UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO

FACULTAD DE POSGRADO

Nombres de los integrantes

Ing. Julissa Jessenia López Fernández

Ing. José Fausto Quishpi Curicama

Ing. Pozo Almea Deisy Mariela

Ing. Zamora Vasco Geomara Karina

Ing. Medina Artos Betty Gabriela

Ing. Milán Chela Edgar Efraín

Nombre del Modulo

Biotecnología Vegetal

Docente

Dra. Carranza Patiño Mercedes

Susana

Título del ensayo

Establecimiento In Vitro de Plantas y Obtención de Semillas Artificiales

Fecha de entrega

26 de febrero de 2025
 Introducción

El establecimiento in vitro de plantas y la producción de semillas artificiales son

procesos clave en la biotecnología, que optimizan la propagación de cultivos, aumentan la
productividad agrícola y contribuyen a la conservación de especies vegetales. (Kumar y Reddy
2011). Con el cultivo de tejidos vegetales, utilizando partes aisladas de la planta (semillas,
embriones, hojas, tallos, raíces, flores, frutos, otros, etc.) se puede llevar a cabo la clonación de
árboles de importancia forestal con el fin de obtener su mejoramiento genético, propagación
masiva o recuperarlo si está en peligro de extinción (Roca y Mroginski, 1993; Pierik, 1997).

Varias especies forestales se propagan por esta vía, géneros como Pinus, Thuja,
Quercus, Picea, Abies, Sequoia, Pawlonia, Ulmus, Eucalyptus, entre otros ya sea por medio de
la regeneración de brotes (organogénesis) o por la formación de embriones somáticos
(embriogénesis somática) (Nehra et al., 2005). La micro propagación o propagación clonal, es
una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micro propagación,
a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme,
con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado para los
procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas (Alicia 2004)

La técnica de producción de semillas sintéticas (artificial) hace referencia a la

encapsulación de embriones somáticos o protocormos, en una matriz de algún agente
gelificante, en su mayor caso, alginato de sodio (Bhattacharyya et al., 2018). Esta técnica
permite la propagación y cultivo de especies que no pueden obtenerse mediante reproducción
sexual, o en casos, donde está, posea diversos inconvenientes que afecten su funcionamiento.
Además, Pech (2017) agrega que, para facilitar la viabilidad y desarrollo del embrión
encapsulado, es posible añadir reguladores de crecimiento y sustancias de reservas que
cumplirían la función del endospermo, el cual no está presente en muchas especies de interés
comercial, como es el caso de la familia Orchidaceae. Esto facilita el desarrollo normal de las
semillas de las plantas, lo que conduce a una germinación sintetizada y una formación saludable
de las plantas (Nongdam, 2016).

También serían un canal para que las nuevas líneas vegetales producidas mediante
avances biotecnológicos se entregaran directamente al invernadero o al campo y brinda una
alternativa para mejorar la resistencia de las plantas frente a enfermedades y condiciones
ambientales desfavorables (Jo Ann et al, 1987).
 En este informe se detalla los procesos clave en el establecimiento in vitro de plantas
y la Obtención de Semillas Artificiales con Alginato, subrayando su relevancia en la
biotecnología agrícola. Se enfoca en cómo estas técnicas mejoran la propagación de cultivos,
incrementan la productividad agrícola y ayudan en la conservación de especies vegetales,
Además, se analiza cómo la micro propagación y la producción de semillas artificiales, a través
de reguladores de crecimiento y sustancias de reserva, facilitan la propagación masiva y la
viabilidad de especies que no se pueden reproducir sexualmente. Finalmente, se discute el
impacto de estas innovaciones en la mejora de la resistencia de las plantas frente a
enfermedades y condiciones ambientales desfavorables.

Objetivos

• Establecer condiciones de cultivo in vitro para la propagación de plantas vegetales a

partir de explantes de yemas apicales de neem (Azadirachta indica), con el fin de
evaluar la eficiencia de la micro propagación mediante la siembra de explantes en medio
Murashige y Skoog (MS) con diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento
(ANA, BAP, GA3) para inducir la formación de brotes y raíces.

