MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGIA MÉDICA.

QFB-UMSNH

PRÁCTICA No. 5

“Perfil Reumático.”
(Proteína “C” Reactiva, Antiestreptolisina “O” y Factor Reumatoide)

PROTEÍNA “C” REACTIVA (PCR).

OBJETIVO.

Detectar la presencia de proteína “C” reactiva en el suero del paciente con proceso
inflamatorio.

INTRODUCCIÓN.

En 1930, Tillet y Francis reportaron una reacción de aglutinación que podía ser demostrada en
el suero de pacientes que padecían neumonía lobar y un extracto de polisacáridos
provenientes de cepas de Streptococcus pneumoniae.

El extracto neumocóccico era un carbohidrato denominado “C” y a la proteína humana selectiva

capaz de participar, se le denominó proteína “C” Reactiva (PCR).

Independientemente de la neumonía lobar, la PCR se ha asociado a una gran variedad de

enfermedades infecciosas, a procesos inflamatorios no infecciosos y a ciertos padecimientos
malignos.

La proteína C reactiva es sintetizada por los hepatocitos, es estimulada por las citocinas en
respuesta a infección o inflamación tisular, particularmente IL-1, IL-6 y TNF-α.

La PCR es una proteína anormal que aparece en sangre después de la fase aguda de distintas
enfermedades inflamatorias. Su nombre proviene de las circunstancias de que forma un
precipitado con el polisacárido somático “C” no especifico del S Streptococcus pneumoniae y
fue aislada y purificada por Avery y Mc Leod.

Al principio se creía que se trataba de un anticuerpo estimulado por la presencia del

Neumococo, lo que se desecha en la actualidad, por que aparece con frecuencias de forma
independiente a toda infección neumocóccica.

La demostración de los niveles elevados de PCR es una prueba no específica de inflamación,

la cual es virtualmente positiva en todas las infecciones agudas bacterianas, en algunos
estados neoplásicos y en varios tipos de destrucción de tejidos, como el infarto al miocardio.

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Algunos autores la consideraron como precursor de anticuerpos. Se sabe también que la PCR
puede aparecer en personas agammaglobulinémicas, dificultad de elaborar anticuerpos. Por
otra parte, el hecho de que desaparezca cuando la inflamación aguda cesa, antes de que
aparezcan anticuerpos, habla contra aquella presunción.

No es un anticuerpo genuino porque carece de la cualidad de este de originarse como

consecuencia del contacto de un organismo con un antígeno específico.

La PCR se encuentra presente en el suero de pacientes con distintos grados de actividad

reumática. Debe insistirse, sin embargo, en que su existencia ni es específica, desde que
puede aparecer como respuesta a otras condiciones inflamatorias. En pacientes reumáticos
tratados con corticoides, la positividad de la PCR reaparece cuando se interrumpe el
tratamiento y quizá por un mecanismo de rebote que dura algunos días. Si persiste la
positividad debe reanudarse aquél.

La prueba es usada frecuentemente para monitorear la actividad en pacientes con fiebre

reumática y artritis reumatoide.

La regresión del proceso inflamatorio es acompañada en forma general por un decremento en

los niveles séricos de PCR.

La elevación de la velocidad de sedimentación eritrocitaria (VSG) se acompaña de la presencia

de PCR, pero la elevación de esta ocurre antes de que el aumento en la velocidad de
sedimentación eritrocitaria, disminuyendo antes de que la VSG retorne a los niveles normales.

La PCR aparece en el suero en forma de complejo de glicoproteína.

Fundamento de la prueba de PCR.

La prueba de PCR látex se basa en una técnica desarrollada por Senger (1957). Las moléculas
inertes biológicamente de poliestireno látex son sensibilizadas con anti PCR, obtenida de
animales por medio de inmunizaciones. La PCR presente en el suero del paciente sirve como
antígeno y cuando el suero contenido PCR se mezcla con el látex sensibilizado se produce una
aglutinación detectable microscópicamente.

PRUEBA DE ANTIESTREPTOLISINAS “O” (ASO).

OBJETIVO.

Detectar los niveles de antiestreptolisina “O” en el suero de pacientes con infecciones por
estreptococos.

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INTERPRETACION.

La presencia de títulos altos de antiestreptolisina “O” ó ASO, indican una infección por
estreptococos beta-hemolíticos del grupo A (Streptococcus pyogenes), constituyen cerca del
95% de las infecciones en el hombre. Las infecciones son comunes en niños de edad escolar y
en raras ocasiones pueden dar lugar a serias complicaciones como, glomerulonefritis, fiebre
reumática, endocarditis bacteriana o escarlatina. Durante la invasión de los tejidos del paciente,
los estreptococos del grupo A y, algunas otras cepas de los grupos C y G producen sustancias
extracelulares de diferentes tipos. Una de las sustancias producidas es la estreptolisina “O” una
proteína lábil en presencia de oxígeno, que tiene actividad enzimática y es capaz de producir
hemólisis de los eritrocitos humanos y de conejo.

La elevación de ASO aparece a la semana de la infección, los valores más elevados se dan en
la tercera semana de la infección y es cuando pueden aparecer las enfermedades secundarias
a esta infección. Las ASO pueden permanecer elevadas a los 6 meses en el 30% de los casos.

Principio del método.

El ASO-látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección de anti-estreptolisina O,

en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con estreptolisina O (SLO) son
aglutinadas por anticuerpos ASO presentes en la muestra del paciente.

PRUEBA DEL FACTOR REUMATOIDE (FR).

OBJETIVO.

Detectar la presencia del factor reumatoide en suero de pacientes con diagnóstico de artritis
reumatoide y F. Reumática.

INTRODUCCIÓN.

El factor reumatoide (FR), es un anticuerpo circulante que reacciona con algunos componentes
inmunoglobulinas.
La especificidad de la reacción es variable, por lo regular, se identifican tres formas de reacción
específica:
1) Reacción a inmunoglobulinas extrañas (de conejo o caballo).

2) Reacción a inmunoglobulinas humanas (IgG humana desnaturalizada).

3) Reacción a inmunoglobulinas autologas (la propia IgG del paciente).

El FR por lo regular es un anticuerpo IgM (19S), que reacciona con uno o más de los antígenos
señalados. La producción de dicho factor es resultado de la respuesta por parte del huésped

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hacia uno o más determinantes antigénicos específicos presentes en sus propias

gammablobulinas.

El FR suele ser detectado por la aglutinación de partículas (eritrocitos o latex), recubiertos con
gammaglobulinas, también reacciona con complejos Ag-Ab; en casi todos los casos el FR (anti
IgM forma grandes complejos solubles con IgM in vivo, que al parecer son eliminados de la
circulación sin mayor daño tisular por acción del sistema reticuloendotelial).

En raros casos los complejos: FR-Inmunoglobulinas, son solubles a temperatura corporal, pero
se pueden precipitar en el suero por el frío (crioglobulina); los individuos que tienen
crioglobulinas muestran mayor propensión a sufrir lesiones secundarias (vasculitis), tal vez por
la presencia in vivo de complejos circulantes solubles.

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune crónico-degenerativa que se caracteriza

por la destrucción del cartílago articular y la inflamación de la membrana sinovial. Los pacientes
que padecen artritis reumatoide tienen con frecuencia anticuerpos circulantes, que pueden ser
IgM o IgG reactivos con las porciones Fc de las inmunoglobulinas G y, raramente Fab de sus
propias moléculas IgG. Estos anticuerpos se llaman Factores Reumatoides, y su presencia se
utiliza como una prueba diagnóstica de la artritis reumatoide y de otros desordenes reumáticos,
tales como el lupus eritematoso sistémico y el síndrome de Sjögren, pero su interés clínico
radica en el diagnóstico de la artritis reumatoide (RA).

Principio del método.

El FR-Látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección de factores reumatoides

(FR) en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con gamma-globulina humana son
aglutinadas por factores reumatoides presentes en la muestra del paciente.

MATERIALES.

• Kit de Reactivos para determinación de PCR

• Kit de Reactivos para determinación de ASO
• Kit de Reactivos para determinación de FR
• Aplicadores de palillo de madera o de plástico.
• Placas de aglutinación.
• Jeringa
• Torniquete
• Torunda de algodón
• Tubo rojo
• Tubo de ensaye

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NOTA: Los sueros control no requieren de alguna dilución y están listos para su uso, además
de revisar el inserto de trabajo.

METODOLOGIA.

Procedimiento cualitativo.

A) Para la recolección de la muestra, no se requiere ningún tipo de preparación del

paciente para obtener la muestra. La sangre se recolecta por punción venosa, se deja
de coagular y el suero se separa por centrifugación.
B) Separar suero tan pronto como se obtenga la sangre y conservar en refrigeración de 2
a 8 hasta realizar la prueba. Si dentro de las 72 horas no se efectúa la prueba debe de
congelarse la muestra.

