UNIVERSIDAD DEL NORTE

PROGRAMA DE MEDICINA – II SEMESTRE

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Técnica adaptada y modificada por la profesora Alma Polo Barrios de la técnica de Sambrook et al. y las
anotaciones del profesor José Villarreal Camacho.

1. OBJETIVO
Diseñar y ejecutar la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction – PCR) a
partir de ADN genómico humano con la adición de cebadores (primers) específicos para la región
polimórfica del gen apoE con la finalidad de hacer la genotipificación de la muestra.

2. RESPONSABLE
Los responsables de la ejecución exitosa de la PCR son los estudiantes de medicina, supervisados
por el docente de biología molecular y asistidos por el auxiliar de laboratorio.

3. DEFINICIONES.
PCR: es una técnica que se utiliza para amplificar (copiar) el ADN. En el procedimiento se hace
uso de una enzima, una ADN polimerasa, que es la encargada de sintetizar ADN complementario
a una molécula molde de ADN, en un proceso que simula la forma en la que el ADN se replica in
vivo. Esta técnica permite sintetizar múltiples copias a partir de un ADN molde que se encuentra
en concentraciones bajas. Es importante aclarar que en esta técnica no se deben generar copias
de genes de gran tamaño (más de 3 Kb), así como tampoco de genomas completos, debido a la
alta frecuencia de mutaciones, asociadas al desgaste que sufre la enzima durante el proceso.
MÁSTER MIX: es la solución que se prepara teniendo en cuenta los elementos requeridos por el
proceso enzimático para culminar de manera exitosa una reacción de PCR. Sus componentes
tradicionales son:
• BUFFER o TAMPÓN PARA LA AMPLIFICACIÓN
Contiene KCl, Tris-HCl y MgCl2. El cloruro de magnesio es el componente más influyente en la
reacción de PCR ya que actúa como cofactor de la enzima Taq polimerasa mediante la
donación de iones Mg2+; la inestabilidad de sus concentración en la reacción genera errores
graves en el proceso, que incluyen la falta de un producto de la reacción.
• PRIMER o CEBADOR
Es un oligonucleótido sintético de desoxinucleótidos que forman una sola hebra de ADN. Esta
molécula posee una secuencia complementaria a la región adyacente o vecina al fragmento
que se desea amplificar (copiar). Para la técnica de amplificación tradicional se preparan dos
 primers: F (forward) y R (reverse). El Primer F tiene una secuencia complementaria a la región
adyacente que se localiza corriente arriba de la diana que se quiere amplificar. El Primer R es
complementario a la región adyacente que se localiza corriente abajo de la diana que se va a
amplificar. Los primers (cebadores) definen la longitud del fragmento que se va a amplificar. Lo
usual es que se utilicen para amplificar regiones específicas de un gen y no el gen completo.
Los primers actúan como iniciadores del proceso de síntesis de ADN. A la hora de elegirlos
para una PCR se debe tener en cuenta lo siguiente:
 La longitud de los primers debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos. La
experimentación ha mostrado que los primers de más de 30 nucleótidos no aumentan el
rendimiento de una reacción de PCR y los primers muy cortos carecen de especificidad.
 Ambos primers deben tener una temperatura de hibridación (Tm o temperatura de fusión)
similar. La máxima diferencia entre las temperaturas de hibridación de los primers que se
utilizan en una PCR debe ser de aproximadamente ± 5°C).
 La relación purinas:pirimidinas debe ser 1:1 o en su defecto 1:1.5 (que es lo mismo que
40:60), lo que fácilmente se puede controlar debido a que el primer es un ADN de una sola
hebra. Se sugiere que en el extremo 3´- de los primers esté una G o C, pero esto no es un
requisito indispensable.
• DESOXINUCLEÓSIDOS TRIFOSFATOS (dNTP)
Es una mezcla de moléculas de tipo ATP, GTP, CTP y TTP que suele agregarse en altas
concentraciones (ya que se gastan rápidamente durante la reacción) para que sean
incorporados por la ADN polimerasa a las cadenas de ADN que se están sintetizando. Las
concentraciones de dNTP y el MgCl2 siempre van relacionadas. Para una concentración de
200 μM de cada uno de los dNTP se suele añadir una concentración de 1.5 mM de Mg2+.
• Taq POLIMERASA
Es una enzima de tipo ADN polimerasa que fue extraída inicialmente a partir de una bacteria
extremófila, el Thermus aquaticus. Hoy día se obtiene en el laboratorio a partir de bacterias
recombinantes que poseen el gen que codifica para esta enzima, por lo que son capaces de
sintetizarla. La Taq-pol se encarga de incorporar desoxinucleótidos al extremo 3’- de alguno de
los primers que previamente se han unido por complementariedad a la zona adyacente al gen
que se desea amplificar. La principal característica de esta enzima es que es termoestable por
lo que puede soportar temperaturas elevadas y mantener una media de extensión
(procesamiento) de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en pares G-C. Las cantidades
óptimas de Taq polimerasa para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades por cada 25
μL de volumen final de reacción. La actividad de esta enzima se ve influenciada por la
 concentración de dNTPs, Mg+2 y de algunos iones monovalentes. Las concentraciones
elevadas de estos iones inhiben la actividad de dicha enzima.
• ADN MOLDE (TEMPLATE)
Es el ADN que se desea amplificar. La concentración de ADN requerida para una reacción de
PCR siempre va a ser muy baja y depende de la calidad del ADN. Cuando el ADN es de óptima
calidad (puro) no surgen problemas durante la amplificación. Generalmente una concentración
de mínimo 5 ng por cada 25 μL de reacción genera buenos resultados. El problema aparece
cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, debido a que está degradado o bien porque
se encuentra mezclado con diferentes contaminantes que entorpecen la función de la enzima.

