TEMA 11: ESTUDIO DELAESTRUCTURACELULAR: microscopio
óptico y electrónico
[Link] de medida más frecuentes en biología celular.
1 mm=1.000µm(micrómetro o micra).
1 mm=1.000.000 nm (nanómetro).
1 mm=10.000.000 Å(Ångstrom).
1 mm = 1.000 µm = 1.000.000 nm.
Con el ojo humano podemos llegar a ver 0.1-0.2 mm, es decir 100-200 micras. Al utilizar el
microscopio óptico llegamos aproximadamente hasta 0.1 micras, pudiendo ver células,
bacterias, núcleos, cloroplastos y con el electrónico podemos llevar hasta el angstrom, ver
orgánulos celulares, para ver moléculas ya sería necesario uno de Ultra resolución.
Necesitamos el microscopio porque en biología celular vamos a observar estructuras 5 veces
más pequeñas de lo que puede captar nuestro ojo. Una célula típica mide entre 10 y 100 µm.
2. Características ópticas de los microscopios
-Poder de resolución: es la capacidad de un sistema de lentes de distinguir como dos
imágenes independientes/separadas dos puntos que están muy próximos entre sí. Dicho de
otra manera, es la capacidad que tiene la lente para diferenciar dos imágenes que son
diferentes como independientes. Cuanto mayor sea el poder de resolución de un instrumento
óptico, menor es la distancia existente entre dos puntos que se pueden distinguir como
puntos separados. Cuanto menor sea el límite de resolución, mayor poder de resolución tiene.
El poder de resolución es directamente proporcional a la calidad de la imagen.
*Nos interesa un límite de resolución bajo, que la distancia sea lo más pequeña posible pero
un poder de resolución alto, para que menor sea la distancia a la que tienen que estar los
puntos para verlos separados.
-Límite de resolución: es la menor distancia a la cual dos puntos pueden ser distinguibles
de forma separada. Es decir, es el número a partir del cual ya no podemos diferenciar dos
cosas como separadas. Cuanto menor sea el límite de resolución, mayor calidad tiene la
lente, puesto que puedes diferenciar dos cosas más cercanas entre sí. Se relaciona con la
fuente de luz utilizada, medida por una longitud de onda. A menor longitud de onda, menor
límite de resolución. LR pequeño = mejor calidad (puedes diferenciar dos cosas más cercanas
entre sí)
*Ecuación de Abbe: basada en los sistemas ópticos, las lentes. Tiene en cuenta tanto la
longitud de onda como el límite de refracción del medio y el seno del Alpha y una constante
que es 0,61.
-Apertura numérica: capacidad del objetivo de utilizar un mayor o menor número de rayos
luminosos en la formación de la imagen. Depende del semiángulo de entrada de la luz al
objetivo (α) y del índice de refracción (n) del medio que existe entre el objetivo y la muestra.
A mayor AN la imagen tendrá mejor luminosidad y resolución. Mientras más luz no se
disperse, sino que llegue al objetivo, mayor va a ser la resolución. Este valor viene indicado
en el objetivo del microscopio, debajo del aumento.
n = índice de refracción del medio, variable que tiene en cuenta la velocidad de la luz en el
medio en el que está con respecto a la velocidad de la luz en el vacío (aire n=1, aceite de
inmersión=1.4).
α = mitad del ángulo máximo al cual el rayo de luz incide en la lente desde el punto enfocado
de la preparación. Para que este posea el mayor valor que es 1, es 90º.
Para un LR bajo necesitamos, la menor longitud de onda posible y la mayor apertura
numérica. El límite de resolución máximo del microscopio óptico recordamos que es 200 nm y
es físicamente es imposible conseguir un valor mayor, no podemos varias la longitud de onda
de la luz, no se ha encontrado un índice de refracción menor al de la aceite y el mayor seno a
obtener es 90º para un valor de 1.
3. Microscopio óptico:
3.1 Óptico simple.
También llamado estereoscópico o lupa. Llamado así al poseer únicamente una lente. Esta es
curva y convergente, que desvía la luz que le atraviesa, permitiendo formar una imagen
ampliada del objeto, solo de aquellos observables a simple vista. Aumenta entre 2-30 veces.
Su ventaja es que proporciona una imagen en 3D de la muestra, a diferencia de un
microscopio clásico que es plana. Se utiliza principalmente en botánica, mineralogía, medicina
(disecciones o cirugías).
3.2 Óptico compuesto.
