INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Centro Nacional de Salud Pública

Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias

AGENDA

1. Bioseguridad en el laboratorio de Tuberculosis.

2. Plataforma Molecular Automatizada GeneXpert

GeneXpert MTB Rif Ultra, GeneXpert MTB XDR.

3. Mantenimiento del equipo GeneXpert.

•MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO DE TUBERCULOSIS.

Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias

Instituto Nacional de Salud
Bioseguridad en el laboratorio:
Es el conjunto de medidas preventivas de sentido común, para
proteger la salud y la seguridad del personal que trabaja en el
laboratorio así como a la comunidad, frente a microorganismos
potencialmente infecciosos.

manual de bioseguridad en el laboratorio de tuberculosis

[Link]/iris/bitstream/10665/92661/1/9789243504636_spa.pdf
¿POR QUE LA BIOSEGURIDAD ES NECESARIA EN
LABORATORIOS DE TUBERCULOSIS?
El riesgo de infección con Mtb es mayor para
profesionales de laboratorio de TB, que para los de
otros labs.
1,4 veces mayor para microscopistas TB
21,5 veces para técnicos que realizan PS
La infección generalmente resulta de la producción de
aerosoles infecciosos no percibidos.
 ACTITUD DE LOS PROFESIONALES.
• Las personas y organizaciones necesitan estar
comprometidas con la seguridad
• Estar conscientes de los riesgos
• Actuar de forma que garantice la seguridad
• Estar abierto a los cambios
PATRONES DE SEGURIDAD

• Un proceso continuo de reconocimiento

del peligro
• Evaluación del riesgo
• Prácticas para disminución del riesgo
• Garantía de que los gestores y técnicos del
laboratorio están igualmente enterados
del problema y trabajan en conjunto para
mantener los altos patrones de seguridad
 CAPACITACIÓN
Encargado debe asegurar personal entrenado y evaluar competencias
técnicas.
• Capacitación en seguridad:
• Código de prácticas y manual de
seguridad;
• Prácticas seguras para evitar o
minimizar riesgo de inhalación,
ingestión e inoculación;
• Cómo descontaminar y desechar
material infeccioso.
DETERMINANDO RIESGOS
Riesgo es la combinación de
probabilidad de que exista
determinado peligro y las
consecuencias de un incidente
relacionado con ese peligro
concreto.

El análisis de los riesgo relacionado con los aerosoles ha llevado al desarrollo

de unos requisitos mínimos de bioseguridad necesarios para desarrollar
diferentes procesos en los laboratorios de TB.
 EVALUACIÓN DE RIESGO EN EL LAB. TB.
• La carga bacteriana y viabilidad de los bacilos.
• Vía de transmisión de la TB.
• Número de maniobras que generarían aerosoles.
• La carga de trabajo del laboratorio y el personal.
• La epidemiologia de la enfermedad.
• Experiencia y competencia del personal.
• El estado de salud de los trabajadores.
IDENTIFICACIÓN DE PELIGROS:

Todo aquello que tenga potencial para causar daño.

• físico (incendio, explosión)
• actividad (pipetear)
• material (aerosoles con bacilos).
PRINCIPAL RIESGO PARA EL PERSONAL DE LABORATORIO.

• Puede incluir gotas que contienen 1-3 bacilos vivos que

permanecen suspendidos en el aire – daño real para el personal.
 MANIOBRAS QUE PRODUCEN AEROSOLES
• Pipetear
• Mezclar
• Agitar
• Centrifugar
• Moler
• « Vortexear »
• Vaciar
• “flamear” asas de siembra o láminas
húmedas
• Abrir tubos a temperatura y presión
diferente a las ambientales
 COMO MINIMIZAR AEROSOLES?
❖Siempre abrir y manipular muestras y
cultivos en CBS certificada.
❖ Usar asas descartables.
❖Trabajar sobre papel absorbente
humedecido con desinfectante.
❖Usar cubetas de seguridad para
centrífuga, cargar y descargar en CBS.
❖Nunca descargar todo el líquido de
pipeta (dejar pequeño volumen en tip).
❖Eliminar burbujas de tubos de cultivo
líquido con precaución.
 CÓDIGO DE PRÁCTICAS

Conceptos que incluyen:

• Acceso al laboratorio
• Responsabilidad del encargado del lab;
• Equipos de protección personal;
• Procedimientos.

Describe las prácticas y los procedimientos indispensables para

aplicar técnicas microbiológicas.
Prácticas Microbiológicas Seguras
 BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO
• No comer, beber o fumar
• No usar telefónos celulares
• No pipetear con la boca
• No llevarse a la boca lápices o lapiceros
• No llevarse las manos a los ojos o cara
• Siempre lavarse las manos al salir del lab
 PROCEDIMIENTOS DE DESCARTE DE MATERIALES
• Material no contaminado
(no infeccioso) reusar,
reciclar o descartar como
desechos comunes;
• Contaminados (infecciosos)
elementos cortantes, e.g.
vidrio roto, jeringas, láminas
de vidrio;
• Enterrar, incinerar o
autoclavar material
infeccioso
MANEJO DE DESECHOS
Preguntas antes de descartar cualquier material del
laboratorio:
• Los materiales se han • El desecho de material
decontaminado o decontaminado involucra
desinfectado siguiendo riesgos adicionales,
procedimientos adecuados? biológicos/no, personal que
entre en contacto fuera del
lab.?
• Si no, se han empacado en
un recipiente cerrado o bolsa
para incineración o
autoclavado inmediato en el
laboratorio?
 AUTOCLAVE
Materiales para autoclavar:
• Instrumentos, vidrio, medio o soluciones
para uso estéril
• Cultivos de micobacterias que se vayan a
descartar
• Todos los materiales infecciosos del TB lab

Registrar tiempo, T° y presión en cada uso para monitorear funcionamiento

adecuado. Usar indicadores biológicos periódicamente para validar capacidad
de esterilización.
 DESINFECCIÓN
Desinfectantes recomendados:

❑ Lejía: Hipoclorito de sodio 0.5% ó 1 %;

❑Alcohol: etanol (etanol denaturalizado,
alcoholes metilados) o isopropanol al 70%.

