METODOS INMUNOLOGICOS DE LABORATORIO
INTRODUCCION.- las pruebas de laboratorio evolucionan para poder determinar y cuantificar
distintos elementos en fluidos biológicos, es decir que cada vez aparecen distintas pruebas
para identificar distintas moléculas a medida que la medicina y la ciencia van avanzando o
evolucionando
Entonces un elemento como la purificación y la creación de anticuerpos ha revolucionado el
diagnostico en laboratorio, porque los anticuerpos son los que entregan esa especificidad a las
mediciones que se realizan, por lo tanto esto ha creado ensayos basados en reacciones
antígeno – anticuerpo, eso veremos, métodos de laboratorio que se basan en reacciones
antígeno – anticuerpo
Entonces esas reacciones antígeno – anticuerpo tienen varias características propias, entre
ellas resalta la
- especificidad .- el anticuerpo tiene afinidad por un cierto orden de patrones
moleculares, si le cambian una molécula a ese anticuerpo ya no será específico para un
determinado antígeno
- reversible.- las uniones o enlaces bioquímicos que se realizan entre el antígeno y el
anticuerpo son débiles porque son enlaces no covalentes, entre estos resaltaran los
puentes de hidrogeno, las interacciones electrostáticas, las interacciones hidrófobas y
las fuerzas de van der Waals
- rápida.- estas reaccin sucede de manera rápida es en el orden de milésimas de
segundo
- espontanea.- porque no requiere el consumo de energía
ANTICUERPOS PARA DIAGNOSTICO .- para realizar un inmunodiagnostico necesitamos de
anticuerpos específicos contra moléculas de interés contra antígenos específicos, esos a su vez
nos dicen que pueden ser de dos tipos
- anticuerpos policlonales.- son anticuerpos obtenidos del suero animal previamente
expuestos al antígeno de interés, entonces se obtienen a través de múltiples clonas de
linfocitos B específicos para un determinado antígeno
- anticuerpos monoclonales.- al contrario de los policlonales, los monoclonales son
anticuerpos obtenidos de una sola clona de linfocitos B también específicos para un
determinado antígeno
Eso quiere decir que ambos son específicos tanto el anticuerpo policlonal como el monoclonal
En la imagen vemos que tenemos distintos anticuerpos que son específicos para un antígeno X
Si los anticuerpos son distintos estamos hablando de anticuerpos policlonales, entonces ocurre
que se reconoce ese antígeno X contra distintos epitopes del mismo antígeno X , tenemos el
antígeno X pero ese antígeno X se va a caracterizar por tener una variedad considerable de
epitopes o determinantes antigénicos para cada uno de estos anticuerpos, porque son
policlonal
Por este otro lado tenemos un suero con anticuerpos también para un antígeno x pero en este
caso son de una sola clona por eso se los denomina monoclonal, entonces tenemos el antígeno
X acá se reconoce un solo epitope de ese antígeno porque está proviniendo de una sola clona
de un anticuerpo monoclonal, entonces decíamos que son específicos contra la molécula por
la cual han sido creados entonces entre los dos cual va a ser el más específico obviamente el
monoclonal.
Cuál va a ser la utilidad de esos anticuerpos los anticuerpos policlonales son útiles para
pruebas de laboratorio que necesiten de la formación de complejo antígeno - anticuerpo
grandes como se ve en la gráfica. Entonces son complejo antígeno - anticuerpo grandes,
mientras que los anticuerpos monoclonales son útiles para pruebas de laboratorio que
necesitan encontrar de forma más específica a un determinado antígenos, cual es el fin
diagnostico específico.
Entonces volvemos a lo que más antes decíamos cuales van a ser más específicos los que nos
van a servir para emitir un diagnostico inmunológico laboratorial, los anticuerpos
monoclonales.
