TEMA 5.
TÉCNICAS DE
SEPARACIÓN DE
SUSTANCIAS
1. INTRODUCCIÓN
1.
q A veces será necesario recurrir a la separación de las sustancias de una mezcla,
bien sea con fines cualitativos o cuantitativos.
q
q El número de técnicas es muy amplio y el método elegido se elige teniendo en
cuenta alguna propiedad del componente a separar que lo difiera del resto.
●
MAGNITUD ●
TÉCNICA
●
Tamaño ●
FILTRACIÓN/DIÁLISIS
●
Densidad de sustancias ●
DECANTACIÓN/
CENTRIFUGACIÓN
●
Solubilidad ●
EXTRACCIÓN
●
Carga tamaño ●
ELECTROFORESIS
●
Afinidad, capacidad de ●
CROMATOGRAFIA
absorción
2. FILTRACIÓN
q Es un método de separación basado en las diferencias
de tamaño entre las partículas que se vayan a
separar.
q
q Funcionamiento: consiste en hacer pasar una
suspensión a través de un filtro de un determinado
tamaño de poro, de forma que las partículas de
mayor tamaño no lo podrán atravesar.
q
q Es una técnica muy usada en laboratorio y puede
tener como objetivo recoger el FILTRADO (líquido
que ha atravesado el filtro), el RESIDUO (partículas
retenidas en el filtro) o ambos.
q
q USOS COMUNES: eliminar impurezas de las
disoluciones, concentrar muestras eliminando
disolvente, etc.
2.1 FILTROS
§ Dispositivos porosos de diversa naturaleza que dejan pasar partículas de tamaño
inferior al de su poro. Así, tendremos que elegir el filtro adecuado para la
filtración.
§
§ Encontramos, pues, diferentes tipos de filtros:
§
1) FILTROS DE PAPEL
2)
v Se trata de un papel de celulosa especial, con un tamaño de poro variable. Se
utilizan con un embudo.
v
v Filtro liso: se construye plegando un círculo de papel por la mitad dos veces y se
abre de forma que una mitad tenga tres partes del grosor del papel y se ajusta al
embudo. Suele usarse este filtro cuando queremos obtener el residuo.
v Filtro de pliegues: se construye doblando por la mitad un círculo y después el
semicírculo. Se abre el pliegue y se dobla cada una de las dos mitades hacia el
centro en la misma dirección. Se despliega el papel y se repiten los pliegues en
dirección opuesta. Luego se coloca en el embudo. Con este tipo de filtro, la
filtración es mayor.
Vamos a ver cómo se hace exactamente un filtro de pliegues.
[Link]
2. FILTROS DE MEMBRANA
v Tienen forma de disco y están fabricados con acetato. Se utilizan para
estirilizar disoluciones.
3. FILTROS DE VIDRIO MOLIDO O PLACAS FILTRANTES
v Formados por vidrio molido aglomerado. Presentan una gran resistencia química y
puede haberlos con diferente tamaño de poro.
EJERCICIO: indica en qué propiedad física se basa la técnica de separación de
sustancias por filtración. Cita los tipos de filtros de papel y la utilidad de cada uno
de ellos.
2.2. MÉTODOS DE FILTRACIÓN
En el laboratorio se filtran sustancias recurriendo a la gravedad o al
vacío.
1. FILTRACIÓN POR GRAVEDAD
v Se emplea la fuerza gravitatoria para hacer pasar el líquido a
través del filtro, generalmente de papel en forma cónica, liso o
de pliegues.
v
v El filtro se debe ajustar bien al embudo, sujetado con un aro
metálico a un soporte. Justo debajo del embudo vamos a colocar
el recipiente dónde recoger el filtrado.
v
v Precauciones a tener en cuenta: vertemos poco a poco para no
llenar hasta el borde del filtro. Para evitar salpicaduras, es
conveniente que el extremo del embudo toque la pared interior
del recipiente.
Vamos a ver un video para que se vea claramente cómo funciona este tipo de
filtración
[Link]
2. FILTRACIÓN POR VACÍO O PRESIÓN REDUCIDA
v Requiere conectar a una bomba de vacío el extremo final del brazo del matraz de
Kitasato, de tal forma que se origine el vacío y acelere el paso del líquido, ya que
se produce un efecto de succión.
v
v PROCEDIMIENTO:
v
1. SE PREPARA EL MONTAJE
• Se coloca el Kitasato sobre un soporte metálico, sujetando el cuello del matraz con
unas pinzas.
• Se coloca un tapón de goma con un orificio central sobre la boca del matraz y se
acopla el embudo pasándolo por el orificio del tampón.
• Se acopla el tubo de goma desde la boca lateral del matraz de Kitasato a la boca de
la bomba de vacío.
