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B UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIA, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA DE

ALIMENTOS

INFORME DE PRÁCTICA

TEMAS: NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS Y

BACTERIAS COLIFORMES, SALMONELLA

CURSO : MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II

DOCENTE : CONDORI RONDAN, Victor Elvis

INTEGRANTES:
YURA HUAMAN, Elizabeth Magdalena

CICLO : 2025 - verano

TINGO MARÍA - PERÚ

Enero – 2025
 I. INTRODUCCION

II. OBJETIVOS

III. ANTECEDENTES

Gamón (2024) en su estudio del proceso de aislamiento de Salmonella spp.,

basándose en el protocolo establecido de la Norma ISO 6579-2014 y el aislamiento de
E. coli por medio de un protocolo estandarizado basado en la norma ISO 16649-1:2001.
Por lo que es su investigación la prevalencia de Salmonella y Escherichia coli en
huevos no pudo ser obtenida, debido a que los huevo siguieron los parámetros de
inocuidad recomendados por la reglamentación legal ecuatoriana, la cual señala que
este tipo de producto crudo debería presentar ausencia total de Salmonella en 25
gramos.

Guran et al (2023) estudiaron la presencia de bacterias aerobias mesófilas totales

(TMAB), bacterias aerobias psicrofílicas totales (TPAB), coliformes, E. coli,
Enterobacteriaceae y Salmonella en huevos minoristas producidos en diferentes
sistemas de crianza de aves de corral. De los 350 huevos analizados, las muestras de la
superficie de la cáscara estaban contaminadas con TMAB, TPAB, coliformes, E. coli y
Enterobacteriaceae en porcentajes positivos de 100%, 100%, 49,1%, 18,6% y 38%,
respectivamente. El porcentaje de contaminación positiva de las muestras de cáscara de
huevo triturada, con TMAB, TPAB, coliformes, E. coli y Enterobacteriaceae fue del
100%, 100%, 50%, 33,7% y 42,5%, respectivamente. Detectaron Salmonella de solo un
aislado de Enterobacteriaceae obtenido de un pool de cáscara de huevo orgánico, pero
no de superficies de cáscara de huevo o yemas de huevo. Recuperaron un total de 35
aislados de E. coli de aislados de Enterobacteriaceae. Doce (34,3%) de ellos exhibieron
resistencia a al menos un antibiótico probado.

IV. METODOLOGIA
IV.1. Métodos

− Recuento estándar en placa (Aerobios mesófilos)

− Número más probable (bacterias coliformes)
− Presencia/Ausencia de Salmonella
IV.2. Procedimiento

Para esta práctica se utilizó con la muestra un huevo de la marca san

Fernando se puede apreciar en la figura 1 de anexo.

IV.2.1. Muestra original para aerobios mesófilos y bacterias

coliformes

Pre-enriquecimiento

Consistió en realizar un enjuague a la cascara de huevo por inmersión

en una solución diluyente (caldo peptonado de 100 ml). Para ello primero
vaciamos en el recipiente vaso precipitado toda la solución diluyente y se
introdujo la cascara de huevo y agitamos vigorosamente luego se regresó la
solución a su frasco original (matraz) seguidamente se Cerró
herméticamente el frasco para su traslado a incubación 37ºC por 24 horas.
Todo el procedimiento lo realizaremos cerca de un mechero para mantener
estéril el lugar de trabajo.

o Recuento estándar en placa (Aerobios mesófilos)

Se tiene 5 tubos con 9 ml de diluyentes (agua peptonado) para hacer las
diluciones,

1. Del matraz erlenmeyer que contiene la muestra original viniendo a ser

la dilución 1/10 se tomó con una pipeta 1 ml y lo colocamos en el
primer tubo de 9 ml de diluyente, con la misma pipeta comenzamos a
pipetear diez veces la muestra con el diluyente, obteniendo la dilución
a 10−1 .
2. Con una pipeta tomamos 1 ml de la dilución 10−1 e inoculamos en el
segundo tubo sin chocar con el contenido de 9 ml de diluyente,
tomamos otra pipeta estéril y homogenizamos con el bortex, llegando
a ser esta la dilución de 10−2.
3. Con esa misma pipeta que homogenizamos tomamos 1 ml de la
dilución 10−2 e inoculamos en el tercer tubo sin chocar con el
contenido de 9 ml de diluyente, tomamos otra pipeta estéril y
homogenizamos con el bortex, llegando a ser esta la dilución de 10−3 .
 4. Con esa misma pipeta que homogenizamos tomamos 1 ml de la
dilución 10−3 e inoculamos en el cuarto tubo sin chocar con el
contenido de 9 ml de diluyente, tomamos otra pipeta estéril y
homogenizamos haciendo uso del bortex, llegando a ser esta la
dilución de 10−4.
5. Con esa misma pipeta que homogenizamos tomamos 1 ml de la
dilución 10−4 e inoculamos en el quinto tubo sin chocar con el
contenido de 9 ml de diluyente, tomamos otra pipeta estéril y
homogenizamos usando bortex, llegando a ser esta la dilución de 10−5
.
Para el recuento estándar en placas: realizamos por desimanación para el
cual se tiene 3 placas con agar nutritivo,

