RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PRODUCTO
Generalidades de bioproductos
Hasta ahora se vió todo lo que implican los procesos upstream, ahora se va a analizar que
es lo que pasa luego de que el proceso en el biorreactor termina para separar al producto en
cantidad y calidad adecuada para que pueda cumplir con las especificaciones.
El “corazón” es el bioproceso, lo que pasa antes es el upstream y lo que pasa después es el
downstream.
Clasificación de productos
● Compuestos orgánicos con peso molecular de bajo a medio: etanol, ácidos
orgánicos, aminoácidos y antibióticos.
● Macromoléculas: proteínas, polisacáridos, poliésteres.
● Partículas: células, esporas, virus.
Objetivo del proceso “dowstream”
- Pureza: hablamos de un producto más puro cuando hay mayor cantidad de producto
por cantidad de producto más impureza.
- Actividad específica: útil para los productos biológicos por ejemplo enzimas.
- Rendimiento: de un proceso global o de distintas etapas.
A medida que se avanza en el proceso de recuperación y purificación es esperable que la
PUREZA aumente. Sin embargo, también habrá que tener en cuenta que al aumentar las
etapas el RENDIMIENTO global disminuye. Esto ayuda a ver que lo ideal es no poner etapas
en el proceso a no ser que sean necesarias!
En resumen entonces, el objetivo del proceso “downstream” implica:
Recuperar el producto con las propiedades y pureza requeridos, con el menor costo operativo
y de inversión.
En acciones esto se podría resumir en:
➔ Seleccionar equipos sencillos y de bajo costo
➔ Obtener el mayor rendimiento posible en cada etapa.
➔ Usar el menor número de pasos posibles.
Etapas en la separación de un producto biotecnológico
Operaciones unitarias aplicadas en la recuperación y purificación
de producto
¿Qué tipo de operaciones se pueden usar?
Depende principalmente de características del:
1. Producto
2. Medio o caldo donde se encuentra el producto
3. Otras consideraciones :
a. escala de producción
b. interacción entre etapas
Características del producto
● Localización (intracelular o extracelular, disuelto en el caldo de cultivo), es
importante para ver en el caso de la separación solido-líquido con cual de las dos
partes nos interesará quedarnos.
● Propiedades físicas y químicas:
○ Tamaño, características moleculares o de la partícula (grupos funcionales,
densidad de carga)
○ Estabilidad: T, pH, fuerza iónica, tipo de solvente, agentes químicos.
○ Volatilidad, solubilidad, etc.
● Requisitos del producto. Ej: pureza, presencia de pirógenos u otras impurezas.
● Valor o precio de venta. Etanol por ej, precio no muy alto, las etapas de purificación
no pueden ser muy caras.
Normalmente los productos se encuentran en bajas concentraciones al final de la etapa de
producción. Inicialmente se encuentran en caldos o dentro de la célula, donde también se
encuentra una gran variedad de otros compuestos. Por lo que una parte importante será
concentrar la solución en el producto buscado.
Características del medio
● Propiedades reológicas: viscosidad.
● Características de los componentes presentes: tamaño, densidad, etc. Refiere a todo
aquello que no es nuestro producto de interés por ejemplo: residuos de sustratos,
otros metabolitos, materiales lipídicos, antiespumante, proteínas, ADN, etc.
Características ideales de las operaciones unitarias
● Alta selectividad y recuperación de producto.
● Buena capacidad de reducción de volumen. El producto se va concentrando, y
además al reducir el volumen se van a necesitar cada vez equipos más chicos.
● Alta reproducibilidad. Que si repito las mismas condiciones en otras situaciones se
puedan obtener los mismos resultados.
● Robustez: capacidad de tolerar variaciones en las condiciones de producción sin
perder efectividad.
● Bajo consumo de energía.
● Bajo costo
Secuencia de operaciones
Diseño:
Reglas Huerísticas
I. Remover primero las impurezas presentes en mayor cantidad y las impurezas más
fáciles de remover.
II. Realizar las separaciones más caras y más difíciles al final.
III. Seleccionar procesos que hacen uso de las mayores diferencias de propiedades de
los productos y de las impurezas.
IV. Seleccionar y secuenciar operaciones que hagan uso de diferentes fuerzas motrices
y de separación.
Etapas de separación
Acondicionamiento del caldo
Se utiliza para estabilizar el producto o su actividad y/o facilitar posteriores etapas. El tipo
de pretratamiento depende del producto y las posteriores etapas a realizar.
● Tratamiento térmico/Ajuste de T. El cambio de temperatura puede generar que se
produzcan coágulos grandes que puedan facilitar las separaciones posteriores.
También el cambio de temperatura puede ser útil para mantener la actividad del
producto.
● Tratamiento químico (pH, floculantes)
Centrifugación:
Se puede usar tanto para sólido-líquido como para líquidos inmiscibles.
