plátano”, Dichanthium
aristatum “pasto”, Zea mays L. “maíz” y rastrojos (Lara et al., 2007); Spinacia
oleracea L. “espinaca” y Cucurbita pepo L. “calabacín” (Jiménez, 2007),

4
Bambusa bamboo “bambú” (Sachin & Misra, 2009), Pinus patula Shcl. “pino”
(Orozco & Martínez, 2009), Solanum tuberosum L. “papa” (Rico, 2009), Stevia
rebaudiana Bert (Borda et al., 2009), Eucaliptus sp. “eucalipto” (Obando et al.,
2010), Lactuca sativa “lechuga” (Vélez & Orellana, 2010), Lycopersicum
esculentum Mill “tomate” (Escobar et al., 2011), Vigna unguiculata “frijol caupi”
(Obando, 2012) e inclusive malezas (Rojas, 2013).

El potencial biológico de las especies de Azotobacter como PGPR, es

consecuencia de su actividad en la fijación de nitrógeno (Lara et al., 2007;
Kizilkaya, 2009; Escobar et al., 2011; Obando, 2012), producción de ácido
indolacético (García et al., 2005; Rico, 2009; Obando et al., 2010; Naz et al.,
2012; Aly et al., 2012; Guzmán et al., 2012), giberélico y abscísico (Naz et al.,
2012), solubilización de fosfatos (Rico, 2009; Escobar et al., 2011; Obando,
2012; Rojas, 2013) e inclusive efecto antagónico de hongos fitopatógenos como
Fusarium solani (Rico, 2009) y Fusarium verticillioides (Rojas, 2013).

Ensayos con Azotobacter spp. demostraron incremento en la germinación

de Coffea arabica L. “café” (Delgado et al., 2003), bambú (Sachin & Misra,
2009), Triticum aestivum “trigo” (Aly et al., 2012), maíz (Rojas, 2013); altura de
trigo (García et al., 2005), pino (Orozco & Martínez, 2009), Cucumis sativus
“pepinillo” (Salhia, 2010), pasto (Mantilla et al., 2011), maíz (Ashrafi & Seiedi,
2011; Exebio, 2013), longitud radicular de bambú (Sachin & Misra, 2009);
biomasa aérea y radicular de pino (Orozco & Martínez, 2009), pepinillo (Salhia,
2010), tomate (Escobar et al., 2011), frijol caupí (Obando, 2012), maíz (Córdova
& Manayay, 2013); contenido de nitrógeno en raíces de pepinillo (Salhia, 2010),
clorofila en hojas frijol caupí (Obando, 2012); contenido de nitrógeno, fósforo y
potasio en frutos de tomate (Gonzáles et al., 2003), rendimiento de Allium cepa
“cebolla” (Balemi et al., 2007), papa (Rico, 2009), lechuga (Vélez & Orellana,
2010) y de maíz (Ashrafi & Seiedi, 2011; Jarak et al., 2012) y disminución de la
dosis del fertilizante químico: 25% en cebolla (Balemi et al., 2007) y 50% en trigo
(García et al., 2005) y maíz (Sánchez et al., 2014).

5
 Bacterias aisladas de la rizósfera de Brachiaria decumbens, B. humidicola,
Phaseolus vulgaris, Theobroma cacao “cacao” y plantas silvestres, se
caracterizaron para determinar su potencial como PGPR. Se realizó tinción de
Gram, prueba de motilidad y se investigó la presencia de cápsula y gránulos de
volutina, actividad de la catalasa, tolerancia salina, fijación de nitrógeno y
solubilización de fosfatos. Estas pruebas permitieron seleccionar las bacterias
con potencial, con las que se investigó el efecto en pimentón y maíz en
invernadero. El 68% de bacterias demostraron ser diazótrofas, identificándose
Azotobacter, Azospirillum y Rhizobium. Azotobacter sp.1, incrementó la
germinación de semillas de pimentón y maíz, alcanzando 76 y 57%
respectivamente, en comparación con el testigo (71 y 56%). En pimentón
incrementó el número de botones florales, peso de la biomasa total, porcentaje
de nitrógeno y de fósforo y en maíz solo aumentó el porcentaje de nitrógeno. La
caracterización morfológica, fisiológica y bioquímica permitió seleccionar
bacterias con potencial para la promoción de crecimiento en pimentón y maíz
(Reyes et al., 2008).

El potencial como promotoras del crecimiento de plantas se determinó en

especies de Azotobacter aisladas de la rizósfera de malezas asociadas a maíz.
Las bacterias de las muestras se enriquecieron en caldo Ashby-sacarosa y se
aislaron en el mismo agar. Los aislados se identificaron fenotípicamente y se
sembraron en caldo tripticasa soya, caldo extracto de suelo y caldo Sundara Rao
Sinha Medium para cuantificar los indoles producidos, nitrógeno fijado y fosfato
solubilizado, respectivamente. Se obtuvieron 229 cultivos puros de bacterias,
entre los que se identificaron A. vinelandii (58%), A. paspali (13%), A.
armeniacus (8%) y A. nigricans (8%). Se cuantificaron 2,25-60,75ppm de indoles;
10,37-36,03ppm de amonio y 1,72-6,06ppm de fósforo soluble. La actividad
demostrada corroboró, el potencial de las especies de Azotobacter para
incrementar el desarrollo vegetativo y rendimiento de los cultivos agrícolas
(Rojas, 2013).

6
 Las PGPR son una alternativa para la disminución de la dosis del fertilizante
nitrogenado químico. En este contexto, se investigó la respuesta de maíz a la
inoculación de Azotobacter sp. y Burkholderia sp. junto a 50% de la dosis de
nitrato de amonio, NH4NO3. El experimento se realizó bajo un diseño
experimental de bloques al azar, teniendo como variables el porcentaje de
germinación y la biomasa aérea y radical. Las bacterias incrementaron la
germinación de las semillas, alcanzando 95% y superando significativamente al
testigo 100% fertilizante (85%) y al testigo absoluto (75%). A los 62 días después
de la siembra la aplicación de 50% del fertilizante químico más Azotobacter sp. y
la coinoculación de Azotobacter sp. - Burkholderia sp. incrementó la biomasa
seca aérea y radical de las plantas de maíz, alcanzando 8,54-10,35g y
5,78-7,03g, respectivamente, en comparación con 6,28 y 2,60g en el testigo
100% de fertilizante químico. Se demostró la posibilidad de disminuir en 50% el
fertilizante químico cuando se aplica junto a bacterias como Azotobacter sp. y
Burkholderia sp. (Sánchez et al., 2014).

Jatropha curcas L. “piñón” es una especie utilizada para la producción de

biodisel. Desarrolla en suelos no aptos para la producción de alimentos: no
fértiles y con problemas de contaminación. Se investigó al crecimiento de esta
especie en suelo contaminado con metales pesados al que se le aplicó
enmiendas de residuos industriales y el biofertilizante Azotobacter chroococcum.
Las bacterias se aplicaron a las semillas, las plántulas se trasplantaron a los
15 días y durante 6 meses se evaluó la sobrevivencia y características
biométricas. Las plántulas sobrevivieron a niveles de arsénico, cromo y zinc
superiores de 250, 100 y 3000 mg Kg-1, respectivamente. La aplicación en
conjunto de las enmiendas orgánicas y la combinación del biofertilizante con las
enmiendas orgánicas incrementó la altura y biomasa de las plantas. Por el
contrario, el biofertilizante solo no presentó efecto positivo en el crecimiento de
las plantas, demostrándose que se requieren enmiendas orgánicas para
disminuir la toxicidad de los metales, facilitar el desarrollo de Azotobacter
chroococum y viabilizar su uso en la biorremediación de suelos contaminados
(Kumar et al., 2008).

7
2.2 Base teórica
La agricultura orgánica propone para el crecimiento y desarrollo de los
cultivos la utilización de opciones tecnológicas como las bacterias promotoras de
crecimiento en plantas para producir alimentos sanos, proteger la calidad del
ambiente y la salud humana e intensificar las interacciones biológicas y los
procesos naturales beneficiosos. Se comparten los principios de la agricultura
natural, ecológica, biodinámica y biológica, promoviendo la sustentabilidad de los
sistemas agrícolas desde el punto de vista productivo, ecológico, económico y
social (Dávila, 2004).

En la rizósfera de las plantas se consideran tres componentes: el suelo

rizosférico, el rizoplano y la raíz misma. El suelo rizosférico es la zona del suelo
influenciada por las raíces a través de la liberación de exudados por efecto de la
actividad microbiana. El rizoplano es la superficie de la raíz, incluidas las
partículas fuertemente adheridas a la raíz, La raíz misma también forma parte de
la rizósfera, porque determinados microorganismos son capaces de colonizar los
tejidos internos (Nihorimbere et al., 2011).

El término rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, conocido

por sus siglas en inglés PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) fue
propuesto por Kloepper y Schroth en 1978, para describir a las bacterias que
habitan la rizósfera de las plantas y que pueden tener un efecto sobre los cultivos
(Kloepper, 2003). Las PGPR benefician a los cultivos agrícolas a través de
mecanismos directos e indirectos. La promoción directa ocurre cuando las PGPR
sintetizan metabolitos y facilitan a las plantas la toma de nutrientes mientras que
la promoción indirecta es consecuencia de la disminución o prevención del efecto
deletéreo de fitopatógenos por las PGPR. Los mecanismos directos incluyen la
síntesis de reguladores del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas),
solubilización de fosfatos minerales, fijación de nitrógeno atmosférico, producción
de sideróforos y estimulación del sistema de absorción de iones. Entre los
mecanismos indirectos o de biocontrol se encuentran la competencia por un
nicho ecológico o por nutrientes, interacción directa con los patógenos

8
(parasitismo y lisis enzimática), antibiosis o amensalismo, producción de
sideróforos e inducción de resistencia sistémica a la planta (Delgado et al., 2003;
Hernández et al., 2006; Bhattacharyya & Jha, 2012).

Bacterias como Azospirillum, Herbaspirillum, Enterobacter y Azotobacter

promueven el crecimiento de plantas, mayoritariamente a través de mecanismos
directos, así como Pseudomonas, Bacillus y Streptomyces lo hacen a través de
mecanismos indirectos; no obstante, todas las PGPR presentan un mayor o
menor grado de efectividad en ambos mecanismos (Doumbou et al., 2002;
Kloepper, 2003; Idris et al., 2007; Guillén et al., 2006; Franco, 2008; Karnwal,
2009; Martínez et al., 2010; Salaheddin et al, 2010). El efecto de las PGPR
también se atribuye a la denominada “hipótesis aditiva”, según la cual más de un
mecanismo están involucrados en la asociación planta-rizobacteria, los mismos
que operan simultáneamente o en asociación. La suma de los diferentes
mecanismos refleja los cambios observados en el crecimiento de las plantas,
cuando son cultivadas bajo condiciones ambientales propicias (Bashan &
Levnony, 1990, mencionados por Kloepper, 2003).

Los fijadores de nitrógeno o diazótrofos reducen el nitrógeno molecular

hasta amonio. Los de vida libre pueden ser anaerobios obligados o facultativos
(Clostridium pasteurianum, Klebsiella spp, Desulfovibrio spp.), aerobios obligados
(Azotobacter spp., Beijerinckia spp.) y fotosintéticos como las bacterias púrpuras
sulfurosas y no sulfurosas y bacterias verdes sulfurosas. El número de bacterias
diazótrofas es potencialmente elevado en la rizósfera. Estos microorganismos
son categorizados dentro de las PGPR al ejercer un efecto benéfico en el
crecimiento de las plantas (Coyne, 2000; Agüero, 2009; Altamirano et al., 2014).
Bacteria y Archea son los únicos organismos que pueden fijar el nitrógeno
gracias al complejo enzimático nitrogenasa, formado por dos proteínas, una que
contiene hierro (proteína-Fe) y otra con molibdeno y hierro (proteína Mo-Fe). La
nitrogenasa que contiene Mo es la más ampliamente distribuida (Loredo et al.,
2004).

9
El complejo nitrogenasa cataliza la conversión del N2 a NH3 bajo la reacción
expuesta por Agüero, (2009):

N2 + 10H+ + 8e- + nMgATP 2 NH4+ + H2 + nMg ADP + nPi

N2 + 8H+ + 8e- + nATP 2 NH3+ + H2 + nADP + nPi

La reducción de N2 a NH3 requiere ocho electrones con un mínimo de

16 ATP para reducir una molécula de N2 atmosférico. La reducción de N2 está
siempre acoplada a la reducción de H+ a H2, requiriéndose la reducción obligada
de protones en un número de 1mol de H2 producido por mol de N2 reducido. Bajo
condiciones fisiológicas normales el requerimiento de ATP es de
20-30 moléculas de Mg ATP, en consecuencia, la fijación de nitrógeno puede
consumir una fracción significativa de la reserva celular de ATP. La actividad de
la nitrogenasa se inactiva rápidamente en presencia de oxígeno. Las bacterias
capaces de fijar nitrógeno en total aerobiosis presentan un sistema de protección
de su nitrogenasa que comprende: elevada tasa respiratoria, protección
conformacional, autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos
(Loredo et al., 2004; Agüero, 2009).

El efecto positivo de las PGPR está relacionado con el aumento en la

longitud de las raíces laterales, así como el número y longitud de los pelos
radiculares, cambios que se asocian con la síntesis de auxinas, citoquininas y
giberelinas. En un modelo hipotético, el AIA sintetizado por una bacteria que está
adherida a la superficie de la semilla, o bien a la raíz en desarrollo, es tomado
por la planta y junto con el AIA endógeno (de la planta) puede estimular la
división y alargamiento de las células o bien promover la síntesis de ácido
1-amino-ciclopropano-1-carboxílico (ACC), con la activación de la enzima ACC
sintasa. Por lo tanto, aumenta la síntesis del ACC, que normalmente es un
precursor inmediato del etileno y que a su vez inhibe la elongación de las raíces.
El ACC es tomado activamente por las bacterias para ser hidrolizado por la
enzima amino ciclopropano carboxilasa desaminasa (ACC desaminasa),
transformándose en alfa-cetobutirato y amonio. Las bacterias inducen a la planta
a sintetizar más ACC de lo que necesita para que éstas tengan una fuente de

10
nitrógeno disponible. Una consecuencia directa de la disminución del ACC en la
planta (endógeno y bacteriano) es la reducción de etileno, con incremento
significativo en la formación de los pelos radiculares (Loredo et al., 2004).

La solubilización de fosfatos precipitados consiste en la liberación de fosfato

inorgánico soluble a partir de fosfatos insolubles y las PGPR responsables del
proceso se denominan solubilizadoras del fósforo. El principal mecanismo para la
solubilización de fosfatos, es la producción de ácidos orgánicos, aunque también
se consideran los ácidos inorgánicos como el sulfhídrico, nítrico y carbónico, la
excreción de protones acompañada de la asimilación del ion amonio y la acción
de mecanismos reductores de los cationes. Por su parte, en el proceso de
mineralización del fósforo, las PGPR pueden movilizar el fósforo de la materia
orgánica no soluble del suelo y convertirlo en fósforo inorgánico soluble,
mediante la excreción de enzimas hidrolíticas como fosfatasas, fitasas y
fosfonatasas (Carreño, 2009).

2.2.1 Asparagus officinalis L.

El espárrago es una planta originaria de la cuenca del Mediterraneo cuya
clasificación taxonómica mencionada por Bernabé (2011) y Valdivia (2015) es:
Reino: Plantae, Division: Espermatófitas, Subdivision: Angiospermas, Clase:
Monocotiledóneas, Orden: Asparagales, Familia: Asparagaceae, Subfamilia:
Asparagoideae, Género: Asparagus, Especie: A. officinalis L.
Las plantas de espárrago tienen raíces que nacen directamente del tallo
subterráneo y son cilíndricas y carnosas porque acumulan reservas para la
producción de turiones (Borrego, 2014). De estas raíces nacen las raicillas o
pelos absorbentes. Las raíces principales tienen una vida de 2-3 años y cuando
mueren son sustituidas por otras nuevas que se sitúan en la parte superior de
las anteriores, tal que las yemas van quedando más altas y la parte subterránea
va acercándose a la superficie del suelo, a medida que pasan los años. El tallo
es único, subterráneo y modificado en su rizoma. Se desarrolla horizontalmente
en forma de base, desde la cual se producen otros órganos de la planta. De las
yemas brotan los turiones o parte comestible, que cuando se dejan vegetar son

11
los futuros tallos ramificados. Las flores son pequeñas, generalmente solitarias,
campanuladas y con la corola verde amarillenta. El fruto es una baya
redondeada de 0,5cm de diámetro, al principio verde y rojo cuando madura.
Cada fruto tiene 1-2 semillas de color pardo oscuro o negras, con elevado poder
germinativo (Delgado, 2007; Canto et al., 2008).
Las plantas de espárrago son dioicas. Las plantas macho son más
productivas en turiones, debido a que las plantas hembra utilizan parte de las
reservas en la formación de flores, frutos y semillas. Desde el punto de vista
agronómico la planta de espárrago tiene tres fases diferenciadas: desarrollo
vegetativo, producción de turiones y periodo vegetativo. El cultivo se realiza en
suelo con textura franca, con inclinación a franco-arenoso o limoso. El pH debe
ser 7,5-8,0 aunque tolera un pH 6,5. La producción de turiones requiere de
11-13ºC de temperatura media mensual, con 60-70% de humedad relativa.
Temperaturas mayores favorecen al desarrollo vegetativo (Kirschenbilder et al.,
2015). El producto comestible es de textura carnosa y firme, aroma intenso y un
sabor ligeramente dulce. Su alta cantidad de fibras, facilita el proceso de
digestión (Agrobanco, 2007).