1. Todo el procedimiento lo realizaremos cerca de un mechero para

mantener estéril el lugar de trabajo y no se contamine las placas;
tomaremos las tres últimas diluciones.
2. Con una pipeta limpia y estéril primero tomamos 0,1 ml de la
disolución de 10−3 y lo colocamos en la superficie de la primera placa
de agar nutritivo, luego con la espátula Drigalski se esparce para ello
las placas de agra deben estar rotulados.
3. Luego se tomó con una pipeta limpia y estéril primero tomamos 0,1
ml de la disolución de 10−4 y lo colocamos en la superficie de la
segunda placa de agar nutritivo, luego con la espátula Drigalski se
esparce las baterías que podrían encontrase.
4. Por último, con una pipeta limpia y estéril primero tomamos 0,1 ml
de la disolución de 10−5 y lo colocamos en la superficie de la tercera
placa de agar nutritivo, luego con la espátula Drigalski se esparce para
obtener el crecimiento de las colonias.
5. Se llevo a incubación a 37°C por 24 horas.
6. Una vez pasado el tiempo indicado las placas serán llevadas a la
cuenta colonias para ser contabilizadas y poder obtener datos
requeridos.
o Número más probable (bacterias coliformes)
 Se precedió de acuerdo con el tipo de muestra (muestra liquida), el
procedimiento se observa en la figura 2 en el anexo.

Ensayo Presuntivo

1. El frasco homogenizado vendría a ser la muestra original y la dilución

1/10. con una pipeta tomamos 5 ml de la dilución 1/10 e inoculamos
en los 5 tubos que contienen 9 ml con caldo concentrado) y la
campana durham para el 1er grupo de tubos.
2. Se repite la misma dinámica para el 2do grupo de tubos se toma la
muestra original homogenizado que a su vez representa la dilució
1/10, con una pipeta tomamos 1ml de la dilución 1/10 e inoculamos
en los 5 tubos que contienen 9 ml con caldo simple (caldo BRILA) y
la campana durham.
3. Por último, para el 3er grupo se realizó la misma operación del matraz
se toma la muestra original homogenizado que a su vez representa la
dilución1/10, con una pipeta tomamos 0.1 ml de la dilución 1/10 e
inoculamos en los 5 tubos que contienen 9 ml con caldo simple (caldo
BRILA) y la campana durham.
4. Se llevó a incubación 37°C por 24 horas
5. Se considera tubo positivo si hay formación de gas en la campana de
durham.
IV.2.2. Muestra original para Presencia/Ausencia de Salmonella
Pre-enriquecimiento

1. Con una balanza analítica pesamos 10ml la mezcla de clara y yema de

huevo. Teniendo el peso requerido, prendemos el mechero para mantener el
ambiente estéril y abrimos cuidadosamente el erlenmeyer que contiene
caldo lactosado de 100ml, agregamos los 10ml de la mezcla de huevo para
luego tapar el Erlenmeyer con su tampón de algodón, lo cubrimos con papel
kraft y amarramos con una pita pabilo.
2. Rotulamos el Erlenmeyer colocando el nombre de la muestra, nombre del
caldo, el microorganismo y el número de grupo.
3. Por último, removemos para homogenizar la muestra y lo llevamos a
incubar a 37°C por 24 horas.
4. Todo el procedimiento lo realizaremos cerca de un mechero para mantener
estéril el lugar de trabajo.
Enriquecimiento Selectivo:

1. Pasada las 24 horas sacamos el Erlenmeyer enriquecido que contiene la

muestra original,
2. Con una pipeta tomamos 1ml del medio enriquecido (caldo lactosado más
muestra), luego tomamos el tubo de caldo de tetrationato, retiramos el
tampón de algodón abrazando el mechero, pasamos la boca del tubo para
esterilizar, le adicionamos 1ml del medio enriquecido, finalizando
volvemos a pasar la boca del tubo por el mechero y tapamos con tampón de
algodón.
3. Ahora tomamos el tubo con caldo rappapor y repetimos el mismo
procedimiento anterior agregándole 1ml del medio enriquecido.
4. Rotulamos colocando el nombre a cada uno de los tubos respectivamente,
indicando el tipo de muestra y número de grupo
5. Por último, lo llevamos a incubar 37°C el tubo de tetrationato y a 43°C el
tubo de rappapor por 24 horas.