Seleccionar de acuerdo al material a desinfectar.

Prácticas Especiales
1. Las puertas del laboratorio deben permanecer cerradas
cuando se realicen procedimientos.

2. El personal que está en riesgo de adquirir una infección,

no le será permitido entrar al laboratorio.

3. Solo las personas que cumplan todos los requisitos de

ingreso (inmunización), y que satisfagan los
procedimientos de entrada y salida tendrán acceso al
laboratorio.

4. Los procedimientos de bioseguridad deben incorporarse a

los POE o en un manual de preparado específicamente
para ese laboratorio.
5. Las superficies de trabajo deben descontaminarse
rutinariamente, después de terminar el trabajo y
especialmente cuando hay derrames de material infeccioso.

6. Los residuos contaminados deben ser colocados en

contenedores a prueba de escurrimientos.

7. Todos los residuos del laboratorio con material

potencialmente infeccioso (guantes, batas, etc.), deben ser
descontaminados antes de disponer de ellos o volverlos a
utilizar.
Barreras de Protección Primaria
Equipos de Protección Personal (EPP)
❖ El EPP sirve de barrera física para minimizar el riesgo.
❖ EPP debe ser usado en todo momento dentro del laboratorio.
❖Un EPP mal ajustado, inapropiado o usado incorrectamente
reducirá su efectividad.
❖ La elección del EPP depende del tipo de trabajo realizado.
❖ Todos los EPP deben ser suministrados por el laboratorio.
❖El personal no debe llevar a casa ningún EPP para lavarlo,
desecharlo o usarlo fuera del laboratorio.
 Batas y delantales de laboratorios

❖ Las batas deben cambiarse semanalmente o después

de que ocurra un derrame evidente
❖ Las batas deben estar disponibles en tallas pequeñas,
medianas y grandes.
❖ Las batas no deben usarse fuera del laboratorio.
❖ Las batas no deben almacenarse en el mismo lugar
que la ropa de calle.
❖ Deben ser preferentemente de material no
absorbente
❖ Puños elásticos de al menos 30 mm
 Guantes
❖Deben usarse guantes para todos los
procedimientos que impliquen contacto
con muestras o laboratorio.
❖ Pueden utilizarse de látex o de nitrilo
❖ No llevar guantes fuera del laboratorio.
❖ NO VUELVA A USAR GUANTES UTILIZADOS
❖Guantes mal ajustados reducir la destreza
de los dedos y aumentar el riesgo de
contaminación del guante y accidentes
 Respiradores
• Los respiradores son máscaras ajustadas,
diseñados para crear un sello facial.
• Los respiradores sin válvula brindan una
protección adecuada en dos direcciones, pues
filtran tanto el aire que entra como el aire que sale.
• Los respiradores están diseñados para proteger al
usuario (cuando se utiliza correctamente), según la
clasificación de filtrado que posea.
• El N95 es uno de los respiradores más conocidos.
Se constituye como un estándar estadounidense
administrado por el NIOSH -CDC. Capacidad de
filtrado al menos del 95%.
 Errores comunes
Las correas no están colocadas correctamente

Colocar el respirador alrededor Colocar el respirador en la frente

Ambas correas Ambas correas Correas cruzadas del cuello causará daños causará daños
por encima de las por debajo de las
orejas orejas

La pieza nasal no tiene la

forma correcta: espacio en la
pieza nasal
 Cómo debe reusarse y almacenarse un respirador
Puede reutilizarse varias veces durante dos o tres
semanas.
Antes de usar, siempre verifique
cuidadosamente que:
- No tenga agujeros
- La conexión de la correa no está dañada.
- La superficie del respirador está limpia y no
tiene fibras sueltas.
- Las correas no se han estirado demasiado
Un respirador debe almacenarse en un lugar bien Guarde los respiradores en No cuelgues por las
ventilado cuando no esté en uso para que el bolsas de papel con agujeros
de aire. correas

respirador pueda secarse

NO ALMACENE UN RESPIRADOR EN UN
BOLSILLO, APLASTARÁ LA FORMA PRE-
FORMADA
Protección para los ojos y la cara
• Opciones de equipamiento
❖Las gafas protectoras están hechas de plástico
inastillable y curvadas a los lados. Algunos
protectores están diseñados para ajustarse
sobre anteojos recetados estándar. Las gafas de seguridad están hechas de
plástico inastillable y están curvadas
❖ Los protectores faciales están hechos de alrededor de los lados.

plástico inastillable, cubren el frente y los

lados de la cara, y se mantienen en su lugar
mediante una correa para la cabeza.
❖Los anteojos recetados y las lentes de
contacto no brindan protección.

El escudo protector cubre los anteojos recetados,

está hecho de plástico inastillable y cubre el
frente y los lados de la cara
Calzado
• El uso correcto de EPP proporciona una
barrera importante contra los aerosoles y la
contaminación.
Calzado adecuado

• Sin embargo, usar EPP no protege al usuario

de prácticas laborales inseguras

Calzado inadecuado
 Uso de la cabina de seguridad biológica
❖ Principal dispositivo de contención a aerosoles o
gotas infecciosas generados por procedimientos
microbiológicos.

❖ Formado por:
– Filtros HEPA
– Sistema electrónico y electromecánico con 1 o
2 moto ventiladores para dar movimiento
controlado al aire a través de los filtros.

