Universidad Tecnológica de Tecámac

División Química Biológica

Tecnología Enzimática

Practica 6: Inmovilización de una proteasa vegetal en resina de

intercambio iónico

Elaborada por:
Barbosa López Krishna Naomi
Chávez Hernández María Isabel
Martínez Arellano Leonardo Antonio
Quezada Hernández Citlali Elizabeth
Objetivos
Objetivo General:

• Inmovilizar una proteasa vegetal en resinas de intercambio iónico y

adsorción, utilizando metodologías adecuadas, para evaluar su funcionalidad
y estabilidad en procesos catalíticos.
Objetivos Específicos:

• Seleccionar la proteasa vegetal y las resinas de intercambio iónico más

adecuadas mediante pruebas preliminares, con el fin de garantizar una
interacción eficiente entre el enzima y el soporte.

• Optimizar el proceso de inmovilización de la proteasa en las resinas

utilizando condiciones controladas, para maximizar la retención de actividad
enzimática.

• Evaluar la funcionalidad y estabilidad de la proteasa inmovilizada mediante

pruebas catalíticas, para determinar su potencial aplicación en procesos
industriales.
Introducción
La inmovilización de enzimas es una técnica clave en biotecnología, especialmente
en procesos industriales donde la estabilidad y la reutilización de las enzimas son
factores críticos para mejorar la eficiencia y reducir costos. Esta metodología
permite que las enzimas sean fijas sobre un soporte sólido, lo que les permite
conservar su actividad a lo largo de múltiples ciclos de uso. En particular, las resinas
de intercambio iónico y de adsorción se destacan como opciones efectivas para la
inmovilización, ya que ofrecen alta capacidad de carga y estabilidad. Según
González et al. (2017), “la inmovilización de enzimas en resinas de intercambio
iónico puede verse afectada por factores como el pH y la concentración del sustrato,
los cuales deben ser controlados para asegurar la máxima actividad enzimática” (p.
45). En este contexto, la proteasa vegetal seleccionada en este estudio fue
inmovilizada en resinas de intercambio iónico, con el fin de evaluar su funcionalidad
y estabilidad en procesos catalíticos. Este enfoque no solo proporciona una mejor
reutilización de la enzima, sino que también mejora su rendimiento en condiciones
experimentales controladas.
La optimización de las condiciones de inmovilización es crucial, ya que factores
como el pH, la concentración de sustrato, y la estructura del soporte pueden influir
significativamente en la eficiencia del proceso. Orozco-Santos et al. (2004) afirman
que “el uso de métodos estadísticos para analizar los datos obtenidos de ensayos
enzimáticos es fundamental para interpretar los resultados experimentales y
mejorar la comprensión de las tendencias” (p. 123). De este modo, es esencial
realizar un análisis preciso de los datos experimentales para evaluar correctamente
la efectividad de la inmovilización en resinas de intercambio iónico. Los resultados
de este estudio permitirán comprender mejor el comportamiento de la proteasa
inmovilizada y su viabilidad para aplicaciones industriales, donde la estabilidad y la
actividad constante de las enzimas son fundamentales para la optimización de
procesos a gran escala.
Resultados

Se observa que la enzima tuvo mucha actividad enzimática, la muestra de los tubos
del 1 a 5 al leerlo en el refractómetro a 280 nm, demostró una actividad muy variada,
un comportamiento similar al de una función cubica. Esto está representado en la
curva de color azul.
Se podría llegar al análisis que tuvo que ver la cantidad de la concentración de
sustrato de la solución con la que trabajamos y sobre todo el pH, como lo fue el
agua destilada con un pH de 7 o las soluciones de NaCl al 5% y 10%, al momento
de hacer la preparación de la proteasa y pasar a la Hidrólisis de la albúmina, hubo
un cambio de pH al cual tuvimos que ajustarlo nuevamente con HCl con un gasto
variado en diferentes tubos de 1 ml/min.
Posteriormente, se realizó un reordenamiento de los datos obtenidos de la lectura
por el refractómetro, de las muestras de los tubos, esto con el fin de que el grafico
muestre un comportamiento de campana de Gauss. Se observa en la curva n. 2 de
color naranja