○ Centrífugas de sedimentación: se basan en la diferencia de densidad de dos
fases
○ Centrífugas de filtración
Filtración
Separación de gran parte de los sólidos presentes en una mezcla líquido-
sólido, forzando el pasaje del fluido a través de una capa porosa.
Clarificación: cuando se hace pasar la corriente con baja carga de sólidos
por el filtro y el sólido queda retenido en la parte superior.
Si se tiene una alta carga, no se va a poder usar la misma forma de filtrar
porque se va a “acolmatar” tapar el filtro y no va a permitir seguir el flujo.
Lo que se puede usar entonces es el filtrado en torta.
Filtración tangencial. Orientaciones paralelas del filtro con el flujo, se
generan dos corrientes: una de filtrado y otra de retenido.
Filtros prensa
Como se mencionó previamente, la filtración en torta es utilizada para los medios con alto
contenido de sólidos. Uno de los equipos a nivel industrial que usa este tipo de filtración son
los filtros prensa.
● Método simple, bajo costo.
● Se obtiene una torta seca. Mezcla de biomasa con tierras diatomeas, no es útil si lo
que interesa es la biomasa.
● Puede estar automatizado o no.
● Posibles pérdidas (líquidos, solventes) - desventaja.
Filtro rotatorio a vacío
Filtros continuos rotatorios o filtros rotatorios a vacío son usados a gran escala. Útil para
sólidos altamente compresibles. Ampliamente utilizados en procesos biotecnológicos.
Útil para separar células grandes por ej levaduras y hongos.
Filtración tangencial
Se tiene un determinado tamaño de poro. Aquellas partículas que tengan un menor tamaño
del mismo podrán pasar a través de él y quedar retenidos en la corriente de permeado,
mientras que las partículas más grandes no pasan y quedan en la corriente de filtrado.
Para el caso de la filtración normal a
medida que se aumenta el volumen de
filtrado la velocidad disminuye porque se
acumulan más partículas sobre el filtro,
resultando en un volumen a partir del
cual no se puede continuar filtrando
(existe un volumen limitante).
En el caso del filtro tangencial existe un
período en el que se estabilizan las
condiciones de filtrado y luego se
mantiene la velocidad del flujo casi
constante por un largo período. El flujo
barre la membrana y permite que no se
sature de sólido, permitiendo una operación más prolongada.
Características de las membranas:
Material:
● polimérico: ej. acetato de celulosa, nylon, politetrafluroetileno (PTFE), polisulfona,
etc.
● inorgánico: ej. cerámica
Selección del tipo de material dependerá de: interacciones del producto con membrana,
estabilidad mecánica, estabilidad química (limpieza), velocidad de flujo, esterilización, costo.
NMWC (nominal molecular cut-off): Las membranas se caracterizan por un tamaño de corte
según la masa molecular en base a soluto soluble que es retenido en un 90% por la
membrana.
Equipos usados en bioprocesos:
- En espiral
- Plana
- Fibra hueca.
Con el uso de membranas se puede:
- Clarificar
- Concentrar
- Diafiltrar: Se usa para lavar soluciones previamente concentradas, cambios de
solvente o cambios de buffer.
Disrupción celular
En el caso de que el producto esté retenido en la célula, interesará romper la estructura
celular con el objetivo de extraer los productos biológicos de interés que no son secretados
por la célula naturalmente.
Se debe obtener un extracto celular que pueda ser manipulado eficientemente en un
proceso downstream sin que se produzca la inactivación o degradación del producto de
interés.
La elección del tipo de método a utilizar para la separación va a depender de:
- tipo celular
- características del producto
- localización celular
Métodos mecánicos:
Son muy usados a escala industrial. El ultrasonido se restringe a procesos de menor escala
debido al calor que se genera en este proceso y que es difícil de remover. Los molinos y el
homogenizador son los más usados a mayor escala.
Molino a bolillas de alta velocidad
Las células (4-20% sólidos) se mezclan con pequeñas perlas de
vidrio o metal y se agitan en una cámara que tiene un eje rotativo
con agitadores en su centro. Mecanismo: compactación, fuerzas
de corte, transferencia de energía de las perlas a las células.
● Stress: alto. Es lo que permite su ruptura total.
● Costo: bajo
Homogeneizador de alta presión
La suspensión celular (5-15% de sólidos) es presurizada y forzada
a través de una válvula de orificio restringido, chocando a la
salida contra un anillo de impacto.
La disrupción está relacionada con la brusca caída de presión a
través de la válvula, pero el mecanismo es complejo y es una
combinación de efectos, en el que también influye el choque. En
caso de ser necesario se puede recircular.
● Costo moderado. Por trabajar a altas presiones.
Generación de debris celular para ambos casos de ruptura mecánica : una vez que se
rompe la célula, el debris se refiere a los pedazos de material celular que quedan en
suspensión. Lo mejor es que sea lo suficientemente grande. Si rompo todas las células
puedo generar un debris celular muy chico que puede dificultar las etapas posteriores. Por lo
que muchas veces se busca el compromiso entre un debris celular que sea fácilmente
removible y en condiciones que permitan una buena liberación del producto de interés.