Aislamiento en placas en agar selectivo SS y XLD

Pasando las 24 horas retiramos los dos tubos de incubadora de caldo de

tetrationato y caldo rappapor y hacemos la lectura correspondiente que se muestra
en resultados. Nos entregaron los medios, 1placa con agar SS y 1 placa con agar
XLD.

1. Primero rotulamos para este caso se dividió en 2 partes la placa de agar SS

y la placa de agar XLD, se le añadió el tipo de muestra, número del grupo.
2. Para el rotulado de la placa agar SS en el primer lado derecho se colocó el
nombre tetrationato y en el segundo lado izquierdo de SS se colocó el
nombre rappaport, también añadimos el nombre la muestra y el número del
grupo, este mismo mecanismo se repite para el agar XLD.
3. Comenzamos prendiendo el mechero, luego con la mano derecha cogemos
un asa de siembra en aro, lo quemamos al rojo vivo y esperamos que enfrié
unos cuantos segundos.
4. Después con la mano izquierda tomamos el tubo de ensayo de caldo de
tetrationato y abrazando el mechero sacamos la tapa de algodón, pasamos la
boca del tubo por el fuego y con la mano derecha donde está el asa de
siembra en aro sacamos un poco de inoculo(tetrationato), tapamos el tubo
con el algodón. Una vez transferido el inoculo al medio de enriquecimiento
selectivo con el asa de siembra cogemos la placa con el medio SS con la
mano izquierda la abrimos, sembramos por estría en la superficie del primer
lado derecho de la división de la placa de agar SS y lo tapamos. Volvemos a
quemar al rojo vivo el asa de siembra para ahora sembrar el caldo rappaport
en el segundo lado izquierdo de la división en la placa de agar SS.
5. Esta misma dinámica se repite para el agar XLD
6. Se llevo a incobacion las placas de SS y XLD a una temperatura de 37°C
por 24 horas,
7. Se realiza la lectura de las colonias después del tiempo de incubado.
 Pruebas bioquímicas
Se eligió una colonia sospechosa de salmonela del agar SS rappaport, para
hacer el inoculado en agar nutritivo plano inclinado TSI, LIA Y SIM
Agar hierro tres azucares (TSI) inoculación del Agar SS rappaport

1. Primero se rotula el tubo indicando el nombre del grupo y del medio.

2. Luego se enciende el mechero, con la mano derecha cogemos el asa de
siembra en punta y lo quemamos al rojo vivo, esperamos que enfrié unos
cuantos segundos.
3. Con la mano izquierda tomamos la placa que contiene la cepa alrededor del
mechero lo abrimos y con el asa de siembra en punta sacamos un poco de
cepa y cerramos la placa.
4. Después cogemos el tubo con agar TSI, lo destapamos cerca del mechero,
esterilizamos la boca del tubo y sembramos la cepa con el asa de siembra
haciendo una punción profunda seguida de una estría en el tubo, luego
volvemos a pasar la boca del tubo al mechero y lo tapamos.
5. Lo llevamos a incubar por 24 horas a una temperatura de 37°C.
Lectura: Terminado el tiempo se debe concluir lo siguiente según la observación:
Si es positiva el medio se tornará color negro por la formación de sulfuro, si
en caso sea negativo el medio permanecerá inalterado.
Agar lisina hierro (LIA) inoculación del Agar SS rappaport

1. Primero se rotula el tubo indicando el nombre del grupo y del medio.

2. Luego se enciende el mechero, con la mano derecha cogemos el asa de
siembra en punta y lo quemamos al rojo vivo, esperamos que enfrié unos
cuantos segundos.
3. Con la mano izquierda tomamos la placa que contiene la cepa alrededor del
mechero lo abrimos y con el asa de siembra en punta sacamos un poco de
cepa y cerramos la placa.
4. Después cogemos el tubo con agar LIA, lo destapamos cerca del mechero,
esterilizamos la boca del tubo y sembramos la cepa con el asa de siembra
haciendo una punción profunda seguida de una estría en el tubo, luego
volvemos a pasar la boca del tubo al mechero y lo tapamos.
5. Lo llevamos a incubar por 24 horas a una temperatura de 37°C, por último,
terminado el tiempo procedemos a hacer las lecturas correspondientes
Agar SIM inoculación del Agar SS rappaport