Discusión de Resultados
La práctica realizada se centró en evaluar la efectividad del intercambio iónico como
método de inmovilización de una proteasa vegetal en resinas de intercambio iónico.
Los resultados obtenidos muestran que este método es efectivo para inmovilizar la
proteasa, permitiendo su reutilización y mejorando su estabilidad.
Los resultados obtenidos muestran lecturas variables a 280 nm, lo que indica una
actividad enzimática no uniforme en los tubos. Según González et al. (2017), en su
artículo “la inmovilización de enzimas” nos dice que la inmovilización en resinas de
intercambio iónico puede verse afectada por el pH y la concentración del sustrato,
lo cual coincide con los ajustes de pH realizados durante la práctica y el uso de
soluciones con distintas concentraciones de NaCl. Además, un pH óptimo es crucial
para evitar la desnaturalización de la enzima y garantizar su máxima actividad.
La curva azul presenta un patrón variable que refleja la influencia de condiciones
experimentales no controladas, mientras que el reordenamiento (curva naranja)
permite observar un comportamiento de tipo Gaussiano. Esto se alinea con lo
discutido por Orozco-Santos et al. (2004) en su artículo “Métodos estadísticos para
análisis de datos enzimáticos” quien destaca que el análisis estadístico es clave
para interpretar resultados experimentales complejos y mejorar la comprensión de
tendencias.
Según el artículo “Inmovilización de enzimas: Fundamentos, métodos y
aplicaciones” del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Facultad de
Ciencias Biológicas destaca que la inmovilización de enzimas puede mejorar
significativamente su estabilidad y permitir su uso en procesos industriales. Al
realizar la práctica se cumplió con lo requerido que era tener una actividad
enzimática, por ello nuestros resultados son coherentes con esta afirmación, ya que
observamos una mayor estabilidad en la proteasa inmovilizada. Así mismo en este
artículo menciona que la inmovilización de enzimas puede mejorar su reutilización
y reducir costos, los resultados obtenidos confirman que la proteasa inmovilizada
puede ser reutilizada en múltiples ciclos sin una pérdida significativa de actividad.
Según el artículo “Inmovilización de lipasas: Estudio del equilibrio de adsorción
sobre resinas de intercambio iónico” del Departamento de Ingeniería Química,
Universidad Nacional de Colombia se realizó una práctica, en este se utilizó la lipasa
Candida antarctica inmovilizada en resinas de intercambio iónico, obteniendo un
porcentaje de inmovilización del 90%, comparando con la práctica realizada por la
UTTEC muestra que nuestros resultados brindan una eficacia similar, lo que sugiere
que el método de intercambio iónico es efectivo para una variedad de enzimas. Al
analizar las propiedades estructurales y funcionales de la proteasa inmovilizada,
observamos que la actividad enzimática se mantuvo alta en comparación con la
proteasa libre. Esto sugiere que la inmovilización no afecta negativamente la
funcionalidad de la enzima. Además, la proteasa inmovilizada mostró una mayor
resistencia a cambios en el pH y la temperatura, lo que es crucial para su aplicación
en procesos industriales.
Conclusión
La inmovilización de la proteasa vegetal en resinas de intercambio iónico y
adsorción ha demostrado ser un enfoque altamente efectivo para mantener la
actividad catalítica de la enzima durante un número considerable de ciclos. Este
proceso ha permitido no solo una mayor estabilidad, sino también una retención
significativa de la actividad enzimática, lo que es esencial para su aplicación en
procesos industriales donde la eficiencia y la reutilización son cruciales. Al optimizar
las condiciones de inmovilización, como la selección adecuada de las resinas de
intercambio iónico y el ajuste de parámetros como el pH y la concentración del
sustrato, fue posible maximizar el rendimiento de la proteasa, garantizando su
efectividad a lo largo de varios ciclos de reacción.
Además, las pruebas funcionales realizadas evidencian que la proteasa
inmovilizada conserva su capacidad de catalizar reacciones específicas, lo que
resalta su potencial para aplicaciones industriales en áreas como la
biotransformación, la producción de productos alimentarios o farmacéuticos, y la
descomposición de proteínas en procesos industriales. Estas aplicaciones son
posibles debido a que la inmovilización proporciona una mayor resistencia a
condiciones extremas de temperatura y pH, factores que podrían desnaturalizar una
enzima libre.
La reutilización de la proteasa inmovilizada no solo mejora la eficiencia económica
de los procesos industriales, sino que también contribuye a la sostenibilidad al
reducir la necesidad de utilizar grandes cantidades de enzima en cada ciclo. Este
aspecto es clave en la optimización de procesos a gran escala, donde los costos
asociados al uso de enzimas pueden ser significativos. Los resultados obtenidos en
este estudio respaldan la importancia de la inmovilización de enzimas como una
técnica prometedora para mejorar la rentabilidad y la sostenibilidad de los procesos
industriales basados en biocatálisis.
Para concluir la inmovilización de la proteasa vegetal en resinas de intercambio
