Teórico 29 - Apoptosis

Subtipos de muerte celular

●​ Muerte celular accidental: en células expuestas a estímulos extremos: físicos,

químicos o mecánicos. Muerte no controlada con pérdida inmediata de la
integridad estructural.
●​ Muerte celular regulada: muerte celular iniciada por una maquinaria
codificada en el genoma. Puede ser modulada farmacológicamente o
genéticamente.
➔​ Muerte celular programada: muerte regulada que ocurre como parte de
un programa de desarrollo o para preservar la homeostasis fisiológica
de tejidos adultos.

Necrosis y apoptosis

Necrosis
Una de las características principales es que hay daño en la membrana
plasmática (irreversible), por lo que se produce un edema, aumenta el volumen
celular y se pierde el contenido celular. Se activan enzimas hidrolíticas en el medio
extracelular dañando otras células, por lo que se genera una respuesta inflamatoria.
Apoptosis
​ En este caso, la membrana plasmática permanece intacta. Hay una pérdida
de uniones celulares (célula-célula y célula-matriz). Hay una disminución del
volumen celular. Se forman una vesículas que se liberan en forma de cuerpos
apoptóticos. Éstos son reconocidos por células fagociticas, por lo que no se daña el
entorno; no se genera una inflamación.

Visión general
del proceso de
apoptosis
¿Por qué las células sufren apoptosis?

​ La muerte celular programada es tan necesaria para el desarrollo normal

como la mitosis:
●​ Formación de estructuras corporales (mano, intestino)
●​ Desarrollo temprano del sistema nervioso (mayor cantidad de neuronas)
●​ Células que ya han cumplido su función (cola del renacuajo)
​ También es necesaria para la destrucción de células que representan una
amenaza para el organismo:
●​ Destrucción de células infectadas por virus.
●​ Remoción de células autorreactivas del sistema inmune.
●​ Células con el ADN dañado.

Iniciación de la apoptosis

Hay tres estímulos:

●​ Activación de receptores de membrana, denominados receptores de muerte.
●​ Daño en el ADN: inducido por compuestos químicos, tóxicos, radiación
ionizante, envejecimiento, infecciones virales, fallas en la replicación, etc.
●​ Estrés celular: disminución de factores de crecimiento, hormonas, señales de
supervivencia, desacople de uniones celulares, aumento de radicales libres
(aumento de estrés oxidativo).
​ Cualquiera de los tres estímulos, termina activando enzimas específicas
denominadas CASPASAS (proteasas), que se clasifican en iniciadoras y ejecutoras
(activadas por las primeras).
​ Estas caspasas tienen sustratos diferentes, algunos están en el citosol, otros
en el núcleo. Cuando se produce la proteólisis de estos sustratos se observa las
características de la apoptosis: retracción de la membrana y formación de ampollas
(biebbing) - colapso del citoesqueleto - condensación nuclear - degradación del ADN
- formación de cuerpos apoptóticos.

Caspasas
​
Se trata de proteasas específicas ricas en cisteína que clivan en residuos de
aspartato. Se sintetizan como proenzimas; procaspasas.
​ Subfamilia ICE (enzima convertidora de interleuquina-1 beta): intervienen en
la inflamación; en la maduración de citoquinas inflamatorias.
​ Subfamilia CED-3 (caspasa de C. elegans; gusano): es la subfamilia que se
divide en ejecutoras e iniciadoras.
​ ​ Ejecutoras: caspasa-7, caspasa-3, caspasa-6.
​ ​ Iniciadoras: caspasa-8, caspasa-10, caspasa-2, caspasa-9.
Activación de las caspasas

Una procaspasa tiene tres dominios: prodominio, dominio grande y dominio

pequeño. Entre los dos primeros, y entre los últimos, hay un residuo de aspartato;
se pueden autoclivar.
Una caspasa activa es un tetrámero, formado por dos subunidades grandes y
dos subunidades pequeñas; escisión de prodominios. Cuando se encuentra activa,
activa muchas moléculas de caspasas ejecutoras.
Los prodominios se clasifican en:
Dominio de reclutamiento de caspasa (CARD): procaspasas 1, 2, 3, 5,
9, 11, 12 y 13.
Dominio efector de muerte (DED): procaspasas 8 y 10.

Vías de activación

●​ Vía intrínseca / vía mitocondrial: Involucra principalmente a la mitocondria.

●​ Vía extrínseca: Ocurre de afuera hacia adentro de la célula; depende de la
activación de los receptores de muerte.
​ Ambas se relacionan entre sí a través de la proteína tBid.