La siembra del espárrago puede ser directa por semillas o por trasplante de
plántulas o de garras. Las plántulas se obtiene de semillas hibridas, al momento
del trasplante presentan plumerillos de 10-12cm de longitud y después de
1-2 años se cosecha. Las garras se obtienen en los semilleros y después de
1 año se realiza la primera recolección. El primer riego tiene lugar en la
plantación, para mantener la humedad del sistema radicular y favorecer la
formación de la garra. Los otros dos riegos corresponden a la recolección y al
desarrollo anual de la parte aérea. El riego de recolección debe mantener la
humedad en la zona donde van a emerger los turiones y el riego de desarrollo de
la parte aérea se debe hacer por gravedad sino se dispone de riego por goteo;
aplicando 1-2 riegos semanales. El ultimo riego se realiza 3 meses antes de la
cosecha para evitar las brotaciones tardías que puedan consumir las reservas de
las raíces (Reyes, 2006; Delgado, 2007; Vallejo et al., 2009).

12
 Según el manejo agronómico, los espárragos son blancos, morados y
verdes. Los blancos se cultivan bajo la tierra, sin recibir la luz del sol y se
cosechan cuando la tierra se eleva ligeramente, antes que la yema esté en
contacto con la luz. Los espárragos morados se cultivan igual que los blancos,
pero se recolectan cuando la yema ha traspasado la superficie de la tierra y ha
entrado en contacto con la luz solar. Los espárragos verdes se cultivan al aire
libre y reciben su color de la luz solar y se recolectan cuando sobresalen
20-25cm de la tierra. Su sabor es más aromático, parecido al espárrago silvestre
y contienen mayor cantidad de vitaminas por la clorofila (Reyes 2006; Delgado,
2007).

El rendimiento de los cultivos y la calidad de sus productos, están

determinados por un componente genético y un ambiental. El componente
genético es el germoplasma o cultivar utilizado. El espárrago, a diferencia de
otras especies hortícolas, tiene un número reducido de cultivares comerciales
que, a partir de una base genética e histórica muy restringida, han sido
mejorados y seleccionados con distintos objetivos, con potenciales de
rendimiento y características cualitativas bastante diferentes para distintos países
o regiones productivas. Uno de las principales cultivares de espárrago es el
UC-157 F1, el cual junto con el F2 y otros derivados ocupan mayoritariamente la
superficie cultivada (Farías et al., 2004). El cultivar UC-157 fue obtenido en
Estados Unidos, en 1980 y es específica para la producción de turiones verdes.
El hibrido F1 es más productivo y de mejor calidad que el F2 y es una de los
cultivares más precoces y productivos en el mercado (Delgado, 2007).

13
 III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Materiales
3.1.1 Material biológico
El material biológico estuvo constituido por raíces con suelo rizosférico
adherido de espárrago, cultivos puros de Azotobacter spp. y coronas de
espárrago cultivar UC-157 F2.

3.1.2 Población y muestra

En la investigación descriptiva la población estuvo constituida por las plantas
de espárrago (Figura 1) del fundo Josymar (50ha) en Virú, Trujillo y se investigó
una muestra no probabilística de 96 plantas colectadas durante abril de 2016. El
número de muestras fue calculado (Vásquez et al., 2012), tomando en cuenta una
prevalencia de 90% (Anexo 1), determinada en un estudio piloto por los
investigadores. En la investigación explicativa la población fueron las bacterias del
género Azotobacter aisladas e identificadas en el rizoplano y rizósfera de
espárrago durante abril de 2016 y la muestra no probabilística y por conveniencia
estuvo constituida por ocho cultivos de Azotobacter spp. seleccionados.

14
 3.2 Métodos
3.2.1 Variable de la fase descriptiva
Variable cuantitativa: Potencial como promotoras del crecimiento en plantas
(nitrógeno fijado, fosfato solubilizado, indoles producidos).
3.2.2 Variables de la fase experimental
Variable independiente: Cultivos (8) de Azotobacter spp.
Variable dependiente: Desarrollo vegetativo de plantas de espárrago (altura
y número de tallos).

Figura 1. Cultivo de Asparagus officinalis L. Virú, región La Libertad, 2016.

15
3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis
La investigación se realizó en dos fases. La primera fase descriptiva
correspondió al aislamiento e identificación de Azotobacter spp., cuantificación de
nitrógeno, fosfato solubilizado e indoles producidos. En la segunda fase
experimental se determinó el efecto de ocho cultivos de Azotobacter spp. en la
altura y número de tallos de plantas de espárrago, durante 60 días, en invernadero.

La hipótesis en la primera fase se contrastó con el diseño no experimental de

“Solo Después” (Vásquez et al., 2012) y en la segunda fase con el diseño
experimental completamente aleatorio, DCA (Hernández et al., 2003). Los
tratamientos fueron diez correspondientes a T1: Testigo absoluto (agua destilada),
T2: Testigo químico (urea 46% N), T3-T10 Azotobacter spp. En cada tratamiento se
consideraron tres repeticiones, totalizando 30 unidades experimentales (Figura 2).

16
3.2.4 Lugar de muestreo
Las 96 muestras de raíces con suelo rizósferico de espárrago se colectaron
en el fundo Josymar, ubicado en el lote 10,6 del sector IV, Proyecto Especial
Chavimochic, en la provincia Virú, región La Libertad (Figura 3, tabla 1, anexo 2).
Virú tiene una superficie de 3218,74 km 2 y limita por el norte con la provincia de
Trujillo, por el este con las provincias de Julcán y Santiago de Chuco, por el sur con
el Departamento de Ancash y por el oeste con el océano Pacífico (Municipalidad
Provincial de Virú, 2016). El fundo Josymar tiene 50 ha, distribuidas en 24 lotes de
aproximadamente 1,5 ha cada uno. Al momento del muestreo 19 lotes estaban
sembrados con espárrago cultivar UC-157 F2 (cuatro plantas por metro lineal), con
1,8-2,5 años transcurridos después del transplante de coronas y una población
promedio de 30 000 plantas ha-1.

17
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1

3 4 5 6 7 8 9 10 1 2
T1: Testigo absoluto

T2: Testigo químico

T3 – T10: Azotobacter spp.

Figura 2. Diseño completamente aleatorio para determinar el efecto de Azotobacter spp. en Asparagus officinalis L.

17
Figura 3. Ubicación de la provincia de Virú, región La Libertad, abril, 2016
(https://www.google.com.pe/maps/place/Vir%C3%BA/@-8.5664616,-
78.794859,10z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b0391:0x6c172095672
753ce!8m2!3d-8.5528417!4d-78.6254767).

o o
Lote N de surcos N de muestras

A1-B1-C1 54 15 (1-15)
A2-B2-C3 61 15 (16-30)

A3-B3-C3 62 15 (31-45)
A4-B4-C4 63 15 (46-60)
C5 56 5 (61-65)
A6-B6-C6 64 15 (66-88)
C7 49 5 (81-85)
C8 55 6 (86-91)
C9 51 5 (92-96)

18
 Total: 19 lotes 515 96

Tabla 1. Lote de procedencia de muestras de raíces con suelo rizósferico de

Asparagus officinalis en el Fundo Josymar, Virú, La Libertad

17
3.2.5 Obtención de muestras
En el campo de cultivo de espárrago, cada cinco surcos se seleccionó la
planta más vigorosa y se extrajeron aproximadamente 50g de raíces con suelo
adherido, se depositaron en bolsas de polietileno debidamente identificadas e
inmediatamente se transportaron en una caja térmica (10 ± 1°C) hacia el
Laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección Biotecnología Microbiana de
la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo en
Lambayeque.

En simultáneo al muestreo de raíces con suelo rizosférico de espárrago para

el aislamiento de Azotobacter spp., se colectó una muestra representativa de 1kg
de suelo para realizar el análisis físico-químico en el Instituto Nacional de
Innovación y Extensión Agraria, Estación Experimental Vista Florida de Chiclayo.
Según los resultados (Tabla 2), el suelo es ligeramente ácido (pH 6,5) y
ligeramente salino (CE 3,06 dSm-1), con textura arenosa, niveles bajos de materia
orgánica (0,23%), nitrógeno (0,103ppm), fósforo disponible (6,0ppm) y potasio
(203,0ppm).

3.2.6 Aislamiento e identificación fenotípica de Azotobacter spp.

Las bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias del género Azotobacter fueron
aisladas con enriquecimiento (Escobar et al., 2011) y sin enriquecimiento previo
(Ramírez & Ugaz, 2014). Las muestras de raíces con suelo rizosférico (Figura 4) se
deshidrataron bajo sombra durante 72 horas se fragmentaron (5cm),
aleatoriamente se tomaron 10g de raíces junto con el suelo adherido, se
depositaron en frascos de 250mL de capacidad conteniendo 90mL de solución
salina esterilizada (NaCl 0,87% p/v) constituyendo una suspensión de raíces con
suelo rizosférico o dilución 10-1 (Figura 5) que se agitó manualmente durante
10 minutos.

Para el aislamiento de las bacterias sin previo enriquecimiento (Ramírez &

Ugaz, 2014), alícuotas de la dilución 10-1 se sembraron mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre la superficie del medio solido sin nitrógeno LG
(Figuras 6, 7, anexo 3) y se incubaron a 30 0C por 48 horas.

19
Tabla 2. Análisis físico-químico de suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en
Virú, La Libertad, 2016

Clase CE MO N P K
-1
Textual pH (dSm ) (%) (%) (ppm) (ppm)

Arenosa 6,5 3,06 0.23 0,103 6,0 203,0

20
Figura 4. Raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L.
deshidratadas.

Figura 5. Suspensión de raíces y suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en

solución salina esterilizada.

21
Figura 6. Placas de Petri con medio LG para el aislamiento de Azotobacter spp.

Figura 7. Siembra en medio LG mediante la técnica de agotamiento y estría.

22
 Para el enriquecimiento (Escobar et al., 2011), las bacterias de la dilución
10-1 se cultivaron en caldo sin nitrógeno Ashby Sacarosa con azul de bromotimol
(Figura 8, anexo 2), se incubaron a 300C, por 96 horas y se reportaron como
positivos al enriquecimiento, los caldos donde se observó viraje del indicador del
verde al amarillo, turbidez y una película superficial. Para el aislamiento de las
bacterias se tomó una alícuota del caldo cultivado, se sembró en medio sólido sin
nitrógeno Ashby Sacarosa (Figura 9), mediante la técnica francesa de agotamiento
y estría y se incubó a 300C por 96 horas.

Las colonias desarrolladas en los medios LG y Ashby Sacarosa, con viraje del
indicador al amarillo, grandes y consistencia mucosa se seleccionaron y purificaron
mediante subcultivos sucesivos en el medio de aislamiento (Escobar et al., 2011).
Se realizaron coloraciones de Gram y cuando se observaron bacilos Gram
negativos, grandes con o sin quistes, se sembraron en agar tripticasa soya (TSA) y
en el medio sin nitrógeno correspondiente, se incubaron a 300C durante 24 horas y
constituyeron los cultivos puros de bacterias que se guardaron en refrigeración
(80C). En la identificación fenotípica del género Azotobacter (Escobar et al., 2011)
se realizaron pruebas de catalasa, oxidasa, acidificación de glucosa, sacarosa,
fructosa, maltosa y reducción de nitratos (Figura 10).

3.2.7 Mantenimiento de cultivos de Azotobacter spp.

Los cultivos puros de Azotobacter spp. identificados se sembraron en el
medio sólido sin nitrógeno de aislamiento y en agar tripticasa soya durante
24 horas (Figura 11) y se mantuvieron a temperatura ambiente (28 0C) y en
refrigeración (80C), respectivamente, realizándose subcultivos cada 30 dias
(Escobar et al.,2011).

23
Figura 8. Enriquecimiento de bacterias en caldo Ashby Sacarosa.

Figura 9. Placas de Petri con medio Ashby Sacarosa para el aislamiento de

Azotobacter spp.

24
 Glucosa Fructosa Sacarosa Nitrato

Figura 10. Medios de cultivo líquidos para la identificación del género Azotobacter.

Figura 11. Cultivos puros de Azotobacter spp. en agar nutritivo.

25
3.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles
producidos
Con las bacterias del género Azotobacter aisladas e identificadas se
cuantificó el amonio, producto de la fijación de nitrógeno, el fósforo soluble
producto de la solubilización de fosfatos y los indoles producidos. Para la
obtención del inóculo, cada bacteria se cultivó en 5mL de caldo nutritivo a 30°C,
durante 24 horas (Córdova, 2016). Posteriormente, el caldo se centrifugó
(3500rpm) durante 5 minutos, el sobrenadante se eliminó, el sedimento se lavó
con solución salina esterilizada (NaCl 0,87% p/v) y su concentración se
estandarizó a 9x108 cel mL-1 por turbidimetría (tubo 3 del nefelómetro de Mc
Farland) y con el espectrofotómetro de luz visible a 540nm: absorbancia = 0,20,
equivalente a 108 células mL-1 (Rodríguez, 2013).

a. Cuantificación de nitrógeno fijado in vitro

La cuantificación del nitrógeno fijado in vitro por las bacterias investigadas se
realizó con el método colorimétrico de Berthelot o fenol hipoclorito (Lara et al.,
2007; Cadena & Martínez, 2011). El inóculo (5%:0,15mL) de cada cultivo
bacteriano fue sembrado por triplicado en tubos de 15x150mL conteniendo 3mL
de caldo extracto de suelo 10% (Figura 12, anexo 3) y se incubaron a 30°C, por
72 horas, con agitación constante (150rpm). A continuación, se agregaron 9mL de
KCl 2M, (Figura 13) se agitaron a 150rpm durante 1 hora y se dejaron en reposo
1 hora adicional, para después tomar 10mL de sobrenadante y centrifugarlos
(3000rpm) durante 5 minutos.

Los sobrenadantes se vertieron en tubos de dilución y se añadieron 0,4mL de

solución alcohólica de fenol al 10% (Figura 14); 0,4mL de nitroprusiato de sodio al
0,5% y 1mL de solución oxidante. Los tubos se agitaron manualmente por
2 minutos y se dejaron en reposo durante 1 hora adicional. La reacción se
consideró positiva a la fijación de nitrógeno por la aparición de una coloración
azul, leyéndose la absorbancia en espectrofotómetro de luz visible a 632,9nm.
Las concentraciones de amonio se calcularon con la ecuación de la curva de
calibración, obtenida previamente con diluciones sucesivas de una solución de
100ppm de cloruro de amonio (Anexo 3).

26
Figura 12. Caldo extracto de suelo cultivado con Azotobacter spp.

Figura 13. Caldo extracto de suelo con cloruro de potasio.

27
Figura 14. Adición de solución alcohólica de fenol al caldo extracto de suelo.

28
b. Cuantificación de fosfato solubilizado in vitro
La cuantificación de fosfato solubilizado in vitro por las bacterias investigadas
se realizó con el método colorimétrico del molibdato (Alvarado & Valderrama,
2014). El inóculo (5%: 0,25mL) de cada cultivo bacteriano se sembró por triplicado
en 5mL de caldo National Botanical Research Institute’s phosphate, NBRIP
(Figura 15, anexo 4) y se incubaron a 30°C, con agitación (150rpm), por 96 horas.
Después, los caldos fueron centrifugados a 3000rpm por 5 minutos y en el
sobrenadante se cuantificó el fósforo soluble (Rodier & Rodi, 2005),
considerándose una coloración azul positiva a la solubilización del fosfato. La
absorbancia se leyó en espectrofotómetro de luz visible a 690nm y las
concentraciones de fósforo soluble se calcularon con la ecuación de la curva de
calibración, obtenida previamente con diluciones sucesivas de una solución de
10ppm de fósforo (Anexo 4).

c. Cuantificación de indoles producidos in vitro

La cuantificación de indoles producidos in vitro se realizó según la reacción
colorimétrica de Salkowski (Mantilla, 2007; García & Muñoz, 2010). El inóculo
(5%:0,25mL) de cada cultivo bacteriano fue sembrado por triplicado en 5mL de
caldo tripticasa soya suplementado con triptófano (Figura 16, anexo 5). Después
de la incubación a 30°C, por 72 horas, en agitación constante (150rpm), los
cultivos se centrifugaron a 3000rpm, durante 5 minutos. A continuación, 0,4mL de
cada sobrenadante se depositaron en tubos, se agregaron 1,6mL de reactivo de
Salkowski modificado, se mezclaron y se dejaron en reposo durante 30 minutos
en oscuridad. La reacción se consideró positiva a la producción de indoles por la
aparición de una coloración grosella, leyéndose la absorbancia en
espectrofotómetro de luz visible a 530nm. Las concentraciones de indoles se
calcularon con la ecuación de la curva de calibración obtenida previamente con
diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de ácido indolacético (Anexo 5).

29
Figura 15. Caldo National Botanical Research Institute’s phosphate cultivado con
Azotobacter spp.

Figura 16. Caldo tripticasa soya suplementado con triptofano cultivado con
Azotobacter spp.

