C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.

4.6.- La propagación in vitro o micropropagación. -

¿QUÉ ES?
Es el cultivo en medio nutritivo, bajo condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones,
órganos, explantos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores.
La micropropagación "in vitro" de plantas es una técnica que utiliza pequeños trozos de
tejido o de órganos en condiciones asépticas, con el fin de conseguir nuevas plantas
idénticas a la planta madre.
Esto se consigue gracias a que las células de las plantas son "totipotentes", es decir, tienen
una capacidad latente para regenerar una planta nueva a partir de una única célula, de
manera que la nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre.
El cultivo in vitro permite entre otras muchas cosas una rápida propagación vegetativa de
las plantas, y una mejora del estado sanitario de las mismas.
El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la
metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere
decir "dentro de vidrio", es decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (pero
también de células y tejidos animales) dentro de recipientes de vidrio en condiciones de
ambiente controlado. En las siguientes secciones nos referiremos siempre al cultivo in vitro
aplicado a las plantas, omitiendo otros usos de esa técnica.

Material vegetal para micropropagación. -

Es un método de reproducción vegetativa totalmente aséptico que trata de eliminar la
variabilidad en la descendencia, que producen los métodos
de reproducción sexual.
Es de suma importancia este tipo de cultivo en
especies de plantas seleccionadas y de individuos que
presentan caracteres excepcionales, sobre todo con un
objetivo: la reproducción. Permite obtener un número
ilimitado de plantas a partir de una sola planta madre,
genéticamente idénticos entre sí e idénticos al material
de partida, exento de enfermedades víricas.
Proceso. - La aptitud para la multiplicación
vegetativa es variable según las especies. En cultivo "in vitro" esta aptitud se potencia mediante
el uso de medios nutritivos adecuados para cada cultivar y etapa de micropropagación. Es
necesaria también una correcta combinación de luz y temperatura y, sobre todo, una total
asepsia de medios, material vegetal y manipulación. Por ello, todas las operaciones deben
realizarse necesariamente en cabinas de flujo laminar que proporcionan un ambiente estéril al
microfiltrar el aire.
Se realiza en tubos de ensayo y el medio de cultivo es agua, sales minerales (macro y
micronutrientes), azúcares, compuestos orgánicos complejos como vitaminas, inositol... y
reguladores del crecimiento. Pueden utilizarse medios líquidos o adicionar un agente gelificante
tal como el agar para solidificarse. Una vez elaborados se esterilizan en autoclave.
La extracción del material vegetal de la planta madre se realiza con lupa binocular y
microescarpelo.
Es muy fácil la proliferación de microorganismos, patógenos vegetales o no, en los medios
de cultivo, lo que origina importantes pérdidas de plantas siendo uno de los mayores problemas
en la aplicación comercial de esta técnica.

Son varias las técnicas de multiplicación in vitro:

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 263

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

• MICROINJERTO: injerto in vitro de pequeños fragmentos de tallo con varias

yemas, cuyo desarrollo produce rápidamente una ramificación que puede injertarse de
nuevo.
• MULTIPLICACIÓN DE MERISTEMOS: los meristemos son tejidos primarios que se
obtienen de tallos y raíces, formados por células no diferenciadas o embrionarias, y
que proporcionan a la planta su crecimiento en longitud. Las proliferaciones de
meristemos in vitro permiten crear clones de yemas que pueden regenerar plantas
idénticas a la planta madre.
• DESDIFERENCIACIÓN: se trata de un método que se utiliza cuando no se pueden
aplicar ninguno de los dos métodos anteriores. Consiste en tratamientos a base de
fitohormonas que provocan, en fragmentos de órganos definidos, la proliferación de
células no diferenciadas, que forman masas de tejidos inorgánicos llamados agallas o
callosidades, a partir de las cuales es posible regenerar plantas completas.
• SEMILLAS SINTÉTICAS: En biotecnología, se denomina semilla sintética a un
embrión somático encapsulado. Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en
que el embrión es somático y no cigótico y que, si tiene endospermo y cubierta
seminal, éstos son artificiales.

Para obtener la regeneración de las plántulas es necesario preparar varios medios de

cultivo diferentes, hasta conseguir neoformaciones llamadas embrioides (comparables a los
embriones o semillas producidos por multiplicación sexual). A este proceso se le denomina
embriogénesis somática. Le sigue un proceso de automultiplicación de embrioides, que darán
lugar a infinidad de plantas. Esto se consigue en medios de cultivo con citoquinina (provoca la
formación de brotes). El siguiente paso es el desarrollo de jóvenes brotes de hojas, en medio
de cultivo con giberelinas. Cuando alcancen una talla suficiente, se aíslan y se colocan en otro
medio con auxinas, que induce a la formación de raíces. Se llega así a jóvenes plántulas bien
formadas que se pueden sacar de sus tubos para colocarlas en macetas con sustratos clásicos.
Transcurren unos 3 meses desde embrioide a plántula. Habrá que esperar a que florezcan
y fructifiquen para saber si las plantas responden al material de partida; si se parecen o son
idénticas a la planta madre. Las plantaciones deben partir de varios clones diferentes.

EL ENTORNO DEL CULTIVO

El estudio de cualquier fenómeno biológico en condiciones de laboratorio exige reproducir
de la forma más aproximada posible todos los factores que puedan incidir en el fenómeno
estudiado cuando este sucede en la naturaleza. Este principio general se aplica también al
cultivo in vitro de plantas.
Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el biotopo de la
planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza una
simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener
controlados.
Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solo una parte de él (explanto),
a la dificultad de reproducir las condiciones naturales se debe añadir la dificultad de
suministrar a la parte todo aquello que antes obtenía del sistema completo.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 264

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

En resumen, el cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control
absoluto del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explanto. Conviene,
por tanto, conocer cuales son los principales factores que conforman el ambiente del
explanto y que deberán ser controlados.
Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores no
biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro como:
• AMBIENTE QUÍMICO
o COMPOSICIÓN DEL MEDIO
o PH
• AMBIENTE FÍSICO
o TEMPERATURA
o LUZ Y FOTOPERÍODO

MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente
incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina
Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y
ocasionalmente con otras sustancias varias. Los nutrientes son esenciales para el
crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede
vivir niin vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las
plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en
estas condiciones (Tabla 1).
Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos
vegetales
Agua
Macro Micro
Sustancias orgánicas
elementos
Fe
Zn
Azúcares N B
Aminoácidos P Mn
Auxinas K Cu
Citoquininas Ca Ni
Giberelinas Mg Co
Acido abcísico S Al
Mo
I
Mezclas de sustancias poco definidas:
Extracto de levadura
Leche de coco
Extractos vegetales
Hidrolizados de caseína
Peptona y triptona

Figura 1. Conjunto de sustancias que pueden formar parte de los medios nutritivos, para
inducir el crecimiento y desarrollo (Pierik, 1987, modificado).