4. FUNDAMENTO
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica aplicada para la amplificación
(multiplicación) in vitro de uno o varios segmentos de ADN, por acción de una enzima ADN
polimerasa termoestable, en ciclos repetitivos en los que se utiliza la temperatura para generar los
pasos de los que se compone la reacción. Durante el proceso, lo primero que sucede es la
desnaturalización del ADN bicatenario, a una temperatura muy alta, con la finalidad de que se
generen cadenas de ADN de una sola hebra. Luego la temperatura se lleva a 50 – 65°C (Tm
determinada por las características de los primers) para que los primers sintéticos se unan por
complementariedad a una región del ADN molde, lo cual les da la capacidad de delimitar la región
que se va a amplificar. Inmediatamente después se eleva la temperatura a 72°C para que empiece
la síntesis de ADN a partir de los extremos 3´- de los primers por acción de la polimerasa
termoestable. Todo esto corresponde a un proceso de síntesis de ADN de doble hebra, in vitro.

5. REACTIVOS Y ENZIMAS
• Buffer para la amplificación (contiene KCl, Tris-HCl y MgCl2)
• Primers o cebadores diseñados para la amplificación del gen apoE:
Primer 1F 5´CGG ACA TGG AGG ACG TGT 3´
Primer 2R 5´CTG GTA CAC TGC CAG GCA 3´
Primer 3F 5´ CTG GTA CAC TGC CAG GCG 3´
Primer 4R 5´ CGG ACA TGG AGG ACG TGC 3´
• Muestras de ADN genómico humano y ADN genómico bacteriano (se usará como control).
• dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
• Taq polimerasa
• Agua ultrapura estéril
6. MATERIALES Y EQUIPOS
• Micropipetas de volumen variable y puntas para micropipetas.
• Microtubos para PCR con capacidad para 200 l
• Gradillas refrigeradas (coolers)
• Termociclador

Nota: Todo el material debe mantenerse en frío (0°C a 4°C) en las gradillas refrigeradas, durante todo el
procedimiento. En ningún momento se debe abandonar la cadena de frío para la reacción.

7. PROCEDIMIENTO
• Preparar 3 soluciones máster mix (para apoE2, apoE3 y apoE4) teniendo en cuenta las
indicaciones de la tabla. Con respecto a los primers, añadirlos según la siguiente
indicación: primers 1F y 2R se utilizarán para la reacción de apoE2; primers 1F y 3F
servirán para la reacción de apoE3; y, primers 4R y 3F se agregarán a la reacción para
apoE4.
• Rotular los microtubos para su posterior almacenamiento en refrigeración.
• A 20 μl de la solución máster mix que se encuentra en cada microtubo, agregar 5 μl de
ADN. Mezclar la solución por pipeteo suave.
REACTIVOS COMPONENTE CONCENTRACION CONCENTRACION VOLUMEN POR
INICIAL REQUERIDA TUBO

Buffer de amplificación 10X 1X 2 µL

MgCl2 25mM 1.2 mM 0.96 μL

MASTER MIX

Primer F 10 µM 1 µM 1 μL

Primer R 10 µM 1 µM 1 μL

10 mM de cada 0.2mM de cada

dNTP 0.44 μL
dNTP dNTP

Polimerasa 5 U / µL 1.25 U 1 μL

H2O ultrapura Hasta 20 μL Hasta 20 μL 13.6 μL

Total 20 μL

Después de tener preparada la solución Master Mix, agregar el ADN

ADN ? 0.2 ng/ µL 5 µL

• Llevar los tubos (en las gradillas refrigeradas) hasta el termociclador y colocarlos en la
portacubetas del equipo. Cerrar la tapa del termociclador y seleccionar el programa para
la amplificación según las siguientes indicaciones:
 Programación del termociclador:

Homogeneización 98°C por 4 min.

Desnaturalización 98°C por 30sec

30 ciclos: Hibridación o Anillamiento 57°C por 30sec

Extensión 72°C por 30sec
Extensión Final 72°C por 5 min
Temperatura de mantenimiento 4°C por tiempo indefinido

• En cada tubo, los primers amplificarán el ADN asociado al gen apoE, generando un
fragmento específico de 173 pb.
• Después de la amplificación, guardar las muestras en refrigeración a -20°C. También
puede montar una electroforesis en gel de agarosa al 1.5% para observar los resultados.

8. REFERENCIAS
• Green MR, Sambrook J. 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press. 4ª ed. Volumen
III.
• Dixon, S.C., Horti, J., Guo, Y., Reed, E., and Figg, W.D. 1998. Methods for extracting and amplifying
genomic DNA isolated from frozen serum. Nat. Biotechnol. 16, 91.
• Ossendorf M and Prellwitz W. 2000. Rapid and easy apolipoprotein E genotyping using an improved
PCR-RFLP technique. QiagenNews issue I.