Universidad Autónoma de Baja California

Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería

Plan educativo de estudios Químico Farmacobiólogo.

PRÁCTICA No. 2. Cuantificación de Proteínas.

Tijuana, B.C, a 10 de noviembre del 2022

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ÍNDICE.
Resumen .................................................................................................................................. pág. 3
Palabras clave ......................................................................................................................... pág. 3
Introducción ………………………………………................................................................ pág. 3
Objetivo …………………………………………………………………………………….. pág. 4
Marco Teórico ………………………………………………………………………………. pág. 4
Materiales y Reactivos …………………...…………………………………………………. pág. 4
Procedimiento ………………………………………………………………………………. pág. 5
Datos y Observaciones …………………………….……………………………………….. pág. 5
Resultados ………………………………………………………………………………….. pág. 5
Discusión de Resultados ……………………………………………………………………. pág. 5
Conclusión .............................................................................................................................. pág. 5
Cuestionario ………………………………………………………………………………… pág. 5
Referencias …………………………………………............................................................. pág. 6

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RESUMEN.
La detección, cuantificación y análisis de proteínas son cruciales para investigar una gran variedad
de procesos biológicos. Un claro ejemplo sería la medición de concentración de proteína, tal que
es necesaria en procesos que abarcan desde la purificación y marcaje de proteínas hasta la
preparación de muestras para electroforesis.
Dentro de este reporte se abarcarán tres métodos para la su cuantificación.
PALABRAS CLAVE.
Cuantificación.
Proteínas.
Absorbancia.
Lowry.
Bradford.
BCA.
INTRODUCCIÓN.
Las proteínas conforman la base fundamental de las células en el organismo, estas funcionan por
parte mecánica a partir de las secuencias primarias hasta las cuaternarias a causa de los
polipéptidos, en el cual, determina el funcionamiento en la estructura y sus respectivos procesos
vitales. Cada una tiene un propósito, -como, por ejemplo, la globulina. Siendo así, se implementan
métodos en la cuantificación de cada una de ellas para conocer la concentración de proteínas
normales y anormales en una muestra biológica. Se considera una rutina básica cuando se trata de
un esquema de purificación de una proteína concreta, hablamos de cuando se requiere conocer la
actividad específica de una preparación enzimática para el diagnostico de enfermedades u
cualquier otro. Existen diferentes métodos, pero la mayoría se basan en:
1. Propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en UV.
2. Formación de derivados químicos.
3. Capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
La medición de la concentración de proteína es necesaria en procesos que abarcan desde la
purificación y marcaje de proteínas hasta la preparación de muestras para electroforesis. Se trata
de la medición de la concentración de proteína total en una muestra, las cuales se pueden
cuantificar directamente mediante absorbancia a 280 nm, o indirectamente mediante métodos
colorimétricos o fluorimétricos que ofrecen ventajas como una mayor sensibilidad.
Para identificar y medir una proteína específica dentro de una muestra compleja, -por ejemplo,
suero, puede utilizarse un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima.
La señalización celular y otros procesos biológicos pueden analizarse usando proteínas
fluorescentes. Por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) puede expresarse en células vivas
y utilizarse para visualizar la localización y la dinámica de proteínas en condiciones
experimentales. [1]

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OBJETIVO.
Determinar la cantidad de absorbancia en una proteína en una muestra de albúmina en 660 nm con
un equipo de electrofotometría.
Así como se pretende obtener:
• Manejo adecuado de los materiales del laboratorio: uso de las micropipetas y equipo de
electrofotometría.
• Obtención del menor grado de error en resultados.
MARCO TEÓRICO.
Método de Bradford. Se basa en la unión de un colorante a las proteínas. Se trata de una solución
ácida; las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un
coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple,
rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que
interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. [2]
Método de BCA. El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo
púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método
analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con
Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo
proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y
que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. [3]
Protocolo de Lowry. El ensayo utiliza cobre, el cual, une a los enlaces peptídicos de las proteínas
en condiciones alcalinas. Esto forma un ion de cobre monovalente que luego puede reaccionar con
el reactivo de Folin, y de la misma manera, puede reducirse a una sustancia de color azul. El color
se puede medir usando un espectrofotómetro para determinar la concentración en la muestra,
mismo que es equivalente a la concentración de la proteína. [4]
MATERIALES Y REACTIVOS.
o 5 vasos de precipitado de 200-250 ml
o 3 matraces de 250 ml
o 1 probeta de 100 ml
o 1 probeta de 250 ml
o 1 pipeta graduada de 10 ml
o 1 pipeta graduada de 25 ml
o Micropipeta

▪ Albúmina
▪ Solución A: NaCO3 al 2% en 0.1 N de NaOH.
▪ Solución B: CuSO4, 5 H2O al 2% en NaOH a 0.1 N.