1. Primero se rotula el tubo que contiene SIM el nombre del grupo y del
medio.
2. Luego se enciende el mechero, con la mano derecha cogemos el asa de
siembra en punta y lo quemamos al rojo vivo, esperamos que enfrié unos
cuantos segundos.
3. Con la mano izquierda tomamos la placa que contiene la cepa alrededor del
mechero lo abrimos y con el asa de siembra en punta sacamos un poco de
cepa y cerramos la placa.
4. Después cogemos el tubo con agar LIA, lo destapamos cerca del mechero,
esterilizamos la boca del tubo y sembramos la cepa con el asa de siembra
haciendo por puntura profunda en el tubo, luego volvemos a pasar la boca
del tubo al mechero y lo tapamos.
5. Lo llevamos a incubar por 24 horas a una temperatura de 37°C, Por último,
terminado el tiempo procedemos a hacer las lecturas correspondientes.
6. Por último, en el tubo de SIM se le añadió 2 gotitas de reactivo de
KOVACS
 Coloración de Gram
 Se tomo la misma colonia sospechosa de salmonela del agar SS rappaport
que se utilizó anteriormente para las pruebas de TSI, LIA y SIM. Para ello
primero se toma un porta objeto y se esteriliza con alcohol y tomamos el asa de
siembra lo quemamos al rojo vivo, esperamos que enfrié unos cuantos segundos.

1. Se tomó la placa que contiene la cepa del agar SS, alrededor del mechero lo
abrimos y con el asa de siembra sacamos un poco de cepa y cerramos la
placa, lo depositamos en el porta objeto, se quema el asa de siembra para
luego tomar el diluyente una cierta cantidad de gotitas seguidamente se
esparce en el porta objeto la mezcla de cepas y diluyente con la ayuda del
mechero a temperatura ambiente procurando no matar los microorganismos
secamos el contenido del porta objeto.
2. Una vez secado el porta objeto (laminilla) se le realiza la coloración para
ello se toma en cuenta el siguiente paso:
- Cubrir el protis con cristal violeta (1minuto)
- Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte y escurrir,
- Cubrir Frotis con yudo (1minuto)
- Enjuague con agua destilada y escurrir
- Enjuague la laminilla con alcohol etilico 95% (no exceder los 30 seg)
- Enjuague la laminilla con agua destilada y escurrir,
- Cubrir Frotis con tinte safranina (1minuto)
- Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte y escurrir,
- Secar laminillas con papel secante para remover el exceso de agua.
Finalmente se lleva al microscopio para idéntica que tipo de
microorganismo es, se observó la bacteria gran positiva en forma de cocos figura.

V. MATERIALES Y METODOS

VI. EQUIPOS
 VII. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1 Resultados microbiológicos

7.1.1 Recuento de microorganismos mesófilos aerobios

Tabla 1. Contaje de mesófilos aerobios en el huevo crudo

Número de
Muestra Dilución Imagen
Colonias

−4
M-1 10 45

−5
M-2 10 28

−6
M-3 10 7

- Fórmula para determinar las UFC/ml de microrganismos mesófilos aerobios

numero de colonias
∗1
volumen de la muestra
UFC=
dilución

Tabla 2. Resultados obtenidos de las UFC/ml en las tres muestras del recuento
estándar en placa de mesófilos aerobios viables

Dilución N. C UFC/ml
−4 6
10 48 4 , 8 x 10
 −5 7
10 28 2 , 8 x 10
−6 7
10 7 7 , 0 x 10
Nota: Dentro del rango de m.o mesófilos viables esta la dilución 10−4 ósea la muestra M-1 ya que
está dentro del rango aceptable para el recuento estándar de placa que es de 30-300 colonias.

- El resultado obtenido fue de 4.8 × 10⁶ UFC/mL de microorganismos mesófilos

viables en la muestra M-1.
- Para evaluar si este valor está dentro del rango aceptable, es importante
compararlo con los limites microbiológicos establecidos en normativas sanitarias.
Según Jay (2000), los niveles típicos de microorganismos mesófilos viables en
productos frescos como los huevos suelen estar en el rango de 10² a 10⁴ UFC/mL.
En este caso, el valor obtenido supera ampliamente el rango aceptable, lo que
indica una posible contaminación microbiológica significativa.
- Los resultados obtenidos en la muestra M-2 y M-3 están fuera del rango aceptable
por lo que se descarta la posibilidad de la presencia de mesófilos viables.