• Desarrollar una técnica para la producción de semillas artificiales mediante la

encapsulación de embriones somáticos en alginato de sodio, y evaluar el proceso de
formación de cápsulas gelificadas.

• Establecer condiciones óptimas para la germinación de las semillas artificiales,

utilizando medio MS sin reguladores de crecimiento, para evaluar la tasa de
germinación y el desarrollo de plántulas en un ambiente controlado.

3. Materiales y métodos

🔸 Material Vegetal
Explantes de plantas (yemas apicales, embriones somáticos o meristemos).
🔸 Medios de Cultivo
Medio Murashige y Skoog (MS) con reguladores de crecimiento (ANA, BAP, GA3).
Medio MS sin reguladores de crecimiento para la germinación de semillas artificiales.
Gelificante: Alginato de sodio (para encapsulación).
Solución de CaCl₂ (100 mM) para la formación de semillas artificiales.
🔸 Material de Laboratorio
Autoclave
Campana de flujo laminar
Balanza analítica
pH-metro
Probetas y cilindros graduados
Pinzas y bisturí estériles
Pipetas automáticas
Tubos de ensayo, placas Petri y frascos de cultivo

Procedimiento experimental

1. Establecimiento in Vitro de Plantas

Selección y Desinfección del Explante:

Lavar los explantes con agua destilada y detergente que fueron recolectadas de la planta madre
neem (Azadirachta indica) en un frasco de vidrio. Para la desinfección completa se realizó
primero la disolución de ácido ascórbico de la siguiente manera:

Preparación de la disolución de Ácido Ascórbico:

• Se pesaron 2 gramos de ácido ascórbico utilizando una balanza digital, agregando 1

gramo por cada litro de solución.
 • Posteriormente, se añadieron 200 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer.

Disolución del ácido ascórbico y mescal final

• Se colocaron 2 gramos adicionales de ácido ascórbico en un frasco y se disolvieron

completamente.

• Una vez disuelto el ácido ascórbico, se agregó al matraz Erlenmeyer, completando así
la preparación de la disolución de ácido ascórbico.
Seleccion del explante:

• Se seleccionaron 6 explantes y se colocaron en un vaso de precipitación pequeño.

Adición de la solución de ácido ascórbico:

• Se añadieron 50 ml de la solución de ácido ascórbico al vaso de precipitación.

Tratamiento con Tuim:

• Se agregaron 2 gotas de Tuim al frasco que para luego agregar los explantes, con el
propósito de eliminar las capas cerosas de los mismos.
Agitación del contenido:

• Se agitó la mezcla durante aproximadamente 10 minutos para asegurar la acción del

Tuim y la disolución adecuada del ácido ascórbico, al cumplir los diez minutos se
procedió a enjuagar los explantes de manera que quede bien enjuagada sin ninguna
presencia de Tuim.

o Esterilizar con hipoclorito de sodio al 5% por 15 minutos y enjuagar con agua

estéril.

• Preparación de la solución de hipoclorito de sodio:

• Se mezclaron 5% de hipoclorito con 95% de agua destilada.

• Se añadió la mezcla en una probeta de 40 ml y 45 ml, obteniendo un total de
100 ml de solución.
• Tratamiento de los explantes con hipoclorito:

• Una vez preparada la solución de hipoclorito al 5%, se colocó en un vaso de

precipitación que contenía los explantes.
• Se dejó reposar durante 15 minutos.

• Autoclave:

• Después del reposo, se llevó el vaso de precipitación con los explantes a la

autoclave.

• Inocular en el medio MS con reguladores de crecimiento.

• Preparación de la solución de agua oxigenada:

• Se usó 10 ml de agua oxigenada y un 90%, de agua destilada hasta

obtener 100 ml de la solución para el proceso final de siembra de los
explantes en los frascos de cultivo.
 • Enjuague de los explantes:

• Después de los 15 minutos de tratamiento, se procedió a enjuagar los

explantes en la autoclave, realizando tres enjuagues con agua destilada
para asegurar que quedaran completamente limpios.