30
3.2.9 Selección de Azotobacter spp.
Los cultivos de Azotobacter spp seleccionados para la fase experimental de
la investigación fueron ocho, correspondientes a los valores máximos en la
concentración de amonio (dos cultivos), fósforo soluble (dos cultivos), índoles
producidos (dos cultivos), concentración de amonio y fósforo soluble (un cultivo) y
concentración de amonio e indoles producidos (un cultivo).

3.2.10 Efecto de Azotobacter spp. en plantas de espárrago

Los ocho cultivos de Azotobacter spp. seleccionados se inocularon en
coronas de espárrago (Figura 17), determinándose, durante 60 días el efecto en
el desarrollo vegetativo de las plantas, en condiciones de invernadero.

El suelo experimental estuvo constituido por 120kg de una mezcla de suelo

agrícola, arena de río y humus en la proporción 2:1:1 (Figura 18), que fue
distribuido en macetas de arcilla de 4,5kg de capacidad, a razón de 4kg por
maceta (Figura 19). El cultivo de espárrago y la inoculación de Azotobacter spp.
se realizó entre el 19 de agosto al 17 de octubre de 2016, registrándose las
temperaturas máxima (290C), mínima (230C) y media (260C), valores obtenidos
por la Estación Meteorológica de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo,
ubicado en el fundo “El Cienago” de Lambayeque (Anexo 6).

En el ensayo se sembraron coronas de espárrago cultivar UC-157 F2,

luego de ser tratadas por inmersión durante 5 minutos (Figura 20), en una
solución del fungicida Benomyl polvo mojable-WP (Benlate), en la dosis de 2gL-1
de agua declorada previamente durante 24 horas. El cultivar UC-157 fue obtenido
en 1980 en Estados Unidos (Farias et al., 2004). Es específico para la producción
de turiones verdes. Se comercializan los hibridos F1 y F2 y son los más precoces
y productivos del mercado (Delgado, 2007).

El inóculo fue obtenido con Azotobacter spp. cultivadas en caldo nutritivo, a

300C, durante 24 horas y después de la centrifugación se obtuvieron 500mL de
cada cultivo bacteriano en solución salina esterilizada, NaCl 0,87% p/v
(Figura 21), cuya concentración se estandarizó a 9x108 cel mL-1 por turbidimetría
(tubo 3 del nefelómetro de MC Farland).

31
 Figura 17. Coronas de Asparagus officinalis L.

Figura 18. Suelo agrícola, arena de río y humus.

32
Figura 19. Suelo experimental contenido en macetas de arcilla.

Figura 20. Inmersión de coronas de Asparagus officinalis L. en solución de

fungicida.

33
Figura 21. Inóculo de Azotobacter spp. solución salina esterilizada.

34
 Transcurridos 30 minutos del tratamiento con fungicida, las coronas de
espárrago se asperjaron con el inóculo bacteriano (100mL por corona), con ayuda de
un pulverizador de plástico de 500mL de capacidad (Figura 22). Después de
30 minutos de reposo a temperatura ambiental (250C), se sembraron en el suelo
experimental, a razón de una corona por maceta. Los riegos se realizaron cada
3 días con agua potable declorada, tomando en cuenta los requerimientos hídricos
de las plantas. Después de 15 días de la siembra, en el testigo químico se aplicaron
250mL de una solución de fertilizante nitrogenado (Urea 46%), en la dosis de 5gL-1
de agua, cada 30 días.

Transcurridos 30, 45 y 60 días después de la siembra, se midió la altura de

las plantas (Figura 23) y se contaron los tallos (Figura 24). La altura se expresó en
cm, considerando desde la base del tallo más alto hasta la yema terminal
(Puicón, 2014). Con los valores de altura y número de tallos se calculó el índice de
efectividad de la inoculación (IEI) en porcentaje, mediante la fórmula (Carreño, 2009)
siguiente:

( )

3.2.11 Análisis estadístico de los datos

Para el diseño experimental completamente aleatorio, el modelo aditivo
lineal fue:
Yij = u + ti + Eij
Dónde:
Yij = observación del i- ésimo tratamiento, J- enésima repetición
u = media general de la variable respuesta.
ti = efecto I- ésimo tratamiento, siendo i = 1, 2, 3, … 10
Eij = error experimental en el i- ésimo tratamiento, j- ésima repetición
H0 = u1 = u2 = u3,… = u10
Ha = al menos una media diferente

35
Figura 22. Inóculo bacteriano asperjado en corona de Asparagus officinalis L.

Figura 23. Medición de altura de tallo de Asparagus officinalis L.

36
Figura 24. Conteo del número de tallos de Asparagus officinalis L.

37
 Con los valores de altura y número de tallos de las plantas se realizaron las
pruebas de normalidad y homogeneidad de varianza y según los resultados se
llevaron a cabo análisis paramétricos y no paramétricos (Hernández et al., 2003).
En el presente trabajo se utilizó el software estadístico SPSS versión 15,0 así como
los programas de Microsoft Office Word, Excel versión 2013 y Minitab 15.

38
 IV RESULTADOS

4.1 Bacterias del género Azotobacter aisladas e identificadas en el rizoplano

y rizósfera de Asparagus officinalis L.
En muestras de rizoplano y rizósfera de espárrago sembradas en los medios de
cultivo sólidos sin nitrógeno: agar Ashby y LG, se aislaron bacterias fijadoras de
nitrógeno aerobias con y sin previo enriquecimiento, respectivamente
(Figuras 25, 26). Las bacterias se enriquecieron en el caldo Ashby sin nitrógeno en
el que se observó viraje del indicador al amarillo, turbidez y una película superficial.

En el agar Ashby y LG se seleccionaron las colonias con viraje del indicador al

amarillo, grandes, de forma irregular, bordes enteros, convexas, aspecto brillante,
consistencia mucosa, no pigmentadas, constituidas por bacilos Gram negativos y
positivos en la prueba de catalasa (Figuras 27, 28), obteniéndose 238 cultivos en
agar Ashby y 211 en LG. Después de su cultivo por dos veces consecutivas en agar
similar al de su aislamiento, se verificó su pureza y actividad fijadora de nitrógeno
(Figuras 29, 30), obteniéndose 140 cultivos puros de bacterias fijadoras de nitrógeno
aerobias en agar Ashby y 117 en LG, provenientes del 59,38%(57) y 55,21%(53) de
las muestras de raíces con suelo rizosférico de espárrago, respectivamente.

Las bacterias del género Azotobacter se observaron como bacilos Gram

negativos, con y sin quistes, positivos en catalasa y oxidasa (Tabla 3, figuras 31, 32).
Estas pruebas junto a la acidificación de glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa y
reducción de nitratos (Figura 33), diferenciaron al género Azotobacter.

39
Figura 25. Colonias de bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias aisladas en medio
Ashby Sacarosa.

Figura 26. Colonias de bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias aisladas en

medio LG.

40
Figura 27. Colonias bacterianas grandes, cremosas y de consistencia mucosa
seleccionadas en el medio Ashby Sacarosa.

Figura 28. Colonias bacterianas grandes, cremosas y de consistencia mucosa

seleccionadas en el medio LG.

41
Figura 29. Bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias subcultivadas en medio Ashby
Sacarosa.

Figura 30. Bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias subcultivadas en medio LG.

42
 Tabla 3. Características diferenciales de Azotobacter spp.

Características Azotobacter spp.

Células Bacilos rectos

Coloración de Gram -
Catalasa +
Oxidasa +
Acidificación de:
- Glucosa +
- Sacarosa +
- Fructosa +
- Maltosa +
Reducción de nitratos +

Figura 31. Bacilos Gram negativos del género Azotobacter.

43
Figura 32. Bacterias enquistadas del género Azotobacter.

G F S Ni G F S Ni

CONTROL

Figura 33. Acidificación de glucosa, sacarosa, fructosa y reducción de nitratos.

44
 El 87,87%(123) y 64,52%(75) de los cultivos de bacterias rizosféricas
fijadoras de nitrógeno aerobias aisladas en medio Ashby Sacarosa y en LG,
respectivamente, se identificaron fenotípicamente como Azotobacter spp.
(Figuras 34, 35), tal que el 43,75%(42) y 34,38%(33) de las muestras de
rizoplano y rizosféra de espárrago fueron positivas (Figuras 36, 37) para el
aislamiento de Azotobacter spp. En este contexto, independientemente del medio
de aislamiento se obtuvieron 198 cultivos de Azotobacter spp, procedentes del
70,83%(68) de muestras de rizoplano y rizosféra de espárrago.

4.2 Nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e índoles producidos por

Azotobacter spp.
Todos los cultivos de Azotobacter spp. aislados en medio Ashby Sacarosa
(123) y LG (75), fijaron nitrógeno in vitro y como producto de la fijación se detectó
amonio, evidenciado por una coloración azul (Figura 38). La concentración de
amonio osciló entre 3,406-34,527ppm para Azotobacter spp. aisladas en medio
Ashby Sacarosa (Tabla 4) y entre 5,630-32,340ppm para Azotobacter spp.
aislados en medio LG (Tabla 5).

Todos los cultivos de Azotobacter spp. aislados en medio Ashby Sacarosa

(123) y el 97,33% (73) aislado en medio LG (Figura 39), solubilizaron fosfato in
vitro y como producto de la solubilización se detectó fósforo soluble, evidenciado
por una coloración azul (Figura 40). La concentración de fósforo soluble osciló
entre 1,188-5,050ppm para Azotobacter spp. aisladas en medio Ashby Sacarosa
(Tabla 6) y entre 0,275-5,391ppm para Azotobacter spp. aisladas en medio LG
(Tabla 7).

El 95,93% (118) de cultivos de Azotobacter spp. aisladas en medio Ashby

Sacarosa y el 85,33% (64) aislado en medio LG produjeron indoles in vitro
(Figuras 41, 42), evidenciados por una coloración grosella (Figura 43). La
concentración de indoles producidos osciló entre 0,244-62,022ppm para
Azotobacter spp. aisladas en medio Ashby Sacarosa (Tabla 8) y entre
0,244-59,577ppm para Azotobacter spp. aisladas en medio LG (Tabla 9).

45
 12,13%

Azotobacter spp.
87,87%
Otros géneros

Figura 34. Frecuencia de Azotobacter spp. en bacterias fijadoras de nitrógeno

aerobias aisladas en medio Ashby Sacarosa.

35,48%

Azotobacter spp.
64,52%
Otros géneros

Figura 35. Frecuencia de Azotobacter spp. en bacterias fijadoras de nitrógeno

aerobias aisladas en medio LG.

46
 43,75%

Positivas
56,25%
Negativas

Figura 36. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis

L. positivas al aislamiento de Azotobacter spp. en medio Ashby
Sacarosa.

34,38%

Positivas

65,62% Negativas

Figura 37. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis

L. positivas al aislamiento de Azotobacter spp. en medio LG.

47
Figura 38. Coloración observada en la cuantificación de amonio.

48
Tabla 4. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Azotobacter spp. aisladas de
Asparagus officinalis L. en medio Ashby Sacarosa

Azotobacter spp. Amonio Azotobacter spp. Amonio Azotobacter spp. Amonio

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

16 - 28 ASHBY 34,527 83 - 189 ASHBY 22,027 16 - 27 ASHBY 18,204

12 - 17 ASHBY 33,553 34 - 76 ASHBY 21,972 33 - 73 ASHBY 17,909

95 - 215 ASHBY 32,597 26 - 53 ASHBY 21,954 65 - 136 ASHBY 17,909

66 - 144 ASHBY 32,542 25 - 48 ASHBY 21,898 86 - 202 ASHBY 17,597

80 - 182 ASHBY 32,395 3 -7 ASHBY 21,806 53 - 115 ASHBY 17,560

82 - 184 ASHBY 31,347 26 - 55 ASHBY 21,715 33 - 74 ASHBY 17,505

44 - 104 ASHBY 30,299 16 - 25 ASHBY 21,678 76 - 163 ASHBY 17,487

95 - 222 ASHBY 29,251 24 - 47 ASHBY 21,420 6 - 11 ASHBY 17,431

84 - 194 ASHBY 28,406 89 - 206 ASHBY 21,255 95 - 228 ASHBY 17,321

65 - 140 ASHBY 26,696 20 - 37 ASHBY 21,090 68 - 147 ASHBY 17,101

63 - 132ASHBY 26,604 44 -102 ASHBY 21,017 83 - 192 ASHBY 17,032

72 - 153 ASHBY 26,476 74 - 154 ASHBY 20,832 26 - 54 ASHBY 17,009

83 - 191 ASHBY 26,071 26 - 56 ASHBY 20,814 96 - 237 ASHBY 17,009

80 - 173 ASHBY 25,979 76 - 161 ASHBY 20,814 66 - 145 ASHBY 16,972

63 - 133 ASHBY 25,777 12 - 20 ASHBY 20,685 17 - 32 ASHBY 16,806

24 - 46 ASHBY 25,759 5 - 9 ASHBY 20,262 33 - 75 ASHBY 16,365

11 - 15 ASHBY 25,170 21 - 42 ASHBY 20,207 24 - 44 ASHBY 16,311

89 - 207 ASHBY 24,766 75 - 157 ASHBY 20,005 84 - 195 ASHBY 16,200

15 - 24 ASHBY 24,656 12 - 19 ASHBY 19,748 21 - 39 ASHBY 16,181

95 - 216 ASHBY 24,656 53 - 120 ASHBY 19,711 1 - 2 ASHBY 15,814

28 - 59 ASHBY 24,490 55 - 125 ASHBY 19,656 11 - 16 ASHBY 15,814

43- 101 ASHBY 24,104 95 - 219 ASHBY 19,656 59 - 126 ASHBY 15,777

89 - 205 ASHBY 23,902 68 - 146 ASHBY 19,637 76 - 166 ASHBY 15,593

80 - 178 ASHBY 23,884 95 - 226 ASHBY 19,601 35 - 78 ASHBY 15,428

49
Continuación…

Azotobacter spp. Amonio Azotobacter spp. Amonio Azotobacter spp. Amonio

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

65 – 138 ASHBY 23.865 86 - 204 ASHBY 19,545 32 - 71 ASHBY 15,318

32 – 70 ASHBY 23.608 96 - 235 ASHBY 19,459 42 - 100 ASHBY 14,968

83 - 193 ASHBY 23,443 80 - 175 ASHBY 19,362 80 - 180 ASHBY 14,821

86 - 198 ASHBY 23,406 39 - 92 ASHBY 19,325 25 - 50 ASHBY 14,619

39 - 93 ASHBY 23,332 95 - 217 ASHBY 19,325 80 - 174 ASHBY 14,435

45 - 110 ASHBY 23,277 17 – 30 ASHBY 19.306 68 – 148 ASHBY 13.994

51 - 113 ASHBY 23,056 75 – 158 ASHBY 19.288 16 - 29 ASHBY 13,737

80 - 183 ASHBY 23,038 53 - 118 ASHBY 19,233 49 - 111 ASHBY 13,204

86 - 201 ASHBY 23,038 95 - 221 ASHBY 19,031 74 - 155 ASHBY 13,167

28 -60 ASHBY 22,965 9 -13 ASHBY 18,939 95 -220 ASHBY 13,001

36 - 82 ASHBY 22,597 9 - 14 ASHBY 18,884 19 - 36 ASHBY 12,909

76 - 165 ASHBY 22,542 83 - 190 ASHBY 18,695 27 - 58 ASHBY 8,075

83 - 188 ASHBY 22,413 35 - 80 ASHBY 18,534 95 - 214 ASHBY 7,670

95 - 218 ASHBY 22,413 63 - 130 ASHBY 18,479 93 - 210 ASHBY 4,748

45 - 107 ASHBY 22,284 53 - 117 ASHBY 18,369 21- 40 ASHBY 3,406

65 - 135 ASHBY 22,211 95 - 227 ASHBY 18,351

80 - 181 ASHBY 22,174 45 - 108 ASHBY 18,332

76 - 164 ASHBY 22,064 80 - 179 ASHBY 18,222

50
Tabla 5. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Azotobacter spp. aisladas de
Asparagus officinalis L. en medio LG

Azotobacter spp. Amonio Azotobacter spp. Amonio Azotobacter spp. Amonio

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

21 - 48 LG 32,340 87 - 188 LG 24,012 6 - 17 LG 20,648

88 - 192 LG 32,330 64 - 134 LG 23,773 39 - 99 LG 20,593

2 - 7 LG 31,531 51 - 120 LG 23,424 69 – 145 20,575

76 - 164 LG 31,770 90 - 206 LG 23,424 74 - 154 LG 20,575

83 - 177 LG 30,270 88 - 200 LG 23,222 2 - 9 LG 20,465

71 - 152 LG 29,810 75 - 156 LG 23,093 35 - 87 LG 20,244

88 - 195 LG 29,020 47 - 110 LG 22,946 20 - 46 LG 20,185

12 - 30 LG 28,340 7 - 19 LG 22,873 83 - 178 LG 20,097

87 - 190 LG 28,310 40 - 102 LG 22,799 68 - 140 LG 20,055

13 - 33 LG 28,152 36 - 88 LG 22,211 75 - 160 LG 19,601

78 - 170 LG 27,847 3 - 10 LG 22,193 68 - 142 LG 19,435

95 - 209 LG 27,523 59 - 129 LG 22,156 2 - 4 LG 19,325

8 - 25 LG 27,457 6 - 15 LG 22,082 15 - 38 LG 19,288

68 - 144 LG 26,943 44 - 109 LG 21,880 90 - 202 LG 19,288

68 - 139 LG 26,722 82 - 175 LG 21,678 65 - 138 LG 18,590

55 - 123 LG 25,939 60 - 130 LG 21,623 88 - 191 LG 17,799

27 - 63 LG 25,927 31 - 77 LG 21,457 76 - 165 LG 17,229

68 - 143 LG 25,744 69 - 147 LG 21,439 87 - 190 LG 16,806

88 - 194 LG 25,537 61 - 132 LG 21,090 25 - 59 LG 16,806

88 - 196 LG 25,101 61 - 131 LG 21,016 89 - 201 LG 16,512

82 -173 LG 24,531 75 - 155 LG 20,924 86 - 186 LG 14,821

90 - 204 LG 24,347 50 - 117 LG 20,869 1 - 2 LG 14,527

76 - 166 LG 24,310 28 - 67 LG 20,851 16 - 40 LG 14,196

40 - 101 LG 24,196 27 - 66 LG 20,832 25 -60 LG 13,001

90 - 205 LG 24,086 96 - 211 LG 20,722 3 - 11 LG 5,630

51
 2,67%

Solubilizaron

No solubilizaron

97,33%

Figura 39. Porcentaje de Azotobacter spp. aisladas en medio LG que solubilizaron

fosfato in vitro.