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 265

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la especie, e
incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté cultivando y a la
respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades específicas se han
desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivo .
El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente si el objetivo
es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio. El medio
B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo
de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en regeneración de plantas.
La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor concentración de nitratos en
B5. El medio WPM (1980) de baja concentración de sales está especialmente indicado para
especies leñosas.

PH
Cuando se prepara un medio de cultivo, después de añadir todos sus componentes, se
procede a ajustar el pH final al valor deseado, añadiendo OHNa o HCl al medio. Una vez
ajustado el pH se procede a esterilizar el medio.
El pH final del medio de cultivo es un factor importante por diversas razones:
• Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes
añadidos a los medios sólidos
• Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede producir
su licuación.
• El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de
cultivo
• El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por parte
del explanto (p.e. la absorción de iones NO3-aumenta con la acidez del medio)
• El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a
la actividad de muchos enzimas

Por todas estas razones conviene optimizar el pH del medio para cada caso en concreto. En
general, no obstante, en la mayoría de las situaciones se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 266

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una ligera acidificación durante el proceso
de esterilización en autoclave, para, después, evolucionar nuevamente durante el decurso
del cultivo, de forma que habitualmente se irá acidificando progresivamente como
resultado de la absorción diferencial de algunos componentes del medio de cultivo, así como
de la excreción de exudados por parte del explanto.
El control del pH inicial del medio y de su dinámica durante el cultivo tiene una gran
importancia en el desarrollo de cualquier proyecto de cultivo in vitro. A pesar de su
importancia, en muchos experimentos este control se limita a fijar su valor inicial sin
reparar en los posibles efectos de su dinámica.

LA TEMPERATURA

La temperatura a la que está expuesto el explanto cultivado in vitro afecta a la mayoría de

los procesos fisiológicos y por consiguiente es un factor fundamental a controlar.
En general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que se produce el
crecimiento óptimo. Este intervalo puede variar en función del genotipo, del órgano del que
se ha obtenido el explanto, de la época del año, de la edad de la planta madre, del
fotoperiodo, etc. Una complicación adicional se produce por el hecho de que puede existir
interacción entre la temperatura óptima de crecimiento y otros factores como la luz, la
composición del medio (p.e: en algunos casos se ha comprobado que se obtiene mayor
rendimiento haciendo fluctuar la temperatura según el fotoperiodo)
Determinar la temperatura óptima de crecimiento para cada cultivo in vitro puede ser un
proceso muy laborioso que, además, exige gran cantidad de cámaras de cultivo reguladas de
forma diferente. Afortunadamente, y para la mayoría de las situaciones, se pueden obtener
resultados satisfactorios con temperaturas de incubación que oscilan entre los 20 y 28 0C.
El control de la temperatura no es solamente importante porque pueda afectar al
crecimiento del cultivo sino también porque puede ser un factor que induzca determinados
procesos fisiológicos. Así, temperaturas bajas (del orden de 4-50C) permiten superar los
periodos de dormición de algunas leñosas y la conservación prolongada de determinados
cultivos in vitro; mientras que una temperatura constante de 20 0 C induce la formación de
raíces en la mayoría de las coníferas.

¿Como se controla?
El cultivo in vitro se realiza dentro de espacios denominados cámaras de cultivo, diseñados
para permitir el control del ambiente físico al que será expuesto el cultivo.

LA LUZ
La luz, definida como una forma de energía radiante que se nos manifiesta mediante la
visión es, en realidad, parte de un fenómeno físico más amplio: la energía radiante

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 267

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

(radiación), que puede ser descrito según dos modelos diferentes: el modelo ondulatorio
(radiación electromagnética) y el modelo corpuscular.
Los diferentes tipos de radiación electromagnética se pueden clasificar según sea su
longitud de onda, así podemos obtener un espectro electromagnético formado por las
diferentes longitudes de onda de la radiación electromagnética, que van desde los 10 -16 m
hasta los 104m. De todas estas longitudes de onda sólo las comprendidas entre 380 y 775
nm pueden ser percibidas por el ojo humano: ese conjunto de radiaciones es el que
denominamos luz en el lenguaje coloquial.
Como quiera que sólo una parte de la energía radiante (la luz y algunas de las radiaciones
infrarrojas y ultravioletas próximas) tiene influencia conocida sobre el desarrollo de las
plantas, a veces, se usa el término luz para referirse a ese conjunto de radiaciones cuando
en realidad se refiere al conjunto de radiaciones electromagnéticas con efectos
fisiológicos.
La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos
autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro.
Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:
• La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN
• La calidad de la luz: EL ESPECTRO
• La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO

LA IRRADIACIÓN
La cantidad de luz que incide sobre las superficies fotosintéticas de las plantas
determinará en gran medida la capacidad fotosintética de éstas. Esta cantidad de luz
puede ser medida de formas diversas, bien midiendo la iluminación de una superficie y
expresándola en lux (en realidad se trata de una unidad definida en términos de percepción
del ojo humano); o bien midiendo la irradiancia, es decir, la energía radiante que llega a una
superficie dada en un intervalo de tiempo.
Cuando el sensor del equipo con el que medimos la irradiancia está diseñado para detectar
solo las longitudes de onda comprendidas entre 400 y 700 nm, obtenemos una medida de la
radiación fotosintéticamente activa (PAR)
Se asume que las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las de la planta
in vivo, dado que el medio de cultivo contiene cantidades importantes de sacarosa, los
cultivos in vitro se comportan sólo parcialmente de forma autotrófica. Además, una
irradiación excesiva produciría un aumento notable de la temperatura dentro del recipiente
de cultivo debido al efecto invernadero.
La irradiación habitual en el campo es nociva en condiciones in vitro. Es habitual usar
irradiaciones mucho menores (un 10% o incluso menos del valor de plena insolación)

EL ESPECTRO
La luz es esencial para las plantas debido a que proporciona la energía necesaria para la
fotosíntesis. La clorofila y los demás pigmentos fotosintéticos captan la energía contenida
en diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas reacciones químicas que
constituyen el proceso. Pero la luz también puede intervenir en otros procesos fisiológicos,
como el fototropismo, la germinación, la floración, ...
Todos estos fenómenos no son producidos en igual medida por todos los tipos de luz
(radiaciones de cualquier longitud de onda) sino que algunas radiaciones concretas tienen un
efecto notable mientras que otras, tiene poco o ningún efecto. Es por ello por lo que es
preciso conocer el espectro de la radiación que es activo en el proceso fisiológico
estudiado. La cámara de cultivo deberá reproducir lo mejor posible ese espectro de luz