• Proceso de corte y desinfección de los explantes:

• Se utilizaron dos cajas Petri y un bisturí para realizar los cortes de los
explantes de forma diagonal, tanto en la base como en los lados,
asegurándose de dejar los brotes correctamente de acuerdo al protocolo.
• En la segunda caja Petri se añadió la solución de agua oxigenada para
desinfectar los explantes y evitar la contaminación.
• Los explantes fueron manipulados cuidadosamente con pinzas para
realizar los cortes adecuados.
• Siembra de los explantes en los frascos del cultivo:

• Una vez preparados los explantes se sembraron en los frascos de cultivo

que contenían el Medio de Murashige y Skoog (MS) con reguladores de
crecimiento (ANA, BAP, GA3). manipulando con las pinzas
correctamente.

• Incubación en condiciones controladas:

• Colocar los frascos de cultivo con los explantes en una cámara de

incubación con condiciones controladas.
• Mantener un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad
(16/8 h).
• Asegurar que la temperatura se mantenga a 25°C para favorecer el
crecimiento adecuado de los explantes.
2. Evaluación del Crecimiento:

- Registrar la formación de callos, brotes o raíces: - Observar y registrar el desarrollo de

callos, brotes y raíces durante el proceso de incubación. - Anotar el tiempo en el que se observa
la formación de cada una de estas estructuras.

- Evaluar contaminación y supervivencia de los explantes: - Verificar si los explantes

muestran signos de contaminación (como la presencia de hongos o bacterias) y documentar los
casos observados.

- Evaluar la tasa de supervivencia de los explantes en función de su crecimiento y desarrollo,

anotando aquellos que no sobrevivieron o que no presentaron crecimiento.

1. Resultados y observaciones

Desarrollo del cultivo in vitro:

¿Los explantes sobrevivieron o presentaron contaminación?

La mayoría de los explantes sobrevivieron, pero algunos no mostraron crecimiento,

posiblemente por una desinfección insuficiente y durante el proceso de incubación hubo
contaminación por hongos y bacterias en algunos frascos, principalmente en los explantes que
no se enjuagaron adecuadamente.

¿Hubo formación de brotes o callos?

Se observó la formación de brotes en un 75% de los explantes, con un buen desarrollo en

algunos y un crecimiento limitado en otros, pero los callos se formaron en algunas zonas de
los explantes, pero no de manera destacada.

Discusión

En este estudio sobre el cultivo in vitro de Azadirachta indica, se trabajó en la

propagación a partir de yemas apicales y en la creación de semillas artificiales utilizando el

medio MS y alginato de sodio. La mayoría de los explantes sobrevivieron, aunque algunos

no crecieron debido a una posible desinfección insuficiente y la contaminación por hongos

y bacterias. Alrededor del 75% de los explantes desarrollaron brotes, pero la formación de

callos fue limitada. Los resultados muestran avances y también algunas dificultades,

resaltando la necesidad de un ambiente controlado para prevenir la contaminación y

asegurar una propagación efectiva y sostenible de las especies vegetales

Conclusión

El establecimiento in vitro de plantas es una técnica clave para propagar especies

de forma controlada, mejorando la productividad y ayudando a conservar especies. Aunque

puede haber algunos desafíos como la contaminación, el proceso demuestra ser eficaz en

la regeneración de plantas y la obtención de brotes, lo que lo convierte en una herramienta

valiosa para la biotecnología agrícola. Al igual que todas las técnicas de micropropagación,

la encapsulación con alginato es un proceso muy laborioso. es importante que distintos

laboratorios de investigación adopten esta práctica con el fin de ampliar las investigaciones

y recursos en el tema, a fin de generar un mayor desarrollo de la técnica y un impacto

significativo en la conservación de tejidos vegetales

Anexos
Fotografía 1. Preparando para realizar las prácticas de Establecimiento In Vitro de Plantas y
Obtención de Semillas Artificiales

Fotografía 3. Las dos practicas realizadas generando experiencias de Biotecnología vegetal.