NOTA: Los sueros contaminados o lipémicos producen resultados falsos positivos. El plasma obtenido
con anticoagulante no debe de ser usado en esta prueba, debido a que el fibrinógeno puede causar
agregación inespecífica de las partículas de látex.

C) Esperar que los reactivos y la muestra alcancen la temperatura ambiente.

D) Suero del paciente.
E) Poner una gota del suero control positivo y negativo respectivamente en la segunda y
tercera área marcada en la laminilla.
F) Mezclar el reactivo PCR látex hasta una suspensión homogénea y añadir una gota del
reactivo de látex a cada uno de los sueros.
G) Mezclar con un aplicador diferente para cada área.
H) Mover la laminilla en un ángulo de 45° por 2 minutos.
I) Examine la aglutinación usando una fuente de luz.

Repetir mismo procedimiento para los kits de la prueba de ASO y FR.

Interpretación de resultados del método cualitativo: (Revisar inserto de trabajo)

• La aglutinación de las partículas de látex indica una reacción positiva.

• La no aglutinación o una ligera aparición de granulosidad que no exceda a la observada
en el control negativo, indica una reacción negativa.

Procedimiento cuantitativo.

Cuando la muestra da un resultado positivo por el método cualitativo ya sea en la PCR, la ASO
ó FR, lo conveniente es realizar la semicuantificación del título de anticuerpos, para ello se
requiere hacer una serie de diluciones a ensayar, la dilución que muestre positividad se debe
multiplicar por el factor de dilución correspondiente a cada tipo de prueba realizada.

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A) Realizar 5 diluciones en tubo del suero positivo, la primera se comienza con una
dilución 1:20 (0.05 ml de suero y 0.95 ml de solución salina).
B) Se agrega a los 4 tubos restantes 0.5 ml de solución salina fisiológica.
C) Del primer tubo se toman 0.5 ml de la dilución 1:20 y se transfiere al tubo 2, se
homogeniza y se toman 0.5 ml y se transfieren al tubo 3, se realiza la mismo con los
tubos 4 y 5. Los últimos 0.5 ml se desechan.
D) De cada uno de los tubos se toman 50 µl y se colocan en la placa y se agrega el
reactivo de látex a cada uno.
E) Agitar durante dos minutos con movimientos rotatorios y observar la aglutinación.
F) Reportar el número más alto de anticuerpos y multiplique por el factor de dilución de
cada reactivo.

Limitaciones del procedimiento.

1) La fuerza de la reacción positiva puede variar de una floculación gruesa a una fina o
parcial aglutinación y esta no tiene correlación con el título. La ligera granulosidad del
látex no debe de ser confundida con un resultado positivo. La comparación con el
control negativo facilita el reconocimiento de una aglutinación significativa.
2) La agregación de partículas de látex que se asemeja una aglutinación puede ocurrir si
la lectura no se realiza inmediatamente y se deja pasar más de dos minutos.
3) Los sueros lipémicos y contaminantes pueden dar resultados falsos positivo.
4) El plasma obtenido con anticoagulantes no es indicado para la prueba, porque el
fibrinógeno puede causar agregación de partículas de látex.

Reporte de resultados para el método de semicuantificación. (Revisar inserto de trabajo)

ASO 200 X Título de ASO = UI/mL

PCR 6 X Título de PCR = mg/L
FR 8 X Título de FR = UI/mL.

RESULTADOS.

Resultados del método cualitativo. (Positivo o negativo)

RESULTADO. VALOR DE REFERENCIA.

Proteína C reactiva. NEGATIVO.
Antiestreptolisina O. NEGATIVO.
Factor Reumatoide. NEGATIVO.

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Resultados del método cuantitativo. (Último tubo positivo de la dilución por el factor de dilución
del reactivo indicado en el kit)

RESULTADO. VALOR DE REFERENCIA.

Proteína C reactiva. mg/L. NEGATIVO.

Antiestreptolisina O. UI/mL. NEGATIVO.

Factor Reumatoide. UI/mL. NEGATIVO.

CUESTIONARIO.

1. Defina qué es la fiebre reumática y por qué es importante la erradicación de

Streptococcus pyogenes.
2. ¿Qué pruebas de laboratorio son útiles para el diagnóstico de fiebre reumática?.

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFÍA.

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PRÁCTICA No. 6

“Género Haemophilus”

OBJETIVO.

Conocer las diferentes pruebas utilizadas para el diagnóstico del género Haemophilus.

INTRODUCCIÓN.

El género Haemophilus, se considera como un patógeno involucrado en una amplia variedad

de patologías en el humano y varias especies de animales habitando las membranas de las
mucosas de vías respiratorias altas principalmente; siendo los de carácter patógeno las cepas
capsuladas. También se encuentran en algunas especies formando parte de la biota normal.

Éste género se encuentra, junto con los Actinobacillus y Pasteurella dentro de la familia
Pasterellaceae. Dentro del Manual de Bergey se encuentra en el rango taxonómico y sección:
volumen 2 proteobacterias, dentro de la selección XVII llamada Υ-proteobacterias.

Son bacilos o cocobacilos inmóviles, con diámetro menor a 1 µ, es facultativo o aerobio; es

fermentador; para su desarrollo requiere de los factores de crecimiento presentes en la sangre.
Son pleomórficos, es decir, pueden presentar formas cocobacilares, filamentosas, son
inmóviles, no esporulados, forman cápsulas en cultivos jóvenes, son parásitos estrictos del
hombre y de algunos animales.

Crecen a una temperatura óptima es entre 35 y 37oC. Reducen nitratos a nitritos. Son
microorganismos quimiorgánitróficos.

Entre las especies que colonizan al humano el más importante desde el punto de vista clínico
es el Haemophilus influenzae ya que puede causar:

• Enfermedades severas. Ej. meningitis, epiglotitis.

• Enfermedades crónicas en las cuales Haemophilus influenzae juega un papel

secundario. Ej. bronquitis, bronquitacsia, sinusitis y otitis media.

Tabla 8. Variedades de Haemophilus y las enfermedades que causa.

Haemophilus ENFERMEDADES PRIMARIAS
Haemophilus influenzae Meningitis, epiglotítis, celulitis, otitis,
sinusitis, neumonía, bacteremia.
Haemophilus parainfluenzae Bacteremia, endocarditis, infecciones
oportunistas.
Haemophilus ducreyi Chacroide blando
Haemophilus haemolyticus Infecciones oportunistas
Haemophilus parahaemolyticus Infecciones oportunistas
Haemophilus segnis Infecciones oportunistas

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Haemophilus aphrophilus Endocarditis, infecciones oportunistas.

Haemophilus paraphrophilus Infecciones oportunistas

ASPECTOS DE TRANSMISIÓN PARA CONSIDERARLOS EN LA TOMA DE MUESTRA.

La transmisión de este agente puede ser por diseminación endógena desde el tracto
respiratorio alto a través de la sangre, hasta las meninges, la epiglotis, la piel o las
articulaciones; o extensión directa al ojo, el oído interno, los senos o el tracto respiratorio bajo,
Haemophilus ducreyi por transmisión sexual.

Los niños menores de 5 años, sin anticuerpos protectores contra la cápsula son los de riesgo;
así como los ancianos y pacientes con depresión del complemento.

El principal mecanismo de patogenicidad por parte del Haemophilus influenzae, está mediado
por la cápsula polisacárida antifagocítica, que contiene ribosa, ribitol y fosfato (PRP).

A las cepas que se demuestra éste antígeno se les llama Haemophilus influenzae tipo “B”.

Toma de productos.

De la toma de productos, como en los aislamientos de microorganismos responsables de

enfermedades infecciosas es de suma importancia, ya que si no se lleva a cabo en forma
adecuada conducirá al fracaso del aislamiento del agente etiológico de las enfermedades
infecciosas.

Para el exudado faríngeo se realiza la toma de muestra tal y como ya sea repasado en las
primeras prácticas del manual. Otra muestra en las que se puede aislar Haemophilus es en
hemocultivo.

Cultivo de oído: En el caso de otitis media la muestra debe ser tomada por el
otorrinolaringólogo por medio de un procedimiento denominado timpanocentésis, ya que en los
cultivos de conducto auditivo externo en ocasiones no muestra el agente etiológico de otitis
media, a menos que haya habido ruptura reciente de la membrana timpánica.