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 268

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

activo, por lo tanto, conviene conocer cuál es el espectro que emiten nuestras fuentes de
luz y en que medida se adapta éste a las necesidades de nuestro cultivo.
La tabla siguiente resume las principales fuentes de luz usadas en las cámaras de cultivo

Producen la luz por fenómenos de incandescencia del

filamento calentado por el paso de la corriente eléctrica.
LAMPARAS
Buena parte del espectro se halla en la zona del
INCANDESCENTES
rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad de calor y
mucho consumo de electricidad.
Producen la luz por fenómenos de fluorescencia del gas
sometido a un arco voltaico. El espectro de la luz
LAMPARAS
producida es rico en la zona del azul, existen
FLUORESCENTES
fluorescentes especiales con un espectro rico en la zona
azul y roja. Consumen menos electricidad.
Producen la luz por efecto del paso de la corriente
LAMPARAS DE VAPOR
eléctrica a través de gases calientes de mercurio (azul y
DE MERCURIO Y
verde) y sodio (naranja). Son altamente eficientes en el
SODIO
consumo de electricidad.

De todas ellas, son los fluorescentes las fuentes de luz más usada en las cámaras de
cultivo, aunque también se pueden encontrar, generalmente en instalaciones industriales,
lámparas de vapor.
LED
Se están realizando pruebas de cultivo in vitro con diferentes tipos de LED. Pruebas con
diferentes tipos de luz: blanco cálido (3000K), blanco natural (4000-5500K) y blanco frío
(5500-6500K) y diferentes intensidades 1 lux a 1500 luxes. Este tipo de proceso se realiza
aplicando luz sobre los cultivos durante muchas horas al día, por tanto, el ahorro en
consumo y mantenimiento, gracias a los LEDs, es muy relevante.
Otro factor importante, es mantener los cultivos a una temperatura determinada, en
cámaras climáticas. El bajo calor que radían los LEDs permite mantener la temperatura de
las cámaras de manera más constante y a menor coste.

EL FOTOPERIODO
Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración,
tuberización...) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la
planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in
vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el
mejor fotoperiodo in vitro

LA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo in vitro deben realizarse en
condiciones de esterilidad total para evitar la contaminación de los cultivos. Para disponer
de una superficie de trabajo estéril que no ponga en peligro la esterilidad de los cultivos se
usan las cámaras de flujo laminar.
Una cámara de flujo laminar es un receptáculo en forma generalmente prismática con una
única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de
trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace circular a través
del interior de la cámara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada para

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 269

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

eliminar toda partícula extraña. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la
cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presión interior sea
ligeramente superior a la presión exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro
hacia fuera y nunca al revés.
Según el grado de sofisticación de la cámara, puede disponer de elementos accesorios como
son: fuente de luz, lámpara de esterilización por U.V., pilotos indicadores de
funcionamiento diversos, contador de horas de funcionamiento, indicador de presión
interior, etc.
Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar según sea la forma en la que se hace circular
el aire: cámaras de flujo horizontal y cámaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se
produce desde el fondo de la cámara hasta el frente, de forma que las partículas se
mueven horizontalmente a la superficie de trabajo. En las segundas, el flujo se produce
desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partículas se mueven
perpendicularmente a ella.
De manera opcional se pueden instalar en ellas lámparas germicidas de UV. La luz
ultravioleta (UV) es efectiva contra la mayoría de los microorganismos bacterianos ya que,
a una longitud de 254 nm, destruye el ADN de los microorganismos. Con el equipo adecuado
se pueden limpiar y desinfectar las superficies, el agua y el aire.
La desinfección por UV no es un proceso químico y no produce ningún residuo.

Figura 1. Esquema de una cámara de flujo laminar horizontal

CÁMARAS DE CULTIVO
Una cámara de cultivo es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas
variables del ambiente físico. Habitualmente se pueden controlar la temperatura, la
iluminación y el fotoperiodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su
composición. Existen muchos modelos de cámaras de cultivo, en unos casos se trata de
espacios reducidos, frecuentemente móviles, mientras que en otros casos son verdaderos
recintos acondicionados para permitir el control del ambiente interior.
Figura 1. Cámara de cultivo tipo cubículo Figura 2. Cámara de cultivo tipo recinto

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 270

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Control de la temperatura
La temperatura de la cámara de cultivo viene afectada por: la temperatura ambiente de la
sala donde se sitúe y el calor generado por las fuentes de luz de que dispone.
El control de la temperatura a la que se desarrolla el cultivo in vitro se efectúa mediante
un sistema de refrigeración-calefacción controlado a través de un termostato. El sistema
de refrigeración-calefacción debe estar correctamente dimensionado a fin de conseguir
que la temperatura de la zona de cultivo se mantenga dentro de los límites deseados.
Para poder caracterizar adecuadamente el funcionamiento respecto de la temperatura de
una cámara de cultivo conviene conocer:
• La homogeneidad de temperatura: es decir la variación de la temperatura en
diferentes zonas de la cámara. Se puede aumentar la homogeneidad haciendo
circular el aire dentro de la cámara mediante un sistema de ventilación
• La estabilidad de la temperatura: es decir, una medida de la variación de la
temperatura de la cámara de cultivo a lo largo del tiempo
Todas las cámaras disponen de un programador que permite regular la temperatura a la que
está la cámara en cada momento

Control de la iluminación.
Las cámaras de cultivo disponen de una serie de unidades productoras de luz situadas de
tal forma que iluminen toda la superficie útil de la cámara. Las unidades productoras de luz
acostumbran a ser fluorescentes (ver luz) y pueden estar situadas de formas distintas:
• horizontales: la batería de fluorescentes se coloca sobre el techo (Figura 2) de
cada área de cultivo. Este sistema tiene la ventaja de que consigue una distribución
más uniforme de la luz en toda el área (Figura 2), pero tiene el inconveniente de que
calienta el techo y éste suele ser, a la vez, la base de otro nivel de cultivo, por lo
cual puede dar lugar a una distribución irregular de la temperatura.
• verticales: la batería de fluorescentes se coloca en los laterales (Figura 1) de la
cámara de cultivo de forma que producen una distribución más irregular de la luz en
el área de cultivo, pero generan menos problemas con la distribución del calor
Las reactancias necesarias para el funcionamiento de los fluorescentes se sitúan siempre
en el exterior de la cámara, para evitar que el calor generado por estas dificulte el control
de la temperatura. Por esa misma razón, cuando las cámaras de cultivo son del tipo cubículo
acostumbran a agruparse en salas especiales dotadas de un sistema de refrigeración propio
que permita un mejor funcionamiento del sistema de refrigeración de cada una de ellas.