• Se coloca el filtro en el interior del embudo
2. Se vierte el líquido que se desea filtrar en el embudo y se conecta la bomba de
vacío
3. Una vez filtrada la suspensión, se lava el sólido/residuo añadiendo más agua.
4. Se desconecta el sistema de vacío.
3. SISTEMAS DE PRESIÓN POSITIVA
v Consisten en emplear una jeringa que se carga con la solución que se vaya a
filtrar. A la jeringa se le acopla un filtro y se empuja con el émbolo para hacer
pasar el líquido.
v Se usan cuando la cantidad a filtrar es muy pequeña.
v
v
v
3. EXTRACCIÓN
§ Se basa en la diferencia de solubilidad de los componentes de una mezcla.
§
§ FUNCIONAMIENTO: añadimos la muestra que queremos separar a una mezcla de
dos disolventes inmiscibles que ofrecen diferente solubilidad a los
componentes de la muestra.
§
§ Ejemplo: queremos separar un componente polar de uno apolar de una muestra.
La ponemos en una disolución con un disolvente polar y con uno apolar. Así, el
componente polar, se va a disolver en el disolvente polar y el apolar en el
disolvente apolar. Luego separamos ambas fases por centrifugación o
decantación.
4. DECANTACIÓN
§ Se basa en la diferencia de la densidad de los
componentes.
§
§ FUNCIONAMIENTO: dejamos reposar la mezcla
un tiempo suficiente, de manera que el
componente de mayor densidad queda abajo
y el de menor densidad queda arriba.
§
§ En caso de emulsiones, separamos las dos fases
con un embudo de decantación
§
§ En el caso de las suspensiones, el sólido se
deposita en el fondo. El líquido se separa
mediante una pipeta. (poco preciso)
5. CENTRIGUGACIÓN
§ Es un método de separación basado en la diferente velocidad de desplazamiento en un
medio líquido que tienen las partículas de una mezcla al ser sometidas a una rotación
rápida.
§
§ Con este método, se acelera el proceso de sedimentación. Para ello, usaremos la
centrífuga.
§
§ Se obtienen dos fracciones: SOBRENADANTE (la fracción que no sedimenta) y el
SEDIMENTO.
5.1. FUNDAMENTO FÍSICO DE LA CENTRIFUGACIÓN
• Cada componente sedimenta a una velocidad diferente.
•
• COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN: velocidad de sedimentación dividida por la aceleración
aplicada. Su unidad es el Svedbergs. Cada sustancia tiene un coeficiente de
sedimentación característico..
• Al centrifugar una solución, actúan sobre las partículas la fuerza de la GRAVEDAD y la
fuerza CENTRÍFUGA. La suma de las dos se llama FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (FCR),
• La FCR depende de la velocidad del motor (v) y del radio de giro (r).
•
• FCR= 1,118·10-5· r · v2
•
• A la hora de centrifugar una muestra, es necesario definir la FCR. Por ejemplo, para
centrifugar una muestra de sangre, hay que aplicar una FCR de 300 g y si
conocemos el radio de giro, podremos saber a qué velocidad de motor hay que
centrifugar.
•
5.2. COMPONENTES DE LAS CENTRIFUGAS
A) ROTOR
B)
§ Es la pieza de la centrífuga que gira. En su interior se colocan las muestras en
tubos.
§
ROTOR BASCULANTE U HORIZONTAL
o Es un rotor en el que, en estado de reposo, los tubos están en posición vertical,
pero cuando gira pasan a una posición horizontal.
o Durante la centrifugación, las partículas se desplazan a lo largo del tubo, así que el
sedimento se distribuye uniformemente contra el fondo de este formando una
superficie plana, paralela al eje.
ROTOR PARA CENTRÍFUGAS DE HEMATOCRITO
o Poseen una plataforma circular con ranuras en
la que se colocan los capilares con la sangre.
ROTOR DE ÁNGULO FIJO
o En estos rotores, los tubos están en posición fija formando
un ángulo de 25-40 grados con el eje de rotación. Al
centrifugar, las partículas son dirigidas hacia fuera
horizontalmente, pero chocan en el lado del tubo. Al
parar, el sedimento se deposita en el fondo y en el borde
inferior del tubo.
ROTOR VERTICAL
o Son cilíndricos, en cuyo interior los tubos se
sitúan y giran en posición vertical, paralelos
al eje. El sedimento queda pegado a la pared
lateral alejada del tubo.
2) COMPONENTES BÁSICOS
§ Entre ellos, encontramos el motor, el eje, el
ventilador, la cámara, el estabilizador y los
controles de velocidad y puesta en
marcha.
§
§ Eje: pieza en la que se encaja el rotor
§
§ Motor: hace girar el eje y, a su vez, el rotor,
creando una fuerza que permite la
centrifugación.