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PROCEDIMIENTO.
1. Llevar la muestra a 100 ml con agua.
2. Realizar la determinación de cantidad de agua y albúmina.
3. Colocar en recipiente.
4. Multiplicar la cantidad por 10 para obtener el resultado, diluido.
5. Tomar 100 µl con micropipeta.
6. Centrifugar dentro de la microcentrífuga con el propósito de obtener las cantidades de la
tabla I.
7. Agregar mezcla de solución AB 800 µl (50:1)
8. Cálculo de obtención de cantidad de soluciones necesitada por tubo.
9. Agregar los datos obtenidos.
10. Incubar 10 minutos TA.
11. Agregar reactivo Folin 100 µl cada uno.
12. Incubar 30 minutos.
13. Leer absorbancia a 600 nanómetros.
DATOS Y OBSERVACIONES.
Se analizó un total de cinco muestras, las cuales, tenían cantidades diferentes de albúmina. Éstas
fueron diluidas a un nivel de 100 μl de agua, además, se colocaron 100 μl de folin a 800 μl de cada
una de las anteriores. Después de haber realizado estos pasos, se incubaron en un promedio de
treinta minutos para visualizar el cambio de color.
Se infirió que las muestras que poseían una menor cantidad de albumina tenían un color claro, y
este iba incrementando forme la cantidad de albumina en la muestra. Esto también se ve reflejado
en la tabla que se encuentra abajo.
** Se debe considerar que hubo fallas en la práctica por falta de tiempo e inexperiencia,
entre ellas, las muestras fueron diluidas en un aproximado de diez veces lo usual a causa de la
ausencia de micropipetas, la cual, nos garantizaba un resultado más exacto. También, se
transfirieron las muestras diluidas a los tubos que contenían mayor albúmina a los que contenían
menor por los posibles residuos que podrían haber dejado en la punta del equipo.
RESULTADOS.

Cantidad de
proteina Absorcion
0 0
2 0.062
5 0.035
10 0.099
20 0.127

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 Absorcion
0.16
0.14 0.127

Absorcion (660nm)
0.12 0.099
0.1
0.08 0.062
0.06 0.035
0.04
0.02 0
0
0 5 10 15 20 25
Cantidad de proteina

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
MEDINA CHAIRE KARLA ELIZABETH: Se analizaron muestras con diferentes cantidades de
albúmina diluidas en tubos de microcentrífuga. Después de centrifugarlo, pudimos observar que
las muestras que contenían una menor cantidad de albumina se tornaron de un color más claro que
las otras al aumentar la cantidad en la muestra. Aunque tuvimos errores fuera de nuestro alcance,
pudimos determinar la concentración de albumina con éxito, gracias al uso del equipo, aunque
obtuvimos un pequeño error adicional al confundir los tubos, pero se puede percatar al
intercambiarlos de lugar. De igual manera, podemos identificar que los resultados son más
acertados que la mayoría de nuestros compañeros al utilizar la muestra, como se puede distinguir
en la gráfica.
CONCLUSIÓN.
Ya que el cobre en el reactivo Lowry reacciona con los enlaces peptídicos, estos se hacen visibles
a la vez que se reduce el cobre, formando una solución de color azul. Misma que se puede medir
dentro de un espectofotómetro.
Cumplimos con el objetivo de adaptarnos y utilizar adecuadamente las micropipetas para una toma
de muestra más definida y exacta, en nuestro caso, fueron agua y albumina para la preparación de
disoluciones para obtener la absorbancia.
REFERENCIAS.
[1] Métodos para la cuantificación de proteínas - Técnica del Plata -. (2022, March 11). Técnica
Del Plata. [Link]
[2] Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.
[3] Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using
bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.
[4] Ensayo de proteínas de Lowry: principio, protocolo y mecanismo - Estudyando. (2020,
September 7). [Link]
mecanismo/

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