Fotografía 3. Grupo 8 adquiriendo conocimiento y experiencia
brindada por nuestra Dra. Mercedes Susana
 Referencias Bibliográficas

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UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO

FACULTAD DE POSGRADO

OBTENCIÓN DE SEMILLAS ARTIFICIALES CON ALGINATO

AUTORES:

Ing. Arguello Chavarría Peter

Ing. Cornejo Loor Roxana

Ing. Gonzabay Piguave Walter

Ing. Guevara Pérez Jenifer

Dr. Meza Pacheco Eladio

Ing. Salazar Quinde Roxana

DOCENTE: DRA. MERCEDES CARRANZA PATIÑO

MODULO: BIOTECNOLOGIA VEGETAL

QUEVEDO – ECUADOR

2025
1. INTRODUCCION

La biotecnología ha revolucionado el sector agrícola, particularmente a través del cultivo

de tejidos vegetales (CTV), con el propósito de mejorar las características fitosanitarias y
agronómicas de diversas especies de interés comercial. Este avance ha permitido el
desarrollo de técnicas como la propagación masiva de plantas (Suárez., 2020). Sin embargo,
las plantas propagadas in vitro pueden sufrir deterioro y enfrentar desafíos durante su
comercialización. Para mitigar estos inconvenientes, se ha implementado la técnica de
encapsulación (Bonilla, Mancipe y Aguirre, 2015), un proceso clave en la producción de
semillas artificiales.

La encapsulación consiste en la inclusión de explantes en perlas de alginato de sodio,

generando una matriz protectora que imita la función de las semillas naturales. Dentro de
los agentes gelificantes utilizados, el alginato de sodio, un polisacárido extraído de algas
pardas, destaca por su capacidad para formar geles estables en presencia de cationes como
el calcio (Cárdenas et al., 2022).

La producción de semillas sintéticas implica la encapsulación de embriones somáticos o

protocormos en una matriz de alginato de sodio, facilitando la propagación y cultivo de
especies que no pueden reproducirse sexualmente o que presentan limitaciones en su
reproducción convencional (Bhattacharyya et al., 2018). Además, Pech (2017) menciona
que para mejorar la viabilidad y el desarrollo del embrión encapsulado, se pueden añadir
reguladores de crecimiento y compuestos de reserva que cumplan la función del
endospermo, el cual está ausente en muchas especies de interés comercial.

El alginato no solo proporciona una matriz óptima para la encapsulación, sino que también
protege los explantes de daños mecánicos y del estrés ambiental, además de permitir la
liberación controlada de nutrientes y agentes antimicrobianos. Esta tecnología tiene un gran
potencial en la agricultura moderna, especialmente en la producción masiva de cultivos
clonales y en la propagación de especies en riesgo de extinción (Rueda., 2020).

2. OBJETIVOS

Desarrollar un método eficiente para la obtención de semillas artificiales mediante el uso de

alginato, evaluando las condiciones óptimas de encapsulación y gelificación que garanticen
la viabilidad, germinación y funcionalidad de las estructuras encapsuladas, con el propósito
de mejorar la propagación, conservación y producción de cultivos de interés agrícola y
especies en riesgo.

3. MATERIALES Y METODOS
Materiales

1. Material biológico:

o Embriones somáticos, ápices de brotes o explantes vegetativos de la planta

seleccionada.

2. Reactivos y productos químicos:

o Alginato de sodio (grado biológico). o Cloruro de calcio (CaCl₂)

como agente gelificante. o Solución de Murashige y Skoog (MS) o medio
de cultivo equivalente.
o Agua destilada o deionizada.

3. Instrumentos y equipos:

o Cámara de flujo laminar para trabajo estéril.

o Pipetas y micropipetas.
o Matraces, vasos de precipitados y tubos de ensayo.

o Estufa de incubación y refrigerador.

o Balanza analítica.
o Agitador magnético.
o Microscopio estereoscópico.

Métodos

1. Preparación del medio de alginato:

o Disolver alginato de sodio al 2-4% (p/v) en agua destilada con agitación

constante hasta obtener una solución homogénea. o Esterilizar la solución
mediante autoclave a 121°C durante 20 minutos.

2. Preparación del agente gelificante:

o Preparar una solución de cloruro de calcio al 50-100 mM.

o Filtrar la solución con membranas estériles para evitar contaminación.