Líquido Cefalorraquídeo: Es de gran ayuda diagnóstica el estudio citoquímico y

microbiológico de LCR. La muestra debe recogerse en tubo estéril de tapón de rosca
manteniéndola a temperatura ambiente. En caso de no procesarse de inmediato deberá
mantenerse a 37oC, ya que la refrigeración está contraindicada debido al efecto letal del frío
sobre las especies bacterianas: Neisseria meningitidis y Haemophilus influenzae (en México el
primero no es frecuente).

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Transporte de las muestras: Cuando la muestra no puede procesarse en un término de 2

horas, deberá utilizarse medio de transporte de Stuart (nota: no se debe de refrigerar la
muestra).

Cultivo de esputo: se recolecta la muestra en un recipiente estéril de boca ancha. Tomar de

las porciones sanguinolentas y purulentas para hacer frotis, hacer tinción Gram y contar el
número de leucocitos y de células epiteliales evaluando de acuerdo al Criterio de Nomarsky
(sólo se sembrarán las muestras que pertenezcan a la clase I y II).

Tabla 9. Criterios para el reporte de acuerdo con Nomarsky.

CRITERIO DE NOMARSKY
Expectoración Grupo Células epiteliales Leucocitos
0 <25 <25
I 1 >25 <10
2 >25 10-25
II 3 >25 >25
4 10-25 >25
III 5 <10 >25
6 <25 >25

Método de aislamiento.
Entre los medios de cultivo que pueden utilizarse para el aislamiento de Haemophilus tenemos:
Levithal, Casman, Fildes, gelosa sangre de conejo, gelosas chocolate enriquecida, G.C. y
vancomicina y el GHBEL (gelosa hemina bacitracina extracto de levadura).

CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES ENTRE ESPECIES.

En general se utilizan tres características para diferenciar las especies del género Haemophilus
de importancia clínica.

1. Esta bacteria requiere para su crecimiento ciertos factores, como la hemina (factor X) y/o
difosfopiridina nucleótido (NAD) (factor V).
2. Tiene reacciones hemolíticas en sangre de caballo o conejo.
3. Requiere de CO2.

Otras características que se emplean para la diferenciación de especies son:

• Requerimiento de suero y otros enriquecimientos.

• Producción de indol y catalasa.
• Todas las especies de Haemophilus excepto Haemophilus ducreyi reducen nitratos a
nitritos.

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MATERIALES.
• Placas petri con gelosa chocolate
• Placas petri divididas a la mitad con gelosa sangre de carnero y mueller hinton
• Peróxido de hidrógeno al 3%
• Cepa de problema de Haemophilus influenzae
• Cepa de problema de Haemophilus parainfluenzae
• Cepa de problema de Staphylococcus aureus
• Aplicadores de madera
• Laminillas teñidas con tinción Gram.

METODOLOGIA.

Ejercicio I.

1. Observar las laminillas de tinción Gram y reportar.

Ejercicio II.

Prueba de la Catalasa para diferenciar le género.

1. En un portaobjetos, adicionar dos gotas de H2O2 una por cada extremo del portaobjetos.
2. Con ayuda de un aplicador de madera, tomar una pequeña porción de la superficie de
una colonia aislada de la cepa problema de Haemophilus influenzae y descargarla sobre
una de las gotas de H2O2, disolver y observar.
3. Repetir el paso anterior, utilizando otro aplicador de madera y realizar el mismo
procedimiento con una colonia aislada de Haemophilus parainfluenzae de la cepa
problema.
4. Observar la reacción y reportar.

Interpretación de resultados:

• Prueba positiva (+): Formación de burbujas.

• Prueba negativa (-): No se observa la formación de burbujas.

Ejercicio II.
Prueba del Satelitismo para la diferenciación del género.

1. Utilizar la placa dividida de gelosa sangre y gelosa mueller hinton.

2. Con ayuda del asa bacteriológica, tomar una colonia aislada de la cepa problema de
Haemophilus parainfluenzae y descargarla por estría simple en la gelosa gangre.

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3. Tomar otra colonia de la misma cepa problema y descargar de igual forma que en el paso
anterior, en la gelosa mueller hinton.
4. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar una colonia aislada de la cepa
problema de Staphylococcus aureus y descargarla verticalmente sobre estría de
Haemophilus parainfluenzae realizada anteriormente en la gelosa sangre.
5. Repetir el paso anterior para la estría de Haemophilus parainfluenzae en agar Mueller
Hinton.
6. Tomar otra placa dividida de gelosa sangre y gelosa mueller hinton y estriar ambas partes,
cada una ahora con una colonia aislada de la cepa problema de Haemophilus influenzae
por estría simple.
7. Tomar con el asa una aislada de la cepa problema de Staphylococcus aureus y descargarla
verticalmente sobre estría de Haemophilus influenzae realizada anteriormente en la gelosa
sangre, hacer lo mismo en la gelosa mueller hinton.
8. Incubar a 37oC/ 24 horas y reportar resultados.

SATELITISMO
Microorganismo
En gelosa sangre En gelosa mueller-hinton
Haemophilus influenzae + -
Haemophilus parainfluenzae + +

RESULTADOS.

1. Llenar la siguiente tabla con los resultados obtenidos durante la práctica.

COLONIAS Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae.

Reacción

Tinción Gram Forma

Agrupación

Tamaño

Forma
Morfología Pigmento
colonial
Borde

Elevación

Consistencia

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SATELITISMO
Microorganismo
En gelosa Sangre En gelosa Mueller-Hinton
Haemophilus influenzae

Haemophilus parainfluenzae

2. Dibujar esquemas de las placas después de la incubación.

CUESTIONARIO.

1. Esquematizar la morfología microscópica de las cepas problema en gelosa chocolate.

2. Describa el fundamento de la Prueba del Satelitismo.
3. Explique: ¿Por qué es indispensable la gelosa chocolate para conseguir el aislamiento
de Haemophilus?

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFÍA.

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PRÁCTICA No. 7

“Bacilos Ácido Alcohol Resistentes.”

Diagnóstico microbiológico de tuberculosis.

OBJETIVO.

Conocer las técnicas empleadas para el diagnóstico de microbiológico de las micobacterias.

INTRODUCCIÓN.

La familia Mycobacteriaceae comprende un sólo género Mycobacterium. Se presentan

generalmente como formas bacilares, aunque también pueden encontrar formas cocoides. Son
inmóviles, no capsulados, no presentan esporas, son aerobios estrictos, contienen gran
cantidad de lípidos en su pared celular que supone el 60% de su peso seco. Son de
crecimiento lento, no forma hifas, se tiñen con dificultad, pero una vez teñidos resisten la
decoloración a los ácidos minerales fuertes. Son muy resistentes a la desecación y a los
desinfectantes comunes, como: el hipoclorito, benzal y aún al fenol al 5%.

El género incluye parásitos obligados, saprófitos y formas intermedias que difieren en

requerimientos nutricionales. En este género van incluidos 30 especies.

Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis son las micobacterias más frecuentes,

como causantes de tuberculosis en el humano. Existen otras micobacterias como
Mycobacterium avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
xenopi, Mycobacterium kansaii, Mycobacterium marinum y Mycobacterium intracellularis,
consideradas como patógenos o como micobacterias potencialmente patógenas (atípicas). En
la actualidad se les llama “MOTT” (Micobacterias diferentes de Mycobacterium tuberculosis); y
su principal interés radica en que su morfología microscópica es indistinguible de
Mycobacterium tuberculosis. Algunas de ellas pueden dar cuadros semejantes a la
tuberculosis y en general son resistentes a los esquemas quimioterapéuticos para esta
enfermedad.

Actualmente las micobacterias relacionadas taxonómicamente se han agrupado en complejos:

A) Complejo del Bacilo tuberculoso: conteniendo principalmente a Mycobacterium

tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti
(no patógeno para el hombre).
B) Complejo MAIS: M. avium, Mycobacterium intracellularis, Mycobacterium scrofulaceum.
C) Complejo Fortuiti: Principalmente, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonii.

Cualquier infección o enfermedad causada por las micobacterias, se le denomina

MICOBACTERIOSIS.

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La tuberculosis es una micobacteriosis caracterizada por la formación de tubérculos y en

ocasiones por necrosis caseosa en los tejidos.

Las micobacterias se clasifican de acuerdo a la temperatura de desarrollo en: termófilas,

aquellas que se desarrollan óptimamente a 40°C o más, ejemplo de ellas son: Mycobacterium
avium, y Mycobacterium xenopi, las mesófilas son las que tienen un crecimiento a 37°C, y
dentro de esta clasificación crecen todas las micobacterias que se aíslan del hombre y de
algunos animales; y las psicrófilas, que se caracterizan por tener un mejor crecimiento a una
temperatura de 20°C o menos, como por ejemplo: Mycobacterium marinum, Mycobacterium
ulcerans y las micobacterias que afectan a los animales de sangre fría.