Control del fotoperiodo

Además de la radiación luminosa recibida por el cultivo, otro factor a controlar es el
número de horas de luz diarias que recibe el cultivo (fotoperiodo). La regulación del
fotoperiodo se consigue mediante un programador (analógico o digital) conectado al circuito
de iluminación. El programador del fotoperiodo puede estar relacionado con el programador
de temperaturas, de forma que se puedan programar diferentes temperaturas según sea la
fase del fotoperiodo en la que se halle el cultivo

LA ESTERILIZACIÓN DE UTILLAJE Y MEDIOS

La esterilización, tanto del material y medios frescos, como de los medios ya usados que
haya sufrido contaminación, es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo in vitro.
Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos denominados
autoclaves. En situaciones especiales, como en el caso de que algún componente del medio
sea termolábil, puede usarse un sistema de esterilización por filtración.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 271

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

El autoclave.
El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de cultivo in vitro. En esencia,
un autoclave (Figura 1) es un recipiente en el que se consigue exponer el material a
esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua, gracias a aumentar la
presión.
Figura 1. Esquema de un autoclave

FUNCIONAMIENTO.
El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fases:
• FASE DE PURGADO. A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del
calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula
de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura
de esterilización.
• FASE DE ESTERILIZACIÓN. Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la
temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de
esterilización.
• FASE DE DESCARGA. Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la
resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presión y
temperatura del calderín empiezan a bajar poco a poco.
Hay que tener en cuenta algunas normas para una correcta esterilización del material:
• Para que la esterilización de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el
tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el líquido. Como quiera que la
transmisión del calor en el líquido de los recipientes se realiza de fuera hacia
dentro, es evidente que la eficacia del proceso dependerá del volumen de líquido. En
general, no conviene esterilizar juntos recipientes grandes y pequeños. En todo
caso la selección de la temperatura y tiempo se efectuará según sea el volumen de
los recipientes
• Los recipientes con cierre hermético deben ser introducidos en el autoclave sin
cerrar totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso.
Al vaciar el autoclave después de la esterilización procederemos a cerrar
totalmente estos recipientes.
• Los recipientes vacíos precisan de un tiempo de esterilización mayor que los
recipientes con líquido en su interior
• Hay que tener en cuenta que algunas substancias químicas son termolábiles a las
temperaturas de esterilización con autoclave. En esos casos es preciso utilizar
otros sistemas de esterilización, como el filtrado

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 272

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

Diagrama de flujo del proceso de preparación de un medio de cultivo a partir de soluciones
stock

Una vez escogida la formulación del medio de cultivo, se procede a su preparación

Se podrían pesar las cantidades necesarias de todos y cada uno de los componentes del
medio. Ello, no obstante, sería una operación larga y tediosa, además de muy imprecisa
puesto que obligaría a pesar algunas cantidades muy pequeñas. Por todas esas razones,
acostumbra a ser una práctica habitual en todos los laboratorios preparar soluciones stock
concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no se produzcan
fenómenos de precipitación. Es habitual trabajar con una solución stock de
macronutrientes, una de micronutrientes, una de hierro con un agente quelante, otra de
vitaminas y mio-inositol, así como con soluciones específicas para los demás componentes
del medio (reguladores, ...).
Proceder de esa forma simplifica la preparación del medio: un medio como el MS, que
contiene un total de 20 substancias diferentes, requeriría otras tantas pesadas, mientras
que a partir de soluciones stock su preparación se reduciría a cuatro medidas de volumen y
una pesada (sacarosa). Las soluciones stock pueden mantenerse durante un cierto tiempo en
la nevera o en el congelador.
Una vez obtenido el volumen de medio deseado se procede a ajustar su pH al valor
prefijado mediante la adición de OHNa y/o HCl 0.1-1 N. A continuación, dependiendo de que
se vaya a preparar un medio sólido o líquido, se añadirá en el primer caso el agente
solidificante, se fundirá por calentamiento breve para, finalmente, ser dosificado en los
contenedores adecuados. En el caso de tratarse de un medio líquido se procederá a
dosificar directamente en los contenedores escogidos. Tanto si es un medio sólido como
líquido se procederá a continuación a autoclavear los contenedores con el medio
(generalmente a 121 0C durante 20 minutos).
Conviene tener en cuenta que algunos de los componentes del medio de cultivo pueden ser
termolábiles (algunas vitaminas, algunos reguladores...). En este caso, la esterilización de la
solución que contienen la sustancia termolábil debe hacerse por filtración y añadirse una
vez esterilizada al medio de cultivo previamente esterilizado y parcialmente (en medios
sólidos) o totalmente (en medios líquidos) enfriado

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 273

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Preparación de 1 l de medio de cultivo MS

Para la obtención de 1 l de medio de cultivo MS a partir de soluciones stock, síganse los
siguientes pasos:
• Llenar un erlenmeyer de 2 l de capacidad con unos 500 ml de agua destilada
• Añadir 100 ml de solución stock de macronutrientes y agitar.
• Agregar 10 ml de solución stock de micronutrientes y agitar.
• A continuación, añadir 5 ml de solución stock de hierro y agitar.
• Agregar 5 ml de solución stock de vitaminas y agitar.
• Añadir 30 g de sacarosa y agitar hasta que se disuelva completamente.
• Verter el contenido en una probeta de 1 l y enrasar.
• Devolver la solución preparada al erlenmeyer, agitar y ajustar el pH para que se
encuentre entre 5,7-5,8.
• Añadir 2 g de gelrita, agitar y calentar la solución hasta que la gelrita quede
disuelta.
• Verter el contenido en los recipientes de cultivo y esterilizarlo (20 minutos a 121
ºC).
Cuando finalice el proceso de esterilización, dejar enfriar el material para que el medio
adquiera una textura gelatinosa.
En caso de trabajar con medio líquido, no se debe añadir la gelrita.
El medio de cultivo puede permanecer en buenas condiciones durante una semana si se
almacena a temperatura ambiente, y hasta un mes si se conserva a 4 ºC.

ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

La puesta en cultivo es un proceso que consiste en obtener material vegetal in vitro libre de
microorganismos, a partir de material vegetal ex vitro.
El paso previo y obligado para obtener el material vegetal libre de microorganismos es la
esterilización de la superficie de éste.
En general, el proceso de esterilización puede resumirse en los siguientes pasos:
• Lavado del material con agua corriente, para retirar restos de tierra u otras
partículas (opcional).
• Eliminación de las partes muertas e infectadas de la planta.
• Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al 80% durante unos
segundos.
• Sumergir la planta en una solución de hipoclorito de sodio (por ejemplo, al 1%) con
un agente humectante (por ejemplo, Tween 20 o Tween 80), durante 10-30 minutos.
La fuente más utilizada de hipoclorito de sodio es la lejía. Ésta contiene un 5% de
hipoclorito de sodio como agente activo. Para una mayor eficacia se recomienda
agitar la solución mientras dura el proceso.
• Enjuague del material con agua estéril para eliminar la solución de hipoclorito de
sodio. El enjuague debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele realizarse
en tres veces sucesivas de unos 2 minutos cada una.
Este proceso de esterilización presenta, principalmente, dos problemas: la capacidad de los
agentes esterilizantes para dañar los tejidos vegetales y la presencia de microorganismos
en el interior de dichos tejidos.
En el primer caso, se aconseja disminuir la concentración y/o tiempo de exposición a los
agentes esterilizantes. Con esta medida disminuyen los daños al material vegetal, pero
aumenta el porcentaje de contaminaciones.
En el segundo caso, el proceso de esterilización no tiene el efecto deseado puesto que los
microorganismos internos no se eliminan y pueden proliferar en el medio de cultivo.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 274

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Un producto alternativo al hipoclorito de sodio es el hipoclorito de calcio. Se presenta en

forma de polvo que se mezcla con agua a una concentración de 35-100 g/l. El material
vegetal debe permanecer sumergido entre 5-30 minutos y ser enjuagado con agua estéril al
finalizar.
Otro agente esterilizante es el cloruro de mercurio, el cual se disuelve en agua. El material
vegetal está en contacto con el producto durante 2-12 minutos, para ser enjuagado
concienzudamente con agua estéril al final del proceso. Este producto debe utilizarse bajo
medidas de seguridad, ya que es nocivo para la salud.

TIPOS DE CULTIVOS IN VITRO

El material vegetal con el que se inicia un cultivo in vitro puede ser cualquier célula, tejido u
órgano de la planta. Se puede partir de fragmentos de tallo, raíz, hoja, meristemos,
embriones, es decir de tejidos somáticos, pero también se puede iniciar a partir de células
o tejidos no somáticos: anteras, polen, microesporas, óvulos, etc. Según sea el explanto
utilizado se hablará de cultivo de secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de
polen, de embriones, etc.
Las condiciones de cultivo pueden pretender la proliferación desorganizada de las células
del explanto hasta dar lugar a un callo o incluso a un cultivo de células cuando se separan
éstas del callo. Si se elimina la pared celular de las células se obtiene un cultivo de
protoplastos.
En otros casos se puede pretender la regeneración de la planta completa (morfogénesis)
mediante la formación de raíces (rizogénesis) y/o de tallos. La morfogénesis se produce a
partir del explanto inicial mediante la formación de raíces y/o tallos en posición normal o en
posición no normal (adventicias/os). Sí la morfogénesis se produce después de la formación
de un callo, entonces se habla de morfogénesis indirecta, mientras que, si se produce
directamente del explanto sin que este pase por una fase de callo, entonces se habla de
morfogénesis directa.
Una situación particular surge cuando en el explanto se producen unas estructuras
bipolares que presentan las propiedades morfológicas de los embriones zigóticos. Estas
estructuras se denominan embriones somáticos. Según que estos embriones somáticos
surjan directamente del explanto o bien de un callo se habla de embriogénesis directa o
indirecta, respectivamente.

Figura 1. Tipos de cultivos in vitro. (modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant
biotechnology in agriculture. Open University Press, Wiley, Chichester, p 59

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 275

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

MICROPROPAGACIÓN
Micropropagar es el proceso de multiplicar plantas in vitro.
A través de la micropropagación, a partir de un fragmento
(explanto) de una planta madre, se obtiene una descendencia
uniforme en condiciones de asepsia.
Este proceso incluye varias fases:
• FASE 0: Preparación de la planta madre
• FASE I: Establecimiento del cultivo en condiciones de
asepsia
• FASE II: Multiplicación de brotes
• FASE III: Enraizamiento
• FASE IV: Aclimatación

FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE

Las plantas madre deben cultivarse en invernadero, controlando cuidadosamente las condiciones
de luz, temperatura, humedad relativa, estado nutricional y fitosanitario. Además, se suelen
someter a tratamientos específicos: aplicación de reguladores de crecimiento, etiolación... con
el fin de condicionar el crecimiento de las partes que van a ser empleadas en la iniciación. Para
poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un
nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es
recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre
unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en
condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperiodo y de la
irradiancia recibida.

FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA

De las plantas madre se toman unas pequeñas porciones de tejido que deben ser
desinfectadas para obtener, a partir de ellas, los explantos primarios,
usualmente yemas, ápices meristemáticos o meristemos, que serán colocados en
el medio de cultivo. Esta fase, que dura de 4 a 6 semanas, tiene como fin el
establecimiento de dichos desplantes en condiciones asépticas y su adaptación a
las condiciones del laboratorio.
Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas por
microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser
introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente
se introducirán en el medio a su vez estéril y se mantendrán allí en condiciones asépticas.
Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los
explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de
un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantos.
Figura 2. Esquema de la fase I del proceso de micropropagación

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 276

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Una vez que la primera fase se ha completado con éxito,
comienza la multiplicación de los explantos. El explanto
encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para
su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales,
azúcares, hormonas, etc). Tras un período de crecimiento (4-8
semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es
en este paso donde se produce la multiplicación de las plantas.
Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.
La multiplicación "in vitro" puede conseguirse por diversas
vías:
- Elongación de tallos y obtención de microesquejes.
- Producción de brotes axilares.
- Producción de brotes adventicios.
- Regeneración de plantas a partir de callos, cultivos celulares.
Sólo la producción de brotes axilares y adventicios se utiliza de un modo general en la
micropropagación comercial.
. Figura 3. Esquema del proceso de multiplicación de los brotes

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS

EXPLANTOS
Las plántulas producidas en la etapa anterior se colocan en un medio capaz se inducir la
elongación y, en casos, el enraizamiento. Durante esta etapa se incrementa la intensidad de luz
con el fin de preparar a las plantas para su próximo paso al exterior.
Normalmente la etapa dura de 4 a 6 semanas. Antes de llevar las nuevas
plantas al exterior es necesario proporcionarles una raíz con la que
sean capaces de realizar sus actividades vitales una vez que se
encuentren de nuevo en el medio natural. La inducción de estas raíces
se produce modificando ligeramente las características del medio de
cultivo adecuándolas para la generación de raíces.
Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

• ENRAIZAMIENTO IN VITRO
Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio
libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se
realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible a la
hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía
para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien
desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 277

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Figura 4. Fotografía de un cultivo en la fase de enraizado in vitro

• ENRAIZAMIENTO EX VITRO
Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente
estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.
Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de
organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que
deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para
enraizar y desarrollarse.
Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para
mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o
ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-
system" o "mist-system".