Formado por al menos dos lentes. Permite ver estructuras biológicas no visibles a simple vista
y utiliza una haz de luz blanca que atraviesa la muestra. Los actuales cuentan con tres
sistemas de lentes: el condensador, que está justo
debajo de la muestra que recibe la luz y la concentra
sobre la preparación, el objetivo, que es el encargado
de formar la imagen y aumentarla y el ocular, forma y
aumenta la imagen en el ojo observador:
-Diafragma: regula la cantidad de luz que pasa a través de la muestra.
-Condensador: conjunto de lentes situado debajo de la platina, justo entre el diafragma y la
muestra. Su función es concentrar y enfocar la luz en un haz uniforme que ilumina la muestra
de manera adecuada y maximiza la resolución.
-Revólver: pieza giratoria en la parte inferior del tubo del microscopio, en la cual están
montados los objetivos.
*Se llama microscopio compuesto NO porque tenga dos objetivos sino porque posee 2 o
más sistemas de lentes.
*Orden ↑de abajo a arriba: Condensador➟Muestra➟Objetivo➟Ocular.
*Conceptos importantes:
-Magnificación: aumento que nos proporciona el microscopio, que se calcula mediante la
multiplicación del aumento del objetivo por el aumento del ocular.
-Aumentos totales: magnificación del microscopio por los aumentos de la imagen.
-Formas de indicar los aumentos: signo x seguido de un número que indica los aumentos
totales que tiene la imagen o una barra de aumento, con una longitud determinada que indica
la correspondencia con el tamaño real. Esta última es la más idónea.
3.2 Óptico compuesto invertido.
Microscopio que amplía la imagen de muestras biológicas que no son visibles a simple vista,
utilizando un haz de luz blanca. La diferencia con el anterior es la organización propia del
microscopio. En este caso, el condensador se encuentra arriba, debajo de este la muestra en
la platina y por debajo de ella los objetivos y oculares. Nos permite aumentar el espacio de
trabajo, al trabajar con cultivos celulares, para observar las células y ver que están en buen
estado, directamente observamos las células adheridas a la placa/frasco que tiene un grosor.
Si enfocamos desde arriba, la altura de la placa de Petri hace que el seno de Alpha sea cada
vez más pequeño, siendo el límite de resolución mayor. Nosotros queremos un límite de
resolución lo más pequeño posible y para ello enfocamos desde abajo.
Aplicaciones: cultivos celulares, observación y manipulación de gametos o embriones vivos,
etc. ↑Microscopios que utilizan la luz visible como fuente de iluminación.
↓ A partir de los anteriores, que ya poseen el límite de resolución máximo que
puede alcanzarse empleando la luz visible, se han realizado una serie de
modificaciones que aprovechan ciertas propiedades de la luz para detectar
estructuras que no serían visibles (NO aumenta el poder de resolución, no se
puede).
3.3 Óptico compuesto de campo oscuro.
Posee un filtro oscuro justo delante del condensador que bloquea el
paso directo de los rayos de luz y solo permite que esta se
proyecte por la periferia del condensador e irradien oblicuamente
la preparación, no la van a atravesar a diferencia de un
microscopio normal. El objetivo recibe los rayos que son
dispersados por la muestra. Conseguimos ver partículas dispersas,
pone de manifiesto la periferia de la célula, que vemos de manera
brillante, es dónde llegan los rayos de luz que están siendo dispersados. La ventaja que posee
es que no necesitamos teñir y por ello, podemos emplear células vivas.
Aplicaciones: partículas dispersas en un medio homogéneo, preparaciones vivas sin teñir,
los bordes de las muestras y microorganismos con diámetro superior a 0,2 μm.
3.4. Óptico de contraste de fase.
La naturaleza de la luz es ondulatoria y posee unas fases que son
la distancia entra las longitud de onda de la luz. Dicha luz cuando
atraviesa la muestra en función de la densidad de la estructura
que atraviesa se retrasa (por ej puede tardar más en atravesar el
núcleo que el citoplasma). Este microscopio nos permite detectar
la diferencia en el retraso de las fases en función de la densidad de
la estructura que está siendo atravesada (a mayor densidad, se retrasa y su fase queda
desplazada respecto a la luz que atraviesa una zona de menor densidad). Observamos
estructuras más o menos brillantes dependiendo de si la luz las ha podido atravesar más
rápido (menos densas, más brillante) o más lento (más densa, retrasa la fase de la luz, más
oscuras). Aplicaciones: estructuras incoloras (cultivos celulares
y cortes histológicos sin teñir), células vivas sin ninguna preparación.