●​

Vía extrínseca
​ Los receptores de muerte, en general, funcionan como trímeros que tienen 3
dominios. Un dominio extracelular, donde se une el ligando, que también suelen ser
trímeros, los más comunes son Fas y TNF. Un dominio transmembrana. Un dominio
de muerte (en citosol), le permite unirse a una proteína adaptadora (FADD), la cual
también tiene un dominio de muerte, y un dominio efector de muerte, a través del
cual interacciona con una procaspasa iniciadora.
​ Cuando se une el ligando al receptor, éste se une a la proteína adaptadora
que interacciona con la procaspasa iniciadora. Este complejo que se forma se
denomina complejo de señalización inductor de la muerte (DISC) o receptosoma.
Las procaspasas están lo suficientemente cerca para autoactivarse.

Regulación negativa de la vía extrínseca: receptores señuelo

Los receptores de señuelo son muy similares a los receptores de muerte,
pero no tienen el dominio de muerte. El ligando se une, pero no dispara la
apoptosis. Actúan competitivamente con los receptores de muerte. Dependiendo las
necesidades de la célula, se van a expresar en mayor proporción unos que otros.

Regulación negativa de la vía extrínseca: proteínas intracelulares - FLIP

​ Estas proteínas tienen una estructura muy similar a la de las procaspasas 8
(iniciadora), excepto porque carecen de residuos de cisteína en el sitio catalítico (lo
que le da la actividad catalítica a la caspasa). Éstas, a través de su dominio efector
de muerte se pueden unir a la proteína adaptadora FADD, pero como en su sitio
catalítico carecen de cisteína, no pueden activar a la caspasa 8.

Vía intrínseca de la apoptosis o vía mitocondrial

Los principales estímulos son diferentes tipos de estrés celular. Cuando llega
uno de ellos, se liberan, hacia el citosol, proteínas que se encuentran en el espacio
intermembrana de la mitocondria; la más común es el citocromo C. Esta liberación
está regulada por la familia de proteínas Bcl-2.
​ El citocromo C se une a la Apaf-1 (factor activador de proteasas
apoptóticas-1) cambiando su conformación, por lo que se expone un nuevo dominio
CARD, donde se van a unir la procaspasa-9 (que también tiene un dominio CARD),
formándose una estructura con 7 moléculas de Apaf y 7 moléculas de procaspasa-9
denominada apoptosoma. En esta estructura, las procaspasas se encuentran lo
suficientemente cerca para autoactivarse y así activar las procaspasas efectoras.

Regulación negativa de la vía intrínseca

●​ Proteínas HSPs (proteínas de shock térmico). Por ejemplo, la Hsp-27 une
citocromo C, por lo que disminuye su disponibilidad para interaccionar con la
Apaf-1. Las Hsp-70 y Hsp-90 inhiben el reclutamiento de procaspasa 9 y la
oligomerización de Apaf.
●​ Proteínas antiapoptóticas Bcl2/Bcl-XL.
●​ IAPs

Miembros de la familia Bcl-2

​
Tienen sitios de unión BH. Según los tipos que tenga, se subclasifican en:
●​ Proteínas antiapoptóticas: BH1 y BH2 (formación de poros), BH3 y BH4
(regulación de proteína) y TM (anclaje a membrana). Ejemplo: Bcl2, Bcl-XL.
●​ Proteínas proapoptóticas BH123: BH1, BH2, BH3 y TM. Ejemplo: Bax, Bak.
●​ Proteínas proapoptóticas “sólo BH3”: es un hélice anfipática que le permite
dimerizar (con miembros de la misma subclasificación o con miembros de
otras subclasificaciones). BH3 y TM. Ejemplo: Bad, Bid.

El papel de las proteínas Bcl-2 proapoptóticas BH123 en la liberación de proteínas

mitocondriales: Bax, Bak
​ En condiciones normales están inactivas, es decir, como monómeros, ya sea
en el citosol o anclada a la membrana externa. Cuando reciben un estímulo
apoptótico, tienen la capacidad de oligomerizar y formar estructuras similares a
poros/canales que permiten la salida de proteínas, como el citocromo C.
Regulación mediante las proteínas proapoptóticas “solo BH3” y antiapoptóticas
​ Las proteínas proapoptóticas BH123 se encuentran inactivas porque están
siendo inhibidas por las proteínas antiapoptóticas. Cuando llega un estímulo, las
proteínas proapoptóticas “sólo BH3” inhiben a las antiapoptóticas.

El balance o la concentración relativa de proteínas pro y anti apoptóticas

define el destino celular hacia la supervivencia o hacia la muerte.

Proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs)

Son proteínas que se unen a las caspasas activadas y las inhiben, a través
de su dominio BIR. Algunas de ellas tienen un dominio denominado RING que tiene
actividad de ubiquitina-ligasa, por lo que además de inhibir a las caspasas, las
pueden poliubiquitinizarlas para mandarlas a degradación. Otras tienen un dominio
CARD que regula la actividad de la ubiquitina-ligasa.
Smac/Diablo: inhibe a las proteínas IAPs; favorece la apoptosis ya que no se
degradan las caspasas.

Apoptosis inducida por células citotóxicas: linfocito T citotóxico /

linfocito killer que eliminan células tumorales o células infectadas
por virus

Los linfocitos tienen en su citoplasma vesículas/gránulos citotóxicos que ante

un estímulo (producido por la interacción de sus proteínas de membrana con
receptores de la célula diana) se dispara el transporta/traslocación de los gránulos
hacia la zona de contacto entre las dos células por exocitosis (el proceso se
denomina sinapsis inmunológica). Se liberan dos tipos de proteínas, las perforinas
que tienen la capacidad de formar canales en la membrana de la célula diana. Las
granzimas son las que ingresan en la célula diana y desencadenan la apoptosis.
Son muy similares a las caspasas porque pueden clivar residuos de aspartato. Por
un lado, pueden clivar sustratos similares a los que activan las caspasas y por otro
lado pueden activar procaspasas. Se genera la cascada de caspasas y se produce
la apoptosis.

Apoptosis y ciclo celular

Cuando el ADN no se encuentra dañado, la p53 (factor de crecimiento) está

en baja expresión. Cuando hay un daño en el ADN se activan las quinasas
ATM/ATR y Chk1/Chk2 y se fosforila p53, cambia su conformación y se disocia de
Mdm2 (aumenta su concentración porque no se degrada más). p53 estimula la
expresión de inhibidores de complejos ciclina/CDK (como el p21 que inhibe Cdk-G y
Cdk-S; detención sostenida en G1 y G2); frena el ciclo celular.
 p53 también induce la reparación del ADN. Además de que induce la
expresión de genes que estimulan apoptosis, principalmente la proteína Bax.
​ Cuando hay daño en el ADN también se estimula la expresión del gen INK4a,
que es procesado por el proceso de corte y empalme alternativo, de manera tal que
puede dar dos proteínas: p16 y p14ARF. La primera es un inhibidor del ciclo ya que
inhibe al complejo ciclina D1/Cdk4. La segunda inhibe a Mdm2 que es la que inhibe
a p53, por lo que su concentración va a aumentar.

Los factores de supervivencia inhiben la apoptosis: mecanismos

Estimulación de la expresión de las proteínas antiapoptóticas del tipo Bcl2

​ El factor de supervivencia interacciona con el receptor de membrana y se
desencadenan vías de señalización que activan proteínas reguladoras de genes que
entran al núcleo y estimulan la transcripción de proteínas antiapoptóticas.

Inactivación de las proteínas Bcl2 proapoptóticas “sólo BH3”

​ Está involucrada la vía de la IP3K. El factor de supervivencia interacciona con
el receptor y se activa la quinasa Akt que fosforila diferentes sustratos, entre ellos
Bad (proapoptótica “sólo BH3”) que se encuentra inhibiendo a una proteína
antiapoptótica.

Inactivación de las anti-IAP

​ Está involucrada la vía de la MAPK. El factor de supervivencia interacciona
con el receptor y se activa una MAPK que fosforila a una proteína anti-IAP,
inactivandola.

Eventos bioquímicos de la apoptosis

En primer lugar se activan las caspasas iniciadoras que activan a las

efectoras. Pero también tienen sustratos celulares sobre los cuales actúan,
produciendo los eventos bioquímicos tempranos. Los dos eventos principales son la
formación de ampollas (biebbing) y la translocación de fosfatidilserina (PS).
​ Luego de la activación de las caspasas efectoras, tienen lugar los eventos
bioquímicos tardíos que a nivel del núcleo son: degradación de proteínas nucleares
- compactación de la cromatina - activación de nucleasas (fragmentación ADN) -
desregulación de la replicación y transcripción. Y a nivel citosólico: pérdida de
uniones celulares - cambios en la localización de proteínas (transglutaminasa) -
fragmentación del RE y el Golgi.

Formación de ampollas en la membrana (biebbing)

Uno de los sustratos de las caspasas iniciadoras activas son proteínas que
se encuentran en el cortex celular; las fodrinas. Cuando se cliva esta proteína se
pierden las vinculaciones entre el cortex de miosina y la membrana (en zonas
localizadas). Cuando los filamentos del cortex se contraen por la presión del citosol,
parte del fluido sale hacia afuera formando la ampolla.