3. Encapsulación de los explantes o embriones:

o Colocar el material biológico en la solución de alginato previamente esterilizada.

 o Utilizando una pipeta estéril, formar gotas de la mezcla de alginato que
contengan el material vegetal y depositarlas en la solución de cloruro de calcio.
o Dejar gelificar las gotas durante 10-20 minutos, dependiendo de la consistencia
deseada.

4. Lavado de las cápsulas:

o Retirar las cápsulas gelificadas y lavarlas cuidadosamente con agua estéril para
eliminar el exceso de cloruro de calcio.

5. Almacenamiento y pruebas de viabilidad:

o Conservar las semillas artificiales en condiciones controladas de humedad y

temperatura.

o Evaluar la viabilidad y germinación en medios de cultivo adecuados, registrando

el porcentaje de germinación, tiempo de respuesta y características de las
plántulas obtenidas.

RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Formación de cápsulas de semillas artificiales:

o Se logró la encapsulación exitosa de los embriones somáticos y explantes

vegetativos en gotas de alginato, las cuales gelificaron adecuadamente en la
solución de cloruro de calcio.

o Las cápsulas presentaron una textura homogénea, tamaño uniforme

(aproximadamente 4-6 mm de diámetro) y buena resistencia mecánica.

Viabilidad de las semillas artificiales: o El porcentaje de viabilidad inicial fue alto,

superando el 90% tras la encapsulación.
o Las semillas almacenadas a 4°C por un periodo de hasta 30 días mantuvieron
una viabilidad promedio del 85%, mientras que aquellas almacenadas a
temperatura ambiente mostraron una reducción significativa en su viabilidad
(70% al día 30).

Germinación:

o En condiciones de cultivo in vitro, el porcentaje de germinación fue del 80-85%

en las semillas artificiales frescas y del 65-75% en aquellas almacenadas a 4°C
durante 30 días.
 o Se observó un crecimiento normal en las plántulas obtenidas, con características
similares a las plantas generadas a partir de semillas naturales.

Efectos de las concentraciones de alginato y cloruro de calcio:

o La mejor encapsulación y germinación se obtuvieron con una concentración de

alginato del 3% y cloruro de calcio al 75 mM, que proporcionaron cápsulas
suficientemente firmes y con buena permeabilidad al agua y nutrientes.

Observaciones

Calidad de las cápsulas: o Las concentraciones de alginato inferiores al 2%

resultaron en cápsulas frágiles y propensas a romperse durante la manipulación.
o Concentraciones superiores al 4% dificultaron la gelificación homogénea y
disminuyeron la eficiencia de germinación, posiblemente debido a una menor
permeabilidad.

Condiciones de almacenamiento:

o Las semillas artificiales almacenadas a bajas temperaturas conservaron mejor su

viabilidad en comparación con las almacenadas a temperatura ambiente, lo que
sugiere que el frío reduce el deterioro metabólico.

Diferencias entre materiales biológicos:

o Los embriones somáticos presentaron mejores tasas de germinación en

comparación con los explantes vegetativos, probablemente debido a su menor
dependencia de condiciones externas para iniciar el desarrollo.

Aplicabilidad de las semillas artificiales:

o La técnica de encapsulación mostró potencial para aplicaciones agrícolas,

especialmente en cultivos clonales y conservación de especies vegetales.

Sin embargo, se requiere optimizar el proceso para especies con estructuras

más complejas o sensibilidad a la deshidratación.
 Figura 1. Microencapsulación de explantes vegetativos

DISCUSION
La obtención de semillas artificiales mediante el uso de alginato representa una técnica
prometedora en la propagación y conservación de plantas, permitiendo encapsular y proteger
estructuras vegetativas o embriones somáticos. Los resultados obtenidos en este estudio
demuestran la eficacia de esta tecnología, destacando su versatilidad y potencial para
aplicaciones prácticas en la agricultura y la biotecnología.

El principio fundamental de la formación de la cápsula por parte del alginato es el intercambio

de iones entre el sodio (Na+) del alginato de sodio y el calcio (Ca2+) del cloruro de calcio; este
intercambio produce un reordenamiento estructural en la cadena del alginato, resultando en un
material sólido con las características de un gel (Reddy, Murthy y Pullaiah, 2012). Este
intercambio iónico no afecta la naturaleza de los embriones, los cuales permanecen intactos
durante el proceso de formación de la cápsula.