LOS ANTICUERPOS COMO HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO
Un anticuerpo como tal no dice nada desde el punto de vista laboratorial a no ser que se
anticuerpo se pueda conjugar con moléculas reveladoras, eso quiere decir que nosotros no
podemos evidenciar a ojo humano como es la reacción antígeno anticuerpo, necesitamos que
no revele necesitamos moléculas reveladoras que nos indique que ha sucedido en un lugar
específico esa reacción antígeno anticuerpo, y esas moléculas reveladoras las más
comúnmente utilizadas son o enzimas o fluoroforos o radioisótopos. Cualquiera de esos tres
como moléculas reveladoras de una reacción antígeno anticuerpo.
Tenemos tres tipos de anticuerpos que obviamente van a reaccionar con un determinado
antígeno y que en su fracción cristalizable las tres tienen este tipo de moléculas reveladoras,
en el primas caso tendremos una enzima en el segundo un fluoroforo y en el tercero un
radioisotopo, entonces tendremos en el primer ejemplo la enzima a la cual se le suma el
substrato y de esa reacción enzima substrato genera un producto, y ese producto va a ser un
color que nos va emitir y ese color lo vamos a determinar por absorbencia y transmitancia en
un equipo laboratorial denominado de espectrofotometro que nos va a cuantificar la cantidad
de ese antígeno que queríamos determinar.
El otro será el ejemplo será el del fluoroforo que también está unido a la fracción cristalizable
una vez que ese anticuerpo se ha unido a un determinado antígeno de este estudio, en este
caso no necesita un sustrato, pero como es un fluoroforo necesita una luz, necesita excitar ese
fluoroforo para que emita otra luz de distinto color a una distinta longitud de onda
dependiendo de que sustancia este excitando el fluoroforo y esa medición de luz se medirá
por otro equipo del laboratorio denominado de fluorimetro.
Y por último tendremos los radioisótopos que también estára unidos a la fracción cristalizable
de ese anticueerpo y cuyo mecanismo va a ser la emisión de radiación el cual va ase leído por
un lector gamma, entonces la revelación indica que ha sucedido la reacción antígeno -
anticuerpo.
Aquí otro concepto que debemos tener muy en cuenta que nos habla del anticuerpo
secundario, entonces por ejemplo vean esta grafica acá tenemos un antígeno X al cual se ha
unido un anticuerpo específico para ese antígeno X y a este anticuerpo se le denomina como
anticuerpo primario, entonces hay anticuerpos primarios que ya tienen una molécula
reveladora
ANTICUERPO SECUNDARIO
Ahora aquí otro concepto que debemos tener muy en cuenta que nos habla del anticuerpo
secundario.
entonces por ejemplo vean esta gráfica acá tenemos un antígeno x al cual se ha Unido un
anticuerpo específico para ese antígeno X y a este anticuerpo se le denomina como anticuerpo
primario, entonces hay anticuerpos primarios que ya tiene una molécula reveladora, pero en
su mayoría no lo tiene y cuando no lo tienen o sea no posee una molécula reveladora necesita
de un segundo anticuerpo que reconozca la clase de inmunoglobulina a la cual pertenece y ese
segundo anticuerpo o anticuerpo secundario es el que posee la molécula reveladora.
entonces aquí tenemos nuevamente el antígeno x al cual se ha Unido el anticuerpo específico
pero en este caso en su fracción cristalizable no está como en este otro una enzima, un
fluoroforos y un radioisótopo, si no se está uniendo un anticuerpo secundario y es este
anticuerpo secundario que posee la molécula reveladora, en este caso o ejemplo la molécula
reveladora será una enzima que posteriormente necesitará de un sustrato para emitir un color
y ser leído por espectrofotometría.
este anticuerpo secundario que posee las moléculas de reveladora nos dice que es un
anticuerpo anti-anticuerpos, entonces donde se está uniendo este segundo anticuerpo? a la
fracción cristalizable de quien? del primer anticuerpo que ha reconocido ese antígeno x
entonces de anticuerpos dirigidos contra la dirección de la cadena o la fracción cristalizable.
y esos anticuerpos anti-anticuerpos o anticuerpos secundarios pueden ser anti-Ig-M o anti-Ig-
G y anti-IgE, esos 3 tipos de anticuerpos secundarios que nos sirven en laboratorio.