Translocación de fosfatidilserina
La fosfatidilserina se encuentra mayormente en la hemicapa citosólica,
cuando se expone en la hemicapa externa es porque la célula se encuentra en
apoptosis; es una señal “comanme”.
¿Por qué sucede esta translocación? Las caspasas iniciadoras activas
pueden inhibir a la enzima translocasa, que revierten la translocación de la
fosfatidilserina. Además activan a la enzima escramblasa que expone la
fosfatidilserina del lado extracelular.

Pérdida de uniones celulares

​ Otro de los sustratos de las caspasas ejecutoras activas (3 y 6) son proteínas
que forman parte de las uniones celulares. Se degradan las alfa y beta cateninas
(uniones adherentes), citoqueratinas (hemidesmosomas y desmosomas) y quinasas
de los contactos focales (contactos focales).

Cambios en la localización de proteínas

​ Otro de los sustratos de las caspasas es la proteína transglutaminasa II, que
cuando es clivada cambia su localización. Normalmente está distribuida por todo el
citosol, pero cuando es clivada se dirige al cortex celular. Su función es catalizar la
formación de uniones cruzadas entre diferentes proteínas que están en el cortex,
como también las uniones entre aminoácidos; le dan alta estabilidad a las proteínas
entonces hacen que el cortex sea resistente a la ruptura y degradación química.

Fragmentación del RE y del Golgi

​ Otro de los sustratos de las caspasas ejecutoras son proteínas presentes en
el retículo y el Golgi, por ejemplo GRASP65 y golginas. Pasan de una estructura de
cisternas ordenadas a una estructura en forma de vesículas.

Fragmentación del ADN

​ Ocurre por varios eventos. En primer lugar por la degradación de la enzima
PARP, una enzima que interviene en la reparación del ADN. En segundo lugar, por
la degradación de la topoisomerasa, por lo que se bloquea la relajación de la doble
hélice del ADN. En tercer lugar, por la activación de nucleasas que degradan el ADN
entre nucleosomas. Las nucleasas no son el sustrato, sino que éstas se encuentran
unidas a proteínas inhibidoras que son degradadas por las caspasas.

Colapso nuclear
​ Ocurre por varios eventos. En primer lugar por la degradación de las láminas
nucleares (formadas por filamentos intermedios y adyacente a la hemicapa interna
de la lámina nuclear) por parte de las caspasas; además, las láminas nucleares no
sólo están asociadas con proteínas de la envoltura nuclear sino también con
proteínas o complejos que intervienen en la replicación y transcripción, por lo que se
desregulan estos dos procesos. En segundo lugar por condensación de la
cromatina, la cual, durante la apoptosis, tiene un alto grado de compactación pero
que es diferente a la compactación que ocurre durante la mitosis. En tercer lugar por
degradación de proteínas de la envoltura nuclear, primero se degradan proteínas
específicas del poro nuclear que están hacie el citosol, por lo que disminuye la
permeabilidad del poro permitiendo la entrada de las caspasas, que van a degradar
otras proteínas del poro nuclear y de la envoltura nuclear (proceso específico y
secuencial).

Etapa de clearence: fagocitosis de cuerpos apoptóticos

Los cuerpos apoptóticos son mucho más que un desecho celular.

Los cuerpos apoptóticos tienen una forma similar a vesículas, y contienen

mucha información de la célula de la que provienen: lípidos, proteínas, mARN,
miARN, organelas residuales; de tal manera que llevan esa información a la célula a
la que an a ingresar (por ejemplo: macrófago).
Estos cuerpos apoptóticos intervienen en la comunicación intercelular; se
consideran un tipo de vesícula extracelular.
Las células que contienen estos cuerpos apoptóticos (macrófago) pueden
inducir procesos de regeneración y reparación, regular procesos inflamatorios y
actuar como inmunoreguladores. E inclusive, como se pueden aislar estos cuerpos
apoptóticos, se pueden cargar drogas/moléculas y utilizarlos como una forma de
entrega. Es por todo esto que se considera a los cuerpos apoptóticos como
potenciales herramientas de diagnóstico y herramientas terapéuticas.
El clearence defectuoso de los cuerpos apoptóticos puede producir diversas
patologías, como la aterosclerosis.

Desregulación de la apoptosis

Muerte en defecto: las células que deben morir, no lo hacen. Se tienen

patologías como cáncer, lupus, etc.
La desregulación de la apoptosis lleva al crecimiento de tumores ya
que aumenta la proliferación y disminuye la apoptosis (sobreexpresión de
proteínas IAPs / Bcl2).
Muerte en exceso: se tienen patologías como el SIDA, infarto de miocardio,
etc.