BUENAS PRÁCTICAS DE TRABAJO SEGURAS ES SU MEJOR PROTECCIÓN

Alarmas y operación CSB
❖ La mayoría de los BSC están equipados con alarmas visuales y audibles.
❖ Las alarmas BSC advierten que ya no es seguro operar, y que sus funciones de
protección pueden no estar funcionando correctamente
❖El laboratorio debe tener una copia de las instrucciones del equipo
disponibles en todo momento.
❖ Las alarmas son instrucciones: debe actuar cuando escuche una alarma

CUANDO SUENA UNA ALARMA, DEJE DE TRABAJAR INMEDIATAMENTE Y NOTIFICAR AL SUPERVISOR O

GERENTE DE LABORATORIO

NO PRESIONE EL BOTÓN MUTE Y CONTINÚE TRABAJANDO

Cómo protege un CSB
Clase II
• Los BSC de clase 2 extraen alrededor del 70%
del aire purificado del filtro HEPA sobre el
área de trabajo y alrededor del 30% de aire a
través de la rejilla frontal
• La clase II proporciona protección para el
usuario, el medio ambiente y el área de
trabajo. Hay cuatro tipos de BSC Clase II: A1,
A2, B1 y B2. El más adecuado para todos El
trabajo de TB es del tipo A2. La CSB de clase 2
protegen tanto al técnico
como al área de trabajo.
 No trabaje ni coloque artículos
Ambas rejillas deben mantenerse en la rejilla
completamente libres en todo
momento
 Separación de las áreas de trabajo

Un CSB no es un almacen:
elimine los elementos no
necesarios para la tarea

Espacio limpio Principal área de Espacio sucio

trabajo
Movimiento corporal dentro de un CSB

Minimiza los movimientos Tómate 2-3 segundos para

laterales del brazo completar el movimiento
Después de trabajar en un CSB

No coloque ninguna parte de su cuerpo en un

CSB vacío, listo para limpiar
BSC

NO ES NECESARIO SU USO PARA PREPARAR LAS BACILOSCOPIAS

 Barreras de contención secundarias:
Instalaciones y diseño del laboratorio

Fuente:[Link]/biosseguranca/ BIS/virtualtour/lab_virtual
 LABORATORIO DE BAJO RIESGO
• Bajo riesgo de generar aerosoles infecciosos; baja concentración
de partículas infecciosas
• Situaciones que aumentan el riesgo :
✓Uso inadecuado de las zonas de trabajo.
✓Fugas y derrames de los recipientes de muestras.
✓Falta de cuidado en la manipulación de muestras, lo que puede
generar aerosoles
✓Agitación enérgica de las muestras.
✓Insuficiente ventilación o iluminación.
 Procedimientos en un Lab. Bajo Riesgo
• El carácter viscoso del esputo no favorece la generación de aerosoles
cuando se utilizan buenas técnicas microbiológicas.
• Los Labs. de bajo riesgo pueden:
-Manipular muestras de esputo para la baciloscopia directa
-Manipular muestras de esputo para el ensayo Xpert MTB/RIF®
Medidas mínimas de bioseguridad
 LABORATORIO RIESGO MODERADO

Procedimientos en labs de riesgo moderado:

• Inoculación de cultivo primario en medio sólido;

• PS directa (GenoType, MODS, Nitrato reductasa).
 Medidas mínimas de bioseguridad
2 niveles de contención: CBS y laboratorio en si.
 LABORATORIO DE RIESGO ALTO
Diseñados para trabajar altos volúmenes y concentraciones de
M. tuberculosis

Procedimientos :
• Manipulación de cultivo para
identificación de M.
tuberculosis;
• Manipulación de cultivo o
suspensiones para PS
indirecta y pruebas
moleculares.
 Procedimientos de respuesta a emergencias en
laboratorios de TB
Derrame infeccioso (fuera de CBS)
• Evacuar inmediatamente área afectada
• Informar al encargado del laboratorio
• No re-ingresar antes de 1h
• Colocar señales para evitar ingreso durante
limpieza
• Usar implementos de protección personal
adecuados.
 Seguir con el procedimiento de limpieza:

• Guantes, bata y mascarilla

• Re-ingresar al área afectada
• Cubrir el derrame con tela o papel toalla.
• Vaciar desinfectante sobre área contigua y
después sobre papel toalla
concéntricamente (lejía 5%)
• Dejar actuar tiempo suficiente antes de
descartar materiales
• Colocar materiales contaminados en bolsa y
descartar.
 Derrame en la CBS – qué hacer

• Cubrir el derrame con papel toalla absorbente.

• Verter desinfectante y dejar actuar al menos 45 min (1 hora).
• Descartar el papel absorbente y todo el material utilizado en la
limpieza en una bolsa autoclavable y autoclavar.
 KIT DE LIMPIEZA DE DERRAME
Preparar 2 kits de derrame (fuera y
dentro de lab.)
• Lejía, respiradores, guantes
• Batas de lab. (4-6 descartables)
• Cepillo y recogedor (para descartar si
fuera necesario)
• Tabletas de cloro (10 tabletas), papel
toalla
• Envase para objetos cortantes, bolsas
de bioseguridad, gafas de protección.
Preguntas y Comentarios.

Gracias
 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Centro Nacional de Salud Pública
Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias

“Amplificación automatizada del ácido nucleico en

tiempo real altamente sensible (ULTRA) para la
detección simultánea de la tuberculosis y
resistencia a la rifampicina – plataforma
GeneXpert”
GENEXPERT MTB RIF ULTRA
 EL BOOM DE LAS PRUEBAS MOLECULARES

La OMS recomienda que las pruebas moleculares reemplacen o complementen las

pruebas convencionales por ser más sensibles, se deben utilizar como prueba
diagnóstica inicial para detección de MTB y la resistencia por lo menos a rifampicina,
a fin de minimizar los retrasos en el inicio de tratamientos adecuados.
 EL BOOM DE LAS PRUEBAS MOLECULARES

La plataforma GeneXpert es un
sistema que simplificó las pruebas
moleculares, al integrar la
amplificación y la detección del
material genético, el cual ha
permitido hacer pruebas fuera de los
laboratorios clínicos especializados.
CONSIDERACIONES

• El principal mecanismo de resistencia antimicrobiano del MTB es la mutación de

genes que codifican dianas para la unión de los fármacos anti-TB.

• La resistencia a rifampicina está mediada principalmente por mutaciones

agrupadas en los codones 507 al 533 del gen que codifica la subunidad beta de la
ARN polimerasa, el gen rpoB.
Evita la unión de a rifampicina a la ARN polimerasa, la síntesis de
proteínas y la muerte de bacilos.