Ahora hay varios efectos que pueden modificar la reacción antígeno anticuerpo, entonces
recordemos que es una reacción antigénico que va a estar dada por enlaces no covalentes,
por tanto es una reacción reversible.
cuáles son los factores que pueden jugar en la ruptura de sus enlaces no covalentes?
• pH
• Temperatura
• Concentración del anticuerpo
• concentración del antígeno
Estos cuatro factores son los que pueden jugar en modificar por ruptura del enlace covalente
en la reacción antígeno-anticuerpo, entonces nos da un ejemplo de anticuerpos que quieren
actuar sobre los glóbulos rojos y nos hablan de una influencia del punto isoeléctrico tomando
en cuenta que bioquímicamente los anticuerpos son proteínas porque están conformados por
más de 100 aminoácidos, entonces ahí nos hablan de 2 pH
1. de 6,5 obviamente pH acido
2. ph de 7.5 obviamente álcalino
Porque sabemos que el ph de 7 es neutro, entonces qué sucede cuando teníamos ph ácido
aumenta la concentración de hidrogeniones o protones qué cargas tienen? Carga positiva ,
tiene la bicapa lipídica del glóbulo rojo carga negativa y porque tiene carga negativa??
porque entre la bicapa lipídica aparte de sus proteínas periféricas integrales estarán ahí el
ácido cítrico el ácido salicílico le conferirá la carga negativa entonces si hablamos de un pH
ácido tendremos mayor concentración de carga positiva y aquí hay que recordar y recalcar que
el anticuerpo mira estos anticuerpos que se van a unir el siglo rojo generalmente se
caracterizan porque tienen carga positiva, entonces en pH ácido cargas iguales se repelen,
entonces no va a haber una buena reacción antígeno anticuerpo, mientras que por el otro lado
tenemos un ph de 7.5 eso que quiere decir que la va a disminuir la carga de protones, no las
cargas positivas. Así que tenemos
• Cuatro cargas positivas ph de 6.5
• pH 7.5 tendremos solamente dos cargas positivas
se ha disminuido la acidez porque no es un seguido a un parámetro alcalino de 7.5 por tanto
acá va a haber una buena dirección antígeno anticuerpo por qué por qué signos distintos sr
atraen.
Pero qué es el punto isoeléctrico? es un estado químico en el cual se igualan las cargas
positivas y las cargas negativas, la parte protonada y la parte desprotonada de una
determinada molécula, o el ph al cual todas las moléculas se neutralizan y adquieren una
carga de cero.
Entonces con este ejemplo de ver como el ph va a afectar a esta reación antígeno anticuerpo
como médicos tendríamos que tener mucho cuidado si ese paciente está haciendo una
acidosis o el paciente está haciendo una alcalosis, si hablamos de temperatura también la
temperatura óptima será 37º si está por debajo de 37 entonces también las reacciones de
antígeno anticuerpo serán más lentas y si está por encima se está haciendo una frecula o ya
ha desencadenado una fiebre mayor a 38º entonces las reacciones antígeno anticuerpo
también se producirán de una manera más rápido más violento.
El Ph al cual todas las moleculas se neutralizan y adquieren una carga de 0. Con este ejemplo
de como el pH va a afectar a la reacción antigeno-anticuerpo, como médicos hay que tener
mucho cuidado si un paciente está haciendo una acidosis o una alcalosis.
Si hablamos de temperatura, la temperatura óptima será 37° .
• Si está por debajo de 37 entonces también las reacciones antigeno-anticuerpo serán
más lentas.
• Si está por encima, si está haciendo una febricula o ya ha desencadenado una fiebre de
38°, las reacciones antigeno-anticuerpo serán más rápidas. Es violento.
Hay que tener ciertos factores en las reacciones antigeno-anticuerpo.
Entrando ya en el tema, vemos las pruebas inmunológicas de laboratorio: se basan en la
reacción antigeno-anticuerpo.