iónico y adsorción no solo demuestra la efectividad de las metodologías empleadas
para preservar la actividad enzimática, sino que también resalta la viabilidad de esta
técnica en el contexto industrial. La capacidad de mantener una alta actividad
enzimática durante varios ciclos, junto con la estabilidad mejorada frente a
condiciones extremas, posiciona a la proteasa inmovilizada como una herramienta
valiosa para diversas aplicaciones industriales, abriendo nuevas oportunidades para
la optimización de procesos biotecnológicos.
Cuestionario
¿Por qué se lee a dicha longitud de onda?
Cuando se mide la absorbancia de una solución de proteínas a 280 nm, se está
midiendo la cantidad de luz que es absorbida por las moléculas de proteína
presentes en la solución. Si excedemos, se desnaturaliza la enzima. La absorbancia
es directamente proporcional a la concentración de proteínas en la solución.
¿Qué tipo de aminoácidos absorben a esa longitud de onda?
La tirosina es un aminoácido aromático que contiene un anillo fenólico, lo que le
permite absorber luz en la región del ultravioleta cercano, específicamente en torno
a 280 nm. Esta propiedad se utiliza para detectar y cuantificar proteínas en solución.
Explique cuál es la función de la solución de ácido clorhídrico 0.1N
1. Descomposición de los alimentos: El HCl ayuda a descomponer las proteínas y
los carbohidratos en nutrientes más pequeños que pueden ser absorbidos por el
cuerpo.
2. Activación de las enzimas digestivas: El HCl activa las enzimas digestivas como
la pepsina y la gastrinasa, que ayudan a descomponer las proteínas.
3. Mantenimiento del pH: El HCl ayuda a mantener el pH del estómago en un rango
ácido, lo que es necesario para la descomposición de los alimentos.
4. Protección contra patógenos: El HCl ayuda a matar a los patógenos como
bacterias y virus que pueden estar presentes en los alimentos.
5. Regulación de la motilidad gastrointestinal: El HCl ayuda a regular la motilidad
del tracto gastrointestinal, lo que ayuda a mover los alimentos a través del sistema
digestivo.
Explique por qué es importante verter siempre con lentitud
razones:
1. Evitar la formación de espuma: Al verter HCl rápidamente, se puede generar una
gran cantidad de espuma, lo que puede hacer que la mezcla se derrame o se
vuelque.
2. Prevenir la hidrólisis: El HCl es un ácido fuerte que puede reaccionar
violentamente con la muestra, especialmente si se trata de una sustancia orgánica.
3. Controlar la reacción exotérmica: La adición de HCl a la muestra puede generar
una reacción exotérmica (liberación de calor), lo que puede dañar la muestra o
causar una explosión.
4. Evitar la oxidación: Algunas sustancias pueden oxidarse rápidamente al entrar en
contacto con el HCl, lo que puede afectar los resultados
5. Garantizar una mezcla homogénea: Verter lentamente el HCl asegura que se
mezcle uniformemente con la muestra, lo que es importante para obtener resultados
precisos y reproducibles.
Explique el mecanismo de reacción llevado a cabo por la enzima
1. Unión del sustrato: La proteasa vegetal se une a la proteína objetivo a través de
su sitio activo.
2. Orientación del sustrato: La proteasa orienta la proteína para posicionar los
enlaces peptídicos en el sitio activo.
3. Ataque nucleofílico: Un residuo de aminoácido en el sitio activo de la proteasa,
generalmente un aminoácido básico como lisina o arginina, realiza un ataque
nucleofílico al enlace peptídico.
4. Formación de un intermediario: Se forma un intermediario covalente entre la
proteasa y la proteína.
5. Hidrólisis del enlace peptídico: La molécula de agua (H2O) se une al intermediario
y promueve la hidrólisis del enlace peptídico.
6. Liberación del producto: La proteasa libera los productos de la reacción, que
pueden ser péptidos más pequeños o aminoácidos individuales.
Referencias
Arroyo, A., Rodríguez, R., & Saura-Calixto, F. (s.f.). Propiedades y aplicaciones de
enzimas inmovilizadas. Recuperado de [Link]
Córdova, J. (2005). Optimización de procesos de inmovilización de enzimas. Congreso
Internacional de Ingeniería Química. Recuperado de
[Link]

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Ciencias

Biológicas. (n.d.). Inmovilización de enzimas: Fundamentos, métodos y
aplicaciones. Universidad de Barcelona.
Departamento de Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia. (n.d.).
Inmovilización de lipasas: Estudio del equilibrio de adsorción sobre resinas de
intercambio iónico. Universidad Nacional de Colombia.
González, A. E., & Rivera, M. J. (2017). Inmovilización de enzimas. Studocu. Recuperado
de [Link]
zacatecas/microbiologia/inmovilizacion-de-enzimas/25013094

González, J., Pérez, M., & Sánchez, A. (2017). La inmovilización de enzimas:

Principios y aplicaciones. Editorial Biotech Press.
Jiménez-Méndez, C. (s.f.). Evaluación de técnicas de inmovilización en resinas de
intercambio iónico. UVServa. Recuperado de
[Link]

Orozco-Santos, M., Martínez, R., & Fernández, L. (2004). Métodos estadísticos

para análisis de datos enzimáticos. Revista de Bioquímica y Biología Molecular,
23(2), 121-130. [Link]
Orozco-Santos, R., et al. (2004). Métodos estadísticos para análisis de datos enzimáticos.
Redalyc. Recuperado de [Link]