Se realizan comúnmente dos tipos de tinciones:

1.- Tinciones con carbolfucsina: una mezcla de fucsina con fenol (ácido carbólico)
a)Zielh-Neelsen (Tinción caliente)
b)Kinyoun (Tinción fría)

2.- Tinción con fluorocromos: Auramina O sola o con el agregado de un segundo fluorocromo
la rodamina.

La pigmentación junto con la velocidad de desarrollo son la base de la clasificación de Runyon,

aun aplicable a laboratorios de rutina. (Ver tabla 10)

Tabla 10. Clasificación de las micobacterias de acuerdo con Runyon.

Grupo I Fotocromógenos: producen pigmento amarillo en presencia de la luz.
Especies: Mycobacterium kansassi, Mycobacterium marinum.
Grupo II Escotocromógenos: producen pigmento amarillo a naranja en la oscuridad.
Especies: Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium gordonae.
Grupo III No fotocromógenos: no producen pigmento.
Especies: Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare.
Grupo IV Rápido crecimiento: crecen en menos de una semana.
Especies: Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae,
Mycobacterium abscessus.

Método de diagnóstico tradicional para tuberculosis.

1. Baciloscopia (Microscopia)
2. Cultivo por aislamiento del agente causal.
3. Determinación de anticuerpos específicos contra el agente causal.
4. Radiología
5. Biopsias

Nuevos métodos de diagnóstico.

1. Método de cultivo BACTEC.
2. Tubo BBL-MGI indicador de crecimiento micobacteriano suplementado.
3. Cromatografía gas líquido GLC por cromatografía líquida de alta presión HPLC.

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4. Técnicas de hibridación Gen Probe.

5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

MUESTRAS.

Se pueden tener diferentes productos biológicos como: esputo, orina, lavado gástrico, raspado
laríngeo, lavado bronquial, líquido pleural, materia fecal, LCR, tejidos infectados, etc.

MATERIAL.

1. Muestra sugestiva.
2. Tubos para centrifuga.
3. Tubos con medio Lowenstein-Jensen.
4. HCl, NaOH 4%.

MÉTODO.

Ejercicio a. “Baciloscopia directa en esputo”

Hacer un frote de la porción purulenta o caseosa de la muestra, usando un aplicador de

madera.
A) Extender la partícula seleccionada en una superficie de 2 cm2. Desechar el aplicador en
un tubo para esterilizarlo posteriormente.
B) Dejar secar el frote al ambiente.
C) Fijar al calor.
D) Teñir por la técnica de Ziehl-Neelsen.
E) Observar al microscopio e informar el número de bacilos de acuerdo a lo propuesto por
la Unión Internacional Contra la Tuberculosis.

BACILOSCOPIA: Es muy importante el número de bacilos presentes en la muestra, ya que, se

relaciona con el grado de infectividad del paciente.

La lectura se hace en forma sistemática empezando del lado izquierdo superior del frote
moviendo hacia la derecha hasta terminar ese largo, sino se encuentran bacilos o se
encuentran pocos, continuar como lo requiera el caso.

Datos del
paciente.

Lectura del frote.

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Tabla 11. Informe de la baciloscopía en la búsqueda de BAAR para el diagnóstico de tuberculosis.

AUSENCIA DE BAAR. NSE BAAR: NO SE ENCONTRARON BACILOS ACIDO ALCOHOL
RESISTENTES EN TODO EL FROTE.
0-1 BAAR + En 100 campos de inmersión.
1-10 BAAR POR CAMPO. ++ En 50 campos de inmersión.
MÁS DE 10 POR CAMPO. ++ En 20 campos de inmersión.

Tabla 12.

OBSERVACIONES.

CONCLUSIONES.

CUESTIONARIO.

1.- Fundamento de la tinción Zielh-Neelsen.

2.- Función de la descontaminación con NaOH en las muestras.
3.- Tipos de muestras para la identificación de las micobacterias.
4.- Composición y función del medio de Lowenstein – Jensen.
5.- Métodos alternativos para el diagnóstico de tuberculosis

BIBLIOGRAFÍA.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 17

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PRÁCTICA No. 8

“Familia Enterobacteriaceae”

OBJETIVO.

Diferenciar los géneros y especies de la familia Enterobacteriaceae, a través de las

características morfológicas coloniales, pruebas bioquímicas, pruebas de toxicidad e
invasividad y serológicas. Así como, realizar y conocer los criterios que se persiguen en el
coprocultivo.

INTRODUCCIÓN.

Dentro de la familia Enterobacteriaceae se han descrito 8 tribus grupos entéricos, 27 géneros,

con más de 110 especies. Géneros descritos de acuerdo a la homología que guarda con el
DNA, pruebas bioquímicas, serología y susceptibilidad a los antibióticos.

Son microorganismo de distribución mundial y se encuentran en el suelo, agua, vegetación y

formando parte de algunos de la flora normal de casi todos los animales.

Algunos géneros como Shigella, Salmonella, Yersinia pestis, Escherichia coli, siempre se
asocian a enfermedades cuando se aíslan en el hombre; y entre tanto, Escherichia coli,
Klebsiella (algunas), Proteus mirabilis, son miembros de la flora saprofita que producen
infecciones cuando llegan por algún mecanismo a otro sitio anatómico distinto. Las infecciones
por enterobacterias, también pueden ocurrir a partir de reservorios animales (Salmonella) y
portador humano (Shigella, Salmonella typhi) o por diseminación endógena de las infecciones
pueden afectar a casi todas las localizaciones corporales. Más del 5% de pacientes
hospitalizados desarrollan infecciones nosocomiales, siendo las enterobacterias los agentes
etiológicos más frecuentes en la mayoría de las infecciones.

Algunos de los agentes que también causan afecciones gastrointestinales son:

A) PROTOZOOS:
Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium, Balantidium coli.

B) VIRUS

Rotavirus grupo NORWALK, Adenovirus, Calicivirus y algunos Coronavirus.

Sin embargo todos los microorganismos enteropatógenos tienen en común ciertas

características: la puerta de entrada al organismo humano (por la boca al comer o beber), su
hábitat (el propio intestino) y su eliminación con las evacuaciones (fuentes de infecciones).

El proceso patológico consta de tres etapas: la primera, implica la ingestión de la bacteria en

cantidad suficiente para resistir las defensas naturales del huésped. La dosis infecciosa varía
Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 18
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según el microorganismo; así, por ejemplo: Shigella es de 101 – 102, mientras que en
Salmonella es de 106 – 108. La segunda etapa, comprende la localización del microorganismo
en el huésped y finalmente en la tercera etapa, entra en acción uno o varios mecanismos de
virulencia del agente infeccioso como: elaboración de ENTEROTOXINAS, por ejemplo, la LT y
ST de Escherichia coli, la CT de Vibrio cholerae, la invasión de la mucosa intestinal y el poder
de adhesión íntima a las vellosidades del intestino delgado.

El sistema cardial de la gastroenteritis es la diarrea en la que puede encontrarse moco, sangre

y pus, la frecuencia e intensidad de estos signos varían con el agente causal, lo que permite al
microbiólogo ciertas orientaciones etiológicas, siendo indispensable el laboratorio para poder
determinar el agente causal.

La presencia de moco y de sangre en las evacuaciones es dado fundamentalmente por:

Shigella, Entamoeba histolytica, Escherichia coli Enterohemorragica (EHEC) y en menor grado:
Campylobacter, Salmonella y Escherichia coli Enteroinvasiva (EIEC).

La presencia de pujo y tenesmo sugiere fundamentalmente amibiasis y/o shigelosis.

Los microorganismos que producen enterotoxinas como: Escherichia coli Enterotoxigénica,

además de algunas cepas de Campylobacter, Klebsiella y Proteus, Pseudomonas, etc. Tiene
la peculiaridad de no presentar sangre, si no que están caracterizadas por producir diarreas
líquidas.

Es también de gran utilidad la búsqueda de PMN (polimorfonucleares), en heces ya que

aparecen en grandes cantidades en presencia de: EHEC, EIEC, Shigella, Salmonella y de
algunos casos por Campylobacter y en presencia de escasos ausentes de PMN está,
Escherichia coli, EPEC, ETEC, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia.

Panorama actual de métodos y pruebas que apoyan el esquema de estudio para las
enterobacterias.

Actualmente, existen métodos para la clasificación, diferenciación e identificación de las

bacterias que incluyen nuevas pruebas bioquímicas, patrones de sensibilidad a los antibióticos,
bacteriófagos específicos de grupos y especies, pruebas moleculares es decir, a nivel de DNA
y RNA (PCR, RT-PCR, hibridación), además de algunos programas de computación. El uso
combinado de estos métodos es un instrumento poderoso que ha permitido promover nuevas
especies de bacterias y cambios en la nomenclatura de especies.