Veremos las pruebas:
• Aglutinacion
• Precipitacion
• Pruebas de fase sólida
• De análisis para detectar estructuras subcelulares
• Inmunofluorescencia
• Citometria de flujo
Aglutinacion: Utilizan células en suspensión las cuales forman conglomerados por medio de
puentes de anticuerpos entre las celulas que formaran los conglomerados.
Surge un nuevo concepto que es la Reacción de Equivalencia., que no necesariamente es igual
pero tiene que haber una reacción entre célula y anticuerpo, equivalencial 5-5, 10-10. Se
necesita para esto un material particulado para revelar la reacción antigeno-anticuerpo o para
revelar la reacción de ese conglomerado.
El material particulado va a ser la misma célula porque tiene superficie , volumen y es soluble
en el medio.Mas actualmente se utiliza el látex .
Estas pruebas son sencillas y fácile de realizar, se hace un screening tamizaje que nos dan una
idea general, pero que después requieren otra prueba para confirmar lo que se ha observado
las reacciones positivas se observan aglomerados celulares con mucho observado espacios
vacíos, por la formación de conglomerado.
Existen dos tipos de pruebas de Aglutinacion: Directa e Indirecta.
AGLUTINACION DIRECTA.- como la clasificación sistema ABO de glóbulos rojos. Se utilizan
antisueros que son soluciones con anticuerpos que son específicos para los antígenos ABO de
los glóbulos rojos. El material particulado son los glóbulos rojos. Observamos reacciones
positivas y reacciones negativas que son suspensiones homogéneas.
AGLUTINACION INDIRECTA: Por el lado contrario la aglutinación indirecta (aglutinación en
látex) en este caso el látex va hacia nuestro material particulado que se conjuga con los
anticuerpos para detectar moléculas solubles en suero:
por ejemplo
• Proteína C reactiva
• Factor reumatoide
• Toxinas bacterianas.
PRUEBAS DE PRECIPITACION: Se basan en la multivalencia de los anticuerpos. Una molécula
puede unirse a mas de un antígeno ( cuando hablamos de la IgG porque tiene una estructura
monomerica y esta tiene dos sitios de unión para el antígeno)
Segundo la detección de un antígeno polivalente: Mas de un epitome por molécula de
antígeno. (Recordando que un antígeno no solo estará enmarcado con un determinante
antigénico sino puede contener 5 a más determinantes antigénico)
Complejo por uniones covalentes: Complejo grande que se separa de la solución por
precipitación.
Una vez que se separe por precipitación se puede tener:
• Centrifugación por precipitado
• Separación por métodos bioquímicos
• O hacerlos visibles en una matriz de gel
Una de las aplicaciones mas comunes en las pruebas de precipitación es
LA INMUNOPRECIPITACION EN MATRICES DE GEL:
1. El deposito del antígeno que se quiere buscar y los anticuerpos. Ambos son colocados
en pocillos sobre un gel de agarosa. Con una distancia equidistante entre ambas
2. Se deja reposar ambos donde empezaran a difundir radialmente las moléculas
colocadas en los pocillos tanto el antígeno como el anticuerpo.
3. Una vez que se deja reposando, llegara un punto donde ambos elementos van a
encontrarse dando lugar a la reacción antígeno – anticuerpo.
Y esta reacción será un precipitado visible.
PRUEBAS CON SOPORTE DE BASE SOLIDA: Estas pruebas se caracterizan porque fueron un
logro y un avance considerable en el inmunodiagnostico.
Definiendo esta prueba cuando los antígenos o anticuerpos se depositan en bases sólidas. En
una placa de misma titulación, en un portaobjeto o en una membrana de nitrocelulosa.
De estas pruebas con soporte de base solida. Fue iniciada con el RADIOINMUNOENSAYO
(RIA) esta prueba fue atribuida como premio novel en 1977 a Rosalind Yalow fue atribuida
porque antes de RIA los métodos no eran tan sensibles para detectar proteínas u hormonas en
líquidos biológicos.
La Prueba de Radioinmunoensayo (RIA) Nos dice que utiliza radio isotopos y el más común es
el yodo 125 (I125), es una metodología inicial de un ensayo competitivo.