Figura 5. Fotografía de un cultivo en la fase de enraizado ex vitro

FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso
extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran
número de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo están en una atmósfera con alta
humedad y baja intensidad luminosa, por tanto, el tejido epitelial se caracterizará por
tener menos ceras que protejan a las plantas contra la deshidratación. El acondicionamiento
de nuevo al medio exterior se efectuará por tanto cuidadosamente, utilizando para ello
invernaderos.
Las plantas obtenidas son transferidas a un sustrato adecuado y cultivadas en invernadero. Es
necesario disponer de condiciones de elevada humedad relativa, temperatura alrededor de 25ºC
y baja iluminación

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 278

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera
que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
Figura 6. Esquema del proceso de aclimatación ex vitro

Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se
extraen los explantos de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer
en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una
humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosas para responder al
descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para evitar la desecación del explanto.
Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una
cutícula cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la perdida de agua a lo largo de
toda la superficie de la planta.
Figura 7. Fotografía de una zona de aclimatación

Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero
disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la
intensidad de luz.
Figura 8. Esquema de la finalización de la aclimatación ex vitro

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 279

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

El seguimiento de estas etapas es

esencial para algunas especies o
cultivares. Aunque en muchos casos la
iniciación de raíces ocurre fácilmente y
puede prescindirse de la etapa 3, que
ocurre simultáneamente a la 4 en el
invernadero. Los laboratorios
comerciales venden las plantas en los
estados 3, 4 y menos frecuentemente en
el 2.

PUESTA EN CULTIVO
En el cultivo in vitro se presentan dos situaciones diferentes respecto de la puesta en
cultivo:
• que los explantos procedan de un material no estéril
• que los explantos procedan de un material estéril
En el primer caso, se deberán preparar los explantos previamente esterilizados cortando
los extremos que hayan podido ser afectados por la sustancia esterilizante antes de
ponerlo en contacto con el medio de cultivo.
En el segundo caso, una vez obtenidos los explantos en el entorno estéril de la cámara de
flujo se procederá a ponerlos en contacto con el nuevo medio de cultivo.

RESUMEN: la multiplicación in vitro permite obtener de 200.000 a 400.000 plantas al año

de una sola yema terminal.
Tubo de ensayo con meristemo en medio de cultivo (1 mes)  brote: fragmentación  repicado
(4 ó 5 tubos)  4 ó 5 microesquejes en citoquinina  cada brote producirá nuevos brotes (10
meses)

 200.000 microesquejes (que se pueden almacenar en frío)  cultivo en giberelinas (1

mes) 

cultivo en auxina (1 mes)  plantitas enraizadas  plantación en maceta en invernadero

(2 meses)

 plantas autónomas  plantación en exterior (6 meses)  floración.

CULTIVO DE MERISTEMOS

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 280

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Es el cultivo in vitro del domo apical más los primeros primordios foliares.
El cultivo de meristemos es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y
es el material preferido para la conservación de germoplasma.
La razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el
meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van
contaminando a la planta. Existen otros factores:
• El meristemo apical tiene una mayor velocidad de crecimiento y en consecuencia el
virus "no alcanza" al meristemo.
• En una célula meristemática el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los
ribosomas, debido a que estás células tienen un código de trabajo muy definido.
• Existe una competencia por uso de algunos metabolitos entre células y virus.

Figura 2. Aspecto de una plántula

Figura 1. Sección de un meristemo apical de un
de ajo obtenida por cultivo de
tubérculo de patata visto al microscopio óptico
meristemos.

El tamaño óptimo a utilizar se decide tomando en cuenta dos factores: tamaño óptimo para
la liberación del virus y tamaño óptimo para facilitar el cultivo. Existe una mayor posibilidad
de obtener plantas libres de virus si sólo se aísla el meristemo, pero la posibilidad de que el
meristemo sobreviva sin primordios foliares es muy pequeña. Por otro lado, utilizar
meristemos más grandes (con más primordios foliares) hace que la probabilidad de obtener
plantas libres de virus sea pequeña.
De manera general se puede decir que los meristemos apicales tienen más probabilidad de
estar libres de virus que los meristemos axilares, y que si los meristemos provienen de una
planta en plena actividad hay mayor probabilidad de obtener plantas libres de virus.

Medio y condiciones de cultivo

De manera general, el medio de cultivo debe ser rico en elementos minerales, en particular
el potasio debe estar en un nivel alto para una mejor multiplicación vegetativa; desde este
punto de vista, el medio Murashige y Skoog es conveniente.
Los meristemos se cultivan generalmente sobre medio sólido, aunque en algunos casos se
utilizan medios líquidos (empleando puente de papel). El pH normalmente se sitúa entre 5,4-
6,0. El contenido de sacarosa es de un 2-4%. Frecuentemente se utilizan las siguientes
vitaminas: vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico y ácido pantoténico. Los reguladores que
se suelen utilizar en bajas concentraciones (0,1-0,5 mg l-1); son auxinas y citoquininas para
promover la división celular; el GA3 es mucho menos utilizado.
Los tubos con los meristemos se ponen bajo luz fluorescente (en general de 1,000 a 3,000
lux) - en ocasiones es necesario utilizar una irradiancia menor en los primeros días después
del aislamiento- bajo un fotoperiodo de 14-16 horas y a una temperatura de 23-25 oC.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 281

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

MICROPROPGACIÓN DE VIOLETAS AFRICANAS VERSUS

PROPAGACIÓN POR ESQUEJE.
INTRODUCCIÓN
La violeta africana (Saintpaulina ionantha) fue descubierta por el barón Walter von Saint
Paul St Claire en las montañas de Usambara, en la provincia del Cabo (Suráfrica), a finales
de siglo pasado. Cultivada por primera vez como planta de interior hará unos cincuenta
años, hoy es una de las plantas de flor de interior más populares. Inicialmente se
reproducía por semilla o, sobre todo, por esqueje foliar. Hoy la forma más habitual de
reproducirla es el cultivo in vitro de secciones de peciolo.
La producción de violetas africanas en diversos países da una idea de la importancia
económica de la micropropagación:
País n° de plantas año
Francia 1.5 x 106 1985
Países Bajos 4.0x106 1988
6
EEUU 1.5x10 1985

Datos de producción de Violetas

africanas por micropropagación
según Debergh y Zimmerman
En un experimento conducido por alumnos de secundaria, sin formación específica en
cultivo in vitro, se realizó una comparación (en términos esencialmente cualitativos) de los
dos sistemas de reproducción comercial de la violeta africana: el esqueje de hoja y la
micropropagación.