La familia Enterobacteriaceae, comprende bacterias en forma de bacilos Gram (-), aerobios y

anaerobios facultativos, que no producen esporas y crecen bien en medios artificiales; algunas
especies son inmóviles o las que lo hacen es por medio de flagelos perítricos. Todas las
especies fermentan la glucosa, en la que para unas especies producen gas a partir de ella,
pero todas producen ácidos orgánicos, reducen los nitratos a nitritos y no tienen en su equipo
enzimático de cada respiratoria la citocromo oxidasa.

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La familia está compuesta por un gran número de microorganismos que varían en su

estructura antigénica, hibridación del DNA, especificidad a ciertos fagos y algunas de sus
propiedades bioquímicas.

En el intestino humano se llegan a concentrar por gramo de heces aproximadamente 10 10. Los
anaerobios son las bacterias que predominan, especialmente Bacteroides fragilis, además
entre ellas se destacan también Clostridium perfringens y Lactobacillus (aerobios y anaerobios
facultativos). Otros aerobios y anaerobios facultativos se encuentran obviamente las
Enterobacterias y los Enterococos. También son frecuentes Pseudomonas, Staphylococcus
Candida albicans y la microbiota.

El gran número de especies del tubo digestivo, su metabolismo semejante, sus antígenos
comunes, así como las características genitales, existente entre ellas, hacen que su estudio
sea más completo, siendo esto más marcado en el grupo de las Enterobacterias.

Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae poseen una morfología y afinidad tintorial
idéntica; así como, un desarrollo colonial semejante características que comparten con
Pseudomonas y otros Gram negativos. Es por esto que la identificación de cada especie
necesita un sistema cuidadoso basado en la utilización de medios enriquecidos, diferenciales y
selectivos para su aislamiento y su diferenciación bioquímica y serológica posterior.

Todos los miembros, son capaces de producir infecciones. Muchos microorganismos que no
eran considerados anteriormente como patógenos, son ahora causas frecuentes de
infecciones secundarias en pacientes, cuyos mecanismos de defensa se han alterado por:
medicación, radiación o por la misma enfermedad. Los casos de gastroenteritis por
Enterobacterias patógenas son muy frecuentes en nuestro medio. Las infecciones urinarias
son debidas con frecuencia elevada a bacterias de esta familia, principalmente: Proteus,
Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, entre los importantes. También de manera
importante se pueden aislar este tipo de bacterias a partir de hemocultivos, como lo son:
Salmonella, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, entre los más frecuentes. De líquido
cefalorraquídeo, como lo llega ser Escherichia coli. Es más, podemos encontrar
Enterobacterias que por algún mecanismo predisponente puede infectar vías respiratorias y
aparato genital. Por estas razones y entre otras más, se requiere que el alumno esté
capacitado para aislar e identificar los diferentes géneros y especies de enterobacterias,
principalmente las patógenas, en el menor tiempo posible y con la mayor exactitud.

Para dar una mejor idea de su importancia, es necesario destacar, que el total de los
aislamientos clínicos, aproximadamente el 50% pertenecen a la familia Enterobacteriacea, y
del total de los bacilos Gram (-) aislados el 80% son de esta familia. Miembros de esta familia
son responsables de más del 70% de las infecciones del tracto urinario y más del 50% de los
casos de septicemia.

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Tabla 13. Tabla de resultados de las bioquímicas de algunas de las especies de enterobacterias.

COPROCULTIVO.

Toma de muestra.

Las muestras fecales deben recogerse en las primeras fases de la enfermedad, cuando suelen
estar presentes grandes cantidades de agentes patógenos, y de preferencia antes de iniciar el
tratamiento con antibióticos.

Las heces deben de depositarse en un frasco limpio estéril, la cucharilla o hisopo en un tubo
estéril. Si la muestra contiene moco, se toma un poco de este en un portaobjetos con dos
gotas de azul de metileno.

Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensión teñida y las láminas se observa al microscopio,

después dos o tres minutos para los leucocitos adquieran una buena tinción nuclear.

Se toma nota de las células perfectamente identificadas como mononucleares o

polimorfonucleares. Los leucocitos y células epiteliales se anotan por separado y las que estén
degeneradas y no puedan identificarse claramente se ignoran. Los leucocitos fecales aparecen

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en grandes cantidades (más de 30 células/campo de alta potencia) en casos de shigelosis y en

mayor número en casos de salmonelosis, fiebre tifoidea y por enfermedad por Escherichia coli
enterotoxigénica serán muy pocos (menos de 2 – 5 células/campo de alta potencia). El
exudado de tipo Shigelosis, se observa también en casos de campilobacteriosis si se
examinan muestras de heces fecales recientes (en término de unos 20 minutos).

Las muestras que por cualquier causa no pueden ser procesadas inmediatamente; después de
ser recolectadas, se depositan en medios de transporte como Stuart, Cary Blair o Amies, para
evitar la reproducción de bacterias saprófitas o comensales.

También puede tomarse la muestra por medio de una cucharilla o hisopo especialmente en
lactantes.

Medios de cultivos empleados para el diagnóstico a partir de la muestra de heces.

Es preciso indicar que cuando no es posible procesar la muestra de coprocultivo, se

consideran para su transporte los medios de cultivo entes mencionados. Sin embargo, cuando
se procede el camino para aislar se deberá de emplear los siguientes medios de cultivo:

A. Medios enriquecidos como: Caldo Tetrationato (se usa para el aislamiento primario de
Salmonella en las heces) y junto con el caldo Selenito son más inhibidores del
desarrollo de Escherichia coli. Y otros bacilos Gram (-) que el caldo GN Hajna (que
también se puede emplear).

B. Medios diferenciales no selectivos: gelosa Lactosa Azul Bromotimol ó Rojo Fenol.

C. Medios diferenciales poco selectivos: EMB (gelosa Eosina y Azul de Metileno según
Levine), ENDO, gelosa Desoxicolato de Leifson, gelosa Mac Conkey.

D. Medios diferenciales selectivos: gelosa S-S (Salmonella–Shigella), gelosa ADC

(Desoxicolato-Citrato), gelosa HE (Hektoen), gelosa XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato),
gelosa Tergitol 7.

E. Medios altamente selectivos: gelosa Sulfito de bismuto, gelosa Verde Brillante (para
Salmonella exceptuando para S. typhi.).

Tradicionalmente ha sido difícil la identificación de los miembros de la familia

Enterobacteriaceae y en ocasiones se requiere una serie compleja de pruebas bioquímicas
para poder hacerlo. Nosotros utilizaremos las pruebas básicas de acuerdo a los criterios de
Edwards y Ewing para la identificación en primer lugar de la tribu a la que pertenece la
bacteria, posteriormente determinar género y especie. Este criterio de identificación es muy útil
sobre todo cuando se carece de experiencia en el manejo de las Enterobacterias. Existen
también metodologías finas que describen estrictamente el género y especie de las mismas y
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que sólo los laboratorios especializados lo realizan con fines taxonómicos, epidemiológicos,
metabólicos, de susceptibilidad antimicrobiana o genéticos; como pueden ser: Hibridación de
DNA, Tipificación por Bacteriófagos, etc.

MATERIAL.

1. Materia fecal en frasco estéril.

2. Hisopos estériles.
3. Agar: EMB, McConkey, XLD, S-S, ENDO, Tergitol-7, Sulfito de Bismuto y Verde
Brillante.
4. Pruebas bioquímicas en tubos de ensaye: TSI (Agar Hierro y Triple Azúcar), LIA
(Agar Hierro y Lisina), CIT (Agar Citrato de Simmons), FA (Agar Fenil Alanina),
AUC (Agar Urea Christensen), MIO (medio semisólido Movilidad-Indol-Ornitina),
SIM (medio semisólido Sulfhídrico-Hierro-Movilidad) y los siguientes caldos: RM-
VP (rojo de metilo y Voges-Proskauer), Urea, Malonato, Arginina, Azúcares
específicos.
5. Agar Mueller-Hinton ó Agar BAB sin sangre.
6. Reactivos: Solución salina 0.85%, cloruro férrico al 10%, Reactivo de Kovacs o
de Ehrlich, Rojo de metilo, Alfa naftol 5%, NaOH al 40%.
7. Antisueros específicos para Salmonella, Escherichia y Shigella.

EJERCICIO A.

METODOLOGÍA.