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La primera vez que se utilizó esta prueba era para poder identificar la insulina:
1er paso En un pocillo se deposita el anticuerpo Anti-Insulina.
2do paso Se va a depositar la muestra del paciente que obviamente tendrá una determinada
concentración de insulina, a su vez también se va a depositar el reactivo de insulina que va
hacer marcado con yodo 125. Ambos se colocan y ambos van a competir por el anticuerpo
anti-insulina lo que va a variar será la concentración de insulina en nuestro paciente, porque
esta reacción de reactivo-insulina será conocido.
Después de que se una las moléculas del reactivo o del paciente se hace una lectura utilizando
el Lector Gamma que nos va a permitir cuantificar y trasponer esos resultados en una curva de
calificación esto nos dice que es una prueba inversamente proporcional.
Esto nos quiere decir que a una mayor cantidad de insulina va haber menor disponibilidad de
insulina marcada con yodo 125 por tanto la señal de esta curva será menor.
O todo lo contrario, si hay una menor concentración de insulina va haber una mayor
disponibilidad de reactivo de insulina marcado otorgando una máxima señal de lectura
positiva, esta prueba tiene alta sensibilidad nos permite identificar concentraciones de
insulina en el rango de pico gramos la desventaja es los riesgos de radiación en esos
profesionales de laboratorio que realizaban este tipo de pruebas.
Ensayo InmunoSorbente Ligado a Enzimas (ELISA)
El mecanismo o su fundamento va ser similar al RIA, se va a valer del uso de antígenos o
anticuerpos unidos covalentemente a enzimas.
La enzima debe ser capaz de catalizar un sustrato y formar un producto de color, es decir era el
principio básico que el producto sea de color, pero actualmente el producto puede ser:
Coloreado, Fluorescente, Quimioluminiscente.
Tipos de ELISA
- ELISA directo
- ELISA indirecto
- ELISA sándwich
Pero de ellos el más utilizado es el ELISA INDIRECTO y el ELISA sándwich.
ELISA indirecto
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Se utiliza para determinar anticuerpos específicos en una muestra, y es indirecto porque se va
utilizar un anticuerpo secundario que va estar conjugado a una enzima.
Primeramente, se tendrá un pocillo donde tenemos depositados los antígenos y ahí
agregaremos un anticuerpo de interés que es generalmente IgG. Si está presente este
anticuerpo en la muestra que estamos colocando obviamente se va unir a su antígeno
(reacción antígeno).
En una segunda instancia, para evidenciar esta reacción antígeno-anticuerpo se agrega el
anticuerpo secundario que será un anticuerpo anti-IgG conjugado a enzima, entonces este
anticuerpo se va unir a la fracción Fc de la IgG
Fijense que este 2do anticuerpo anti IgG esta conjugada a una enzima entonces se va unir este
2do anticuerpo, se va unir a la fraccion Fc del primer anticuerpo que ha reaccionado con el
antigeno. Posteriormente, lo que se hace es administrar el sustrato para que nos de un
producto coloreado y ese producto coloreado nos sirve para cuantificar por espectrometria, la
cantidad de ese anticuerpo, de ese paciente que ha realizado la reaccion antigeno-anticuerpo,
entonces esta estrategia o esta prueba de soporte solido de ELISA indirecto, nos sirve para
detectar anticuerpos contra virus, entonces esta prueba es estandar para VIH, se utiliza
tambien para protozoos y tambien se utiliza para ciertas bacterias.
Tenemos acá, el otro tipo de ELISA que es el sandwich, que nos sirve para la deteccion y
cuantificacion de antigenos, que se caracteriza por que los antigenos estan entre 2 anticuerpos
como vemos acá esta el antigeno y esta entre el anticuerpo primario y el secundario por eso se
lo denomina ELISA de tipo sandwich.