ESQUEMA DEL TRABAJO

MATERIAL Y MÉTODOS
Medio de cultivo
El medio de cultivo usado en este experimento fue MS con 2% de sacarosa (p/v) y una
combinación de BA y NAA de forma que se obtuvieron relaciones de citoquininas-auxinas
del 5:1, 10:1 y 50:1. Se ha denominado a estos medios Medio I, II, y III respectivamente.
Se solidificaron los medios con agar al 1% (p/v). El pH de la solución fue ajustado antes de
la esterilización a 5.7. Los medios así preparados fueron esterilizado a 121 °C durante 20'.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 282

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

BA (mg/l) NAA (mg/l) Ratio Citoquin./Auxin.

MEDIO I 0.1 0.5 5:1
MEDIO II 0.1 1.0 10:1
MEDIO III 0.1 5.0 50:1

Material vegetal
El material vegetal de partida fue violetas africanas obtenidas en un Centro de Jardinería.

Obtención de secciones.
Se separaron algunas hojas para ser lavadas con aguas jabonosas y aclaradas
posteriormente. A continuación, se procedió a seccionar las hojas obteniéndose trozos de
peciolo de 1.5 cm de longitud aproximadamente y trozos de limbo foliar de 1.5 cm de lado.

Esterilización del material vegetal

Las secciones obtenidas fueron esterilizadas dentro de un vaso de precipitados por
inmersión en una solución acuosa de lejía comercial al 20% (v/v) con Tween 20. La
esterilización se prolongó diez minutos, durante los cuales se sometió al recipiente a varias
agitaciones. Trasladado el vaso de precipitados al interior de la cámara de flujo, se
procedió a decantar la solución esterilizante y a efectuar tres aclarados con agua destilada
estéril.

Puesta en cultivo
Se recortaron los bordes de las secciones previamente esterilizadas para eliminar los
tejidos que pudiesen haber sido afectados por el tratamiento esterilizante, de forma que
se obtuvieron secciones de 1 cm2 aproximadamente. Cada una de las secciones obtenidas
fue introducida en un tubo de cultivo con 20 ml del medio a ensayar.
Se situaron los tubos de cultivo en una cámara de cultivo regulada a un Fotoperiodo de 16 h
y sin control de temperatura (por lo tanto, a temperatura ambiente: aprox 20-220C).

Propagación vegetativa
Con los restos de las hojas producidos en el experimento de micropropagación, se procedió
a semienterrarlos en los alvéolos de una bandeja de siembra llena de tierra para plantas de
interior. Se mantuvieron los esquejes en una habitación soleada hasta el final del
experimento.

Aclimatación
Al final del experimento se procedió a extraer los explantos que habían desarrollado tallos
adventicios, los cuales se seccionaron hasta aislar cada uno de los tallos. Se plantaron estos
tallos en una bandeja de siembra en la que se había dispuesto una mezcla de tierra de
jardinería y vermiculita, previamente esterilizadas. Se tapó la bandeja con un plástico
transparente y se mantuvo unos días en la cámara de cultivo para ser posteriormente
trasladada a las proximidades de la ventana y finalmente al exterior, agujereando
progresivamente la cubierta de plástico para facilitar la aireación de las plantas.
Cuando las plantas tuvieron el tamaño adecuado se transplantaron a un tiesto de mayor
tamaño.

Conclusiones
Como ya hemos visto, el experimento se planteó no tanto en términos cuantitativos sino en
términos cualitativos. Los objetivos que se pretendieron alcanzar eran: comprobar si es

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 283

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

posible desarrollar técnicas de cultivo in vitro con personas no experimentadas en este

campo y con escasos recursos materiales (alumnos de secundaria y laboratorio escolar), así
como comparar dos sistemas de propagación diferentes (in vitro y esquejes), también se
pretendió aprovechar el experimento para aproximar a los alumnos al método científico.

A pesar de que se planteó una comparación entre medios con diferente concentración de
reguladores, finalmente no se procesaron los datos puesto que el reducido número inicial de
tubos por tratamiento y tipo de explanto (en torno a 13) y las pérdidas de material vegetal
por contaminaciones (en torno de un 60%) redujeron el número de datos finales disponibles
a valores pequeños.

A pesar de ese hecho, al final del experimento se obtuvieron en la técnica in vitro 14 tubos
de cultivo viables, de los cuales, una vez seccionados en brotes con una sola yema terminal,
se obtuvieron 50 plántulas listas para la aclimatación. Desde el inicio del experimento hasta
que se dio por terminada la aclimatación, transcurrieron 90 días.

El experimento de propagación por esqueje foliar resultó menos problemático en lo

referente a las pérdidas por contaminación, pero mucho más lento, puesto que no se
obtuvieron plantas comparables a las plantas ya aclimatadas del experimento in vitro hasta
transcurridos 150 días. Las plantas obtenidas in vitro florecieron antes que las obtenidas a
partir de esqueje
GALERÍA DE IMÁGENES
MICROPROPAGACIÓN

Explanto en el que ya se aprecia la formación de yemas

adventicias a partir de la zona subepidérmica.

Detalle de la zona del explanto donde se está produciendo la

brotación de yemas adventicias

Detalle de los nuevos brotes que se están formando en el

borde del explanto

Aspecto de un tubo de cultivo en el que ya se aprecia

claramente la formación de nuevas hojas

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 284

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Aspecto del explanto una vez sacado del tubo de cultivo

Sección longitudinal del explanto anterior en la que pueden

observarse todavía los tejidos del explanto original y cómo
las nuevas hojas se han formado en la periferia del explanto

La gran cantidad de yemas adventicias formadas permite

subdividir el explanto en multitud de grupos de hojas con
una única yema terminal.

Aspecto de un grupo de hojas con una yema terminal única.

Aspecto de la bandeja de siembra con las nuevas plantas

obtenidas por micropropagación al inicio de la aclimatación

Aspecto de la bandeja de siembra con las nuevas plantas

obtenidas por micropropagación una vez terminada la
aclimatación

En esta fotografía podemos ver la violeta africana de la cual

se obtuvieron los explantos y dos de las violetas africanas
obtenidas por micropropagación. ¿Quién es la madre y
quiénes las hijas?

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 285

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Microinjerto

Injerto in vitro de pequeños fragmentos de tallo con varias yemas, cuyo desarrollo produce
rápidamente una ramificación que puede injertarse de nuevo.