§
§ Cámara: todo se encuentra en ella. Lleva
generalmente una tapa que impide abrirla
sin finalizar la centrifugación.
§
§ Estabilizador: elemento de gran peso que
impide que el centrifugador se desplace.
§
§ Ventilador: ayuda a disipar el calor del motor.
3) COMPONENTES ACCESORIOS
§ La centrífuga puede llevar otros accesorios:
§
§ Gradillas para los tubos
§
§ Rotores accesorios
§
§ Refrigerador: está presente en centrífugas que alcanzan grandes velocidades.
Mantienen la cámara a la temperatura programada.
§
§ Sistemas de vacío: evitan el calentamiento del motor a causa del rozamiento
con el aire.
§
4) CONTENEDORES PARA COLOCAR MUESTRAS
§ Las muestras se colocan en tubos de polímeros de plástico o de cristal. Si se
centrifugan cantidades pequeñas se utilizan tubos Eppendorf.
§
§ Deben ser resistentes a la velocidad de la centrifugación y a la temperatura.
5.3. TIPOS DE CENTRIFUGAS
• Hay una gran variedad dependiendo de la
velocidad de giro.
•
1) CENTRÍFUGAS DE BAJA VELOCIDAD
2)
o También se las llama de sobremesa o clínicas.
o
o Son de pequeño tamaño y no tienen refrigerador
y suelen tener un rotor de ángulo fijo.
o
o Usos: separación de partículas grandes, como
células
2) MICROCENTRÍFUGA
o Son pequeñas y los volúmenes de trabajo son
muy pequeños.
o
o Usos: biología molecular
•
3) CENTRÍFUGAS DE ALTA VELOCIDAD
o Alcanzan velocidades máximas de 25 mil rpm
o
o Tienen refrigerador y sistema de vacío.
o
o Usos: separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de
ribosomas, virus o macromoléculas en general.
o
4) ULTRACENTRÍFUGAS
o Pueden superar una velocidad de 50 mil rpm.
o
o Tienen sistemas de refrigeración auxiliares para enfriar el motor. También tienen
sistema de vacío
o
o Usos: separar partículas subcelulares como lisosomas, ribosomas, mitocondrias o
proteínas pequeñas.
5) CITOCENTRÍFUGAS
o Usos: en anatomía patológica, así como en los servicios de oncología, citología,
hematología, virología y microbiología para acelerar la sedimentación de las
células de muestras biológicas sobre los portaobjetos para su posterior
identificación.
o
6) CENTRÍFUGAS DE HEMATOCRITO
o Están diseñadas para centrifugar a elevada velocidad sangre total en el interior de
un tubo capilar para obtener el hematocrito.
o
5.4. TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
1) CENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA
o Se obtienen datos precisos acerca de las propiedades de sedimentación (ej. Masas
moleculares)
o
o Para ello, se usan ultracentrífugas. Los tubos deben ser de cuarzo para dejar pasar
la luz del sistema óptico.
2) CENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA
o Tiene como objetivo purificar la muestra para un uso posterior. Existen dos
métodos de centrifugación preparativa que se diferencian en la forma de
aplicar la muestra: la centrifugación diferencial en gradiente de densidad.
o
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
ü Es el más sencillo y habitual en los laboratorios.
ü
ü Funcionamiento: se pone la muestra en un tubo de centrífuga apropiado. El
componente más rápido avanza más y se deposita en el fondo. Así, se
obtienen dos fracciones: el sobrenadante y el sedimento o pellet.
ü
ü El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma,
tamaño y densidad.
o
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD
ü Permite obtener una mayor resolución en la separación de todos los
componentes de la muestra y practicar medidas analíticas.
ü
ü Se requieren ultracentrífugas debido a que hay que centrifugar a alta velocidad y
en un tiempo prolongado.
ü
ü La muestra se centrifuga en un tubo que contiene un gradiente de
concentración: GRADIENTES AUTOFORMADOS ( se crean al mismo tiempo que
se centrifuga) o GRADIENTES PREFORMADOS (se preparan antes de la
centrifugación).
ü
ü Un gradiente de concentración es un medio líquido en el que la densidad y la
concentración aumentan a lo largo del tubo.
ü
ü TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE: centrifugación zonal, centrifugación
isopícnica o de equilibrio de sedimentación, métodos de barrera.