3. 5. Óptico de interferencia, de contraste diferencial o Nomarski.
El microscopio emplea dos haces luminosos, uno que atraviesa
la muestra por completo y al igual que ocurre en el microscopio
de contraste de fase va a sufrir un retraso cuando atraviesa
ciertas estructuras, observando el interior de la célula con
distinta luminosidad en función de la densidad de la estructura
atravesada; otro haz que atraviese la muestra de forma oblicua,
tal y como un campo oscuro, poniendo de manifiesto los bordes
de la muestra. Con esta combinación, conseguimos aumentar el
contraste, se consigue ver estructuras en relieve más
contrastadas, pudiendo identificar mejor el interior de la célula.
Aplicaciones: estructuras incoloras (cultivos celulares y cortes histológicos sin teñir).
3. 6. Óptico de luz polarizada.
Permite observar cómo reaccionan las estructuras biológicas organizadas cuando se les aplica
luz polarizada, que viaja en un solo plano. La luz, en su forma natural, se propaga en múltiples
direcciones. Para restringir esta dispersión y controlar la dirección en que la luz viaja, el
microscopio utiliza dos filtros: el primero, llamado polarizador y ubicado en el condensador,
deja pasar solo luz en un plano vertical. Luego, antes del ocular, el analizador permite el paso
únicamente de la luz que ha sido desviada en un plano perpendicular al del polarizador.
Cuando la luz polarizada atraviesa una muestra biológica, su comportamiento varía según la
organización interna de la muestra. Si la muestra es isótropa, es decir, sin una estructura
interna definida muy homogéneas, la luz atraviesa sin dispersarse y permanece en el mismo
plano, por lo que no logra pasar por el analizador y no produce ninguna imagen visible. En
cambio, si la muestra es anisótropa/birrefringente (es decir, con una estructura interna
organizada), la luz se dispersa en varias direcciones, lo que permite que parte de ella
atraviese el analizador y llegue al ocular, haciendo visible la estructura en la imagen.
Aplicaciones: observar estructuras muy organizadas al microscopio como minerales, huesos
o músculos.
3.7 Óptico de fluorescencia.
Ampliamos el espectro de la luz, tomamos la zona del ultravioleta y el infrarrojo, teniendo un
mayor abanico de longitudes de onda para visualizar. La fuente de iluminación es un láser o
una lámpara de mercurio que tienen capacidad de emitir en dichas zonas. Ventaja: la fuente
de iluminación es capaz de emitir luz en el infrarrojo y ultravioleta, pero posee un filtro de
excitación, si marco el microtúbulo con un fluorocromo que emite en 488 nm (verde), utilizo
un filtro que solo va a dejar pasar la luz a esa longitud de onda correspondiendo al
fluorocromo que queremos observar, así a mi muestra solo llega la luz con esa longitud de
interés, apareciendo todo lo demás negro. Tenemos otro filtro que solo deja pasar la longitud
de onda emitida (en este caso 525 nm), que es la que llega a nuestros ojos. De esta manera,
puedo marcar una muestra con tantos fluorocromos como componentes existan y ver de
forma independiente cada uno de ellos.
*Fluorocromo: molécula que es capaz de absorber una determinada longitud de onda (luz) y
emitir otra de mayor longitud, menor energía. La mayoría de los componentes celulares no
son fluorescentes, pero podemos acoplarle fluorocromos para poner de manifiesto por
ejemplo los microtúbulos.
↑ Observo la luz que emite el fluorocromo en todo el grosor.
↓solo veo el plano que tengo en foco, no veo la luz emitida ni por arriba ni por
abajo.
- Microscopio láser confocal: utiliza como fuente de iluminación un láser. Permite
enfocar en un único plano, pudiendo movernos en todo el grosor del tejido y ver la
fluorescencia plano por plano. Lo que permite una mayor resolución. Se consigue mediante
agujeros (pinholes) que solo permiten pasar la fluorescencia del plano de foco, impidiendo
que la que está por arriba o por debajo de dónde está enfocado pase hacia la cámara. En
definitiva, obtengo mayor nitidez.
Ventaja: permite hacer estudios de colocalización, ej: quiero saber si la proteína DRP1 está en
la mitocondria y no en el retículo, marco la proteína con un flurocromo verde y la mitocondria
con el rojo, en microscopia al mezclar estos colores obtengo amarillo, así donde observe este
significa que ambos fluorocromos están juntos y por tanto confirmamos que la proteína se
encuentra en el retículo. Con un microscopio de fluorescencia convencional, veo la
fluorescencia de todo el grosor del corte, puede que el fluorocromo verde esté por arriba o por
abajo, pero al estar en distinta altura en la misma zona puedo creer que se encuentran en el
mismo lugar, falsa colocalización (no sería cierto porque cada una está en un plano).