Figura 40. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble.

52
Tabla 6. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilización por Azotobacter spp. aisladas de
Asparagus officinalis L. en medio Ashby Sacarosa.

Azotobacter spp. P soluble Azotobacter spp. P soluble Azotobacter spp. P soluble

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

95 - 221 ASHBY 5,050 83 - 191 ASHBY 4,010 74 - 154 ASHBY 3,273

86 - 202 ASHBY 4,848 16 - 25 ASHBY 3,971 72 - 153 ASHBY 3,128

68 - 146 ASHBY 4,819 21 - 39 ASHBY 3,942 83 - 190 ASHBY 3,114

95 - 215 ASHBY 4,768 95 - 220 ASHBY 3,937 63 - 130 ASHBY 3,114

28 - 60 ASHBY 4,761 51 - 113 ASHBY 3,937 19 - 36 ASHBY 3,057

96 - 237 ASHBY 4,761 80 - 181 ASHBY 3,923 24 - 46 ASHBY 3,043

39 - 93 ASHBY 4,753 86 - 201 ASHBY 3,923 3 - 7 ASHBY 3,014

89 - 207 ASHBY 4,674 28 - 59 ASHBY 3,855 9 - 14 ASHBY 2,971

45 - 107 ASHBY 4,660 43 - 101 ASHBY 3,768 75 - 158 ASHBY 2,969

17 - 32 ASHBY 4,660 74 - 155 ASHBY 3,764 80 - 178 ASHBY 2,969

36 - 82 ASHBY 4,660 76 - 165 ASHBY 3,764 17 - 30 ASHBY 2,898

80 - 174 ASHBY 4,559 53 - 120 ASHBY 3,764 33 - 73 ASHBY 2,898

80 - 182 ASHBY 4,559 53 - 119 ASHBY 3,764 76 - 163 ASHBY 2,897

76 - 166 ASHBY 4,472 75 - 157 ASHBY 3,764 45 - 108 ASHBY 2,753

45 - 110 ASHBY 4,463 95 - 216 ASHBY 3,677 80 - 183 ASHBY 2,752

95 - 226 ASHBY 4,385 80 - 180 ASHBY 3,663 16 - 29 ASHBY 2,608

66 - 145 ASHBY 4,371 25 - 50 ASHBY 3,608 27 - 58 ASHBY 2,550

21 - 42 ASHBY 4,356 11 - 16 ASHBY 3,533 53 - 117 ASHBY 2,550

65 - 140 ASHBY 4,284 6 - 11 ASHBY 3,518 95 - 227 ASHBY 2,550

63 - 132 ASHBY 4,284 76 - 161 ASHBY 3,518 44 - 102 ASHBY 2,536

95 - 214 ASHBY 4,284 15 - 24 ASHBY 3,504 89 - 206 ASHBY 2,536

83 - 192 ASHBY 4,284 49 - 111 ASHBY 3,504 65 - 135 ASHBY 2,478

65 - 138 ASHBY 4,284 68 - 147 ASHBY 3,504 59 - 126 ASHBY 2,406

26 - 54 ASHBY 4,270 84 - 195 ASHBY 3,491 80 - 173 ASHBY 2,348

53
Continuación…

Azotobacter spp. P soluble Azotobacter spp. P soluble Azotobacter spp. P soluble

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

89 - 205 ASHBY 4,270 53 - 118 ASHBY 3,475 26 - 56 ASHBY 2,333

37 - 74 ASHBY 4,260 84 - 195 ASHBY 3,491 80 - 179 ASHBY 2,088

9 - 13 ASHBY 4,202 53 - 118 ASHBY 3,475 35 - 78 ASHBY 2,086

21 - 40 ASHBY 4,197 86 - 204 ASHBY 3,446 16 - 28 ASHBY 2,072

95 - 217 ASHBY 4,197 93 - 210 ASHBY 3,446 16 - 27 ASHBY 2,028

96 - 235 ASHBY 4,197 20 - 37 ASHBY 3,434 26 - 53 ASHBY 2,014

86 - 198 ASHBY 4,197 32 - 71 ASHBY 3,434 25 - 48 ASHBY 2,014

32 - 70 ASHBY 4,173 24 - 47 ASHBY 3,434 95 - 228 ASHBY 1,958

11 - 15 ASHBY 4,111 95 - 219 ASHBY 3,432 84 - 194 ASHBY 1,885

82 - 184 ASHBY 4,111 24 - 44 ASHBY 3,420 26 - 55 ASHBY 1,884

63 - 133 ASHBY 4,110 42 - 100 ASHBY 3,362 80 - 175 ASHBY 1,828

95 - 218 ASHBY 4,096 39 - 92 ASHBY 3,362 83 - 188 ASHBY 1,640

34 - 76 ASHBY 4,043 5 - 9 ASHBY 3,359 83 - 189 ASHBY 1,582

12 - 20 ASHBY 4,043 55 - 125 ASHBY 3,359 65 - 136 ASHBY 1,408

1 - 2 ASHBY 4,024 66 - 144 ASHBY 3,345 35 - 80 ASHBY 1,188

12 - 17 ASHBY 4,024 95 - 222 ASHBY 3,287

53 - 115 ASHBY 4,024 33 - 75 ASHBY 3,275

44 - 104 ASHBY 4,014 12 - 19 ASHBY 3,275

83 - 193 ASHBY 4,010 76 - 164 ASHBY 3,273

54
Tabla 7. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilización por Azotobacter spp. aisladas
de Asparagus officinalis L. en medio LG

Azotobacter spp. P soluble Azotobacter spp. P soluble Azotobacter spp. P soluble

código UNPRG (pmm) código UNPRG (pmm) código UNPRG (pmm)

25 - 60 LG 5,391 68 - 139 LG 2,608 88 - 200 LG 1,507

87 - 190 LG 4,202 7 - 19 LG 2,579 16 - 40 LG 1,492

8 - 25 LG 4,130 2 - 8 LG 2,565 75 - 156 LG 1,492

30 - 46 LG 4,014 36 - 88 LG 2,550 70 - 149 LG 1,492

68 - 143 LG 3,782 78 - 170 LG 2,507 90 - 206 LG 1,449

68 - 144 LG 3,710 82 - 173 LG 2,434 26 - 61 LG 1,391

6 - 17 LG 3,666 27 - 63 LG 2,231 88 - 199 LG 1,391

44 - 109 LG 3,594 35 - 87 LG 2,173 64 - 136 LG 1,347

61 - 132 LG 3,507 75 - 160 LG 2,115 21 - 48 LG 1,333

69 - 145 LG 3,507 90 - 204 LG 2,028 86 - 186 LG 1,333

64 - 134 LG 3,434 88 - 194 LG 2,014 39 - 99 LG 1,275

69 - 147 LG 3,362 13 - 33 LG 2,000 88 - 192 LG 1,217

51 - 120 LG 3,362 74 - 154 LG 1,985 88 - 191 LG 1,173

6 - 15 LG 3,202 87 - 188 LG 1,971 95 - 209 LG 1,115

71 - 152 LG 3,202 28 - 67 LG 1,855 90 - 205 LG 1,057

15 - 38 LG 3,188 47 - 110 LG 1,855 40 - 102 LG 0,985

13 - 32 LG 3,130 68 - 140 LG 1,855 2 - 4 LG 0 ,840

76 - 166 LG 3,043 83 - 177 LG 1,855 61 - 131 LG 0,681

76 - 165 LG 2,985 37 - 92 LG 1,782 27 - 52 LG 0,652

88 - 196 LG 2,985 59 - 129 LG 1,739 68 - 142 LG 0,478

31 - 77 LG 2,942 50 - 117 LG 1,739 83 - 177 LG 0,405

25 - 59 LG 2,927 50 - 119 LG 1,652 76 - 164 LG 0,391

60 - 130 LG 2,797 27 - 66 LG 1,608 3 - 10 LG 0,275

83 - 178 LG 2,710 2 - 7 LG 1,608

1 - 2 LG 2,695 96 - 211 LG 1,521

55
 4,07%

Productoras

No productoras
95,93%

Figura 41. Porcentaje de Azotobacter spp. aisladas en medio Ashby Sacarosa que
produjeron indoles in vitro.

14,67%

Productoras

No productoras
85,33%

Figura 42. Porcentaje de Azotobacter spp. aisladas en medio LG que produjeron

indoles in vitro.

56
Figura 43. Coloración observada en la cuantificación de indoles.

57
Tabla 8. Indoles producidos (ppm) por Azotobacter spp. aisladas de Asparagus
officinalis L. en medio Ashby Sacarosa

Azotobacter spp. Indoles Azotobacter spp. Indoles Azotobacter spp. Indoles

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

21 - 42 ASHBY 62,022 95 - 216 ASHBY 18,688 86 - 202 ASHBY 8,022

27 - 58 ASHBY 42,244 53 - 118 ASHBY 18,466 55 - 125 ASHBY 7,800

83 - 189 ASHBY 41,355 33 - 74 ASHBY 18,244 80 - 181 ASHBY 7,577

26 - 54 ASHBY 36,022 95 - 217 ASHBY 18,022 66 - 145 ASHBY 7,577

16 - 29 ASHBY 35,133 35 - 80 ASHBY 17,800 76 - 165 ASHBY 7,355

21 - 39 ASHBY 33,577 76 - 164 ASHBY 17,800 12 - 17ASHBY 6,688

83 - 190 ASHBY 32,911 84 - 194 ASHBY 17,800 74 - 155 ASHBY 6,688

83 - 191 ASHBY 31,577 63 - 133 ASHBY 17,577 95 - 228 ASHBY 5,800

26 - 55 ASHBY 31,355 86 - 201 ASHBY 17,577 39 - 92 ASHBY 5,577

83 - 188 ASHBY 30,688 5 - 9 ASHBY 17,355 17 - 30 ASHBY 5,133

80 - 173 ASHBY 30,688 9 - 13 ASHBY 17,133 42 - 100 ASHBY 5,133

21 - 40 ASHBY 30,466 95 - 219 ASHBY 17,133 74 - 154 ASHBY 5,133

83 - 193 ASHBY 29,355 95 - 226 ASHBY 17,133 9 - 14 ASHBY 4,911

76 - 163 ASHBY 28,911 95 - 222 ASHBY 16,688 89 - 205 ASHBY 4,911

80 - 175 ASHBY 28,688 15 - 24 ASHBY 16,022 1 - 2 ASHBY 4,466

24 - 44 ASHBY 28,022 45 - 107 ASHBY 15,355 75 - 158 ASHBY 4,466

39 - 93 ASHBY 28,022 68 - 147 ASHBY 15,355 32 - 70 ASHBY 4,022

76 - 161 ASHBY 27,800 86 - 204 ASHBY 15,355 26 - 53 ASHBY 3,577

80 - 174 ASHBY 27,577 11 - 15 ASHBY 14,911 95 - 218 ASHBY 3,577

95 - 214 ASHBY 25,800 93 - 210 ASHBY 14,466 65 - 140 ASHBY 3,355

16 - 27 ASHBY 24,688 80 - 183 ASHBY 14,466 59 - 126 ASHBY 3,133

24 - 47 ASHBY 24,466 80 - 180 ASHBY 14,244 68 - 146 ASHBY 2,911

75 - 157 ASHBY 24,466 49 - 111 ASHBY 14,022 6 - 11 ASHBY 2,688

20 - 37 ASHBY 23,800 34 - 76 ASHBY 13,800 12 - 19 ASHBY 2,688

58
Continuación…

Azotobacter spp. Indoles Azotobacter spp. Indoles Azotobacter spp. Indoles

código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

89 - 206 ASHBY 23,800 96 - 235 ASHBY 13,800 76 - 166 ASHBY 2,688

95 - 227 ASHBY 23,577 26 - 56 ASHBY 12,911 95 -221 ASHBY 2,688

16 - 28 ASHBY 23,355 65 - 135 ASHBY 12,688 72 - 153 ASHBY 2,466

44 - 104 ASHBY 23,133 36 - 82 ASHBY 12,022 63 - 130 ASHBY 2,022

95 - 224 ASHBY 22,911 12 - 20 ASHBY 12,022 82 - 184 ASHBY 2,022

80 - 179 ASHBY 22,911 53 - 120 ASHBY 11,577 3 - 7 ASHBY 1,355

80 - 182 ASHBY 21,800 28 - 60 ASHBY 10,688 28 - 59 ASHBY 0,911

83 - 192 ASHBY 21,133 25 - 48 ASHBY 10,688 53 -117 ASHBY 0,911

96 - 237 ASHBY 21,133 33 - 73 ASHBY 10466 53 - 115 ASHBY 0,911

80 - 178 ASHBY 20,911 16 - 25 ASHBY 9,577 45 - 108 ASHBY 0,688

24 - 46 ASHBY 20,466 44 - 102 ASHBY 9,355 84 - 195 ASHBY 0,466

25 - 50 ASHBY 20,466 95 - 220 ASHBY 9,133 51 - 113 ASHBY 0,244

33 - 75 ASHBY 20,466 19 - 36 ASHBY 8,911 66 - 144 ASHBY 0,244

11 - 16 ASHBY 20,244 86 - 198 ASHBY 8,244 89 - 207 ASHBY 0,244

43 - 101 ASHBY 20,022 65 - 136 ASHBY 8,022

95 - 215 ASHBY 19,133 63 - 132 ASHBY 8,022

59
Tabla 9. Indoles producidos (ppm) por Azotobacter spp. aisladas de Asparagus
officinalis L. en medio LG
Azotobacter spp. Indoles Azotobacter spp. Indoles Azotobacter spp. Indoles
código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm) código UNPRG (ppm)

76 - 165 LG 59,577 44 - 109 LG 11,577 96 - 211 LG 5,355

12 - 30 LG 58,688 82 - 175 LG 10,688 27 - 52 LG 4,911

13 - 32 LG 43,133 50 - 117 LG 10,688 27 - 63 LG 4,911

25 - 60 LG 38,244 39 -99 LG 10,466 27 - 66 LG 4,244

76 - 164 LG 36,022 31 - 77 LG 10,244 89 - 201 LG 4,244

7 - 19 LG 33,355 2 - 4 LG 9,800 47 - 110 LG 4,022

87 - 190 LG 31,800 28 - 67 LG 9,800 8 -25 LG 3,355

13 - 33 LG 30,022 88 - 200 LG 9,800 86 - 186 LG 3,355

88 - 194 LG 29,355 86 - 187 LG 9,577 48 - 112 LG 2,911

76 - 166 LG 28,688 21 - 48 LG 9,355 40 - 102 LG 2,688

1 - 2 LG 26,022 65 - 138 LG 9,355 69 - 145 LG 2,466

69 - 147 LG 19,577 88 -192 LG 9,133 55 - 123 LG 2,466

51 120 LG 17,577 88 - 195 LG 8,688 68 - 143 LG 1,577

83 - 177 LG 15,355 35 - 87 LG 8,244 37 - 92 LG 1,133

90 - 206 LG 14,911 78 - 170 LG 7,133 6 - 15 LG 1,133

16 - 40 LG 13,355 3 - 11 LG 6,688 83 - 178 LG 1,133

30 - 46 LG 13,355 88 - 191 LG 6,688 95 - 209 LG 0,466

75 - 160 LG 13,133 87 - 188 LG 6,688 68 - 139 LG 0,244

74 - 154 LG 12,911 36 - 88 LG 6,466 68 - 144 LG 0,244

17 - 34 LG 12,688 90 - 204 LG 6,466 61 - 131 LG 0,244

88- 196 LG 12,466 82 - 173 LG 6,244

3 -10 LG 11,577 15 - 38 LG 5,355

60
4.3 Cultivos de Azotobacter spp. seleccionados
Los ocho cultivos de Azotobacter spp. seleccionados correspondieron a
Azotobacter spp.12-17ASHBY y 16-28ASHBY con 34,527 y 33,553ppm de
amonio; Azotobacter spp.95-221ASHBY y 25-60LG con 5,050 y 5,391ppm de
fósforo soluble; Azotobacter spp.21-42ASHBY y 76-165LG con 62,022 y
59,577ppm de indoles; Azotobacter sp.95-215ASHBY con 32,597ppm de amonio y
4,768ppm de fósforo soluble y Azotobacter spp.76-164LG con 21,650ppm de
amonio y 36,022ppm de indoles (Tabla 10).