• > 90% de las mutaciones en el gen rpoB están localizadas en la región de 81 pares
de bases (codón 507 – 533).
CONSIDERACIONES
CONSIDERACIONES

• La base de la tecnología GeneXpert es la PCR:

Xpert MTB/Rif Ultra:

▪ PCR Anidada: Esta PCR se
desarrolló para aumentar la
sensibilidad del ensayo y utiliza
dos parejas de cebadores.
▪ Sondas
▪ Temperatura de fusión
XPERT MTB/Rif Ultra
MTB/Rif Ultra
• Es una PCR que amplifica las
secuencias de ADN en dos etapas.
• Detecta el complejo M. tuberculosis y
la resistencia a rifampicina.
• Objetivo de la PCR: Gen rpoB y dos
secuencias de inserción como
objetivos multicopia de amplificación
(IS6110 e IS1081).
XPERT MTB/Rif Ultra
MTB/Rif Ultra
Tiempo promedio: 60-75 minutos
Carga bacilar: Alto, medio, bajo, muy
bajo, trazas.
Cámara de reacción de PCR: 50ul
Límite de detección:12 - 15 UFC/ml
Si la carga bacilar es “trazas”, no va
aportar información de la resistencia a la
rifampicina. Se recomienda realizar un
cultivo.
CONTROL DE CALIDAD
• Control del sistema: Comprobación del estado.
- El control del sistema comprueba los componentes ópticos, la
temperatura del módulo y la integridad de los dispositivos mecánicos de
cada cartucho.
- Si no se superan los controles del sistema, el resultado notificado de la
prueba será de ERROR.

• Controles de calidad del ensayo

• Cada cartucho Xpert es un dispositivo analítico autónomo.
• Controles internos que permiten al sistema detectar modos de fallo
específico dentro de cada cartucho

- Control de procesamiento de muestras (SPC)

- Controles de comprobación de la sonda (PCC)
Control de calidad internos

• Controles de comprobación de la sonda (PCC)

Antes del paso de la PCR, se mide la señal de fluorescencia en todas las
sondas y se compara con los ajustes predeterminados para monitorizar.
- rehidratación de la microesfera - integridad de la sonda
- llenado del tubo de reacción - estabilidad del colorante

• Controles de procesamiento de muestras (SPC)

- Espora no infecciosa en cada cartucho
- Verifica el procesamiento adecuado de las muestras
- Verifica la lisis, la presencia del organismo y detecta la inhibición de la PCR.
- Deberá ser positivo en una muestra negativa.
- Puede ser positivo o negativo en una muestra positiva.
XPERT MTB/Rif Ultra

GeneXpert NO SE RECOMIENDA PARA

MONITOREAR EL TRATAMIENTO, porque?
XPERT MTB/Rif Ultra

GeneXpert NO SE RECOMIENDA PARA

MONITOREAR EL TRATAMIENTO, por qué?
detecta tanto bacilos vivos como muertos y
puede dar positivo durante el tratamiento, aun
con pocos bacilos.
PROCEDIMIENTO PRE ANALÍTICO Y ANALÍTICO
Buenas prácticas de laboratorio
PROCEDIMIENTO PRE ANALÍTICO
• Una sola muestra es recomendada para analizarla
por Xpert MTB/RIF (1-4 ml de esputo purulento/
mucoide).

• Las muestras no deben contener alimentos u otras

partículas que pueden interferir en el resultado de MUCOIDE
la prueba Xpert MTB/RIF.

PURULENTA
 IMPORTANTE

Correcto llenado
 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO: ESPUTO DIRECTO

Rotular tubo de Agregar 1ml de muestra Agregar reactivo de Agitar de 10 a 20 veces dejar
centrifuga de 15 ml el con una pipeta de la muestra incubar temperatura
código de muestra transferencia proporción 1:2 ambiente 10min Agitar y
darle 5min. mas
Abrir la tapa del cartucho Ajustar la tapa del En el software del Ingresar el cartucho
y con la pipeta cartucho sistema escanear los al modulo asignado
suministrada aspirar la datos de la muestra y
muestra justo por encima el módulo a usar
de la línea y transferir a la
cámara de muestras del
cartucho
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO: EXTRAPULMONARES

MUESTRAS LÍQUIDAS:
1. Muestras con más de 5mL
• Transfiera la muestra a un tubo de centrífuga cónico y concentre la muestra a
3000xg durante 15 minutos.
• Decantar el sobrenadante y resuspenda en 2 ml de buffer fosfato salino (PBS).
• Transferir 1mL de la muestra a un tubo cónico para realizar el proceso de
inactivación.
• Adicionar el reactivo de la muestra en una proporción de 1:2 y seguir el
mismo proceso ya conocido.
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO: EXTRAPULMONARES

MUESTRAS LÍQUIDAS:
2. Muestras con 1-5mL
• Transferir 1 mL de la muestra a un tubo cónico para realizar el proceso de
inactivación.
• Adicionar el “reactivo de la muestra” en una proporción de 1:2 y siga el
mismo proceso ya conocido.

3. Muestras con 0.1-1mL

• Añadir 2mL de reactivo de muestra de Xpert.
• Seguir el mismo proceso ya conocido.
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO: EXTRAPULMONARES