4. Microscopio electrónico:
Utilizan como fuente de iluminación un haz de electrones, cuya longitud de onda es de 0.05
nm, al disminuir la longitud de onda, disminuimos el límite de resolución y por tanto mayor
calidad de la imagen. Nos permite estudiar las estructuras internas de la célula.
4.2 Microscopio electrónico de barrido.
Permite estudiar la superficie de una estructura, se toma la muestra a observar y se recubre
completamente de metales pesados. Luego, se deja pasar el haz de electrones que rebotan
en toda la muestra en una dirección determinada en función de cómo sea la superficie. Un
sistema detector recoge todos los electrones y realiza una reconstrucción tridimensional de la
superficie que tenemos cubierta.
4.1 Microscopio electrónico de transmisión.
A diferencia de los microscopios ópticos, el microscopio electrónico no utiliza lentes, sino
bobinas electromagnéticas. En la parte superior de su estructura se encuentran un cátodo y
un ánodo, entre los cuales se genera un flujo de electrones gracias a una diferencia de
potencial. Este flujo es dirigido a través de una columna metálica y se mantiene en
condiciones de vacío para evitar la dispersión de los electrones por partículas como el polvo,
permitiendo que los electrones viajen desde su punto de origen hasta la muestra sin
interrupciones. Al desplazarse a alta velocidad, el haz de electrones atraviesa una serie de
lentes y finalmente se proyecta en una pantalla fluorescente, que es lo que observamos en el
microscopio.
Las tres lentes del microscopio electrónico cumplen funciones equivalentes a las de un
microscopio óptico, aunque no iguales. La lente condensadora concentra el haz de electrones
sobre la muestra; la lente objetivo utiliza los electrones para formar una imagen ampliada de
la muestra; y la lente de proyección finalmente proyecta los electrones sobre la pantalla
fluorescente, permitiendo observar la imagen generada.
La muestra es introducida mediante un portaobjetos, una barra metálica que en su extremo
sostiene una rejilla metálica con una malla de 3 mm de diámetro. En esta rejilla se colocan los
cortes de muestra, los cuales son extremadamente delgados, con un grosor aproximado de 2
nm y un tamaño de 1 mm, dimensiones casi imperceptibles a simple vista. Al iniciar el
funcionamiento, el haz de electrones pasa primero por la lente condensadora, que concentra
el haz sobre la muestra; luego, al pasar por la lente objetivo, el haz es dirigido hacia la lente
de proyección, que los proyecta sobre la pantalla fluorescente, donde los electrones se
vuelven visibles gracias a la fluorescencia emitida.
Dado que las células están formadas por átomos, al bombardear el tejido con electrones,
estos se comportan de diferentes maneras según el tipo de átomos con los que se
encuentran. Si el haz de electrones atraviesa zonas de átomos ligeros, alcanza la pantalla
fluorescente y emite fluorescencia, creando zonas claras en la imagen. Por el contrario, si los
electrones se encuentran con átomos pesados, no logran atravesarlos y rebotan sin llegar a la
pantalla fluorescente, lo que genera zonas oscuras en la imagen observada.
Problemática: la mayoría de estructuras biológicas se forman de C, H,O, que son átomos
ligeros. Por lo que la mayoría de los electrones no van a rebotar. Por lo que realizamos una
especie de tinción de nuestra muestra para verlo, mediante átomos de metales pesados. Así
en las zonas teñidas, el electrón rebotará y aparecerá una zona oscura y dónde no se haya
teñido, la atravesará dando lugar a una zona clara. El más utilizado es el tetróxido de Osmio
(O4Os), que se une a las cabezas polares de fosfolípidos, lo que nos permite diferenciar las
membranas.
Aplicación: criofractura para el estudio del interior de las membranas celulares, permitió
confirmar cómo se formaban las membranas celulares y que además de lípidos, contenían
proteínas… Consiste en una congelación rápida de la muestra a visualizar a -196ºC con
nitrógeno líquido. Tras ello, se hace la fractura, la muestra se golpea con una cuchilla y se
genera una fractura en la zona más frágil del tejido, que es la membrana, pudiendo separar la
bicapa lipídica. Luego se reviste con metales pesados y se observa al microscopio electrónico.