A) Las muestras que contengan moco se les efectuará la citología de moco fecal.
B) Tome las muestras con el asa picando en varias partes de ella, en caso de contener
sangre y moco, tomar de estas porciones y descargarlas en los siguientes medios:
EMB, Mac Conkey, XLD, SS. Sulfito de bismuto y Verde brillante, con el asa
extender la muestra con el objeto de obtener colonias aisladas. Incubar a 35°/24
horas.
C) Tomar aproximadamente un gramo de heces y suspender en Kauffmann o Caldo
Tetrationato y Caldo Selenito. Incubar de 12 a 18 horas/35°C y resembrar en SS,
Mac Conkey o Agar Verde Brillante.
D) Observar la morfología colonial comparando con las tablas correspondientes que
describan dicha morfología.

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EJERCICIO B.

A) Las colonias desarrolladas de la práctica anterior con las características de

Salmonella, Shigella o Escherichia coli, resembrar para pruebas bioquímicas: TSI y
LIA, los cuáles se sembrarán por estría y picadura.
CITRATO DE SIMMONS, AGAR FENILALANINA y AGAR UREA CHRISTENSEN,
se sembrarán sólo por estría en superficie.
MIO y SIM, por picadura estrictamente vertical sin mover horizontalmente el asa.
Y finalmente sembrar caldos por suspensión, UREA, RM-VP, MALONATO,
ARGININA y CARBOHIDRATOS.
B) Incubar 35°C/24 horas, y consultar las lecturas para su interpretación e identificación.
C) Realizar esquemas.

OBSERVACIONES.

RESULTADOS.

CONCLUSIONES.

CUESTIONARIO.

1. En los medios entéricos, mencione los agentes inhibidores de Gram positivos.

2. Medio de transporte recomendado para el aislamiento de enterobacterias procedentes
de materia fecal.
3. Describa los fundamentos del caldo Tetrationato y caldo Selenito como medios de
enriquecimiento.
4. Describa el fundamento e interpretación de las siguientes pruebas bioquímicas:
• Descarboxilación y desaminación de la Lisina.
• Utilización de Lactosa.
• Utilización de Citrato.
• RM-VP.
5. Describa el procedimiento de las pruebas miniatura para la identificación de
enterobacterias.

BIBLIOGRAFÍA.

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PRÁCTICA No. 9
“Género Vibrio.”

INTRODUCCIÓN.
La familia Vibrionaceae incluye tres géneros de importancia médica: Vibrio, Aeromonas y
Plesiomonas. Se caracterizan por ser bacilos Gram negativos móviles, con un flagelo polar o
un mechón de dos o tres flagelos, no forman capsula, esporas ni fimbrias y son anaerobios
facultativos.

Vibrio
Son bacilos gram negativos curvados que comúnmente se encuentran en agua de mar. Las
células pueden conectarse extremo a extremo generando formas S y espirales. Son
extremadamente móviles y tiene un solo flagelo polar, no poseen esporas son oxidasa positivo
y pueden desarrollarse en condiciones aerobias o anaerobias, además de que fermentan la
glucosa, lo que los distingue de las pseudomonas. No forman parte de la biota normal del
intestino.
Crecen bien a 37°C, crecen a pH muy alto (8.5 a 9.5) y los ácidos los destruyen con rapidez,
por lo tanto, los cultivos que contienen hidratos de carbono fermentables se hacen estériles
rápidamente.

Obtención de muestras para aislamiento de Vibrio cholerae.

Para el diagnóstico clínico suele haber signos premonitorios como anorexia, malestar
abdominal y diarrea líquida. Al principio las evacuaciones de color café con contenido fecal,
pero pronto adquieren un color gris pálido con discreto olor a pescado. La presencia de moco
en las heces da apariencia de agua de arroz. No hay tenesmo y a menudo se presentan
vómitos horas después de iniciarse la diarrea. Esta última causa pérdida del 10 al 15% de
líquidos de peso corporal. En casos graves el pulso periférico puede estar ausente y la presión
arterial no son detectables. Frecuentemente existe signología de acidosis.

El cultivo microbiológico de Vibrio cholerae 01 no es requisito indispensable para iniciar el

tratamiento cuando se ha hecho el diagnóstico clínico, sin embargo la única manera de
corroborar que se trata de un caso de cólera es el aislamiento de Vibrio cholerae 01 toxigénico.
Mediante el cultivo de heces o vómito del paciente. El examen directo de materia fecal no se
recomienda, pero sirve como auxiliar diagnóstico ya que en campo oscuro o en microscopio de
contraste de fases se puede observar el tamaño, forma y movilidad, características,
especialmente después de una breve incubación en caldo. Este examen no se recomienda en
la rutina, sólo en casos extremos y debe ser realizado por personal con experiencia en este
tipo de observaciones.

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TABLA 15. IMPORTANCIA DE Vibrio y ESPECIES RELACIONADAS.

TIPO DE INFECCIÓN. ESPECIES ASOCIADAS.

Vibrio cholerae serotipo 01
Vibrio cholerae NO 01
Vibrio parahaemolyticus
Gastroenteritis Vibrio fluvialis
Vibrio mimicus
Vibrio furnissii
Vibrio hollisae
Vibrio alginolyticus
Heridas infectadas Vibrio vulnificus
Vibrio damsela
Sepsis Vibrio cholerae NO 01
Vibrio vulnificus
Vibrio alginolyticus
Infección ótica Vibrio cholerae NO 01
Vibrio mimicus
Vibrio parahaemolyticus

1. MUESTRAS CLÍNICAS.

El aislamiento de Vibrio cholerae 01 se puede hacer a partir de materia fecal. La toma de

materia fecal se realiza con un hisopo estéril con punta de algodón. Pudiendo ser hisopo fecal
(obtenido a partir de muestra directa de materia fecal), o bien mediante un hisopo rectal, el cual
debe ser obtenido introduciendo el hisopo en el esfínter anal más de un centímetro y girando el
hisopo, el cual debe salir manchado con materia fecal.

Cuando se trata de un cuadro característico de cólera, la muestra se toma de las heces en

forma de agua de arroz. El hisopo se introduce en el tubo de Cary-Blair hasta el fondo, tapando
bien el tubo. Es posible emplear Cary-Blair que fácilmente se puede transferir al medio de
enriquecimiento de agua peptonada alcalina. En aquellos casos en los cuales el laboratorio no
disponga de medio de transporte de Cary-Blair, se puede utilizar agua peptonada alcalina
como medio de transporte (siempre y cuando su transportación sea lo más pronto posible, ya
que hay que recordar que el agua peptonada alcalina es un caldo de enriquecimiento).

Cuando el enfermo se encuentre muy alejado del laboratorio, se puede utilizar un hisopo de
algodón o bien un pedazo de papel higiénico que se empapa bien en la muestra y después se
conserva en una bolsa de polietileno bien sellada para evitar que pierda humedad y que entre
aire. Estas muestras se transportan lo más pronto posible al laboratorio para su
procesamiento.

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Otros medios de transporte como el Stuart y Amies modificado pudieran ser útiles, pero
necesitan evaluarse antes de emplearse con este fin.

2. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS.

MATERIA FECAL.
Si la muestra fecal de un paciente va a tardar en ser procesada, ya sea porque no existen
servicios de laboratorio o se trate de un brote, puede ser enviada en tubos de medio de
transporte Cary-Blair. Si no se dispone de este medio se puede utilizar agua peptonada
alcalina pH 9, tomando en cuenta que es un caldo de enriquecimiento y que no deben de pasar
más de 3 horas para que sea procesada. Las muestras deben transportarse a temperatura
ambiente y si hace mucho calor se pueden utilizar refrigerantes, pero sin llegar jamás a
congelar las muestras.

Los frascos se etiquetan bien y se debe anotar la localidad (incluyendo Municipio y Estado) y el
sitio donde se tomó la muestra, así como la fecha. No hay que omitir el llenado del formato
correspondiente a la ENCUESTA EPIDEMIOLÓGICA PARA ESTUDIO DE COLERA.
MUESTRA DE HUMANOS.

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA EL AISLAMIENTO Y LA

CARACTERIZACIÓN DE Vibrio cholerae

1. IDENTIFICACIÓN DEL GENERO Vibrio

Técnica de aislamiento.

A partir del medio de transporte de Cary-Blair o de la muestra directa, inocular con un hisopo
algodón un tubo con 10 ml de agua peptonada alcalina de pH 9.0. El tubo deberá ser de 16 x
150 con tapón de rosca. Incubar de 6 a 8 horas a 37°C. Tomar 3 asadas de la superficie con
cuidado y tratando de no agitar el tubo. Es muy importante tomar sólo de la superficie, ya que
aquí se encuentran los vibrios en mayor cantidad. Sembrar las 3 asadas en placas de gelosa
TCBS. Aislar colonias por estría cruzada. Flamear el asa entre cada estría. Incubar de 18 a 24
horas a 37°C.