4.4 Efecto de Azotobacter spp. en la altura y número de tallos de Asparagus

officinalis L.
Los valores de altura y número de tallos de las plantas de espárrago
presentaron distribución normal (p>0,05) y homogeneidad de varianza (p>0,05),
por lo que se realizó el análisis de varianza de un solo factor y la prueba múltiple
de Tukey (Anexos 7 a 12). La altura de las plantas de espárrago a los 30 días fue
de 41,07-51,40cm con Azotobacter spp., 38,00cm en el testigo absoluto y 45,67cm
en el testigo químico (Figuras 44 a 47), registrándose índices de efectividad de
8,072% con Azotobacter sp.21-42ASHBY y 35,264% con Azotobacter sp.
16-28ASHBY (Tabla 11). El número de tallos de las plantas de espárrago a los
30 días fue de 4,00-6,33 con Azotobacter spp., 4,00 tallos en el testigo absoluto y
3,00 en el testigo químico (Figura 48), registrándose índices de efectividad de
8,259% con Azotobacter sp.16-28ASHBY y 58,252% con Azotobacter sp.
76-164LG (Tabla 12). El análisis de varianza de los valores de altura y número de
tallos no demostró significancia (Anexos 7, 8).

La altura de las plantas de espárrago a los 45 días fue de 44,00-58,00cm

con Azotobacter spp., 42,00cm en el testigo absoluto y 49,33cm en el testigo
químico (Figuras 49 a 57), registrándose índices de efectividad de 4,762% con
Azotobacter sp.25-60LG y 38,094% con Azotobacter sp.16-28ASHBY (Tabla 11).

61
Tabla 10. Valores (ppm) de amonio, fósforo soluble e indoles correspondientes a
cultivos de Azotobacter spp. seleccionados

Azotobacter Amonio Fósforo Indoles

spp. (ppm) soluble (ppm) (ppm)
código UNPRG
12-17ASHBY 33,553 4,024 6,688
16-28ASHBY 34,527 2,072 23,355
95-221ASHBY 19,031 5,050 2,688
25-60LG 13,001 5,391 38,244
21-42ASHBY 20,207 4,356 62,022
76-165LG 17,229 2,985 59,577
95-215ASHBY 32,597 4,768 19,133
76-164LG 21,770 0,391 36,022

b c d
a

Figura 44. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
12-17ASHBY, d) Azotobacter sp. 16-28ASHBY.

62
 a b c d

Figura 45. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
25-60LG, d) Azotobacter sp. 95-221ASHBY.

a b c d

Figura 46. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
76-165LG, d) Azotobacter sp. 21-42ASHBY.

63
 60
51,40
50 46,67 45,67 45,13 43,63
41,33 41,20 41,07
40 38,00
Altura (cm)

31,83
30

20

10

Figura 47. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de
Azotobacter spp.

Tabla 11. Índices de efectividad (%) de Azotobacter spp. en la altura de

Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

IE%
Azotobacter spp.
código UNPRG 30 días 45 días 60 días
12-17ASHBY 8,767 9,528 3,519
16-28ASHBY 35,264 38,094 28,985
95-221ASHBY 22,823 17,457 7,660
21-42ASHBY 8,072 4,762 0
25-60LG 0 0 0
76-165LG 18,762 24,591 17,184
95-215ASHBY 14,820 19,453 26,915
76-164LG 8,422 14,693 10,351

T. químico 20,184 17,452 6,911

64
 7
6,33
6 5,67
5,33 5,33
5
4,33
Número de tallos

4,00 4,00 4,00

4 3,67
3,00
3

Figura 48. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación
de Azotobacter spp.

Tabla 12. Índices de efectividad (%) de Azotobacter spp. en el número de tallos

de Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días

IE%
Azotobacter spp.
código UNPRG 30 días 45 días 60 días
12-17ASHBY 41,753 77,133 86,046

16-28ASHBY 8,259 18,250 39,534

95-221ASHBY 33,256 38,576 46,511

21-42ASHBY 33,257 38,574 86,046

25-60LG 0 0 6,976

76-165LG 0 7,856 39,534

95-215ASHBY 0 23,093 62,790

76-164LG 58,252 54,045 86,046

T. químico 0 16,750 30,947

65
 a
c
b

Figura 49. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
16-28ASHBY.

a c
b

Figura 50. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
12-17ASHBY.
66
 a c
b

Figura 51. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
95-215ASHBY.

a c
b

Figura 52. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
76-164LG.

67
 c
a b

Figura 53. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
76-165LG.

a
b c

Figura 54. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
21-42LG.

68
 a c
b

Figura 55. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
95-221ASHBY.

a c
b

Figura 56. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo químico, b) Testigo absoluto, c) Azotobacter sp.
25-60LG.

69
 70

60 58,00
52,33
50,17 49,33 49,33 48,17
50 46,00
44,00
42,00
40 36,00
Altura (cm)

30

20

10

Figura 57. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación
de Azotobacter spp.

70
 El número de tallos de las plantas de espárrago a los 45 días fue de
4,00-7,67 con Azotobacter spp., 4,00 tallos en el testigo absoluto y 4,67 tallos en el
testigo químico (Figura 58), registrándose índices de efectividad de 7,856% con
Azotobacter sp.76-165LG y 77,133% con Azotobacter sp.12-17ASHBY (Tabla 12).
El análisis de varianza de los valores de altura y número de tallos no demostró
significancia (Anexos 9, 10).

La altura de las plantas de espárrago a los 60 días fue de 50,00-62,33cm

con Azotobacter spp., 48,33cm en el testigo absoluto y 51,67cm en el testigo
químico (Figuras 59 a 67), registrándose índices de efectividad de 3,519% con
Azotobacter sp.12-17ASHBY y 28,985% con Azotobacter sp.16-28ASHBY
(Tabla 13). El análisis de varianza de los valores de altura demostró alta
significancia (Anexo 11) y según la prueba múltiple de Tukey el mayor valor se
alcanzó con Azotobacter sp.16-28ASHBY, no diferenciándose significativamente
de Azotobacter sp.95-215ASHBY, pero si de los demás tratamientos (Tabla 13). El
número de tallos de las plantas de espárrago a los 60 días fue de 4,67-8,00 con
Azotobacter spp., 4,33 tallos en el testigo absoluto y 5,67 tallos en el testigo
químico (Figura 68), registrándose índices de efectividad de 6,976% con
Azotobacter sp.25-60LG y 86,046% con Azotobacter sp.12-17ASHBY (Tabla 13).
El análisis de varianza de los valores de número de tallos no demostró
significancia (Anexo 12).

Azotobacter sp.25-60LG no incrementó la altura de las plantas de

espárrago a los 30, 45 y 60 días (Tabla 11), ni tampoco el número de tallos a los
30 y 45 días (Tabla 12). A su vez, Azotobacter spp.16-28ASHBY y 95-221ASHBY
superaron al testigo químico en los índices de efectividad en la altura y número de
tallos a los 30, 45 y 60 días, respectivamente (Tabla 11, 12).

71
 9

8 7,67

7 6,67
6,00 6,00
Número de tallos

6 5,33
5 4,67 4,67
4,33
4,00 4,00
4

Figura 58. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación
de Azotobacter spp.

a b c

Figura 59. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
76-164LG.

72
 b c
a

Figura 60. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
95-221ASHBY.

c
b
a

Figura 61. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
12-17ASHBY.

73
 a b c

Figura 62. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
21-42LG.

a b c

Figura 63. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
95-215ASHBY.

74
 a b c

Figura 64. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
76-165LG.

a b c

Figura 65. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
16-28ASHBY.

75
 c
a b

Figura 66. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo químico, c) Azotobacter sp.
25-60LG.

70
62,33 61,33
60 56,67
54,67
52,00 51,67 50,00 48,33
50 46,33
39,67
Altura (cm)

40

30

20

10

Figura 67. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación de
Azotobacter spp.

76
 Tabla 13. Prueba de Tukey de la altura de plantas de Asparagus officinalis L. a
los 30, 45 y 60 días después de la inoculación de Azotobacter spp.

.
Altura (cm)
Azotobacter spp.
código UNPRG 30 días Sign 45 días Sing 60 días Sign.
12-17ASHBY 41,33 a 46,00 a 50,00 ab
16-28ASHBY 51,40 a 58,00 a 62,33 a
95-221ASHBY 46,67 a 49,33 a 52,00 ab
21-42ASHBY 41,07 a 44,00 a 46,33 ab
25-60LG 31,83 a 36,00 a 39,67 b
76-165LG 45,13 a 52,33 a 56,67 ab
95-215ASHBY 43,63 a 50,17 a 61,33 a
76-164LG 41,20 a 48,17 a 54,67 ab
T. absoluto 38,00 a 42,00 a 48,33 ab
T. químico 45,67 a 49,33 a 51,67 ab

9
8,00 8,00 8,00
8 7,67
7,00
7 6,33
6,00
6 5,67
Número de tallos

5 4,67
4,33
4

Figura 68. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación
de Azotobacter spp.

77
 V. DISCUSIÓN

En muestras de rizoplano y rizósfera de espárrago se aislaron bacterias

fijadoras de nitrógeno o diazotròficas aerobias, coincidiendo con Escobar et al.,
2011 (hortalizas), Ramírez & Ugaz, 2014 (arroz) y Jara & Tafur, 2015 (maíz).
La rizósfera es el volumen de suelo adherido al rizoplano o superficie de las
raíces (Aguado, 2012), en el que los compuestos exudados por los vegetales y
presentes en la materia orgánica están disponibles para el crecimiento
microbiano (Zahar et al., 2008).

Las bacterias diazotròficas se aislaron en los medios sòlidos sin

nitrógeno agar Ashby y LG, con y sin previo enriquecimiento, respectivamente.
El enriquecimiento permite incrementar los microorganismos investigados y
disminuir los contaminantes de una muestra biológica (Madigan et al., 2004),
aseveración confirmada por Escobar et al. (2011) y Germán (2015) en
bacterias diazotròficas de raíces y rizósfera de hortalizas y Saccharum
officinarum L. “caña de azúcar”.

Las colonias de consistencia mucosa se seleccionaron para identificar

Azotobacter spp., coincidiendo con Rojas (2013), Rojas & Vásquez (2014) y
Jara & Tafur (2015). El aspecto mucoso indica la producción de
exopolisacáridos (Luque et al., 2010), característica de las especies de
Azotobacter (Escobar et al., 2011) que favorece la fijación de nitrógeno en
aerobiosis (Coyne, 2000). Asimismo, el viraje del indicador en medios líquidos y
sólidos también fue una característica diferencial del género Azotobacter, que
agrupa bacterias productoras de acidez a partir de la sacarosa, componente de
los medios Ashby y LG, con la consecuente disminución del pH (Escobar et al.,
2011).aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa a
78
 El número de cultivos de bacterias diazotróficas disminuyó después del
subcultivo en medio sólido sin nitrógeno porque se eliminaron aquellas que no
fijaron el nitrógeno molecular (Ramírez & Ugaz, 2014). Con la técnica de
subcultivo se purifican las bacterias, se evita el crecimiento de saprófitos y se
minimizan los falsos positivos (Rico, 2009; Rojas, 2013; Jara & Tafur, 2015).

En el 87,87% (Ashby) y 64,52% (LG) de las bacterias fijadoras de nitrógeno

aerobias se identificó el género Azotobacter resultado que denota la presencia de
otros géneros en el rizoplano y rizósfera de espárrago. Las bacterias fijadoras de
nitrógeno pueden ser rizosféricas, que habitan en el suelo rizosférico o la
superficie de las raíces (Aguado, 2012) como Azotobacter, Beijerinckia y
Azomonas (Mayz, 2004) y pueden ser endófitas, que viven dentro de los tejidos,
pero en algún momento de su ciclo de vida se encuentran fuera (Bandera, 2013).
Estas bacterias son aisladas del interior de los tejidos vegetales, pero también del
suelo rizosférico (Beracochea, 2011).

En el medio Ashby se obtuvo el mayor número de bacterias fijadoras de

nitrógeno y cultivos de Azotobacter spp., resultado atribuido al enriquecimiento
previo de las bacterias (Escobar et al., 2011). Este medio también fue utilizado
para aislar Azotobacter spp. sin previo enriquecimiento, mediante la técnica de
siembra de gránulos de suelo (Kizilkaya, 2009; Obando, 2012). Asimismo, el
medio LG también fue utilizado por Garrido (2007), Guzmán et al. (2012) y
Ramírez & Ugaz (2014).

El género Azotobacter se identificó fenotípicamente, coincidiendo con

Reyes et al. (2008), Orozco & Martínez (2009), Obando et al. (2010), Guzmán et
al. (2012) y Jara & Tafur (2015); no obstante, las técnicas convencionales de
identificación fenotípica deben ser complementadas con técnicas moleculares
como el Análisis de Restricción del DNA ribosomal 16S Amplificado: ARDRA
(Jiménez, 2007; Obando, 2012).

En las muestras de raíces con suelo rizosférico de espárrago se aisló e

identificó Azotobacter spp., bacterias que también fueron reportados en hortalizas
(Jiménez, 2007), bambú (Sachin & Misra, 2009), arroz (Vallejo et al., 2008), pino
(Orozco & Martínez, 2009), maíz (Salhia, 2010), eucalipto (Obando et al., 2010),

79
tomate (Escobar et al., 2011), algodón (Guzmán et al., 2012), frijol caupí (Obando,
2012) e incluso malezas (Rojas, 2013).

Los cultivos de Azotobacter spp. fijaron nitrógeno in vitro, cuantificándose

hasta 34,527ppm de amonio, valor similar a 35ppm reportadas por Rojas &
Vásquez (2014) para aislados de maíz. Asimismo, se superó el rango
1,62-12,08ppm registrado por Lara et al. (2007), Escobar et al. (2011) y Ramírez &
Ugaz (2014) para Azotobacter spp. de rastrojos, hortalizas y arroz,
respectivamente. En la presente investigación mediante la técnica de Berthelot o
fenol-hipoclorito se realizó una medición indirecta del nitrógeno fijado como
amonio (Lara et al., 2007); no obstante, también se puede realizar una medición
directa con la técnica de reducción de acetileno, ARA (Orozco & Martínez, 2009;
Obando, 2012).

Los cultivos de Azotobacter spp. solubilizaron fosfato tricálcico,

cuantificándose hasta 5,391ppm de fósforo soluble, valor inferior a 6,06ppm
reportadas por Rojas (2013), para aislados de la rizósfera de malezas. La
capacidad de estas bacterias para solubilizar fosfatos insolubles ha sido
demostrada previamente por Rojas & Moreno (2008), Obando (2012), Exebio
(2013) y Rojas & Vásquez (2014), liberándose fósforo soluble que puede ser
aprovechado por las plantas (Becerra et al., 2011; Álvarez, 2012).

Los cultivos de Azotobacter spp. produjeron indoles, cuantificándose hasta

62,022 ppm, valor superior al rango 27-60ppm reportado por Obando et al. (2010),
Obando (2012) y Rojas (2013) para aislados de eucalipto, frijol caupí y malezas,
respectivamente. Los indoles se cuantificaron mediante la reacción de
colorimétrica de Salkowsky, específica para estos compuestos, que agrupan el
ácido indolacético (Celis & Gallardo, 2008).

El potencial de Azotobacter spp. como promotoras de crecimiento en

plantas se atribuye a mecanismos directos como la fijación de nitrógeno (Obando
et al., 2010),solubilizacion de fosfatos (Obando, 2012) y producción de indoles
(Lara et al., 2011). En este contexto, se seleccionaron los cultivos de Azotobacter
spp. que alcanzaron los mayores valores en la concentración de amonio, fosforo
soluble e indoles, coincidiendo con Obando (2012), Rojas (2013) y Rojas &

80
Vásquez (2014); no obstante, también se pueden seleccionar solo por los índoles
producidos (Lara et al., 2011), nitrógeno fijado y fosfatos solubilizados (Reyes et
al., 2008), fosfato solubilizado, índoles producidos y efecto en la germinación
(Clavijo et al., 2012).

Las bacterias del género Azotobacter, fijadoras de nitrógeno,

solubilizadoras de fosfato y productoras de indoles, a excepción de Azotobacter
sp.25-60LG, influyeron positivamente el desarrollo vegetativo de las plantas de
espárrago, observándose incremento en la altura y número de tallos. De manera
similar, el efecto positivo de Azotobacter spp. ha sido demostrado en café
(Delgado et al., 2003), hortalizas (Jiménez, 2007), pimiento (Reyes et al., 2008),
papa (Rico, 2009), pino (Orozco & Martínez, 2009), eucalipto (Obando et al.,
2010), pepinillo (Salhia, 2010), frijol caupí (Obando, 2012) y maíz (Sánchez et al.,
2014).