Un factor crucial en este proceso es la solidez de la cápsula, que dependerá de las

concentraciones de los dos agentes utilizados para el encapsulamiento (Kaur, Sharma y Kaur,
2019). El ajuste adecuado de estas concentraciones es fundamental para garantizar la estabilidad
y funcionalidad de las semillas artificiales, optimizando su aplicación en la propagación de
especies de interés comercial y en la conservación de germoplasma.

Viabilidad y Germinación

El alto porcentaje de viabilidad inicial (90%) y germinación (80-85%) en las semillas

artificiales frescas confirma que el proceso de encapsulación con alginato es seguro para las
estructuras vegetales. Este resultado coincide con estudios previos que reportan la
biocompatibilidad del alginato con tejidos vegetales (Cárdenas et al., 2022). La disminución de
la viabilidad y germinación tras el almacenamiento a temperatura ambiente indica la necesidad
de condiciones controladas, como bajas temperaturas, para prolongar la funcionalidad de las
semillas artificiales.

Efecto del Alginato y el Cloruro de Calcio

La concentración óptima de alginato (3%) y cloruro de calcio (75 mM) proporcionó cápsulas
con buena integridad estructural y permeabilidad, favoreciendo la germinación de las
estructuras encapsuladas. Concentraciones superiores o inferiores afectaron negativamente la
calidad de las cápsulas, lo que subraya la importancia de ajustar estos parámetros para cada tipo
de material biológico. Estos hallazgos son consistentes con estudios que destacan cómo las
propiedades físicas y químicas del alginato influyen directamente en el desempeño de las
semillas artificiales (León et al., 2019)

Diferencias en Materiales Biológicos

Se observaron diferencias significativas en la germinación entre los embriones somáticos y los

explantes vegetativos, siendo los primeros más eficaces. Esto podría deberse a que los
embriones somáticos ya poseen estructuras celulares especializadas para iniciar el desarrollo,
mientras que los explantes vegetativos dependen de factores externos, como la disponibilidad
de hormonas en el medio de cultivo. Este comportamiento refuerza la importancia de
seleccionar materiales biológicos adecuados según el objetivo del encapsulamiento (García et
al., 2021)

Aplicaciones y Limitaciones

La encapsulación con alginato tiene un gran potencial en la propagación masiva de cultivos

clonales y la conservación de especies vegetales en peligro de extinción. Sin embargo, aún se
enfrentan desafíos, como la optimización para especies sensibles a la deshidratación o con
estructuras más complejas. Además, es necesario evaluar la eficacia de las semillas artificiales
en condiciones de campo para determinar su aplicabilidad en escenarios agrícolas reales.

6. CONCLUSIONES

• La obtención de semillas artificiales con alginato de sodio es una técnica eficaz y versátil
que ofrece un gran potencial para la propagación y conservación de plantas de interés
agrícola y ornamental. En este estudio, se demostró que las condiciones óptimas de
encapsulación, utilizando una solución de alginato al 3% y cloruro de calcio al 75 mM,
 permiten la formación de cápsulas resistentes y biocompatibles que preservan la
viabilidad y capacidad de germinación de los materiales encapsulados.

• El almacenamiento en frío (4°C) resultó ser crucial para mantener la viabilidad y

funcionalidad de las semillas artificiales durante períodos prolongados, mientras que el
almacenamiento a temperatura ambiente mostró limitaciones en la conservación de las
estructuras encapsuladas. Además, los embriones somáticos presentaron mejores
resultados en términos de germinación y desarrollo, destacándose como material
biológico más adecuado para este tipo de aplicaciones.
• Si bien la técnica muestra un gran potencial para su uso en la agricultura moderna,
existen desafíos por abordar, como la optimización para especies sensibles y la
evaluación en condiciones de campo. No obstante, esta tecnología representa un paso
significativo hacia la implementación de métodos sostenibles y eficientes para la
producción masiva de cultivos clonales y la conservación de biodiversidad vegetal.
 REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS

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