Teórico 30 - Autofagia (“Comerse asimismo”)
Vías que aportan materiales a los lisosomas
● Endocitosis
● Fagocitosis
● Autofagia
Autofagia: proceso celular que media la degradación de material citoplasmático en
los lisosomas. Se forma una vesícula de doble membrana que se denomina
autofagosoma, y tiene un tiempo de vida de 100/20 minutos. Incluye componentes
propios de la célula, e inclusive, organelas enteras. Le permite al organismo
mantener su homeostasis; va renovando todos sus componentes. En determinadas
circunstancias puede estimularse y hacerse a mayor velocidad.
Importancia biológica y fisiopatológica de la autofagia
Es un mecanismo que la célula utiliza para adaptarse y sobrevivir en
condiciones de determinados tipos de estrés. El principal estímulo (estrés) que
desencadena la autogafia es una inanición (falta de nutrientes, ayuno); hay otros
como la falta de energía, hipoxia, falta de factores de crecimiento.
Es importante durante la embriogénesis y la diferenciación celular, frente a
infecciones virales y bacterianas, y el envejecimiento celular.
La alteración del proceso puede favorecer el desarrollo de diferentes
enfermedades neurodegenerativas y cáncer.
Tipos de autofagia
● Macroautofagia: en primer lugar se forma una membrana de aislamiento la
cual recluta una carga. Ésta se cierra formando el autofagosoma y se fusiona
con un lisosoma, formando un autolisosoma, donde se degrada la carga y la
membrana.
● Microautofagia
● Autofagia mediada por chaperona
Autofagia no selectiva: Es la que ocurre continuamente y está estimulada por el
ayuno. Ayuda a la supervivencia reciclando moléculas. Se pueden incluir distintos
tipos de carga.
Autofagia selectiva: Requiere receptores de autofagia, no se incluye cualquier
cosa. Dependiendo del tipo de carga, se denomina el proceso como: mitofagia
(mitocondrias), reticulofagia (retículo endoplásmico), lipofagia (gotas lipídicas),
pexofagia (peroxisomas) y ribofagia (ribosomas).
Visión general simplificada del proceso de macroautofagia
A partir de un estímulo se reclutan ATGs (proteínas inductoras de autofagia)
en un sitio específico que se denomina sitio de ensamblaje del fagósforo, el cual va
creciendo hasta encerrar la carga, formando el autofagosoma, que luego se fusiona
con lisosoma para formar el autolisosoma. Finalmente los
componentes degradados son reciclados.
Visión general del proceso de autofagia en
mamíferos
Se da en diferentes etapas: iniciación - nucleación
del fagósforo - expansión e inclusión de la carga - sellado
- maduración - fusión con el lisosoma - reciclaje de
nutrientes.
Una vez que se estimula la autofagia por algún
estrés, comienza la iniciación. El complejo iniciador se
denomina ULK1. Su proteína principal es la ULK1 que
tiene actividad de ser-threo quinasa, es decir, fosforila
residuos de serina y threonina en distintas proteínas.
Puede autofosforilarse, fosforila componentes de este
complejo, y también la proteína VPS34, que se encuentra
en el complejo PI3K.
El segundo complejo, que interviene en la nucleación del fagósforo, es el
complejo IP3K clase 3. Su proteína principal es la VPS34, una quinasa de lípidos
que fosforila al PI en posición 3, produciendo PI3P (fosfatidilinositol 3 fosfato). La
nucleación se va a dar en el RE en un sitio denominado omegasoma; el complejo
ULK1 recluta al complejo IP3K hacia éste. Dentro del segundo complejo hay una
proteína denominada Beclina 1 que regula la actividad quinasa de VPS34.
La expansión de la membrana del fagósforo se da gracias a vesículas
(provenientes de diferentes compartimentos celulares) que en su membrana tienen
ATG9 (proteína integral de membrana). Simultáneamente se va incluyendo la carga.
La membrana enriquecida en PI3P recluta muchas proteínas, entre ellas, la
WIPI2. Ésta, junto a otra proteína, reclutan otras ATG (ATG3, ATG12-ATG5). En
este punto, una proteína citosólica denominada LC3, es reclutada por el complejo de
ATGs hacia la membrana del fagósforo y es modificada. En primer lugar sufre un
corte proteolítico por parte de ATG4 (proteasa) pasando a denominarse LC3I. En
segundo lugar, otras ATG (3,7,etc) conjugan el corte con fosfatidiletanolamina,
transformándola a LC3II, una molécula marcadora de autofagia por excelencia;
además promueve la expansión, el posterior sellado y atrae proteínas con dominios
LIR (de unión a LC3II).