Entonces nuevamente se coloca acá, tenemos el pocillo, colocamos el anticuerpo que va ser
especifico para un antigeno X, que tenga epitope o determinante antigenico especifico (como
en este ejemplo epitope 1)
Posteriormente se agrega la muestra del paciente y se adiciona el reactivo, que va ser el
segundo anticuerpo o 2do antigeno X que contenga un epitope 2, osea distinto al epitope 1,
que obviamente tiene que estar conjugado con una enzima, entonces vemos que el anticuerpo
primario se unira al antigeno a un epitope 1 y que el antigeno secundario se unira al mismo
antigeno pero a un epitope 2, distinto al epitope 1.
Posteriormente se incluye el sustrato que nos dara un producto y que lo oleremos
nuevamente en un espectrometro para ver la concentracion, entonces el antigeno que se va
detectar en este ELISA tipo sandwich debe poseer 2 o mas epitopes, 2 o mas determinantes
antigenicos y por ejemplo este metodo de ELISA tipo sandwich, nos sirve para la determinacion
de la hormona estimulante de la tiroides, la TSH, la TSH recordemos la bioquimica de la
estructura del TSH, contiene 2 subunidades, 1 subunidad alfa y una subunidad beta. Entonces
el anticuerpo que estara en la base del pocillo, lo unira a la fraccion alfa de la TSH y el segundo
anticuerpo se unira a la subunidad beta y ahí nos permitira la determinacion de los valores de
la TSH.
Veamos otra prueba inmunologica que corresponden a las pruebas de estructuras subcelulares
o lo que se denomina pruebas inmunologicas del analisis de estructuras celulares.
Analisis de estructuras subcelulares.- en estas pruebas inmunologicas, la que resalta sera la
inmunohistoquimica, recordar al hablar de inmunohistoquimica, que los anticuerpos no
atraviesan membranas celulares, los anticuerpos, no atraviesan membranas celulares, la otra
caracteristica de los anticuerpos, es que los anticuerpos tienen cargas positivas.
La inmunohistoquimica, entonces utiliza muestras de tejidos a los cuales se le realiza cortes
finos y al realizar cortes finos, esos anticuerpos son capaces de alcanzar cualquier componente
celular, entonces previo a eso, obviamente volvemos, los anticuerpos tienen que estar
conjugado con una enzima, el anticuerpo va ser dirigido hacia el componente de interes, el
sustrato de la enzima va ser catalizado, y el producto va precipitar en el lugar de union del
anticuerpo.
Vemos acá que este metodo de inmunohistoquimica tambien se va clasificar en directo e
indirecto, el directo, tenemos ahí a un antigeno y tenemos a un anticuerpo primario, cual es la
caracteristica de este anticuerpo primario, que ya tiene su molecula reveladora, entonces nos
esta hablando de una inmunohistoquimica directa, mientras que la indirecta, tenemos nuestro
antigeno, tenemos el anticuerpo primario, pero este anticuerpo primario no tiene su molecula
reveladora, entonces hay que adicionarle el segundo anticuerpo que contenga su molecula
reveladora.
Si esos poros son suficientes para el paso de esos anticuerpos, permitirá la llegada de
anticuerpos hacia los componentes intracelulares.
En esta gráfica nos habla y nos da un ejemplo: es el aspirado de la médula ósea dónde se
estaría buscando a los megacariocitos.
¿A estos megacariocitos, como se identifica?
R/ Con la inmunocitoquimica.
➢ Porque van a tener un cúmulo de diferenciación CD61
Recordemos que la médula ósea es un lugar de gran capacidad de hematopoyesis; existen
muchas células hematopoyéticas.
➢ Solamente nos embarcamos en la CD61, qué es un marcador específico
megacariocitos.
Su porcentaje nos permitirán ver estás manchas rojas, indica que han sido identificados los
megacariocitos y coloreado de esta tinción rojiza y que corresponde los cúmulos de
diferenciación CD61.
LAS PRUEBAS INMUNOLOGICAS DE LABORATORIO DE INMUNOFLUORESCENCIA
Su fundamento va a ser los fotones de alta energía y los fotones de baja energía. Y el uso de
fluoroforos, cuando tengamos un fluoroforo conjugado a un anticuerpo y emitimos un haz de
luz a la longitud de onda específica de ese fluoroforo lo vamos a excitar y va emitir una
diferente fluorescencia de acuerdo a la longitud de onda que haya emitido el rayo.