Semillas artificiales
Se puede considerar tanto a la semilla cuyo embrión es obtenido in vitro, a partir del
cultivo de tejidos; como también a los brotes originados por cultivo de meristemas, y que
son utilizados en la propagación comercial de plantas. El objetivo del desarrollo de semillas
artificiales es producir plantas genética y morfológicamente tan similares como sea posible
(clones) a la especie de la cual derivan. Pueden ser embriones
somáticos, brotes del tallo (apicales o axilares), agregados
celulares (como el tejido calloso embriogénico no diferenciado) y
otros tejidos.
Este tipo de semilla combina los beneficios de la propagación
clonal, con los de la propagación y el almacenamiento de semillas.
Permiten el uso de embriones somáticos u otros tipos de
micropropagados como análogos de semillas, tanto en campos como en invernaderos, y su
siembra mecánica a nivel comercial.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 286

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

Compra de plantas producidas “in vitro”. -

Generalmente se precisa 1 año o más desde que se inicia el proceso de micropropagación
hasta que puede disponerse de un stock de planta suficiente para proceder a su venta. Debido a
ello y a sus altos costes, muchos laboratorios comerciales requieren un compromiso previo de
compra (de 6 meses a 1 año antes) para el suministro de plantas. Ello exige una mayor
planificación por parte de los cultivadores. Es posible obtener precios más bajos de compra
cuando el contrato se refiere a un suministro periódico del material vegetal.

Manejo de microplantas. -

Cuando se adquieren plantas al fin de la etapa 4 únicamente son necesarias las prácticas
normales de vivero. Se ha de tener en cuenta que, aunque las plantas micropropagadas están
libres de patógenos, no quiere decir que sean resistentes a los mismos, por lo que siempre será
necesario un buen control fitosanitario.

Si se adquieren microplantas en los estados 2 ó 3 hay que tener en cuenta que proceden
de condiciones de laboratorio. Las raíces, aunque existan, no son completamente funcionales, ni
tampoco el aparato fotosintético. Por ello se requieren cuidados especiales para su adaptación a
las condiciones del vivero:

- Tan pronto como se reciban las plantas deben sacarse de los recipientes y proceder a
su transplante. Durante toda la operación las plantas deben mantenerse en ambiente
húmedo y fresco.

- Eliminar cuidadosamente todos los restos de agar nutritivo de brotes y raíces,

lavando con agua a 20-25ºC. Clasificar las microplantas por tamaños si no son
uniformes.

- Repicarlas a bandejas, o multipots de 3 a 6 cm, con un sustrato ligero y estéril. Se

aconseja dar un riego de solución fungicida después de plantadas.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 287

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

- Las bandejas deben colocarse en invernadero sombreado (4.000 a 6.000 lux, con alta
humedad relativa (80-85%) y a la temperatura de unos 25ºC (mínima mayor de 20ºC y
máxima menor de 30ºC) y mantenerse durante 1 o 2 semanas en estas condiciones.
Durante las dos semanas siguientes se debe ir aumentando la luz, hasta llegar a
15.000 ó 20.000 lux) y el intervalo de humedad relativa del 50 al 100%, pero es
conveniente seguir manteniendo la temperatura por debajo de 32ºC. Estas
condiciones se consiguen usando camas calientes cubiertas con mallas de sombreo
móviles y niebla intermitente para elevar la humedad. Si no existe el riesgo de
elevadas temperaturas también pueden emplearse túneles de PE, siempre
manteniendo temperaturas inferiores a los 32ºC, pues en otro caso pueden producirse
importantes pérdidas de plantas.

- La fertilización debe iniciarse tan pronto como se instale el sistema radicular.

Normalmente se precisa de 1 semana en plantas con raíces y de 2 a 3 cuando las
microplantas carecen de ellas.

- Tras el periodo de adaptación, más o menos largo dependiendo de cada planta y del
estado en que se reciba, se inicia su adaptación gradual a las condiciones de cultivo.

Ventajas e inconvenientes del uso de microplantas para el cultivador.

El proceso de cultivo “in vitro” genera

unos costos considerables debido a los equipos
de laboratorio, consumo de medios de cultivo,
electricidad… y por requerir mano de obra
especializada. En muchos casos el precio de una
microplanta es mayor al de una planta de mayor
tamaño obtenida por propagación vegetativa
convencional.

Si el proceso se maneja correctamente, las plantas producidas “in vitro” presentan

importantes
Ventajas:
- Son plantas genéticamente uniformes y fisiológicamente juveniles, con lo que se logra
un crecimiento homogéneo, vigoroso, mayor ramificación y crecimiento más compacto.
- Debido al elevado potencial de multiplicación, permite la propagación rápida de
plantas difíciles o lentas de obtener por los métodos tradicionales, de nuevas
variedades o clones, y de variantes espontáneas o inducidas.
- Debido a os requerimientos de asepsia del método, las microplantas están en mejor
estado sanitario. Además, puede utilizarse el método para el saneamiento del material
vegetal y s producción de garantía sanitaria.
- Disponibilidad del material a lo largo de todo el año, independientemente de las
condiciones climáticas, incidencias de plagas o enfermedades…
- Los costos de envío del material son menores, debido al pequeño volumen ocupado por
las microplantas.
- Menores limitaciones a la expedición internacional, al existir mayores garantías
fitosanitarias.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 288

C.I.F.P. LA GRANJA. Heras (Cantabria) Módulo: Gestión y organización del vivero: U.T.4

- Permite al productor un considerable ahorro de espacio y energía necesarios para el

cultivo de plantas madre.

Inconvenientes:
- Necesidad de disponer de instalaciones adecuadas para la aclimatación de las
microplantas.
- Necesidad de planificar las adquisiciones con mayor antelación.
- Acortamiento de la vida comercial de los nuevos cultivares al permitir su rápida y
masiva comercialización.
- Mayores precios de coste.
- Peligro de contaminaciones en los laboratorios que pueden impedirle hacer frente a
sus pedidos en el plazo previsto.
- Aparición de variantes o mutantes, cuya frecuencia depende principalmente de la
estabilidad del genoma de la planta madre, del tipo y tamaño del explante inicial, de
los reguladores de crecimiento empleados y sus dosis, y del número de subcultivos
realizados.
- Anomalías en el crecimiento y desarrollo debidas al empleo abusivo de citoquininas en
la fase de multiplicación, tales como dificultad de enraizamiento, escaso crecimiento,
excesiva producción de ramificaciones o brotes basales, retrasos en la floración y
pérdida de calidad de las flores.

Aunque este tipo de multiplicación es teóricamente aplicable a todas las plantas, para
muchas de ellas aún no se han resuelto los problemas técnicos y para otras no resulta
económicamente competitiva, utilizándose en este caso para la propagación de nuevos cultivares,
proporcionar plantas madre sanas u otros fines
especiales.

La micropropagación resulta más fácil en

especies herbáceas que leñosas. Los posibles
problemas de cultivo derivados de una
incorrecta utilización de la técnica suelen ser
menores cuando se trata de plantas de hoja que
en el caso de plantas de flor.

Profesora: Mercedes Tarazona Vicario 289