La maduración implica la pérdida de ATGs de la membrana externa del
autofagosoma y el reclutamiento de la maquinaria de transporte y de fusión del
autofagosoma. El autofagosoma va a ser transportado hacia el lisosoma a través del
citoesqueleto de microtúbulos por interacción con proteínas motoras de éstos
(kinesina/dineína). También se incluyen las proteínas SNARE que permiten la fusión
del autofagosoma con el lisosoma y las proteínas Rab que permiten la interacción
con el factor Rab correspondiente para poder interaccionar con la membrana del
lisosoma y poder fusionarse.
Autofagia selectiva: reclutamiento de la carga
Tiene que haber señales presentes en las moléculas/estructuras carga. Las
más comunes son la monoubiquitina, cadena de poliubiquitina, ubiquitina fosforilada.
Además, se necesitan receptores de autofagia, los cuales tienen que tener
dominios especiales. Un dominio de unión a ubiquitina y un dominio LIR para
interaccionar con LC3II.
Ejemplo: mitofagia - receptores dependientes de ubiquitina
En una mitocondria no funcional se activa una quinasa denominada PINK1
que, además de fosforilar, recluta una ubiquitina ligasa denominada Parkin. Ambas
trabajan en conjunto para introducir residuos de ubiquitina y fosforilarlos. Se
obtienen muchas proteínas de la membrana con marcas de ubiquitina fosforilada.
Ésta, se va a unir a un receptor de autofagia a través de su dominio de unión a
ubiquitina. Y el dominio LIR se une al autofagosoma.
Ejemplo: mitofagia - receptores independientes de ubiquitina
Se da cuando proteínas de la membrana de la mitocondria ya tienen un
domino de unión LIR. Este dominio debe estar fosforilado, por lo que, antes
situaciones de estrés, se activan las quinasas denominadas “quinasas activadas por
estrés” y lo fosforilan.
Ejemplo: mitofagia - reconocimiento de la carga mediada por lípidos
Hay ciertos lípidos como la cardiolipina y la ceramida que se encuentran en la
membrana interna de la mitocondria, pero antes estrés transloca a la membrana
externa, siendo reconocida por la LC3II.
¿Cómo se activa el complejo ULK1? Vía de mTOR
Cuando el complejo mTOR se
encuentra activo y unido a Rheb (GTPasa)
inhibe la autofagia. Su activación también
depende del complejo Rheb-GAP, que
cataliza la hidrólisis de Rheb, inactivando el
complejo mTOR.
La presencia de factores de
crecimiento inhibe a la Rheb-GAP. Es decir,
no inactiva a la mTOR por lo que se inhibe la
macroautofagia. La disminución de energía
estimula la AMPK que fosforila el complejo Rheb-GAP activandolo. El estrés por
hipoxia también activa a Rheb-GAP. Es decir, se va a inactivar el mTOR por lo que
no se va a inhibir la autofagia.
El mTOR también se puede regular por la concentración de nutrientes, ya
que una baja concentración de nutrientes también lo inhibe.
mTOR y regulación del inicio de autofagia
Cuando hay nutrientes suficientes, es decir, cuando mTOR está activo,
fosforila componentes del complejo ULK1 inhibiendo la autofagia. Además AMPK
está inactiva porque hay una concentración correcta de nutrientes.
En situaciones de inanición (estrés) AMPK se activa y fosforila diversos
sustratos, principalmente a Rheb-GAP. También fosforila un componente del
complejo mTOR inactivandolo y sitios activadores a ULK1 (activandolo), que a su
vez se desfosforila en los sitios inhibitorios. Estos sitios activadores fosforilan otros
componentes del complejo ULK1 y se autofosforila; se inicia la formación del
autofagosoma.
Métodos para monitorear la autofagia
● Microscopía electrónico
● Westernblot: relación LC3I/LC3II, cuando hay autofagia debe aumentar la
LC3II
● Microscopía de fluorescencia: LC3-GFP
● Microscopía de fluorescencia: colocalización de mitocondrias y lisosomas
(detección de mitofagia).
● Microscopía de fluorescencia: inmunofluorescencia; con cualquiera de las
principales proteínas de la autofagia.