5.5. APLICACIONES DE LACENTRIFUGACIÓN
§ La centrifugación preparativa se usa en los laboratorios clínicos en
numerosos procesos:
a) Separación de suero o plasma del resto de elementos de la sangre.
b) Concentración de células de los líquidos biológicos para facilitar el
diagnóstico microscópico
c) Obtención de leucocitos
d) Separación de biomoléculas
e) Fraccionamiento subcelular mediante centrifugación diferencial
f)
5.6. CÓMO USAR LAS CENTRIFUGAS
§ Utilizar tubos resistentes y del tamaño adecuado
§ Equilibrar correctamente la centrífuga
§ Tapar los recipientes para evitar la evaporación
§ Se debe cerrar bien antes de ponerla en marcha
§ No se forzará el paro de la centrífuga manualmente
§
§ El proceso de centrifugación consta de los siguientes pasos:
1. Colocar en el rotor los tubos con las muestras que se vayan a centrifugar
2.
3. Cerrar la tapa, seleccionar la velocidad, el tiempo y la temperatura.
4.
5. Esperar a que la centrífuga pare completamente, sacar los tubos y apagarla.
6.
5.7. CONTROL Y MANTENIMIENTO
§ El mantenimiento periódico incluye el chequeo de: velocidad de centrifugación,
temperatura de refrigeración, conmutadores, temporizadores, sistema de
frenado, mecanismos de cierre y estado del eje.
§
§ El mantenimiento diario incluye limpiar la cámara de la centrífuga y los
contenedores.
6. CROMATOGRAFIA
q Es una técnica de separación muy utilizada debido a su rapidez y sencillez. La
separación se realiza en función de la diferente afinidad de los componentes de
una mezcla por las dos fases de todo sistema cromatográfico: la fase móvil y la
fase estacionaria.
q
q La fase móvil es un líquido o gas, que contiene la muestra con los solutos que se
desea separar.
q
q La fase estacionaria es sólida o líquida, se mantiene fija en un soporte, a través
del cuál pasa la fase móvil.
q
q Un compuesto con poca afinidad por la fase estacionaria avanzará más rápido
que otro que tenga más afinidad. Debido a su diferente velocidad de paso a
través de la fase estacionaria, los componentes de la muestra se separan en
una serie de bandas que pueden ser analizadas.
6.1. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
§ Según la forma física de la fase estacionaria: las hay en columna (la fase estacionaria se
encuentra en el interior de un tubo o columna) o en soporte plano (la fase estacionaria
se mantiene sobre una superficie plana)
§
§ Según el estado de agregación en el que se encuentra la fase móvil: está la cromatografía
líquida (la fase móvil es un líquido) y cromatografía de gases (la fase móvil es un gas)
§
§ Según el mecanismo físico que produce la separación de los solutos: tenemos la
cromatografía de intercambio iónico (la fase estacionaria presenta cargas + o -. Las
partículas de la muestra con signo opuesto al de la fase estacionaria serán atraídas y
retenidas), la cromatografía de adsorción (se basa en la aparición de interacciones entre
moléculas, entre los componentes de la mezcla y las moléculas de la fase móvil),
cromatografía de afinidad (se basa en mecanismos que implican interacciones
específicas entre dos moléculas, como uniones del tipo enzima-sustrato, hormona-
receptor, Ag-Ac, etc), cromatografía de exclusión molecular (basada en las diferencias
de tamaño molecular entre las sustancias que se vayan a separar) y cromatografía de
partición o reparto ( basada en las diferencias de solubilidad de los distintos solutos
entre dos fases inmiscibles)
§
§
7. ELECTROFORESIS
§ Es una técnica de separación de sustancias basada en la diferente velocidad de
migración de moléculas cargadas cuando se encuentran sometidas a la acción
de un campo eléctrico.
§
§ Cuando una partícula cargada se coloca en un campo eléctrico, se moverá hacia
el polo de signo opuesto.
§
§ La velocidad de migración se define como la velocidad con la que las diferentes
sustancias se desplazan durante el transcurso de la electroforesis; esta
velocidad depende del potencial eléctrico aplicado, de la densidad de carga
de las partículas por separar y del tipo de soporte en el que se desplazan las
muestras.
7.1. COMPONENTES DEL EQUIPO DE
ELECTROFORESIS
A) FUENTE DE ALIMENTACIÓN
B)
o Aporta el potencial eléctrico necesario
para el proceso electroforético.
o
o De ella, parten dos electrodos, el
ánodo (polo positivo) y el cátodo
(polo negativo), que se conectan a
cada uno de los lados de la cubeta
de electroforesis. Los electrodos
están marcados con dos colores:
rojo para el ánodo y negro para el
cátodo.
o
o En la fuente de electroforesis se
pueden seleccionar los parámetros
de trabajo: el voltaje, la intensidad y
el tiempo.