Las cepas de Vibrio crecen en el medio de Mac Conkey como colonias pálidas no
fermentadoras de lactosa. Sin embargo, se prefiere que sean aislados en un medio de cultivo
especial como es el TCBS (Medio de Tiosulfato citrato bilis sacarosa) el cual no debe de
emplearse si tiene más de 24 horas de haberse preparado. En el Agar TCBS, las colonias
típicas de Vibrio cholerae son amarillas, planas un poco convexas de aproximadamente 2 mm

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de diámetro, mientras que las colonias azul-verdosas, grandes, planas son típicas de Vibrio
parahaemolyticus. Hay que enfatizar que no todas las colonias amarillas en medio TCBS son
de Vibrio cholerae., ya que también dan colonias amarillas Vibrio alginolyticus, Vibrio
cincinnatiensis, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, Vibrio metschnikovii (que además es el único
vibrio oxidasa negativa) y algunos biotipos de Vibrio vulnificus, debido a que todos ellos
fermentan la sacarosa. Otros vibrios importantes como Vibrio parahaemolyticus, no fermentan
la sacarosa y dan colonias verde olivo. Hay por lo menos 5 marcas comerciales de medio
TCBS y hay alguna variación entre ellos con respecto al grado de inhibición de la microbiota
normal como: Proteus, enterococos, Klebsiella y Aeromonas, que a veces pueden crecer,
mientras que algunas cepas de Vibrio cholerae pueden ser inhibidas, de manera que siempre
hay que probar cada lote con cepas de referencia.

Las colonias de Vibrio cholerae en TCBS generalmente son más “pegajosas”, lo que dificulta la
aglutinación directa de las colonias crecidas en ese medio. Las colonias de Vibrio cholerae 01
no pueden diferenciarse de las de Vibrio cholerae NO 01 ó de cepas rugosas (muy raras). Para
un diagnóstico presuntivo y rápido se pasa una de las colonias aisladas a un cuadrante de
medio base de sangre (sin sangre) o de agar nutritivo para hacer serología y la prueba de
oxidasa.

TABLA 16. Vibrio y géneros gram-negativos oxidasa positivos.

CARACTERISTICAS Vibrio Pseudomonas Aeromonas Plesiomonas
Fermentación de glucosa. + - + +
Ácido de Inositol - NA - +
Ácido de Manitol + NA - +
Hidrólisis de gelatina + +/- + -
Crecimiento en TCBS + - - -
Requiere/estimulado por iones + - - -
de Na*
Sensible a 0/129 10 mg +/- - - +/-
Sensible a 0/129 150 mg + - - +
(+) Mayoría positivo, (-) Mayoría negativo, (+/-) Variable.

Seleccionar al menos 3 colonias amarillas sospechosas de Vibrio cholerae en agar TCBS y

sembrar cada una en:
TABLA 17. Medios para el diagnóstico de Vibrio cholerae
Medio MIO. Picadura hasta el fondo.
Agar de Hierro y triple azúcar. Picadura y estría.
Agar de Hierro y lisina. Estría y doble picadura

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Depositar el inoculo y sellar con vaselina líquida o

Caldo Arginina.
aceite mineral estéril: no utilice glicerol (glicerina)
Incubar todos los medios durante 18 a 24 horas a 37°C.

FIGURA 3.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae

MATERIA FECAL ó HISOPO

RECTAL (CARY-BLAIR).

MÉTODO ENRIQUECIMIENTO.

CULTIVO CULTIVO EN
EN TCBS. AGUA
6-8 h,
18-24 h,
CULTIVO
COLONIAS COLONIAS EN TCBS.
AZUL O AMARILLAS.
18-24 h,

TRANSFERIR COLONIAS AMARILLAS A

TRANSFERIR A MIO, MIO, LIA, TSI ó KLIGLER Y CALDO
LIA, TSI ó KLIGLER Y
24 h,
18-24 h,
PRUEBA OXIDASA. PRUEBAS PRUEBA OXIDASA
BIOQUÍMICAS AGLUTINACIÓN CON ANTISUERO
PARA Vibrio parahaemolyticus.

(-) Vibrio cholerae No 01 (+) Vibrio cholerae 01

Aglutinación con
antisueros específicos
Ogawa e Inaba.

Las cepas Hikojoma reaccionan de una forma muy rápida y fuerte con los sueros Ogawa e
Inaba; es posible preparar un antisuero absorbido pero no se recomienda hacerlo ya que estas
cepas se presentan con muy baja frecuencia.

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En caso de que la aglutinación con el suero 01 sea dudosa, se debe repetir la prueba y lo más
recomendable es utilizar simultáneamente controles positivos y negativos empleando cepas de
referencia. Cuando la cepa no corresponde al serogrupo 01 se reporta como Vibrio cholerae
NO 01. En caso de ser posible se utiliza suero polivalente correspondiente a otro lote. Además,
deben realizarse pruebas con una gota de solución salina isotónica y otra con una gota de
suero de conejo normal. En esta categoría NO 01 quedan incluidos más de 72 serovares.
Cuando se observa aglutinación con la solución salina o con el suero de conejo, se trata de
una autoaglutinación y se reporta como Vibrio cholerae NO 01, cepa rugosa.

1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

PRUEBA OXIDASA.

La prueba de la oxidasa debe realizarse con bacterias en crecimiento (18 a 24 h) procedentes

de un cultivo de LIA o en un medio que no contenga azúcar, como lo es la base de agar para
sangre (no usar cultivos en TCBS). En un pedazo de papel filtro colocado sobre una caja petri,
se ponen de 2 a 3 gotas del reactivo oxidasa, se esparce un pequeño inoculo con una asa de
platino (no de nicromo) a través del papel humedecido previamente con el reactivo N,N,N,N,
tetrametil parafenilén diamina. De forma alternativa puede emplearse un palillo o un aplicador
de madera estéril. La reacción positiva se indica por la aparición de un color púrpura oscuro
sobre el papel en un lapso de 10 segundos. Es posible emplear discos de papel filtro
impregnados con el reactivo que se pueden adquirir comercialmente, por ejemplo el Tipibact
N® (Bigaux) o Vibrio, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas y Alcaligenes
reaccionan como positivos para la prueba de la oxidasa, en tanto que todas las enterobacterias
son negativas. Se puede emplear como controles a Pseudomonas (positivo) y E. coli
(negativo).

MEDIO MIO.

Es semisólido, se siembra por picadura y se incuba 24 horas a 37°C. Sirve para leer movilidad,
producción de indol y Descarboxilación de la ornitina.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 30

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P.

Vibrio Vibrio
Vibrio damsela 4 Viblrio fluviali Vibrio parahemoliticus Vibrio Vibrio
hollisae 5 (EF-5) 3 (EF-6)
Vibrio vulnificus alginolyticus
mimicus cholerae
(EF-13)
R/A R/A A/A R( A) /A A/A R/A A ( R ) /A A ( R ) /A TSI

GAS DE CLUCOSA

(-)

V
+

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGIA MÉDICA.

-

-
GLUCOSA

TABLA 18. Diferenciación bioquímica de algunas especies de Vibrio.

A

A
V (ONPG+) LACTOSA

(A)

(A)
-

-
SACAROSA

A
-

-
-(A) MANITOL

A
-

+ (-) CITRATO
(-)

(-)

(-)

(-)

(-)
+

+
-

GELATINA
+

+
-

UREA
+

+
-

-
FENILALANINA
-

-
++++ INDOL
(-)
+

+
-

ROJO DE METILO

(-)

(-)
V

+
-

- VP CLASICO
V
-

-
EL TOR VP
+

+
-

-
(+) 7 días MOVILIDAD
+

+
LISINA
V

+
-

ARGININA
+

+
-

-
ORNITINA
+

+
-

CRECIMINETO

+
-

CALDO CON NaCl.

QFB-UMSNH
NaCl 6%
V

V
+

+
Página 72

NaCl 10%
+
-

-
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OBSERVACIONES.

RESULTADOS.

CONCLUSIONES.

CUESTIONARIO.

1.- ¿De qué tipo de muestras se puede lograr el aislamiento de Vibrio cholerae?

2.- ¿Qué característica importante requiere el medio de enriquecimiento de Vibrio cholerae?

3.- Mencione y describa los componentes del medio de cultivo selectivo de Vibrio cholerae.

4.- Mencione el fundamento de la identificación serológica de Vibrio cholerae 01 y NO 01.

BIBLIOGRAFÍA.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 73

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PRÁCTICA No.10

“Diagnóstico de las enfermedades febriles”

Reacciones febriles y hemocultivo.

INTRODUCCIÓN.