MUESTRAS SÓLIDAS:
1. Ganglios Linfáticos y Otros Tejidos
• Corte la muestra de tejido en pequeños trozos en un mortero.
• Añada aproximadamente 2 ml de solución salina tamponada con fosfatos
(PBS) estéril.
• Triture la solución de tejido y PBS en un mortero hasta obtener una
suspensión homogénea.
• Transferir 1mL de la muestra a un tubo cónico para realizar el proceso de
inactivación.
• Adicionar el reactivo de la muestra en una proporción de 1:2
• Siga el mismo proceso ya conocido.
Método de procesamiento de heces Sencillo de un solo paso
(SOS)
Procedimiento
Antes evaluar la consistencia de la muestra de heces. Se evalúa
utilizando la escala de heces de Bristol.
Para heces con apariencia de Bristol tipo 1 a 5 (heces formadas)
transferir 0.8 g o una cantidad de heces tamaño de una uña del
dedo pulgar directamente del recipiente de heces al frasco del
reactivo de trabajo de la muestra del Xpert MTB, usando un
aplicador de madera (bajalenguas).
Para heces con apariencia de Bristol 6 y 7 (heces líquidas),
extraer 2mL del frasco del reactivo de trabajo de la muestra
Xpert MTB y con una pipeta de transferencia tomar 2mL de las
heces líquidas y se coloca al frasco de reactivo de trabajo.
Para todo tipo de heces se agita la muestra en el frasco del
reactivo de trabajo vigorosamente por unos 30 segundos y
luego dejar en reposo por unos 10 minutos a temperatura
ambiente. Repetir este paso una vez más.
Luego asegurarse que las partículas sólidas y los desecho se
hayan asentado.
A continuación, con la pipeta de transferencia provisto en el kit
Xpert, transferir 2mL del sobrenadante al cartucho Xpert MTB
debidamente identificada con el código de la muestra.
Luego ingresar el cartucho al equipo Xpert.
Muestras de orina.
Procedimiento
Para muestras de orina, centrifugar la muestra a 3000xg por 15 minutos.

NOTA La concentración de las muestras debe realizarse en una centrífuga refrigerada con contenedor de
aerosoles, estos contenedores deben ser abiertos dentro de una cabina de bioseguridad tanto al momento
de ingresar los tubos de centrífuga con las muestras a concentrar y al momento de retirar los tubos de
centrífuga con las muestras después de haberlos realizado el centrifugado).

Retirar el sobrenadante, asegurándose de conservar el sedimento.

Re suspender el sedimento con 2mL de buffer fosfato salino (PBS).
Transferir 1mL del sedimento re suspendido a un tubo de centrifuga cónico de 15mL y agregar el reactivo
de trabajo de la muestra Xpert MTB, en una proporción de 1:2.
Agitar la muestra en un agitador tipo vortex o agitar con movimientos de vaivén unas 20 veces.
Dejar reposar a temperatura ambiente por 10 minutos.
Luego volver agitar y dejar en reposo por 5 minutos más.
A continuación, con la pipeta de transferencia provisto en el kit Xpert, transferir 2mL del sobrenadante al
cartucho Xpert MTB, debidamente identificada con el código de la muestra.
Luego ingresar el cartucho al equipo Xpert.
CONSIDERACIONES PARA PREPARACIÓN DE MUESTRAS

• Preparar el número de muestras de acuerdo a la cantidad de módulos disponibles

en el equipo Xpert (o sea, solo los que se encuentren en funcionamiento).

• Inicie la prueba en las 4 horas siguientes a la adición de la muestra tratada con el

reactivo para muestras al cartucho.

• Cuando procese más de una muestra a la vez, abra solo un cartucho, añada la
muestra tratada con el reactivo para muestras y cierre el cartucho antes de pasar a
la siguiente muestra.

• Utilice el cartucho dentro de 30 minutos después que se destape el cartucho.

 LECTURA DE RESULTADOS
CARTUCHO MTB/RIF ULTRA
Dianas y sondas
Dianas
-IS1081 e IS6110 (diana de elemento d inserción multicopia presente en la mayor
parte de las cepas clínicas de TB)
-Región determinante de resistencia a rifampicina (RRDR) del gen rpoB (81 pares de
bases)

Sondas
-1Sonda para SPC (Control de procesamiento de muestras)
-2 sondas se unen a IS1081-IS6110
-4 sondas se unen a las mutaciones asociadas a la resistencia a la rifampicina en
rpoB.

El análisis de fusión con 4 sondas de rpoB es capaz de distinguir entre la secuencia natural
conservada y las mutaciones que están asociadas a resistencia a RIF.
ALGORITMO DE INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
MTB NO DETECTADO

No se ha detectado la secuencia diana de MTB

en la muestra.
-No se puede determinar la resistencia a RIF
debido a una detección insuficiente de la
señal.
-SPC: SUPERADO (PASS). El SPC cumplió los
criterios de aceptación.

-Comprobación de la sonda SUPERADO (PASS)

MTB DETECTADO Y RESISTENCIA A RIFA NO DETECTADA

La muestra contiene la secuencia diana de MTB:

-No se ha detectado ninguna mutación en la

secuencia diana del gen rpoB.
-SPC: NA (no aplicable) No se requiere un SPC por
que la amplificación de MTB puede competir con
este control.

-Comprobación de la sonda: SUPERADO (PASS)

-
MTB DETECTADO Y RESISTENCIA A RIFA DETECTADA
La muestra contiene la secuencia diana de MTB:

-Se ha detectado al menos una mutación rpoB.

-SPC: NA (no aplicable). No se requiere una señal

SPC por que la amplificación de MTB puede
competir con este control.
-Comprobación de la sonda SUPERADO (PASS)
MTB DETECTADO Y RESISTENCIA A RIFA INDETERMINADA

La muestra contiene la secuencia diana de MTB:

-IS1081/S6110 se detecta la señal.
-No se pudo determinar la resistencia a RIF
debido a una detección insuficiente de la señal.