B) CUBETA
o Consiste en una cámara con dos compartimentos separados entre sí, que se
rellenan con el tampón. Cada uno de ellos, contiene un electrodo que
durante la electroforesis queda sumergido en el tampón y conectado a
través de un cable a la fuente de electroforesis.
o
o Los tabiques permiten montar un soporte, donde se colocan las muestras. El
soporte está embebido también en el tampón y en contacto a cada lado con
el tampón de los compartimentos, así se forma un circuito cerrado.
o
o Hay cubetas en las que el desplazamiento es horizontal, mientras que en otras
es vertical.
C) BUFFER O TAMPÓN
o Es la solución iónica que transporta la corriente eléctrica. Su función es mantener
estable el pH y compensar la liberación de los iones H + y OH- producidos.
o
D) SOPORTE
o Generalmente, en laboratorios clínicos, la electroforesis se practica sobre un
soporte que puede ser sólido o gel generalmente planos. El soporte no debe
reaccionar con el analito que se va a separar. En el soporte se coloca la
muestra.
o
o Hay dos tipos de soporte:
o
1. NO RESTRICTIVOS: en ellos las partículas se separan solamente en función de su
carga, ya que poseen un tamaño de poro lo suficientemente grande para no
interferir en la migración.
2. RESTRICTIVOS: tienen un tamaño de poro determinado, de tal forma que la
separación dependerá de la carga y el tamaño de las partículas. Las partículas,
durante el proceso electroforético, migran de acuerdo con su carga eléctrica,
pero van siendo frenadas según su tamaño. Así, se consigue una separación
más completa.
ü Los soportes restrictivos pueden ser de:
- Gel de agarosa: la agarosa es un polisacárido extraído de algas. Se puede ajustar el
tamaño del poro, ajustando la concentración de agarosa (+ agarosa, -tamaño). Se
utiliza en biología molecular para separar fragmentos de ácidos nucleicos y proteínas
séricas. El soporte de agarosa es horizontal.
- Gel de poliacrilamida: es el gel que proporciona mayor resolución electroforética.
También es posible controlar el tamaño del poro (+bisacrilamida, - tamaño). Se usa
para separar proteínas, ARN y fragmentos pequeños de ADN. Se practica en posición
vertical
7.2. FACTORES QUE AFECTAN AL PROCESO DE ELECTROFORESIS
§ La separación electroforética depende de las diferencias de
velocidad de migración de los componentes de la muestra. Esa
velocidad depende a su vez de varios factores:
A) POTENCIAL DEL CAMPO ELÉCTRICO
o Cuánto más elevado sea el potencial eléctrico por la fuente de
electroforesis, mayor es la movilidad, pero también aumenta la
temperatura del sistema, lo que conlleva el riesgo de
desnaturalización de las muestras y de evaporación del tampón.
Por tanto, solo se usan voltajes altos si el equipo cuenta con un
sistema de refrigeración.
o
B) GRADO DE IONIZACIÓN
o Indica la tendencia de una molécula a estar ionizada y, por tanto, a
presentar carga eléctrica. Es el cociente entre la forma ionizada y
la no ionizada de una partícula en solución. A mayor grado de
ionización, mayor es la carga neta.
C) INFLUENCIA DEL PH
o El pH influya en el grado de ionización de las moléculas. En moléculas anfóteras (las
que pueden adquirir carga negativa o positiva dependiendo del pH del medio)
existe un pH para el cual el número de cargas positivas de una molécula es igual al
número de cargas negativas, lo que da una carga neta cero.
D) FUERZA IÓNICA DEL MEDIO
o La fuerza iónica del medio se debe principalmente a la fuerza iónica del
tampón utilizado para mantener estable el pH. Esta debe ser tal que ayude a
mantener el pH, pero no dificulte el desplazamiento de las partículas iónicas
de la muestra; ya que a > concentración iónica del medio, > dificultad en la
separación
E) OTROS FACTORES
o Otros factores que afectan al proceso de la electroforesis son el tamaño y
forma de las partículas por separar y el tipo de soporte.
o
7.3. ETAPAS DEL PROCESO ELECTROFORÉTICO
§ Se dan los siguientes pasos:
A) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
o En algunos casos, basta con centrifugar la muestra (electroforesis de
proteínas del plasma o suero), en otros es necesario efectuar una
concentración previa (electroforesis de muestras de orina) o un
proceso de extracción previa (electroforesis de ácidos nucleicos)
B) SELECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL SOPORTE
o Seleccionar el soporte depende de la naturaleza de la sustancia que se vaya a
separar.
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o Si el soporte es un gel, habitualmente se prepara in situ. Una vez solidificado el
gel, se sitúa en la cubeta electroforética. Para solidificar el gel de sacarosa, se
ha de calentar. Con el gel de poliacrilamida, se añaden activadores de
polimerización.