¿Qué es inmunofluorescencia?
R.- Solamente el anticuerpo conjugado a un determinado fluoroforo.
➢ Se utilizan sondas que contienen varios fluoroforos. La DAPI, faloidina.
Tenemos una lista: De cuáles son esas longitudes de onda de excitación y cuáles son esas
longitudes de onda de emisión de estos distintos fluoroforos que se pueden conjugar con el
anticuerpo.
➢ Los más utilizados son los tres primeros.
1. FITC ( Isotiocinato de fluroceina )
2. PE ( Ficoeritrina )
3. PerCP ( Proteina de peridina-clorofila )
Estos tres su longitud de onda de excitación es el mismo 488 nm y esa longitud de onda
corresponde a un láser azul.
Cuando llega el haz de luz a esta longitud de onda, obviamente va excitar y va emitir otra
longitud de onda. Y ahí va la diferencia de colores utilizando estos fluoroforos.
por ejemplo:
a) para el FITC su longitud de onda es de 520 que corresponde a un color verde.
b) para la PE su longitud de emisión es 578 qué corresponde a una longitud de onda de
color naranja.
c) Para la PerCP su longitud de emisión es de 678 qué corresponde a una longitud de
onda de color rojo.
Utilizando estos distintos fluoroforos. No, solamente estos van a ser utilizados en
inmunofluorescencia, sino también van a ser utilizados en citometría de flujo.
• Cada uno de ellos vemos que tienen diferente longitud de excitación y diferente
longitud de emisión.
PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
Se rescata los anticuerpos antinucleares. Estos permiten detectar por inmunofluorescencia
indirecta; es la técnica recomendada por la prueba gold standard.
¿Cómo funciona el fundamento de estos anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia?
1. Ya viene elaborados las placas.
2. Placas que contienen células fijadas y permeabilizadas.
¿Qué es lo tenemos que hacer?
R.- es adicionar el suero del paciente en la que sospechamos que puedan existir estos
anticuerpos antinucleares.
• Una vez adicionado en la muestra del paciente.
• Los ANA van a reconocer los componentes de las células.
• Mas ya no los podemos evidenciar, no los podemos ver.
¿Cómo vamos a llegar a evidenciar o ver?
R.- Agregando un anticuerpo secundario.
• Ese anticuerpo secundario va tener una molécula reveladora y en este caso esa
molecula reveladora (en verde) va a ser un fluoróforo.
• Posteriormente va a ser observador por microscopía de fluorescencia.
Entonces utilizando estos distintos fluorometros no solamente estos van a ser utilizados en
inmunofloresencia si no tambien van a ser utilizados en citometria de flujo que vamos a ver
mas adelante
Pruebas de inmunofloresencia
Longitudes de onda de excitación y emisión de distintos fluoruros
Cada uno de ellos tiene vemos que tiene diferente longitud de excitación y diferente longitud
de emicion
Dentro de las pruebas de inmunofloresencia
Anticuerpos antinucleares ANA :
Se rescata los anticuerpos antinucleares los famosos ANA estos permiten detectar por
inmunoflorecencia indirecta nos dice que es la técnica recomendada O LA PRUEBA GOLL
ESTÁNDAR COMO FUNCIONA entonces ya vienen elaborados las placas que contienen células
fijada y permeabilizadas entonces que es lo que tenemos que hacer adicionar el suero del
paciente en la que sospechamos que puedan existir estos anticuerpos antinucleares entonces
una ves adicionado la muestra del paciente los ANA van a reconocer esos componentes de la
célula mas no los podemos evidenciar no los podemos ver y como los vamos a llegar a
evidenciar o ver AGREGANDO UN ANTICUERPO SECUNDARIO Y ESE ANTICUERPO SECUNDARIO
pues tendrá una molécula reveladora y en este caso esa molécula reveladora por eso esta en
verde que va hacer va ser un fluoroforo que posteriormente que puede ser observado por
microscopia de fluorenscencia