-SPC: NA (no aplicable). No se requiere una

señal SPC por que la amplificación de MTB
puede competir con este control.
-Comprobación de la sonda: SUPERADO (PASS)
TRAZAS DE MTB DETECTADA
VISUALIZACIÓN DE RESULTADOS
ERROR
• El tubo de reacción se llenó
incorrectamente
• Ha detectado un problema con la
integridad de la sonda
• Se superó la presión máxima
• Hubo un fallo en un módulo GeneXpert

SIN RESULTADO
• Cortes de energía eléctrica
• Prueba detenida por el operador
 ERRORES COMUNES

5006/5007/5008 2127 2014/3074/3075/1001

• Causa: El control de verificación de • Causa: Se detecta la pérdida de • Causa: Alta temperatura en el
la sonda falló y la prueba se detuvo comunicación del módulo. módulo.
antes de la amplificación.
• Origen(es): Problema con la fuente • Origen(es): Falla de un componente
• Origen(es): Muestra demasiado de alimentación (fluctuación /falla del calentador; ventilador roto;
viscosa y / o volumen de la muestra en la alimentación de la energía polvo en el filtro cerca del ventilador.
mal añadido o con burbujas, fallas principal o UPS).
en la integridad de las sondas.
• Solución: Revisar la temperatura y el
• Solución: Verificación de las ventilador de la parte posterior.
• Solución: Espere 10 minutos más conexiones.
hasta que la muestra esté
completamente licuada
 ERRORES COMUNES

2005 2006
• Causa: No se ha detectado ningún • Causa: No se detecta ningún
movimiento del impulsor de la movimiento de la válvula.
jeringa.
• Origen(es): A fallado el motor de la
• Origen(es): Se ha detectado un válvula.
bloqueo en la jeringa
• Solución: Abrir el módulo y colocar
• Solución: Utilizar un cartucho nuevo. en la posición adecuada el cartucho.
• Reiniciar el sistema. • Utilice un cartucho nuevo.
• Si el error se repite llamar al servicio • Reiniciar el sistema.
técnico
Conservación y manipulación de kit del ensayo Xpert
MTB/RIF Ultra
• Conservar los cartuchos y los reactivos del ensayo Xpert MTB/RIF Ultra a una
temperatura entre 2 °C y 28°C.

• Abrir la tapa del cartucho del ensayo sólo cuando se añada la muestra, cierre la
tapa y proceda con el procesamiento.
Advertencias y precauciones
• No agitar el cartucho.

• No utilizar un cartucho que:

- Parezca mojado, tenga alguna fuga o el precinto de la tapa parezca haberse roto.
- Parezca dañado.
- Se haya caído después de extraerlo del envase.
- Se haya caído o agitado después de haberse añadido la muestra.
- Tenga un tubo de reacción dañado.
- Se hay utilizado: cada cartucho de un solo uso se utiliza para procesar una sola prueba.
- Haya caducado.
- No vuelva a utiliza pipetas desechables usadas.
TIPO DE POBLACIÓN PARA GENEXPERT
El GeneXpert debe ser usado prioritariamente en personas que son sintomáticos
respiratorios/sospecha de TB:
• Viviendo con el Virus de la Inmunodeficiencia humana (PVVIH)
• Con diabetes mellitus (DM)
• Contacto TB-MDR
• Niño/adolescente menor de 11 años
• Privada de su libertad (PPL)
• Trabajadores de salud
• Contacto de casos TB
• Adultos mayores de 60 años
TIPO DE POBLACIÓN PARA GENEXPERT
El GeneXpert debe ser usado prioritariamente en personas que son sintomáticos
respiratorios/sospecha de TB:
• Adolescentes (entre 12 y 17 años)
• Mujeres gestantes
• Trabajadores penitenciarios
• Ex privados de la libertad
• Casos en seguimiento diagnóstico
• Antes tratados
• Como prueba de susceptibilidad a Rifampicina
• TB extrapulmonar
 GENEXPERT

MTB DETECTADO, Sin resultado

MTB DETECTADO
MTB DETECTADO RIF Error
MTB NO resistencia a la
Resistencia a la indeterminada o prueba no
DETECTADO RIF NO
RIF DETECTADA (incluye válida
DETECTADA
resultados trazas)

MTB DETECTADO/RESISTENCIA RIF INDETERMINADA:

Se repetirá la prueba con una segunda muestra.

Si el resultado persiste en la segunda muestra, se debe de
proceder a realizar cultivo.
 CONTROL DE CALIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS DE
LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE
TUBERCULOSIS

A. Control de calidad interno

El control de calidad interno es realizado para cada muestra
mediante la verificación de las sondad PCC y SPC.

B. El control de calidad externo

se realiza en coordinación con el LRNM o el que haga a sus
veces del INS
 Amplificación Automatizada del Ácido
Nucleico en Tiempo Real para la Detección
de la Resistencia a Drogas Antituberculosis
de Primera y Segunda Línea.

GENEXPERT MTB XDR

Amplificación Automatizada del Ácido Nucleico en Tiempo
Real para la Detección de la Resistencia a Drogas
Antituberculosis de Primera y Segunda Línea.

• Utiliza La PMMA automatizada.

• Detección simultanea
₋ Mutaciones asociadas a la amplia resistencia a
fármacos y el complejo MTB.
• Controles internos incorporados para cada
muestra.
₋ Adecuación del volumen de la muestra (SVA)
₋ Control de comprobación de la sonda (PCC)
₋ Control de procesamiento de muestras (SPC)
Amplificación Automatizada del Ácido Nucleico en Tiempo
Real para la Detección de la Resistencia a Drogas
Antituberculosis de Primera y Segunda Línea.

• Resultados en aproximadamente:
- Menos de 90 minutos
• Sistema de cartucho cerrado que minimiza
el riesgo de contaminación.
• Límite de detección:136 UFC/ml
El ensayo Xpert MTB/XDR, es una prueba de diagnóstico in vitro de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, anidada, para la
detección del ADN del complejo MTB extremadamente resistente a
fármacos (XDR) en muestras de esputo sin procesar o en sedimentos
concentrados a partir de esputo.