C) PREPARACIÓN DEL TAMPÓN
o El tampón determina el pH y la fuerza iónica del medio: es fundamental, por tanto, su
correcta preparación.
o
o Los tampones deben llenar por igual ambos compartimentos de la cubeta, de tal
forma que ambos extremos del soporte estén en contacto con el tampón.
D) APLICACIÓN DE LA MUESTRA
o Para aplicar la muestra en el soporte hay diferentes técnicas:
Ø Aplicación sobre la superficie del soporte dejando que la muestra penetre
Ø Introducción de la muestra en los pocillos de los geles junto con un tampón de carga
para asegurar que la muestra queda dentro del pocillo y para visualizar el avance
de la electroforesis
E) PROCESO ELECTROFORÉTICO
o Una vez la muestra en el soporte,
se cierra la tapa de la cubeta, se
seleccionan los parámetros
electroforéticos (voltaje,
intensidad y tiempo) y se pone
en marcha la fuente de voltaje.
o
o El resultado del proceso es la
formación de una serie de
bandas correspondientes a las
fracciones separadas.
F) REVELADO
o Se usan generalmente colorantes que reaccionan con los
componentes de la muestra y los hacen visibles. Para ello, el
soporte se sumerge en el colorante durante un tiempo y, a
continuación se lava el exceso de colorante.
G) LECTURA Y EVALUACIÓN
o La evaluación/interpretación de los resultados puede ser cualitativa (presencia o
ausencia de bandas) o cuantitativa (cantidad de sustancia en cada banda).
o
o Para la lectura de las bandas, se suele utilizar un transiluminador, usar
fotodensitometría (para evaluación cuantitativa) o por espectrofotometría.
o
o FOTODENSITOMETRÍA: se hace pasar un haz de luz de una determinada longitud de
onda, a mayor densidad de color, más luz absorben. Así, dependiendo de la
intensidad de luz recibida, se determina la concentración.
o
o ESPECTROFOTOMETRÍA: se recortan las bandas y se coloca cada una de ellas en un tubo
con una disolución adecuada que permita la extracción de fracción por determinar. A
continuación, se mide la absorbancia de cada uno de los tubos con un
espectrofotómetro.
7.3. TIPOS DE ELECTROFORESIS
§ Existe una gran variedad de técnicas electroforéticas:
A) ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS EN ACETATO DE CELULOSA
o Se utiliza para la obtención del proteinograma, ya que es económica, sencilla
y rápida. El soporte más empleado son las tiras de cellogel. A la hora de
manipularlas, se utilizaran pinzas para que no quede grasa en ellas que
interfiera en la técnica.
a. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
v La muestra que se va a utilizar es suero; si se utiliza plasma en vez de suero,
en el proteionograma aparece la banda correspondiente al fibrinógeno.
v También se preparan los materiales que vamos a necesitar: fuente de
alimentación, cubeta de electroforesis, aplicador, tiras de acetato de
celulosa, cristal, estufa, vidrio de reloj, bateas.
b. REACTIVOS
v Se emplean los siguientes reactivos:
1. TAMPÓN: tampón veronal sódico 0,04M o tampón Tris
2. COLORANTE: negro amido al 0.05% o bien Rojo Ponceau al 0.5% p/v en ácido
tricloroacético al 5%.
3. DECOLORANTE PARA EL ROJO PONCEAU: ácido acético al 5% (precaución porque es
corrosivo)
4. DECOLORANTE PARA EL NEGRO AMIDO: metanol (45%) y ácido acético (10%)
5. SOLUCIÓN TRANSPARENTADORA
c. PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS
v PREPARACIÓN DE LA CUBETA: ha de estar limpia y seca. Con el tampón correspondiente,
se llenan ambos compartimentos sin que entren en contacto
v
v PREPARACIÓN DEL SOPORTE: se sacan las tiras de cellogel, que presentan un lado con
una superficie más opaca , sobre la cuál se siembra el suero. Se sumergen las tiras con
el tampón o buffer correspondiente con la cara absorbente hacia arriba. Se extraen las
tiras y se elimina el exceso del tampón colocándolas entre papel de filtro. Se colocan
las tiras sobre el puente de la cubeta con la cara absorbente hacia arriba. Se tapa la
cubeta y se esperan unos 25 min.
v APLICACIÓN DE LA MUESTRA: se colocan unas gotas de suero sobre un portaobjetos con
una pipeta Pasteur. Se impregna el aplicador con el suero; a continuación, se pulsa el
aplicador sobre la tira durante unos segundos, hasta que la tira absorba la muestra.