Entonces ahí tenemos e patrones de distribución de anticuerpos antinucleares entonces por
microscopia de inmunoflorescencia
• podemos evidenciar podemos ver patrones homogéneos que son los que se marcan
completamente
• Podemos ver patrones moteados donde se marcan pequeños puntos dentro del
nucleó
• Podemos ver patrones nucleolares donde se marcan los componentes de los
núcleolos
• O podemos ver patrones periféricos
Entonces volvemos estas pruebas de inmunofloresencia se utilizan el microscopio de
inmunofloresencia
Pruebas inmunológicas fe laboratorio
Se basa en relación en la reacción antígeno anticuerpo
Citometria de flujo
Entonces esta citometria de flujo se basa en donde un laser incide sobre células y estas nos
sirve para determinar su tamaño, su complejidad y su fluorescencia entonces hacemos pasar
un Haz de un laser a una determinada longitud de onda y envase a la luz que incide o que
disperse
Ejemplo entre 0.5 y 5 grados nos va a permitir determinar el tamaño de esa células si su
dispersión
O su ángulo de dispersión se encuentre entre 15 a 150 vamos a poder determinar la
complejidad interna de esa célula y también nos va a permitir detectar la fluorescencia
Entonces estos 3 elementos
TAMAÑO
COMPLEJIDAD INTERNA Y
FLUORESCENCIA
Son denominados de evento ENTONCES cuando se habla de evento en una citometria de flujo
estamos hablando de tamaño, complejidad interna, y fluorescencia. Pero esta citometria de
flujo no detecta solamente una célula si no va a detectar muchas células y en un corto
tiempo entonces gracias alos distintos filtros de longitudes de onda, la fluorescencia es el
parámetro que otorga mayor versatilidad a la citometria de flujo: permite análisis
multiparametricos.
Porque es multiparametricos por que nos esta determinando el tamaño, la complejidad
interna, fluorescencia por eso es multiparametricos
Entonces la citometria de flujo
Que es lo que puede medir por CMF? Celulas en suspensión de forma unicelular por
ejemplo leucocitos de sangre periférica están disponibles en forma unicelular
Ej. Leucocitos de sangre periférica que estan disponibles de forma unicelular
Esta técnica nos sirve para bacterias y células sanguíneas como glóbulos rojos neutrófilos
mastocitos o puede ser para un blastocito ( cumulo de células) separando ya que no se puede
no se realiza esta técnica
Aplicación de criometría de flujo.
ANALISIS LEUCOCITARIO
Dot-plot tamaño vs. Complejidad de leucocitos (x = tamaño y =complejidad de leucocitos)
En la imagen se muestran tres poblaciones una que esta por debajo y cerca de las coordenadas
y y x ( complejo de menor tamaño y complejidad correspondiendo a un linfocito) el segundo
que se encuentra en medio (con complejidad media y tamaño intermedio correspondería a un
monocito) y el que esta por encima (de mayor tamaño y complejidad grande correspondería a
un neutrófilo o polimorfonucleares
También los eusinofilos y basófilos se encuentran en este grupo
Diferencia entre Citometria de flujo y microscopia de la inmunofluorescencia
Característica de microscopia de inmunofluorescencia determina el porcentaje de células por
cada 100 células por ojo humano
La Citometria de flujo cuantifica a gran escala lo que se observa por inmunofluorescencia y
puede analizar 10000 células en 10 segundos y mucho mas y no depende del ojo humano y el
porcentaje de error disminuye
La Citometria de flujo se utiliza para el fenotipo linfocitario (subpoblaciones linfocitarias) es así
que todos los linfocitos que tengan un cumulo de diferenciación 45+ de leucocitos
Ej. De una muestra de sangre todos los q tengan CD45+ (marcador leucocitario común) son
leucocitos, en linfocitos T tendrán CD3 y en linfocitos B no lo tendrán y solo tendrán CD19 y
natural killer tendran CD16+ y CD56+