En muestras en las que se detecta MTB, el ensayo Xpert MTB/XDR también

puede detectar mutaciones asociadas a la isoniacida (INH); la etionamida
(ETH); la fluoroquinolona (FLQ) y fármacos inyectables de segunda Línea
(SLID).
El ensayo Xpert MTB/XDR está indicado para utilizarse como prueba refleja
para una muestra que se haya determinado como positiva para MTB. Esta
prueba está concebida como una ayuda para el diagnóstico de tuberculosis
(TB) XDR cuando se utiliza junto con los resultados clínicos y otros
hallazgos de laboratorio.
MTB/XDR
▪ Esta diseñado para detectar:
▪ Mutaciones asociadas a la isoniazida (INH) en los
genes KatG y fabG1, la región intergénica oxyR-ahpC y
el promotor inhA.
▪ Mutaciones asociadas a la resistencia a etionamida
(ETH) sólo en el promotor inhA.
▪ Mutaciones asociadas a la resistencia a
fluoroquinolona (FLQ) en las regiones determinantes
de resistencia a las quinolonas gyrA y gyrB (QRDR).
▪ Mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos
inyectables de segunda línea (SLID) en el gen rrs y la
región promotor eis.
No se debe USAR ESTA PRUEBA PARA
MONITOREAR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO
ANTITUBERCULOSIS, ya que puede detectar ADN
de bacilos muertos
 Condiciones de las muestras
• Las muestras deben llegar al laboratorio acompañadas de sus
respectivas fichas bacteriológicas.

• No aceptar muestras inadecuadas (muestras con sangre, restos de

alimentos muestras con volumen insuficiente.

• En caso suceda, se debe informar para el envío de una nueva

muestra..
 Transporte y conservación de muestras
• Las muestras deben llegar al laboratorio dentro de las 72 horas en
cadena de frio.
• Sedimento de esputo: conservar el sedimento resuspendido a una
temperatura entre 2°C – 8°C durante un máximo de siete días.

• Esputo sin procesar: Siempre que sea posible, transportarlo y

conservarlo a una temperatura de 2°C – 8°C antes de procesarlo.

• En caso necesario, las muestras de esputo sin procesar pueden

conservarse hasta tres días a una temperatura máxima de 35°C y
luego a una temperatura entre 2°C – 8°C durante siete días.
• Una sola muestra es recomendada para analizarla por
Xpert MTB (1-4 ml de esputo purulento/ mucoide).

• Las muestras no deben contener alimentos u otras

partículas que pueden interferir en el resultado de la
prueba Xpert MTB.
 Proceso del ensayo “Amplificación Automatizada del Ácido
Nucleico en Tiempo Real para la Detección de la Resistencia a
Drogas Antituberculosis de Primera y Segunda Línea

Rotular tubo de Agregar 1ml de muestra Agregar reactivo de Agitar de 10 a 20 veces dejar
centrifuga de 15 ml el con una pipeta de la muestra incubar temperatura
código de muestra transferencia proporción 1:2 ambiente 10min Agitar y
darle 5min. mas
Abrir la tapa del cartucho Ajustar la tapa del En el software del Ingresar el cartucho
y con la pipeta cartucho sistema escanear los al modulo asignado
suministrada aspirar la datos de la muestra y
muestra justo por encima el módulo a usar
de la línea y transferir a la
cámara de muestras del
cartucho
 Relación muestra-
Volumen mínimo de Volumen máximo de
Tipo de muestra reactivo para
la muestra la muestra
muestras

Sedimento de esputo 0,5 ml 2,5 ml 1:3*

Esputo sin procesar 1 ml 4,0 ml 1.2

* La relación muestra-reactivo para muestra 1:2 debería utilizarse con un volumen de la muestras 0,7 ml o
superior para una prueba
CONSIDERACIONES PARA PREPARACIÓN DE MUESTRAS

• Preparar el número de muestras de acuerdo a la cantidad de módulos disponibles

en el equipo Xpert (o sea, solo los que se encuentren en funcionamiento).

• Inicie la prueba en las 4 horas siguientes a la adición de la muestra tratada con el

reactivo para muestras al cartucho.

• Cuando procese más de una muestra a la vez, abra solo un cartucho, añada la
muestra tratada con el reactivo para muestras y cierre el cartucho antes de pasar a
la siguiente muestra.

• Utilice el cartucho dentro de 30 minutos después que se destape el cartucho.

ALGORITMO DE INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Picos de Fusión
(Melt Peeaks)
No se detecta resistencia
Resistencia INH-FLQ-SLID-ETH
Resistencia INH
Resistencia FLQ
Resistencia a INH + baja resistencia a FLQ
+ resistencia a KAN
Gracias
Mantenimiento del GeneXpert
 El mantenimiento del GeneXpert es fácil
• Tareas de mantenimiento preventivo:
– Realizadas de manera periódica por los usuarios finales: diariamente, semanalmente,
mensualmente y anualmente.
– Aseguran el buen rendimiento del sistema.
– Ayudan a evitar averías del GeneXpert.

131 © Cepheid
 Herramientas y productos necesarios
• Dilución 1:10 de lejía doméstica* (utilizada en el día posterior a su preparación)
• Solución de etanol al 70 %
• Paños sin pelusa o hisopos que no sean de algodón
• Cepillos (cuando se suministren con el sistema; también se
pueden encargar)
• Guantes desechables
• Agua limpia
• Protección ocular
132 © Cepheid

• Filtros de ventilador de repuesto (que se pueden encargar)

Mantenimiento diario
 Mantenimiento diario
1. Limpie el área de trabajo
(siguiendo las directrices de su centro). 2. Retire y deseche los cartuchos usados.

3. Mantenga las puertas en posición vertical.

134 © Cepheid
Mantenimiento semanal
 Mantenimiento semanal
• Reinicie el sistema.
1. Apague el ordenador GeneXpert. 2. Apague el instrumento GeneXpert.

...espere 2 minutos...

3. Encienda el instrumento GeneXpert. 4. Encienda el ordenador GeneXpert.

136 © Cepheid
 Aviso importante
Siempre que no se esté utilizando el
sistema GeneXpert:
1. Apáguelo.
2. Proteja el GeneXpert con la cubierta
antipolvo GeneXpert (suministrada
solamente con el GX-IV).

137 © Cepheid

Específico del HBDC, cuando se suministre con el sistema

Mantenimiento mensual
 Mantenimiento mensual

1. Limpie las superficies del instrumento.

2. Limpie los compartimentos de
los cartuchos.
3. Limpie los vástagos de los émbolos.
4. Limpie las ranuras de los tubos
de PCR del módulo.
5. Limpie el filtro del ventilador.
6.
139 © Cepheid Archive y purgue (borre) los ciclos.
 1. Procedimiento de limpieza de la superficie
del instrumento
1. Humedezca un paño sin pelusa con una solución de
etanol al 70 %.