Se pondrán dos muestras en cada tira. Se cubre la cámara de migración con su tapa.
v
v PROCESO ELECTROFORÉTICO: se conecta el equipo y la fuente de alimentación, se pone
en marcha en alimentador y se seleccionan los parámetros electroforéticos. Una vez
finalizada la migración, se desconecta la fuente de electroforesis.
v
v REVELADO: se extraen las tiras, se sumergen en colorante durante unos 10 minutos con
la cara absorbente hacia abajo y se agitan suavemente. Después, se efectúan baños
con la solución decolorante para obtener un fondo blanco en el que solo se aprecien
las bandas. Tras la separación electroforética, aparecen 5 bandas.
d. VALORACIÓN CUANTITATIVA
v Se puede realizar la cuantificación por fotodensitometría o por elución mediante
espectrofotometría
v FOTODENSITOMETRÍA: se pasan las tiras por varias soluciones transparentadoras hasta
que carezcan de color y solo se aprecien las bandas electroforéticas. Se elimina el
exceso de solución. Se deshidratan las tiras con metanol. Se extienden sobre una placa
de vidrio y se eliminan las burbujas. Se calientan hasta la transparencia completa, se
dejan enfriar y se realiza la lectura, situando las bandas en el densitómetro. Se obtendrá
una gráfica en la que aparecen cuantificadas todas las fracciones proteínicas.
v ELUCIÓN MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA: con este método no hay que transparentar las
tiras. El procedimiento consiste en preparar 6 tubos marcados (blanco, albúmina, a1, a2,
β1 y γ) y añadir a cada uno 3ml de líquido eluyente (ácido acético) menos al tubo 2, al
que se le añaden 9ml. Se cortan las 5 fracciones proteínicas y se colocan en los tubos de
ensayo. Se agita hasta la disolución y se lee en el espectrofotómetro la absorbancia de
cada tubo frente a un blanco que sólo tiene disolvente. La densidad óptica es
proporcional a la concentración de proteínas. Después, se efectúan los cálculos.
B) ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
o Es muy utilizada dentro de las técnicas de biología molecular.
o
o El gel puede venir preparado o bien se puede fabricar en el propio laboratorio.
o
o Esta técnica se utiliza para la separación de proteínas plasmáticas, aunque la
tendencia es a obtener el proteinograma mediante la técnica de electroforesis
capilar.
a. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
v Para la electroforesis de ácidos nucleicos es necesario extraerlos y purificarlos
previamente. A continuación, se redisuelven en el tampón usado durante la
electroforesis.
v
b. MATERIALES
v Se utilizan micropipetas, tubos tipo Eppendorf, matraz de Erlenmeyer, probetas y
vasos de precipitados, espátulas y guantes impermeables.
c. REACTIVOS
v Los reactivos necesarios incluyen:
ü agarosa
ü Tris (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propandiol)
ü Ácido acético glacial
ü Ácido bórico NaOH 10 M y HCl 1 M
ü Soluciones y Buffers: TAE (Tris Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato): ambos
suelen prepararse como soluciones concentradas. Se diluyen en agua
antes de cada electroforesis para lograr la concentración de uso y un pH
de 8.
ü EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,5 M y pH 8
ü El buffer de carga de la muestra en el gel contiene glicerol y sacarosa que le
aportan una alta densidad que permite que la muestra se introduzca en el
pocillo del gel;contiene el colorante azul de bromofenol, que indica el
avance de la electroforesis.
ü Solución de bromuro de etidio
d. Protocolos
v Para preparar el gel de agarosa
1) Se pesa la cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentración deseada en función
de gel, generalmente se preparan geles de agarosa al 2% p/v
2) Se añade la agarosa al buffer (TAE 1x o TBE 0.5x) en un matraz
3) Se calienta la mezcla en un horno de microondas hasta que se observe que toda la agarosa
se ha fundido. Se ha de procurar que no queden burbujas de aire en el interior del gel
4) Se deja enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50º C
5) Mientras la solución de agarosa se enfría, se prepara el molde en el que se va a hacer el gel
sellando los bordes con cinta adhesiva y se coloca el peine en la posición deseada para
hacer los pocillos.
6) Se vierte cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde y se deja que solidifique
durante al menos 30 minutos
v El protocolo de la electroforesis es el siguiente:
1) se mezclan tanto las muestras de ADN como el marcador de pesos moleculares
con el tampón de carga, el volumen total depende del tamaño de los pocillos
2) Una vez que el gel se ha solidificado, se retira el sellado de los bordes y se coloca
el gel en la cámara de electroforesis
3) Se añade el buffer de electroforesis (TAE 1x o TBE 0.5x) hasta que cubra el gel
unos 3-5 mm
4) Se retira cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las
muestras.