7.1.2 Determinación de coliformes totales mediante el número más

probable

- Se realizó la lectura de los tubos con caldo Brilla, observándose que en

ninguno de ellos hubo presencia de gas, lo que indica una prueba negativa
para coliformes.
- Con base en estos resultados, se concluye que no hay presencia de
coliformes totales en la muestra. Por lo tanto, no es posible recurrir a la
tabla del Número Más Probable (NMP) para su cuantificación.
7.2 Detección de Salmonella spp.

7.2.1 Prueba de presencia-ausencia mediante enriquecimiento selectivo

Tabla 3. Resultados de la prueba de ausencia presencia para salmonella spp
Medio de Apariencia de las
imagen Agar Microorganismos
cultivo colonias
Crecimiento de
colonias color del
Tetrationato Salmonella
medio con el
SS centro oscuro
No hubo
Rappaport -
crecimiento
Crecimiento de
colonias color
medio del cultivo
Tetrationato Salmonella
transparentes y
XLD algunas con cetr
negro
No hubo
Rappaport -
crecimiento

Las pruebas de presencia ausencia en medio selectivos indican presencia del m.o
de salmonella spp.
7.2.2 Confirmación bioquímica de Salmonella spp.
Figura 1. Tinción gram de la muestra de la colonia obtenida del agar SS con
rappaport.
- Los resultados de la tinción de Gram mostraron bacterias Gram negativas con
morfología cocoide, lo que sugiere la posible presencia de Neisseria. Sin embargo,
nuestro enfoque está en la identificación de Salmonella, una bacteria de la familia
Enterobacteriaceae, que se distingue por su forma bacilar (Madigan et al., 2021).
Dado que la tinción de Gram no es suficiente para su confirmación, es necesario
complementar con pruebas bioquímicas y cultivos selectivos (Forbes et al., 2018).

Tabla 4. Pruebas bioquímicas aplicadas a salmonella spp.

Resultado
Resultado esperado para Coincidencia con
Prueba Salmonella spp.
obtenido Salmonella spp.
FDA -2007
Glucosa (TSI) + Fondo amarillo (+) Sí
Lisina
decarboxilasa + Fondo violeta (+) Sí
(LIA)
No hubo anillo
SIM - rojo (-) negativo Sí
para indol.

.
SIM (-)
TSI (+)
 - Los resultados bioquímicos coinciden con las características de Salmonella spp.
según la FDA (2007). En TSI, la fermentación de glucosa generó un fondo
amarillo, y en LIA, la descarboxilación de lisina produjo un fondo violeta, ambos
rasgos típicos del género. La prueba SIM fue negativa para indol, lo que también
concuerda con Salmonella spp.
- Aunque en la prueba microscópica hubo algunas inconsistencias, los resultados
bioquímicos sugieren la posible presencia de Salmonella spp.
- Se recomienda complementar con pruebas serológicas y moleculares para una
identificación definitiva.

VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

 IX. BIBLIOGRAFIA

Gamón Marco, P. (2024). Estudio de la prevalencia de Escherichia coli, Salmonella spp. y

enterobacterias resistentes a antibióticos en huevos de gallina convencionales y
ecológicos (Doctoral dissertation, Universitat Politècnica de València).

Guran; Ese, S; y Agli (2023). Contaminación por E. Coli resistente a antibióticos microbios
en huevos comercializados mediante métodos de crianza alternativos y
convencionales. Revista de la Sociedad medica veterinaria. 7(1), pags. 551-5164.

Food and Drug Administration. (2007). Bacteriological Analytical Manual (BAM), Chapter
5: Salmonella. U.S. Food and Drug Administration.
[Link]

Jay, J. M. (2000). Modern Food Microbiology (6th ed.). Aspen Publishers.

Madigan, M. T., Bender, K. S., Buckley, D. H., Sattley, W. M., & Stahl, D. A. (2021). Brock
Biology of Microorganisms (16th ed.). Pearson.
Forbes, B. A., Sahm, D. F., & Weissfeld, A. S. (2018). Bailey & Scott’s Diagnostic
Microbiology (14th ed.). Elsevier.

X. ANEXO
Anexo 1. Pruebas bioquímicas TSI, SIM, LIA

Anexo 2. Prueba de Ausencia-Presencia

.

Anexo 2. Placas con colonias de microorganismo mesofilos viables en las diluciones 10-6,10-
5,10-4.