Por este motivo usualmente se utilizan métodos combinados. Un método químico que
permita una estructura más debilitada para que en el método mecánico no se tenga que
recurrir a condiciones muy drásticas que generen un debris celular difícilmente removible.
Recuperación y concentración del producto:
Extracción
Se basa en la diferencia de solubilidad del compuesto en dos fases:
Coeficiente de partición (K)
De acuerdo al coeficiente de partición que se tenga va se va a ver que tan efectivo puede ser
este método.
Para una separación eficiente generalmente se requiere un proceso en múltiples etapas.
Criterios para la selección de solvente:
● Coeficiente de partición del producto
● Selectividad
● Facilidad de recuperación
● Densidad
● Estabilidad para el soluto
● Inocuo
Tipos de solvente:
- Solventes orgánicos (un solvente no miscible con el agua para que se puedan formar
dos fases)
- Sistema de dos fases acuosas: conteniendo polímeros incompatibles como
polietilenglicol (PEG) y dextrano, o PEG y fosfato de potasio. Las fases contienen
75% agua, pero son inmiscibles. Utilizado para: proteínas, y separación debris
celular.
ADSORCIÓN
Reparto de un soluto entre una solución y un sólido con elevada área superficial. El sólido
pueden ser fibras o resinas de intercambio iónico. Se aplica para:
● Eliminar sustancias no deseadas del caldo de fermentación (compuestos
coloreados)
● Adsorber un producto para concentrarlo al ser extraído del medio.
● Separar solutos por adsorción selectiva
Características:
➔ Generalmente buena selectividad, adecuado para escalado.
➔ Materiales orgánicos: resinas de intercambio iónico, derivados de celulosa y
dextranos, carbón activado.
➔ Materiales inorgánicos: sílica, alúmina, bentonita.
➔ Operación batch o continua en columnas empacadas.
PRECIPITACIÓN:
Inducida por uno o varios métodos:
1. Enfriamiento
2. Agregado solventes: etanol , acetona. Por ej para proteínas.
3. Precipitación isoeléctrica (pH carga neta 0)
4. La solubilidad es reducida por adición de sales (salting out)
5. Polímeros no iónicos (ej. PEG) y polielectrolitos.
6. Método ampliamente utilizado en la recuperación/ concentración de proteínas.
Etapas de Purificación
CROMATOGRAFÍAS
Separación de componentes basado en la diferencia de afinidad de los solutos por una fase
móvil y una estacionaria.
Técnica de alta resolución utilizada para productos que requieren alta pureza
(farmacéuticos).
CRISTALIZACIÓN
Usualmente es el último paso en la producción de productos con alta pureza. Opera a baja
temperatura. Las operaciones se conducen con altas concentraciones, y por lo tanto los
costos son bajos y el factor de separación alto.
Diseño de separación de producto
Criterios para la elección de operaciones unitarias de separación:
1. Localización del producto
2. Características fisicoquímicas del producto
3. Características fisicoquímicas del caldo fermentado
4. Economía de la separación
Caso 1: Ácido cítrico
1. Producto extracelular
2. Características del producto:
○ Molécula pequeña : 192.124 g/mol
○ Fórmula química : C₆H₈O₇
○ Ácido orgánico : tres grupos carboxilos
○ Soluble en agua (133 g/100 ml a 22 °C).
○ Sales de citrato: Ca3(C6H5O7)2 (0.095 g/100 ml a 25 °C)
○ Temperatura de descomposición : 175°C
3. Características del caldo: medio acuoso, ácido, diluido, células
4. Economía del proceso:
- Se quiere al final un sólido cristalizado
- Producto de bajo costo
Caso 2: Zeaxantina
1. Producto intracelular (Mezcla con β-criptoxantina y β-caroteno)
2. Características:
- Molécula pequeña : 568.4 g/mol
- Fórmula química : C40H56O2
- Carotenoide: 9 dobles enlaces conjugados
- Soluble en solventes orgánicos (metanol, acetona)
- Termolábil
- Sensible a la luz y al oxígeno
3. Características del caldo: Medio acuoso, diluido, residuos de sustratos, células
4. Economía del proceso:
- Presentación final: biomasa inactiva o sólido cristalizado
- Producto de medio costo o alto
En este caso como el producto es intracelular nos quedamos con la biomasa. La
centrifugación es útil porque son células relativamente grandes y sedimentan bien.
Producto soluble en solventes orgánicos entonces se usan solventes orgánicos, cuanto
menos agua tengamos en el medio mejor.
● Etapas de disrupción y extracción simultáneas.
● Se separa el debris celular y nos quedamos con el extracto con solvente orgánico.
● Evaporación a vacío por ser producto termolábil.
● Se obtiene un producto como mezcla de los 3 carotenoides.
Si se quisieran vender productos puros se podrían agregar etapas de: cromatografía en fase
reversa.