El efecto positivo de las PGPR como Azotobacter spp. se atribuye a

mecanismos directos e indirectos. Los directos incluyen la síntesis de reguladores
del crecimiento (auxinas, giberelinas y citoquinas), solubilización de fosfatos y
fijación de nitrógeno (Loredo et al., 2004; Lara et al., 2007). Los mecanismos
indirectos son responsables del biocontrol de plagas (Bhattacharyya & Jha, 2012).
Según la “Hipótesis Aditiva” el efecto de las PGPR se atribuye a más de un
mecanismo involucrado en la asociación planta-bacteria, los mismos que operan
simultáneamente, reflejándose en los cambios observados en el crecimiento de las
plantas (Bashan & Levnony, 1990, mencionados por Kloepper, 2003).

El incremento de la altura de las plantas por Azotobacter spp. también fue

reportado en pimentón (Reyes et al., 2008), maíz (Sánchez et al., 2014), pino
(Orozco & Martínez, 2009), tomate (González, 2000), café (Delgado et al., 2003),
trigo (García et al., 2005), pepinillo (Salhia, 2010) y pasto (Mantilla et al., 2011). El
incremento en el número de tallos por Azotobacter spp. también fue reportado por
Salhia (2010) en pepinillo.

Respecto al efecto positivo Azotobacter spp., se ha reportado incremento

en la germinación (Aly et al., 2012), longitud radicular (Sachin & Mirsa, 2009),
biomasa aérea y radicular (Escobar et al., 2011), número de botones florales

81
(Reyes et al., 2008), contenido de nitrógeno en raíces (Salhia, 2010) hojas y suelo
(Orozco & Martínez, 2009) número de ramas y hojas (Salhia, 2010), clorofila en
hojas (Obando, 2012), contenido de nitrógeno, fósforo y potasio en frutos
(Gonzáles et al., 2003) y rendimiento (Jarak et al., 2012).

Azotobacter sp.25-60LG seleccionada por alcanzar el mayor valor de

fósforo soluble y uno los mayores valores en indoles afectó negativamente la
altura de las plantas de espárrago, coincidiendo con Constantino et al. (2011),
quienes observaron disminución en la altura de plántulas de papaya inoculadas
con A. choroococcum. Este resultado contradictorio con la definición de una PGPR
también fue reportado como disminución de la germinación de maíz (Rojas, 2013),
biomasa fresca de lechuga (Rico, 2009), altura, biomasa redicular y aérea de maíz
(Córdova & Manayay, 2013).

Respecto al efecto negativo de las PGPR existen diversas explicaciones;

no obstante, no se pueden uniformizar a todos los géneros. Rico (2009) demostró
que los metabolitos volátiles de Azotobacter spp. disminuyeron el peso freso de
plantas de lechuga; sin embargo, estos compuestos sintetizados por un
actinomiceto incrementaron hasta 35% en peso. Por su parte, Salhia (2010)
observó que A. chroococcum fijadora de nitrógeno incrementó el desarrollo
vegetativo en los primeros estadíos de plántulas de pepinillo; no obstante,
posteriormente el peso de la biomasa fue menor que en las plantas fijadas
fertilizados con químico. Tambien se ha sugerido que altas concentraciones de
auxinas en los tejidos inducen la síntesis de etileno, que a su vez inhibe la
elongación de las raíces (Camelo et al., 2011; Loredo et al., 2004).

Los índices de efectividad de Azotobacter spp.16-28ASHBY y

95-221ASHBY superaron inclusive al testigo químico, coincidiendo con Piscoya &
Ugaz (2016). Por el contrario, Yasari et al. (2008) observaron que un biofertilizante
constituido por Azotobacter sp. y Azospirillum sp. no afectó significativamente el
rendimiento de Brassica napus L., pero cuando se aplicó junto a fertilizante
químico nitrogenado o fosfatado o con ambos, el aumento en el rendimiento fue
significativo. También se ha reportado que con Azotobacter spp. se disminuyó el
fertilizante químico en 25% en cebolla (Balemi et al., 2007) y 50% en trigo (García

82
et al., 2005) y maíz (Sánchez et al., 2014; Piscoya & Ugaz, 2016). En este
contexto, el efecto de Azotobacter spp.12-17, 16-28, 95-221, 21-42, 76-165,
95-215 y 76-164 en el desarrollo vegetativo y rendimiento de espárrago debe ser
investigado en condiciones de campo (Carreño, 2009), para constituir
biofertilizantes que puedan ser aplicados solos o en conjunto con dosis
disminuidas de fertilizante químico.

83
 VI. CONCLUSIONES

 En el rizoplano y rizósfera de espárrago se aislaron e identificaron

fenotípicamente 198 cultivos de Azotobacter spp.

 Los cultivos de Azotobacter spp. fijaron nitrógeno, solubilizaron

fosfato y produjeron indoles, cuantificándose 3,406 a 34,527ppm de
amonio; 0,275 a 5,391ppm de fosfato y 0,244 a 62,022ppm de
índoles.

 Los cultivos de Azotobacter spp. seleccionados correspondieron a

Azotobacter spp.12-17ASHBY y 16-28ASHBY con 33,553 y
34,527ppm de amonio; Azotobacter spp.95-221ASHBY y 25-60LG
con 5,050 y 5,391ppm de fósforo soluble; Azotobacter spp.
21-42ASHBY y 76-165LG con 62,022 y 59,577ppm de indoles;
Azotobacter sp.95-215ASHBY con 32,597ppm de amonio y
4,768ppm de fósforo soluble y Azotobacter spp.76-164LG con
21,650ppm de amonio y 36,022ppm de índoles.
 Las bacterias seleccionadas a excepción de Azotobacter sp.
25-60LG, incrementaron la altura y número de tallos de las plantas de
espárrago con índices de efectividad de 3,519 a 38,094% y
8,259 a 86,046% respectivamente.

84
 VII. RECOMENDACIONES
 Identificar a nivel molecular Azotobacter spp.12-17, 16-28,
95-221, 21-42, 76-165, 95-215 y 76-164.
 Determinar el efecto de Azotobacter spp.12-17, 16-28, 95-221,
21-42, 76-165, 95-215 y 76-164 en el desarrollo vegetativo y
rendimiento en condiciones de campo, con y sin dosis de
fertilizante químico.
 Investigar sustratos orgánicos de bajo costo para el incremento
masivo de Azotobacter spp. 12-17, 16-28, 95-221, 21-42, 76-165,
95-215 y 76-164.

85
 VIII. RESUMEN

En el rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. “espárrago” se aislaron

bacterias de género Azotobacter, con el objetivo de determinar su potencial como
promotoras de crecimiento en plantas. Las bacterias con y sin enriquecimiento se
aislaron en los medios sólidos sin nitrógeno Ashby sacarosa y LG y se
identificaron fenotípicamente. Se cuantificó el nitrógeno fijado como amonio,
fósforo soluble producto de la solubilización de fosfato tricálcico e indoles
producidos por las bacterias in vitro. Los ocho cultivos de bacterias
(9 x 108 cel mL-1) que alcanzarón los mayores valores se inocularon por aspersión
en coronas de espárrago cultivar UC-157 F2 y se determinó el efecto en la altura y
número de tallos, durante 60 días en invernadero. Se aisló e identificó Azotobacter
spp., obteniéndose 198 cultivos puros, con los que se cuantificaron
3,406 a 34,527ppm de amonio; 0,275 a 5,391ppm de fósforo soluble y
0,244 a 62,022ppm de indoles. Los cultivos de bacterias seleccionados, a
excepción de Azotobacter sp.25-60LG incrementaron la altura y número de tallos
de las plantas de espárrago, con índices de efectividad de 3,519 a 38,094% y
8,259 a 86,046%, respectivamente. Se demostró la promoción de crecimiento de
las plantas de espárrago por Azotobacter spp.

86
 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Agrobanco (2007). Área de desarrollo. Cultivo del espárrago. Lima, Perú.

Recuperado de
http://www.agrobanco.com.pe/pdfs/publicacionagroinforma/2_cultivo_de
l_esparrago.pdf
Aguado, S. (Ed.). (2012). Introducción al Uso y Manejo de los Biofertilizantes en
la Agricultura. México: Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
Agrícolas y Pecuarias, INIFAP/Secretaría de Agricultura, Ganadería,
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, SAGARPA.
Agüero, A. (2009). Producción de bacterias fijadoras de nitrógeno (Azotobacter,
Bacillus y Pseudomonas); en medio líquido a base de maleza, para su
aplicación en el cultivo de caña de azúcar (Saccharum spp.) en
azucarera el Viejo. (Tesis de Biología). Instituto Tecnológico de Costa
Rica, Costa Rica.
Albuquerque, M. (2014). Factores que determinan la demanda internacional
del espárrago fresco del Perú, periodo 1992-2013. (Tesis de
Licenciatura). Universidad Privada Antenor Orrego, Perú.
Altamirano, C., Carreño, C., Plasencia, V., Ramírez, L., Silva, J. & Ugaz, F.
(2014). Bacterias rizosféricas y endófitas fijadoras de nitrógeno.
Lambayeque, Perú: Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Alvarado, P. & Valderrama, M. (2014). Caracterización de los géneros
Burkholderia y Pseudomonas solubilizadoras de fosfato aisladas de Zea
mays L. en el distrito de Reque en Lambayeque, marzo-mayo, 2014.
(Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo, Perú.
Álvarez, P. (2012). Selección y evaluación de microoganismos solubilizadores
de fosfatos en suelos calcáreos del valle del Mantaro. (Tesis de
Maestría). Universidad Nacional Agraria La Molina, Perú.

87
Aly, M., El-Sayed, H. & Jastaniah, S. (2012). Synergistic effect between
Azotobacter vinelandii and Streptomyces sp. isolated from saline soil on
seed germination and growth of wheat plant. Journal of American
Science, 8(5), 667-676.
Ashrafi, V. & Seiedi, M. (2011). Influence of different plant densities and plant
growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield and yield attributes of
corn (Zea mays L.). Recent Research in Science and Technology, 3(1),
63-66.
Balemi, T., Pal, N. & Saxena, A. (2007). Responce of onion (Allium cepa L.) to
combined application of biological and chemical nitrogenous fertilizers.
Acta Agriculturae Slovenica, 89(1), 107-114.
Bandera, R. (2013). Rehabilitación de suelos salino-sódicos: Evaluación de
enmiendas y de especies forrajeras. (Tesis de Maestría). Universidad
Nacional de la Plata, Argentina.
Becerra, J., Quintero, D., Martínez, M. & Matiz, A. (2011). Caracterización de
microorganismos solubilizadores de fosfatos aislados de suelos
destinados al cultivo de uchuva (Physalis peruviana L.). Revista
Colombiana de Ciencias Hortícolas, 5(2), 195-208.
Beracochea, M. (2011). Respuesta de variedades comerciales de maiz (Zea
mays L.) a la inoculacion con bacterias endófitas diazotrofas nativas.
(Tesis de Licenciatura). Universidad de la República, Uruguay.
Bernabé, S. (2011). Análisis económico del empleo de dos hibridos (UC-157 y
Italo) de espárrago verde con destino a diferentes mercados. (Tesis de
Ingenería). Pontificia Universidad Católica Argentina, Argentina.
Bhattacharyya, P. & Jha, D. (2012). Plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR): emergence in agriculture. World Journal Microbiology and
Biotechnology, 28, 1327-1350.
Borda, D., Pardo, J., Martinez, M. & Montaña, J. (2009). Producción de un
biofertilizante a partir de un aislamiento de Azotobacter nigricans
obtenido en un cultivo de Stevia rebaudiana Bert. Revista Universitas
Scientiarum, 14(1), 71-78.
Borrego, A. (2014). Las enmiendas orgánicas del suelo en el control de las
Fusariosis del espárrago y del tomate (Tesis de Doctorado).
Universidad de Córdoba, España.

88
Cadena, S. & Martínez, B. (2011). Caracterización de cepas de Pseudomonas
spp. y su efecto en la germinación y emergencia de Zea mays L. “maíz”
en Lambayeque. (Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional Pedro
Ruíz Gallo, Perú.
Canto, B., Hurtado, E., Ma W., Wang, C. & Wang, N. (2008). Proyecto de
importación de espárragos verdes frescos. Madrid, España: Universidad
Complutense de Madrid.
Camelo, M., Vera, S. & Bonilla, R. (2011). Mecanismos de acción de las
rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Revista Corpoíca -
Ciencia y Tecnología Agropecuaria, 12 (2), 159-166.
Carreño, C. (2009). Efecto de la inoculación de bacterias nativas
solubilizadoras de fósforo en el desarrollo y rendimiento de tres cultivos
agrícolas en Mochumí, Lambayeque, Perú. (Tesis de Doctorado).
Universidad Nacional de Trujillo, Perú.
Celis, L. & Gallardo, I. (2008) Estandarización de métodos de detección para
promotores de crecimiento vegetal (acido indolacético y giberalinas) en
cultivos microbianos. (Tesis de Microbiólogo Agrícola y Veterinario).
Pontificia Universidad Javeriana, Colombia.
Clavijo, C., Chipana, V., Centeno, J., Zúñiga, D., & Guillén, C. (2012)
Aislamiento, caracterización e identificación de bacterias diazotróficas
de la rizósfera del cultivo de Olea europea "olivo" en Tacna Perú.
Ecología Aplicada, 11(2), 89-102.
Constantino, M., Gómez, R., Alvarez, J., Pat, J. & Espin, E. (2011). Efecto de
la inoculación de Azotobacter chroococcum y Glomus intraradices en el
crecimiento y nutrición de plántulas de papaya en fase de vivero.
Agronomía Costarricense, 35(1), 15-31.
Córdova, R. & Manayay, C. (2013). Efecto de rizobacterias aisladas de
malezas en el desarrollo vegetativo de Zea mays L. maíz, en
condiciones de invernadero, en Lambayeque 2013. (Tesis de
Licenciatura). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Córdova, L. (2016). Efecto de Azospirillum spp. nativas en el desarrollo
vegetativo de Zea mays L. “maíz” en invernadero. (Tesis de Maestría).
Universidad Nacional de Trujillo, Perú.
Coyne, M. (2000) Microbiología del Suelo: Un enfoque exploratorio. España:
Editorial Paraninfo.
Dávila, J. (2004). Elementos para una agricultura orgánica e introducción de
cultivos alternativos para suelos con problemas de salinidad. (Tesis de
Maestría). Universidad Autónoma de Nuevo León, México.

89
Delgado, A. (2007). Producción y comercialización de espárrago en el valle de
Virú. (Tesis de Maestría). Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas,
Perú.
Delgado, Y., Cupull, R., Pérez, C., Sánchez, A. & Vílchez, M. (2003). Efecto de
Azotobacter spp. en la estimulación de la germinación y el desarrollo de
posturas de Coffea arabica L. Centro Agrícola, 30(1), 26-32.
Doumbou, C., Hamby, M., Crawford, D. & Beaulieu, C. (2002). Actinomycetes,
promising tools to control plant diseases and to promote plant growth.
Phytoprotection, 82, 85-102.
Escobar, C.; Horna, Y.; Carreño, C. & Mendoza, G.( 2011). Caracterización de
cepas nativas de Azotobacter spp. y su efecto en el desarrollo de
Lycopersicon esculentum Mill. “tomate” en Lambayeque. Scientia
Agropecuaria 2(1), 39-49.
Exebio, J. (2013). Efecto de Azotobacter spp. nativas en el desarrollo
vegetativo de Zea mays L. maíz, en condiciones de invernadero, en
Lambayeque 2013. (Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional Pedro
Ruiz Gallo, Perú.
Farías, V., Krarup, C. & Contreras, S. (2004). Efectos de población sobre
rendimiento y calidad de turiones de cuatro cultivares de espárrago.
Scientia Agropecuaria 31, 119-127.
Franco, M. (2008). Evaluación de caracteres PGPR en actinomicetos e
interacciones de estas rizobacterias con hongos formadores de
micorrizas (Tesis de Doctorado). Universidad de Granada, España.
García, F. & Muñoz, H. (2010). Caracterización de cepas nativas de
Azospirillum spp. y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo
de arroz (Oryza sativa). (Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional
Pedro Ruíz Gallo, Perú.
García, M., Farías, R., Peña, J. & Sánchez J. (2005). Inoculación del trigo var.
Pavón con Azospirillum spp. y Azotobacter beijerinckii. Terra
Latinoamericana, 23(1), 65-72.
Garrido, R. (2007). Aislamiento e identificación de bacterias diazotróficas
rizosféricas y endófitas asociados a suelos y pastos del valle y sabana
del Cesar en dos épocas climáticas. (Tesis de Maestría). Universidad
Militar Nueva Granada, Colombia.