5) Se cargan las muestras en los pocillos
6) Se conectan los cables a la fuente alimentación y se aplica un voltaje de 20-150 V
7) Se deja avanzar la electroforesis hasta que el colorante azul de bromofenol esté a
una distancia del borde de aproximadamente un 25% de la longitud total del
gel. En este momento debe detenerse la electroforesis
8) El ADN migra hacia el ánodo
e. Tinción del gel
v Una vez separados los fragmentos con la electroforesis, estos se pueden visualizar
mediante tinción del ADN con bromuro de etidio o con otros reactivos tales como el
SYBR Gold.
v Existen dos formas diferentes de realizar el teñido del ADN:
1) Incorporar el bromuro de etidio en la preparación del gel
2) Teñir el gel una vez finalizada la electroforesis con una solución de bromuro de etidio
durante al menos 15 min
En ambos casos, la concentración final del bromuro de etidio en el gel o en la solución de
teñido debe ser de 0,5microgramos/ml
f. Visualización del gel
v Para la visualización del gel, se coloca sobre un transiluminador, se enciende la lámpara
de luz ultravioleta y se fotografía el gel con el sistema fotográfico disponible. También
pueden emplearse sistemas de fotodocumentación de geles, que permiten visualizar
los geles y fotografiarlos en formato digital.
C) ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
o Proporciona un mayor poder de separación
o
o Usos: separar proteínas, aunque también puede emplearse para separar otras
moléculas.
o
o Es un gel restrictivo, por lo que la separación tiene lugar en función del tamaño. Se trata
de un gel transparente e inerte. Suele ser una electroforesis plana vertical, aunque
también puede ser capilar.
o
o Para preparar el se mezcla la acrilamida con la bisacrilamida en presencia de un agente
iniciacor: el TEMED; y añadiendo persulfato amónico como catalizador, con esta
mezcla se rellena el molde.
o
o El molde consiste en dos placas de vidrio medio separadas. Una vez relleno el molde con
el gel, se coloca el peine para formar los pocillos y se deja polimerizar. Una vez
solidificado el gel, el molde se coloca en la cubeta de electroforesis
v Dependiendo de las condiciones en las que se desarrolla el proceso, hay varios tipos de
PAGE:
v
ü PAGE en condiciones no desnaturalizantes: una vez finalizada la electroforesis, las
proteínas separadas no han perdido su configuración espacial y mantienen intacta su
función.
ü
ü PAGE en condiciones naturalizantes:
naturalizantes tiene lugar en presencia de algunos agentes tales
como los siguientes: determinados detergentes, urea. Estos agentes se incluyen en el
tampón de la electroforesis y originan la pérdida de la configuración espacial de las
proteínas y, por tanto, la pérdida de la función biológica.
D) ISOELECTROENFOQUE
v Es un tipo de PAGE en la que se establece un gradiente de pH en el soporte.
v
v Se basa en la separación de sustancias conforme a su punto isoeléctrico: las moléculas
se desplazan hasta que llegan a una posición del soporte en la que el pH es igual a
su punto isoeléctrico; en este punto su carga es nula y dejan de migrar.
v
v Es útil para separar sustancias anfóteras, como las proteínas.
v
E) ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
v Se trata de dos electroforesis seguidas realizadas en condiciones diferentes. La primera
separación se realiza con isoelectroenfoque y la segunda con PAGE-SDS. Así, en la
primera electroforesis se separan en función de sus puntos isoeléctricos y en la
segunda en función de su tamaño.
v
v Con este sistema, se consigue separar mezclas complejas de proteínas.
F) ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES
v Los fragmentos se someten a dos campos eléctricos de distinta orientación
perpendiculares entre sí.
v
v Se denomina pulso al tiempo que dura la aplicación de los campos eléctricos que se
alternan
v
G) INMUNOELECTROFORESIS
v Es una combinación de dos técnicas instrumentales: la electroforesis en gel de agarosa
y la inmunodifusión. Permite separar sustancias con velocidades de migración
idénticas
v
v Tiene dos fases: la primera es la separación electroforética de las proteínas o
sustancias que actúan como antígenos; en la segunda fase se practica sobre el gel
un canal que sea paralelo a la dirección de la migración. A continuación, se colocan
en el canal los anticuerpos específicos a las proteínas separadas durante la
electroforesis.
G) ELECTROFORESIS CAPILAR
v Consiste en llevar a cabo la separación electroforética en el interior de tubos
capilares con diámetros muy pequeños que actúan como celdas
electroforéticas.
v
v Los extremos de los capilares están conectados a un electrodo positivo y otro
negativo. A lo largo del circuito, el sistema dispone de un detector. Los analitos
avanzan a lo largo del capilar y se separan de acuerdo con sus movilidades
electroforéticas individuales; son detectados y cuantificados a su paso por el
detector.
v
v El equipo básico consta de: fuente de alimentación, columna capilar, viales que
contienen el buffer, sistema de termostatización, sistema de detección de los
componentes separados.
v
v Se puede hacer un análisis cualitativo y cuantitativos.