2. Limpie con un paño todas las superficies exteriores del

instrumento.
3. Limpie con un paño la superficie de la
mesa alrededor del instrumento.

140 © Cepheid

Utilice un paño sin pelusa para el instrumento y otro para la zona de trabajo.

Deseche los paños o usados siguiendo los procedimientos habituales del

laboratorio.
 2. Procedimiento de limpieza del compartimento del cartucho

1. Humedezca un paño sin pelusa con una solución 1:10 de lejía doméstica.
2. Limpie el interior del compartimento del cartucho, el interior de la puerta y el borde superior
3x
de la puerta.

3. Espere 2 minutos.

4. Humedezca un paño sin pelusa con una solución de etanol al 70 %.

5. Limpie las partes antes descritas con la solución de etanol.

141 © Cepheid

Cambie los paños sin pelusa con frecuencia durante la limpieza.

Deseche los paños o usados siguiendo los procedimientos habituales del laboratorio.

Este procedimiento también puede aplicarse en caso de que se produzcan derrames sobre las superficies afectadas.
 2. Limpieza del compartimento del cartucho
Limpie el interior del compartimento del cartucho, el interior de la puerta y el borde
superior de la puerta.

Interior del
compartimento
del cartucho

142 Interior de la puerta

© Cepheid

Borde superior de
la puerta
 3. Procedimiento de limpieza de los vástagos de los émbolos
1. Humedezca un paño sin pelusa con una solución 1:10 de lejía doméstica.

3x 2. Limpie con cuidado los vástagos de los émbolos después de bajarlos.

3. Espere 2 minutos (nunca más de 5 minutos).

4. Humedezca un paño sin pelusa con una solución de etanol al 70 %.

5. Limpie el vástago del émbolo con la solución de etanol.

143 © Cepheid

Cambie los paños sin pelusa con frecuencia durante la limpieza.

Deseche los paños o usados siguiendo los procedimientos habituales
del laboratorio.
 3. Limpieza de los vástagos de los émbolos

2
1

En el menú Mantenimiento (Maintenance),

seleccione Mantenimiento (Maintenance) ->
Mantenimiento del émbolo (Plunger Maintenance).

En la ventana Mantenimiento del émbolo

144 © Cepheid
3 (Plunger Maintenance), seleccione «Limpiar
todo» (Clean All).

Siga las instrucciones de la ventana de diálogo

4 y haga clic en «Aceptar» (OK).
 3. Limpieza de los vástagos de los émbolos
Los vástagos de los émbolos se
5 bajarán en los módulos
seleccionados.

Émbolo

Interior del compartimento

del cartucho

Borde superior de la
puerta

Utilizando un paño, limpie con cuidado el vástago

16 © Cepheid del émbolo para retirar el polvo que pueda haber.
 3. Limpieza de los vástagos de los émbolos
Después de limpiar los émbolos, haga clic en
A continuación, haga clic
6 «Subir todos» (Move Up All) en el software GxDx. 7 en «Cerrar» (Close).
Los émbolos volverán a su posición inicial.

146 © Cepheid
 4. Limpieza de la ranura de PCR del módulo

1. Utilice guantes de laboratorio.

2. Retire los cartuchos de los módulos.

3. Asegúrese de haber introducido por completo

todas las cerdas (hasta el borde del vástago de
plástico del cepillo).

4. Cepille el interior de la ranura con movimientos

de arriba a abajo.

5. Gire el cepillo unos 180° hacia delante y hacia

147
atrás y, a continuación, repita el paso anterior
© Cepheid

dos veces.

6. Limpie cada módulo durante un mínimo de

30 segundos.
 5. Limpieza del filtro del ventilador
(cuando el filtro está colocado detrás del panel trasero)
Apague el sistema y retire los 4 tornillos del Incline hacia atrás el panel.
panel gris trasero.

148 © Cepheid
 5. Limpieza del filtro del ventilador
(cuando el filtro está colocado en el exterior)

Apague el sistema. Desprenda los 4

clips uno a uno.

149 © Cepheid
 5. Limpieza del filtro del ventilador

Extraiga el filtro (esponja).

Lave el filtro con agua y jabón.

150 © Cepheid

Cambie el filtro si es necesario.

Disponible previa petición.
Séquelo entre 2 toallitas de papel.
(Debe quedar totalmente seco antes de
volverlo a colocar).
Mantenimiento anual
 Mantenimiento anual
• Compruebe el rendimiento del módulo con Xpert®Check.

152 © Cepheid

Antes de procesar Xpert Check,

asegúrese de que los cepillos
suministrados se utilizan para limpiar la
ranura del tubo de PCR del módulo.
 Mantenimiento anual
• Todos los módulos deben verificarse cada año con los cartuchos Xpert Check.
• La verificación la realizan los usuarios finales o un técnico de mantenimiento
autorizado de Cepheid.

PASO 2 PASO 3
PASO 1
COMPROBAR EL CONFIRMAR EL
OBTENER EL KIT
FUNCIONAMIENTO FUNCIONAMIENTO

153 © Cepheid
O
 Registro de mantenimiento
Lista de comprobación del mantenimiento para el usuario
Fecha de instalación Mes

Número de serie Año

Escriba sus iniciales en los cuadros al acabar.

MANTENIMIENTO DIARIO
Limpiar el área de trabajo

Desechar los cartuchos usados

Mantener las puertas de los módulos en posición vertical

MANTENIMIENTO SEMANAL Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5

Apagar el instrumento y el ordenador GeneXpert

MANTENIMIENTO MENSUAL
Archivar y eliminar pruebas: Guardar en CD
154 © Cepheid
Limpiar los filtros de los ventiladores

Limpiar la ranura de PCR del módulo

Limpiar los compartimentos de los cartuchos y los vástagos de los émbolos

Limpie las superficies del instrumento

MANTENIMIENTO ANUAL
Realizar el XpertCheck
Gracias