90
Germán, J. (2015). Efecto de las concentraciones de Azotobacter sp. aislado
de rizosféra de suelo de Saccharum officinarum sobre el crecimiento de
Lycopersicum esculentum “tomate”. (Tesis de Biólogo–Microbiólogo).
Universidad Nacional de Trujillo, Perú.
González, M. (2000). Efecto de un inoculante microbiano a partir de cepas
nativas de Azotobacter chroococcum sobre el rendimiento en
secuencias de cultivos hortícolas. (Tesis Maestría). Universidad de
Camaguey, Cuba.
Gonzáles, M., Martínez, R., Corrales, I., Pérez, D., Gandarilla, J., Alonso, R.,
Curbelo, R. & Méndez, V. (2003). Efectividad de un bioestimulador en la
calidad de las hortalizas como sostenibilidad de las producciones en la
agricultura urbana. Centro Agrícola, 4(30), 10-15.
Guillén, R., Hernández, F., Gallegos, G., Rodríguez, R., Aguilar, C., Padrón, E.
& Reyes, M. (2006). Bacillus spp., como biocontrol en un suelo
infestado con Fusarium spp., Rhizoctonia solani Kuhn y Phytophthora
capsici Leonian y su efecto en el desarrollo y rendimiento del cultivo de
chile (Capsicum annuum L.). Revista Mexicana de Fitopatología, 24(2),
105-114.
Guzmán, A., Obando, M., Rivera, D. & Bonilla, R. (2012). Selección y
caracterización de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal
(RPCV) asociadas al cultivo de algodón (Gossypium hirsutum). Revista
Colombiana de Biotecnología, 14(1), 182-190.
Hernández, R., Fernández, C., & Baptista, P. (2003). Metodología de la
Investigación. (5ta ed.). Mexico: Mc Grow, Hill Interamericana Editores
S.A.
Hernández, A., Heydrich, M., Velázquez, M. & Hernández, A. (2006).
Perspectivas del empleo de rizobacterias como agentes de control
biológico en cultivos de importancia económica. Revista Mexicana de
Fitopatología, 24 (1), 42-49.
Idris, E., Iglesias, D., Talon, M. & Borriss, R. (2007). Trytophan-dependent
production of índole-3-acetic acid (IAA) affects level of plant growth
promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Molecular Plant-
Microbe Interactions (MPMI), 20(6), 619-626.
Jara, I. & Tafur, J. (2015). Rendimiento de polihidroxialcanoatos de
Azotobacter spp. aisladas de suelo rizosférico de Zea mays L. en
Lambayeque, agosto-obtubre, 2014. (Tesis de Licenciatura).
Universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo, Perú.

91
Jarak, M., Mrkovacki, N., Bjelic, D., Josic, D., Hajnal- Jafari, T. & Stamenov, D.
(2012). Effects of plant growth promoting rhizobacteria on maize in
greenhouse and field trial. African Journal of Microbology Research,
6(27), 5683-5690.
Jiménez, D. (2007) Caracterización molecular de cepas nativas colombianas
de Azotobacter spp. mediante el análisis de restricción del DNA
ribosomal 16S. (Tesis de Microbiólogo Industrial). Pontificia Universidad
Javeriana, Colombia.
Karnwal, A. (2009). Production of indole acetic acid by fluorescent
Pseudomonas in the presence of L-trhyptophan and rice root exudates.
Journal of plant Pathology, 91(1), 61-63.
Kizilkaya, R. (2009). Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp. strains
isolated from soils in different ecosystems and relationship between
them and the microbiological properties of soils. Journal of
Environmental Biology, 30(1), 73-82.
Kirschenbilder, E., Castagnino, A., Díaz, K., Rosini M. & Falavigna A. (2015).
Cadena espárrago: producción de diferentes genotipos en su quinto año
y comportamiento en poscosecha. Agronomía Mesoamericana, 26(1),
99-109.
Kloepper, J. (2003). A review of mechanisms for plant growth promotion by
PGPR. 6 th International PGPR workshop 5-10 october, Calicut, India.
Kumar, G., Yadav, S., Thawale, P., Singh, S. & Juwarkar, A. (2008). Growth of
Jatropha curcas on heavy metal contaminated soil amended with
industrial wastes and Azotobacter – A greenhouse study. Bioresource
Technology 99, 2078-2082.
Lara, C., Villalba, M. & Oviedo, L. (2007). Bacterias fijadoras asimbióticas de
nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos. Córdova, Colombia.
Revista Colombiana de Biotecnología, IX (2), 6-14.
Lara, C., Oviedo, L. & Alemán, A. (2011a). Aislados nativos con potencial en la
producción de ácido indol acético para mejorar la agricultura.
Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 9 (1), 17-23.
Lara, C., Oviedo, L. & Betancur, C. (2011b). Bacterias nativas con potencial en
la producción de ácido indolacético para mejorar los pastos. Zootecnia
Tropical, 29 (2), 187-194.
Loredo, C., López, L. & Espinosa, D. (2004). Bacterias promotoras del
crecimiento vegetal asociadas con gramíneas: Una revisión. Terra
Latinoamericana, 22 (2), 225-239.

92
Luque, R., Quesada, E., Bejar, V. & Llamas, I. (2010). Aislamiento de cepas
del genero Halomonas con interés biotecnológico en Rambla Salada
(Murcia). Ars Pharmaceutica, 51 (3), 453-462.
Madigan, M.; Martinko, J. & Parker, J. (2004) Brock, Biología de los
microorganismos. Décima edición. España, Editorial Pearson Educación
S.A.
Mantilla, M. (2007). Evaluación de la acción de un bioinoculante sobre un
cultivo de crisantemo (Chrysanthemun morifolium var. Yoko ono) en
periodo de enraizamiento. (Tesis de Microbiólogo Agrícola y
Veterinario). Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
Mantilla, C., Oviedo, L. & Betancur, C. (2011). Bacterias nativas con potencial
en la producción de ácido indolacètico para mejorar los pastos.
Zootecnia Tropica, 29 (2), 187–194.
Martínez, O., Jorquera, M., Crowley, D., Gajardo, G. & Mora, M. (2010).
Mechanisms and practical considerations involved in plant growth
promotion by rizobacteria. Journal of Soil Science and Plant Nutrition,
10 (3), 293-319.
Mayz, J. (2004). Fijación biológica de nitrógeno. Revista UDO Agrícola, 4 (1),
1-20.
Naz, L. Bano, A., Rehman, B., Pervaiz, S., Iqbal, M., Sarwar, A. & Yasmin, F.
(2012). Potencial of Azotobacter vinelandii Khsrl as bio-inoculant.
African Journal of Biotechnology, 11(45), 10368 – 10372.
Nihorimbere, V., Ongena, M., Smargiassi, M. & Thonart P. (2011). Beneficial
effect of the rhizosphere microbial community for plant growth and
health. Biotechnology Agronomy Society and Environment, 15(2), 327-
337.
Obando, D., Burgos, L., Rivera, D., Rubiano, M., Divan, V. & Bonilla, R. (2010).
Caracterización de bacterias diazotróficas asimbióticas asociadas al
eucalipto (Eucalyptus sp.) en Codazzi, Cesar (Colombia). Acta Biología
Colombiana, 15(3), 107-120.
Obando, D. (2012). Respuesta fisiológica de frijol caupí (Vigna unguiculata L.)
Walp a la coinoculación de bacterias diazotróficas de los géneros
Azotobacter y Rhizobium en suelos del departamento del Cesar. (Tesis
de Maestría). Universidad Nacional de Colombia, Colombia.
Orozco, C. & Martínez, P. (2009). Evaluación de la inoculación con
microorganismos fijadores de nitrógeno simbióticos aislados de la
rizósfera de Pinus patula en Colombia. Bosque, 30(2), 70 - 77.

93
Pedraza, R., Bellone, C., & de Bellone, C. (2010). Azospirillum inoculation and
nitrogen fertilization effect on grain yield and on the diversity of
endophytic bacteria in the phyllosphere of rice rainfed crop. European
Journal of Soil Biology, 45, 36-43.
Piscoya, E. & Ugaz, Z. (2016). Efecto de Azospirillum, Azotobacter y
Enterobacter spp. nativas con 50% de fertilizante químico en el
desarrollo vegetativo y rendimiento de Zea mays L. “maíz” amarillo duro
en Lambayeque, 2013. (Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional
Pedro Ruiz Gallo, Perú.
Puicón, H. (2014). Efecto de Pseudomonas spp. nativas en el desarrollo
vegetativo de Zea mays L. “maíz” en condiciones de invernadero, 2013.
(Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo, Perú.
Ramírez, L. & Ugaz, J. (2014). Bacterias rizosféricas fijadoras de nitrógeno en
Oryza sativa L. “arroz”, 2014. (Tesis de Licenciatura). Universidad
Nacional Pedro Ruíz Gallo, Perú.
Reyes, N. (2006). Factibilidad de empresas productora y procesadora-
exportadora de Espárrago verde. (Tesis de Ingeniería). Pontificia
Universidad Católica del Perú, Perú.
Reyes, I., Álvarez, L., El-Ayoubi, H. & Valery, A. (2008). Selección y
evaluación de rizobacterias promotoras del crecimiento en pimentón y
maíz. Bioagro, 20 (1), 37-48.
Rico, M. (2009). Capacidad promotora de crecimiento vegetal por bacterias del
género Azotobacter y Actinomicetos aislados de cultivos de Solanum
tuberosum Linnaeus, 1753 (Papa) cultivados en zonas altoandinas del
Perú. (Tesis de Biología). Universidad Nacional Mayor de San Marcos,
Perú.
Rodier, J. & Rodi, L. (2005). Análisis de Aguas. España: Ediciones Omega.
Rodríguez, C. (2013). Evaluación de microorganismos promotores de
crecimiento vegetal en tomate (Solanum lycopersicum) variedad Santa
Clara, aislados de residuos lignocelulósicos de higuerilla (Ricinus
communis) (Tesis de Especialidad). Universidad Católica de Manizales,
Colombia
Rojas, L. (2013) Potencial como promotoras del crecimiento de plantas de las
especies de Azotobacter aisladas de rizósfera de malezas asociadas a
Zea mays L. “maíz”, en Lambayeque, 2013. (Tesis de Licenciatura).
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Perú.

94
Rojas, J., & Moreno, N. (2008). Producción y formulación de prototipos de un
biofertilizante a partir de bacterias nativas asociadas al cultivo de arroz
(Oryza sativa). Revista Colombiana de Biotecnología, X (2), 50-62.
Rojas, J. & Vásquez, J. (2014). Determinación del potencial como promotoras
del crecimiento de plantas de las especies de Azotobacter aisladas de
las rizósfera de Zea mays L. “maíz” en Lambayeque, 2013. (Tesis de
Licenciatura). Universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo, Perú.
Sachin, D. & Misra, P. (2009). Effect of Azotobacter chroococcum (PGPR) on
the growth of Bamboo (Bambusa bamboo) and maize (Zea mays)
plants. Biofrontiers, 1(1), 24 - 31.
Salaheddin, K., Valluvaparidasan, V., Ladhalakshmi, D. & Velazhahan, R.
(2010). Management of bacterial blight of cotton using a mixture of
Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis. Plant Protection
Science, 46 (2), 41 – 50.
Salhia, B. (2010). The effect of Azotobacter chroococcum as nitrogen
biofertilizer on the growth and yield of Cucumis sativus. (Degree of
Master). The Islamic University, Gaza.
Sánchez, J., Lopez, I., Villegas, J. & Montaño, N. (2014). Respuesta del maíz
(Zea mays L.) a la inoculación con Azotobacter sp. y Burkholderia sp. a
dosis reducida de fertilizante nitrogenado. Scientia Agropecuaria 5, 17-
23.
Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación,
SAGARPA. (2010). Uso de Fertilizantes. Recuperado de
http://www.sagarpa.gob.mx/desarrolloRural/Documents/fichasaapt/Uso
%20de%20Fertilizantes.pdf

Valdivia, C. (2015). Prueba de tetrazolio en semillas de espárrago (Asparagus

officinalis L.). (Tesis de Ingeniería). Universidad Nacional Agraria La
Molina, Perú.

Vallejo, M., Bonilla, C. & Castilla, L. (2008). Evaluación de la asociación

bacterias fijadoras de nitrógeno-líneas interespecificas de arroz-
nitrógeno, en Typic haplustalf. Ibagué, Colombia. Acta Agronomica, 57
(1), 52-57.

Vallejo, J., Peral, D., & Carrasco, M., (2009). Anotaciones al conocimiento
etnobotánico y medicinal de los espárragos extremeños (Género
Asparagus L.). Medicina Naturista, 3(1), 41 – 46.

95
Vásquez, A., Díaz, N., Vásquez, O. & Vásquez, W. (2012). Metodología de la
Investigación Científica. Lambayeque, Perú: Universidad Nacional
Pedro Ruiz Gallo.
Vásquez, P., Holguin, G., Puente, M., Lopez, A. & Bashan, Y. (2000).
Phosphate solubilizing microorganisms associated with the rhizosphere
of mangroves in a semiarid coastal lagoon. Biology and Fertility of Soils,
30(1), 460-468.
Vélez, L. & Orellana, H. (2010). Evaluación de cepas de Azotobacter spp. en el
cultivo de lechuga (Lactuca sativa var. Green Salad Bowl). Tumbaco,
Pichincha. (Tesis de Ingeniería). Universidad Central del Ecuador,
Ecuador.
Yasari, E., Azadgoleh, E., Pirdashti, H. & Mosafari, S. (2008). Azotobacter and
Azospirillum inoculants and biofertilizers in Canola (Brassica napus L.)
cultivation. Asian Journal of Plant Sciences, 7 (5), 490-494.
Zahar, F., Marol, C., Berge, O., Rangel, J., Prosser, J., Balesdent, J., Heulin,
T. & Achouak, W. (2008). Plant host habitat and root exudates shape
soil bacterial community structure. The International Society for
Microbial Ecology Journal, 2, 1221 – 1230.

96
X. ANEXOS

97
 ANEXO 1

Cálculo del número de muestras para el aislamiento de bacterias fijadoras de

nitrógeno (en Vásquez et al., 2012)

n= Z2 p.q

T2

n= (1,96)2 (0,90. 0,10)

(0,06)2

n = 96,04 muestras

Dónde:

n = Tamaño de la muestra

Z = 1,96 (α= 0,05) valor estándar

p = Prevalencia del género Azotobacter promotaras del crecimiento

en plantas (0,90).

q = 1-p, ausencia (0,10).

T= Error estimado (6%).

98
 ANEXO 2
Medios de cultivo y soluciones para el aislamiento, identificación y
mantenimiento de Azotobacter spp.
a. Medio de cultivo Ashby Sacarosa (en Escobar & Horna, 2011)

Componentes gL-1
Sacarosa/Manitol/Benzoato 5,0
KH2PO4 1,0
MgSO4. 7H2O 0,2
FeSO4. 7H2O 0,005
NaCl 0,2
CaCl2 . 7H2O 0,2
Agar 15
Agua destilada 1000 mL

pH 7,0 (+/- 0,2). Adicionar el indicador azul de bromotimol al 0,5% en medio

líquido.

b. Medio de cultivo LG (en Escobar & Horna, 2011)

El medio LG fue elaborado por Lipman (1904)

Componentes gL-1
K2HPO4 0,05
MgSO4. 7H2O 0,20
CaCl2 0,02
Fe Cl3. 2H2O 0,01
Na2MoO4. 2H2O 0,002
KH2PO4 0,15
CaCO3 1,00
Sacarosa 20,0
Azul de bromotimol (0,5 % en KOH 0,2N) 5,00mL
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH y adicionar 15g de agar agar.

99
 c. Agar Nutritivo (en Escobar & Horna, 2011)

Componentes gL-1
Peptona 5,0
Extracto de carne 3,0
Agar agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL

d. Caldo extracto de suelo al 10% (en García & Muñoz, 2010)

Componentes gL-1
K2HPO4 0,4
MgCl2 0,1
MgSO4. 7H2O 0,05
FeCl3 0,01
CaCl2 0,1
Triptona 1,0
Extracto de levadura 1,0
Extracto de suelo al 10 % 250mL
Agua destilada 750mL

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10%, depositar en un

matraz 250g de suelo agrícola y 500mL de agua destilada. Hervir 2 horas,
completar a 500mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25mL
del filtrado y completar a 500mL con agua destilada.

e. Medio de cultivo National Botanical Research Institute, NBRIP

(en Alvarado & Valderrama, 2014)

Componentes gL-1
Glucosa 10,0
Ca3(PO4)2 5,0
(NH4)2SO4 0,1
MgSO4. 7H2O 0,25
KCl 0,2
MgCl2. 6H2O 5,0
Agar agar 15,0
Agua destilada 1000mL

100
Solución de antimicótico (en Alvarado & Valderrama, 2014)
Disolver una capsula de 150mg de Fluconazol en 10mL de alcohol al 95%.
Agregar 2mL de solución de antimicótico por litro de medio de cultivo para
tener 45mg de Fluconazol por litro.

f. Caldo tripticasa Soya suplementado con triptófano (en Escobar &

Horna, 2011)

Componentes gL-1
Peptona de caseína 17,0
Peptona de harina de Soya 3,0
D (+) glucosa (dextrosa) 2,5
Cloruro de sodio 5,0
Fosofato dipotasico 2,5
Triptofano 0,01
Agua destilada cps 1000 mL

Disolver por calentamiento y ajustar a pH 7,3

101
 ANEXO 3
Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar el ion
amonio

a. Reactivos (en Lara et al; 2007., Cadena & Mantilla, 2011)

• Cloruro de potasio 2M
Cloruro de potasio 149,12g
Agua destilada 1000mL

• Solución alcohólica de fenol 10%

Fenol concentrado 10mL
Alcohol 97º 90mL

• Nitroprusiato de sodio 0,5%

Nitroprusiato de sodio 0,5g
Agua destilada 100mL

• Solución oxidante
Citrato de sodio 20,0g
Hidróxido de sodio 1,0g
Hipoclorito de sodio 5% (lejía comercial) 2mL
Agua destilada 100mL

b. Método colorimétrico de Berthelot para cuantificar el nitrógeno en

amonio (en Lara et al., 2007)

b.1 Fundamento del método colorimétrico de Berthelot (fenolhipoclorito)

Se basa en la formación de un color azul intenso de indofenol, que resulta
de la reacción del ión amonio (NH4) con los compuestos fenólicos, en
presencia de un agente oxidante como el hipoclorito de sodio u o-fenol y un
catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo
de la reacción depende de la luz presente, la temperatura ambiente,
catalizadores y pH alcalino. Cuando se utiliza fenol o sodio la reacción puede
ser representada de la siguiente manera:

NH3 + 2C6H60-+ 3ClO- O= C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-

b.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH4Cl

Para obtener la curva patrón se prepara una solución madre de 100ppm
de NH4CI, para lo cual se pesa 0,1g de NH 4CI y se disuelve en 1L de agua

102
 bidestilada. Posteriormente, a partir de la solución madre se efectúan las
siguientes diluciones:
NH4Cl
Solución patrón H2 O bidestilada (Ug/mL = ppm)
N° de tubo
[mL] [mL] NH4Cl
[µg /mL= ppm]
1 0,0 10,0 0
2 0,2 9,8 2
3 0,4 9,6 4
4 0,6 9,4 6
5 0,8 9,2 8
6 1,0 9,0 10
7 1,5 8,5 15
8 2,0 8,0 20

b.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetría

Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4mL de solución
alcohólica de fenol al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y 1mL de
solución oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora.
Observar una coloración que varía del verde azul al azul intenso según la
concentración de amonio. Leer la absorbancia de cada dilución en el
espectrofotómetro a 632,9nm.

Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de amonio,

corregir los valores y mediante regresión lineal con el programa Microsoft
Excel 2010, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de determinación
(R2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea
de los valores sobre la recta.

Nº tubo NH4 100 (ppm) Absorbancia Absorbancia corregida

0 0,058 0,000
01
02 2 0,199 0,141
03 4 0,311 0,253
04 6 0,480 0,422
05 8 0,576 0,518
06 10 0,619 0,561
07 15 0,884 0,826

103
 Obtenida la absorbancia de las siete concentraciones de amonio, introducir
los datos el el programa Microsoft Office Excel 2007 y construir la curva
patrón de calibración:

0.9
0.8
0.7
Absorbancia

0.6
0.5 y = 0.0544x + 0.0387
0.4 R² = 0.9829
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20
NH4 100 ppm

En la ecuación obtenida:

𝒚 𝟎, 𝟎𝟓𝟒𝟒𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟖𝟕

Donde:

y: representa la absorbancia captada (variable dependiente).

x: cantidad de amonio en ppm (variable independiente).

Despejar “x” para obtener la cantidad de amonio (ppm) fijado por cada bacteria
nativa.

y - , 387
𝐱
, 544

104
 ANEXO 4

Cuantificación de fósforo solubilizado in vitro

a. Reactivos (en Rodier & Rodi, 2005)
 Solución de ácido sulfúrico 5N
Ácido sulfúrico (d = 1,84) 14 mL
Agua destilada hasta enrase 100 mL
 Solución de molibdato amónico 4 % 20 mL
 Solución de ácido ascórbico
Ácido ascórbico 1,76 mL
Agua destilada hasta enrase 100 mL
 Solución de amético (Preparar al momento del uso)
Tartrato doble de antimonio y potasio 0,0274 g
Agua destilada hasta enrase 100 mL
 Reactivo para determinación de ortofosfatos
Ácido sulfúrico 5 N 40 mL
Solución de Molibdato amónico 12 mL
Solución de ácido ascórbico 24 mL
Solución de emético 4 mL
 Solución madre de 0,2 mgL -1 de fósforo
Fosfato monopotásico previamente desecado
en estufa a 100 °C 877 g
Agua destilada hasta enrase 100 mL
 Solución hija de 2mgL-1 de fósforo
Diluir 1mL de solución madre en 99mL de agua destilada
(1/100)
b. Método colorimétrico del Molibdato para cuantificar fósforo soluble
( en Rodier  Rodi, 2005)
b.1. Fundamento
En medio ácido y en presencia de molibdato amónico, los ortofosfatos
forman un complejo fosfomolíbdico que, reducido por el ácido ascórbico, desarrolla
una coloración azul susceptible de una determinación colorimétrica y cuya

105
aparición se acelera utilizando el catalizador emético, tartrato doble de antimonio y
potasio.

b.2. Limpieza de los recipientes de vidrio

Para la limpieza del material de vidrio no utilizar detergentes que contengan
fosfato. Lavados con ácido clorhídrico diluido y enjuagados cuidadosamente con
agua destilada.

b.3. Preparación de la curva de calibración

Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL:

Número de matraces T I II III

Solución salina de fósforo de 2 mgL-1 (mL) 0 1 2 5
Agua bidestilada (mL) 20 19 18 15
Reactivo indicador (mL) 4 4 4 4
Agua destilada hasta enrase (mL) 25 25 25 25
Correspondencia de fósforo en mgL-1 0 0,1 0,2 0,5

Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrofotómetro a la

longitud de onda de 690nm en cubetas de 10cm. Construir la curva de calibración.
Los datos de la absorbancia corregida se analizan mediante regresión lineal con el
programa Microsoft Excel 2007 para obtener la ecuación de la recta y el
coeficiente (R2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión
homogénea de los valores sobre la recta.

b.4. Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestra

Introducir 20mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de 25mL

Añadir 4mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25mL con agua
destilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura en el espectrofotómetro de luz
visible con una longitud de onda de 690nm. Tener en cuenta el valor leído para el
testigo. Obtener los resultados en la curva de calibración. Para una muestra de
20mL, la curva indica el contenido de fósforo expresado en miligramos por litro.

106
 N° de tubo Fósforo soluble Absorbancia
(ppm)
1 0,1 0,077
2 0,2 0,085
3 0,5 0,105

Una vez obtenida la absorbancia de las tres concentraciones de fosfato

dicálcico, introducir los datos en el programa Micrsoft Office Excel 2007 y construir
la curva patrón de calibración:

0.12

0.10
Absorbancia 690 nm

0.08

y = 0.0692x + 0.0705
0.06
R² = 0.9985
0.04

0.02

0.00
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Fósforo (ppm)

En la ecuación obtenida:

𝐲 𝟎, 𝟎𝟔𝟗𝟐𝐱 + 𝟎, 𝟎𝟕𝟏

Donde:
y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)
x: cantidad de fósforo en ppm (variable independiente)
Despejar “x” para obtener la cantidad de fósforo (ppm) producido por cada
bacteria nativa.

𝐲 𝟎, 𝟎𝟕𝟏
𝐱
𝟎, 𝟎𝟔𝟗𝟐

107
 ANEXO 5
Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar indoles
a. Rectivos
 Reactivo de Salkowski (en García & Muñoz, 2010)

Componentes gL-1
H2SO4 concentrado 150 mL
Agua destilada 250 mL
FeCl3 0,5M en Agua destilada 7,5 mL

Al momento de la preparación, verter el acido sulfúrico concentrado en un balón

con 250mL de agua destilada y simultáneamente enfriar con chorro de agua
constante. Finalmente agregar el cloruro férrico al 0,5 M.

Utilizar 4mL del reactivo para 1mL de la muestra investigada.

b. Método colorimétrico de Salkowski para cuantificar índoles (en

Mantilla, 2007)

b.1. Fundamento de la reacción de Salkowski

Mediante la reacción de Salkowski se detectan grupos indol presentes en
el medio de cultivo y la concentración de indol es directamente proporcional a la
intensidad de color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el resultado de
una reacción oxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio de una
transaminación un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del FeCl 3,
originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del
indolacético. Otras coloraciones indican la presencia de productos intermedios de
la síntesis del ácido indolacético, que pueden ser generados a partir del
triptófano.
b.2. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de AlA
Para obtener una curva patrón de ácido indolacético, preparar una solución
madre de 100ppm, para lo cual se pesan 10mg de ácido indolacético y se
disuelven con unas gotas de NaOH en un matraz aforado a 100mL. A
continuación, enrasar con agua bidestilada y agitar hasta homogenizar.
Posteriormente se realizan las siguientes diluciones:

108
 N° de tubo Solución patrón H2O bidestilada Concentración
(100 µgmL-1) [µL]* AIA (mgL-1)
1 0 1000 0
2 20 980 2
3 40 960 4
4 60 940 6
5 80 920 8
6 100 900 10
7 150 850 15
8 200 800 20
9 300 700 30
10 400 600 40
11 500 500 50
12 600 400 60
*1000 µL = 1 mL

b.3. Procedimiento para la cuantificación de AIA por colorimetría

Obtenidas las concentraciones parciales de AIA extraer de cada tubo
0,4mL de solución, verter en tubos de 13 x 75mm y agregar 1,6mL de reactivo de
Salkowski (1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30 minutos. Observar la
presencia de una coloración rojiza en los tubos. A continuación, leer la
absorbancia de cada dilución en espectrofotómetro a 530nm.
Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de ácido
indolacético, corregir los valores y mediante regresión lineal en el programa
Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente (R2) que
deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores
sobre la recta.

109
 N° de tubo AIA (µg/mL) Absorbancia
01 0 0,000
02 2 0,013
03 4 0,023
04 6 0,034
05 8 0,043
06 10 0,060
07 15 0,087
08 20 0,110
09 30 0,141
10 40 0,202
11 50 0,229
12 60 0,273

Obtenida la absorbancia de las doce concentraciones de ácido indol

acético, introducir los datos en el programa Microsoft Office Excel 2007 y y
construir la curva patrón de calibración:

0.300

0.250

0.200
Absorbancia

y = 0.0045x + 0.0089
0.150 R² = 0.9931

0.100

0.050

0.000
0 10 20 30 40 50 60 70
AIA ug/mL

En la ecuación obtenida:

y , 45 + , 89
Donde:
y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)
x: ácido indol acético en ppm (variable independiente)

110
Despejar “x” para obtener la cantidad de ácido indol acético (ppm) producido por
cada bacteria nativa.

y - , 89
𝐱
, 45

111
 ANEXO 6

Temperaturas minima, media y máxima durante el cultivo de Asparagus

officinalis L.

Fecha Temperatura Temperatura Temperatura

minima (0C) media (0C) máxima (0C)
19/08/16 21 23 25
20/08/16 22 26 28
21/08/16 23 25 29
22/08/16 22 26 29
23/08/16 21 25 27
24/08/16 23 27 30
25/08/16 22 24 28
26/08/16 22 26 29
27/08/16 23 25 28
28/08/16 22 27 30
29/08/16 24 26 29
30/08/16 22 25 28
31/08/16 22 24 29
01/09/16 23 27 29
02/09/16 22 24 28
03/09/16 23 25 28
04/09/16 22 26 29
05/09/16 22 25 28
06/09/16 24 27 31
07/09/16 22 25 28
08/09/16 23 26 29
09/09/16 22 27 29
10/09/16 22 26 28
11/09/16 21 24 27
12/09/16 22 25 29
13/09/16 22 26 28
14/09/16 23 27 30
15/09/16 21 24 28
16/09/16 22 25 28
17/09/16 21 24 29

112
Continuación…
Fecha Temperatura Temperatura Temperatura
minima (0C) media (0C) máxima (0C)
18/09/16 23 26 29
19/09/16 22 25 28
20/09/16 22 24 28
21/09/16 23 25 29
22/09/16 22 25 28
23/09/16 23 26 29
24/09/16 22 25 28
25/09/16 22 26 28
26/09/16 22 26 29
27/09/16 23 27 31
28/09/16 24 26 29
29/09/16 22 26 28
30/09/16 22 24 29
01/10/16 25 28 32
02/10/16 24 27 30
03/10/16 23 26 29
04/10/16 22 25 29
05/10/16 23 26 28
06/10/16 24 28 32
07/10/16 23 26 29
08/10/16 23 27 30
09/10/16 23 26 29
10/10/16 22 27 29
11/10/16 22 25 29
12/10/16 23 27 29
13/10/16 24 27 30
14/10/16 24 28 32
15/10/16 22 25 29
16/10/16 23 26 29
17/10/16 22 25 30

113
 Anexo 7
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
de la altura de Asparagus officinalis L. a los 30 días

Tests of Normality a los 30 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,276 3 ,976

2 ,328 3 ,904

3 ,232 3 ,997

4 ,219 3 ,999

5 ,219 3 ,999

6 ,242 3 ,995

7 ,257 3 ,989

8 ,236 3 ,996

9 ,338 3 ,882

10 ,232 3 ,997

Prueba de homogeneidad de varianzas

ALTURA A LOS 30 DÍAS

g/1 g/2 Sig.

Estadístico de Levene
1,804 9 20 ,130

114
 Anova de un Factor
ALTURA A LOS 30 DÍAS

Suma de gl Media F Sig.

cuadrados cuadrática
Inter-grupos 220,672 9 24,519 ,369 ,937

Intra-grupos 1330,027 20 66,501

Total 1555,699 29

115
 Anexo 8
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 30 días

Tests of Normality a los 30 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,175 3 1,000

2 ,175 3 1,000

3 ,219 3 ,999

4 ,253 3 ,991

5 ,219 3 ,999

6 ,337 3 ,886

7 ,328 3 ,904

8 ,328 3 ,904

9 ,175 3 1,000

10 ,253 3 ,991

Prueba de homogeneidad de varianzas

NÚMERO DE TALLOS A LOS 30 DÍAS

g/1 g/2 Sig.

Estadístico de Levene
1,887 9 20 ,114

116
 Anova de un Factor
NÚMERO DE TALLOS A LOS 30 DÍAS

Suma de gl Media F Sig.

cuadrados cuadrática
Inter-grupos 29,367 9 3,263 ,616 ,770

Intra-grupos 106,000 20 5,300

Total 135,367 29

117
 Anexo 9
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
de la altura de Asparagus officinalis L. a los 45 días

Tests of Normality a los 45 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,314 3 ,929

2 ,232 3 ,997

3 ,299 3 ,952

4 ,175 3 1,000

5 ,253 3 ,991

6 ,204 3 1,000

7 ,231 3 ,997

8 ,343 3 ,871

9 ,178 3 1,000

10 ,321 3 ,916

Prueba de homogeneidad de varianzas

ALTURA A LOS 45 DÍAS

g/1 g/2 Sig.

Estadístico de Levene
,912 9 20 ,534

118
 Anova de un Factor
ALTURA A LOS 45 DÍAS

Suma de gl Media F Sig.

cuadrados cuadrática
Inter-grupos 587,967 9 65,630 ,939 ,514

Intra-grupos 1391,000 20 69,550

Total 1978,967 29

119
 Anexo 10
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 45 días

Tests of Normality a los 45 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,175 3 1,000

2 ,253 3 ,991

3 ,292 3 ,960

4 ,175 3 1,000

5 ,314 3 ,929

6 ,276 3 ,976

7 ,385 3 ,766

8 ,328 3 ,904

9 ,253 3 ,991

10 ,385 3 ,766

Prueba de homogeneidad de varianzas

NÚMERO DE TALLOS A LOS 45 DÍAS

g/1 g/2 Sig.

Estadístico de Levene
,993 9 20 ,253

120
 Anova de un Factor
NÚMERO DE TALLOS A LOS 45 DÍAS
Suma de gl Media F Sig.
cuadrados cuadrática
Inter-grupos 40,667 9 4,519 ,717 ,688

Intra-grupos 126,000 20 6,300

Total 166,667 29

121
 Anexo 11
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
de la altura de Asparagus officinalis L. a los 60 días

Tests of Normality a los 60 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,191 3 1,000

2 ,253 3 ,991

3 ,343 3 ,871

4 ,253 3 ,991

5 ,175 3 1,000

6 ,229 3 ,997

7 ,191 3 1,000

8 ,200 3 1,000

9 ,269 3 ,982

10 ,253 3 ,991

Prueba de homogeneidad de varianzas

ALTURA A LOS 60 DÍAS

122
 g/1 g/2 Sig.
Estadístico de Levene
1,189 9 20 ,354

Anova de un Factor
ALTURA A LOS 60 DÍAS

Suma de gl Media F Sig.

cuadrados cuadrática
Inter-grupos 1270,967 9 141,219 3,915 ,005

Intra-grupos 721,333 20 36,067

Total 1992,300 29

123
 Anexo 12
Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza
del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 60 días

Tests of Normality a los 60 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,385 3 ,766

2 ,253 3 ,991

3 ,276 3 ,976

4 ,175 3 1,000

5 ,292 3 ,960

6 ,337 3 ,886

7 ,314 3 ,929

8 ,385 3 ,766

9 ,175 3 1,000

10 ,292 3 ,960

Prueba de homogeneidad de varianzas

NÚMERO DE TALLOS A LOS 60 DÍAS

124
 g/1 g/2 Sig.
Estadístico de Levene
,884 9 20 ,337

Anova de un Factor
NÚMERO DE TALLOS A LOS 60 DÍAS
Suma de gl Media F Sig.
cuadrados cuadrática
Inter-grupos 52,033 9 5,781 1,141 ,381

Intra-grupos 101,333 20 5,067

Total 153,366 29

125
126