El hemocultivo es probablemente la muestra clínica más importante enviada al Laboratorio de

Microbiología. Es única en la medida que apoya al diagnóstico específico cuando resulta
positivo. La demostración de la presencia de un microorganismo a partir de la muestra de
sangre, generalmente refleja una infección activa y disemina a los tejidos. Por otro lado, un
cultivo negativo, por lo general, excluye el papel de los agentes antibacterianos en el
padecimiento.

El microbiólogo desde su punto de vista, sigue un programa sistemático que le lleva a

establecer un diagnóstico; dentro de este sistema se incluye pruebas de laboratorio que
apoyan, confirman u orientan la sospecha clínica, tales como: la biometría hemática, química
sanguínea, examen general de orina. Sin embargo, el diagnóstico microbiológico, sigue siendo
el recurso cuando se selecciona oportunamente, puede llevar a aclarar y confirmar un
diagnóstico que en otra circunstancia o cuando este resulta negativo llevan a una solución
desorganizada y confusa.

Muchas enfermedades infecciosas presentan síntomas y signos que llevan a la sospecha de

un diagnóstico presuntivo que requiere del apoyo del laboratorio. Si se envía una solicitud de
hemocultivo se debe hacer una distinción de las manifestaciones clínicas del paciente o del
diagnóstico presuntivo. La presencia de bacterias en sangre puede originarse por:

BACTERIEMIA: Se denomina si a la sola presencia de bacterias en sangre, esta puede ser

transitoria como resultado de un fenómeno muy común y benigno, que puede ser el cepillarse
los dientes o masticar; aunque también puede presentarse en ciertas etapas de la evolución de
muchas enfermedades como: la neumonía, meningitis bacteriana, infecciones de vías urinarias
e infecciones de heridas.

La bacteriemia persistente o recurrente, es la presencia continua en un microorganismo en la

sangre o implica un fenómeno de muchas enfermedades de manifestaciones patológicas.

SEPTICEMIA: Es presencia de bacterias en sangre acompañadas de escalofríos, fiebre y

postración; estas bacterias se les encuentra en multiplicación activa y liberando toxinas
agresivas y factores asociados a su patogenicidad en el torrente sanguíneo, presentándose
manifestaciones patológicas serias en varios órganos y tejidos que se asocian con una
mortalidad elevada.

En pacientes viejos, recién nacidos y pacientes comprometidos terapéutica e

inmunológicamente, suelen presentarse focos sépticos que liberan microorganismos a la
Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 74
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corriente sanguínea en forma persistente y que pueden dar lugar a la diseminación metásica
de la infección que lleva a la condición que se maneja como “infección sistémica”.

PIEMIA: Es una septicemia que origina la infección purulenta; es producida por

microorganismos piógenos y da lugar a la formación de abscesos en distintas partes del
cuerpo, acompañada por ictericia, sudor, dolores articulares, escalofríos y fiebres.

Los microorganismos que más se asocian con las infecciones sistémicas son:

TABLA 19. Agentes implicados en infecciones sistémicas.

GRAM POSITIVOS. GRAM NEGATIVOS.
Staphylococcus aureus Enterobacterias.
Enterococos Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae. Pseudomonas
Clostridium perfringens Neisseria meningitidis
Peptostreptococcus. Brucella
Listeria monocytogenes. Francisella tularensis
Bacteroides fragilis
Campylobacter fetus.

HEMOCULTIVO.

Es un recurso muy importante para el diagnóstico de las infecciones sistémicas que presentan
en su evolución una etapa de bacteriemia o septicemia.

Un solo cultivo de sangre negativa no eliminará la posibilidad de una bacteriemia; esto es en

algunas enfermedades la positividad del cultivo en sangre depende del estado de la
enfermedad.

Así para el caso de fiebre tifoidea, tularencia y ántrax, la recuperación de los agentes
involucrados, sólo es generalmente efectiva durante la primera semana de la enfermedad. Para
el caso de la endocarditis subaguda, en la que el agente causal se encuentra en pequeñas
cantidades, la recuperación es muy difícil. En brucelosis los cultivos positivos se obtienen
generalmente durante la exacerbación de los síntomas y la elevación de la temperatura, ya que
la recuperación de la fase crónica no es fácil.

Los cultivos de médula ósea han resultado ser útiles después de que los cultivos de sangre se
tornan negativos en: Brucelosis, Fiebre tifoidea, Endocarditis e Histoplasmosis. Algunos
microorganismos requieren de métodos especiales de laboratorio para su aislamiento: Borrelia,
Chlamydia, Francisella, Leptospira, Mycobacterium, Mycoplasma, Rickettsia, Spirilum y
Streptobacillus.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 75

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La sangre para el hemocultivo se toma en condiciones asépticas y si se van a tomar varias

muestras deberán pasar intervalos mayores de una hora, colocándose en un medio de cultivo
enriquecido, el cual se recomienda que vaya adicionado de sustancias neutralizantes de los
antimicrobianos e inhibidores de la acción complementaria del suero y la fagocitosis.

El volumen de sangre recolectado en la recuperación de los microorganismos, a veces es más

importante que el medio empleado para cultivarla; la relación que se recomienda es de 1:10 a
1:20 respecto al medio, por lo que se debe obtener 10 ml de sangre en adultos y 1 a 2 ml en
niños. Así, también se recomienda obtener 3 muestras para incubar a diferentes atmósferas:
aerobiosis y anaerobiosis. La diferencia se obtiene durante la ventilación de los frascos, el
potencial redox, en el último caso deberá ser lo suficientemente bajo, como para permitir el
crecimiento de la mayoría de microorganismos anaerobios patógenos.

En condiciones óptimas de laboratorio, se debe de tomar por lo menos tres muestras en 14

horas, con intervalos de una hora previa a la aparición de la fiebre y considerar que la muestra
contiene bajo número de bacterias y que en algunas ocasiones estas se eliminan a la sangre
en forma intermitente.

Recientemente se ha generalizado el uso del polianetolsulfanato de sodio (SPS) al 0.03-0.05%

que es muy efectivo en la prevención de la coagulación, inhibe parcialmente el efecto de
algunos antibióticos (estreptomicina, kanamicina por ejemplo), inactiva polimorfonucleares bajo
el poder bactericida del suero; aunque por otra parte se ha visto que inhibe el desarrollo de
Peptostreptococcus anaerobius, Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, el cual se
puede evitar agregando al medio gelatina en una concentración del 1-2%. Otros agentes no tan
efectivos como el SPS son: citrato de sodio al 0.5% (inhibe cocas gram positivos), amilosulfato
de sodio o SAS (inhibe Klebsiella), etc.

En pacientes que han recibido tratamiento con penicilina, se recomienda agregar penicilinas
como estabilizador osmótico, sacarosa al 10–30%, aunque esta concentración impide el
crecimiento de hongos, por lo que se recomienda en casos especiales y en concentraciones
del 10 – 15%.

METODOLOGÍA DEL HEMOCULTIVO.

Extracción de muestra sanguínea.

1.- En condiciones asépticas de la piel, tomar muestra de sangre.

2.- Obtener aproximadamente 5 ml de sangre venosa.
3.- Cambiar la aguja a la jeringa para depositar muestra en el medio.
4.- Del frasco de hemocultivo retirar el sello de seguridad, y limpiar la zona con solución yodada
y luego con alcohol al 70%. (Opción alternativa uso de clorhexidina como antiséptico).

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 76

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5.- Agregar de forma inclinada y con cuidado 3 ml de sangre al medio de hemocultivo. (Nota:
la cantidad de sangre que se agrega al medio debe de ser en una proporción 1:1, por ello es
importante revisar cuanto se debe de agregar al medio.)
6.- Homogeneizar suavemente para evitar coagulación. (Revisar las indicaciones del
proveedor).
7.- Incubar a 37° C.

OBSERVACIONES.

RESULTADOS.

CUESTIONARIO.

2. ¿Cuál es la importancia de realizar un hemocultivo?

3. ¿Para qué tipo de enfermedades se solicita un hemocultivo?

4. ¿Cuáles son las características que ofrece el hemocultivo para la recuperación de los
microorganismos?

5. ¿Cuál es el momento más oportuno para realizar un hemocultivo?

6. ¿Cuántos tipos de medio para hemocultivo existen?

PARTE II.

Determinación de las reacciones febriles.

Las reacciones febriles son un conjunto de pruebas que sirven para diagnosticar enfermedades
que cursan con fiebre, como Fiebre tifoidea (Salmonella), Brucelosis (fiebre ondulante, fiebre de
Malta) y Rickettsiosis (Fiebre Q, fiebre de las montañas rocallosas).

Los antígenos febriles se usan para detectar anticuerpos en el suero del paciente contra la
Salmonella, Brucella y Rickettsias (reacción cruzada con Proteus OX-19).

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 77

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Estas reacciones se basan en el hecho de que cuando el organismo humano es invadido por
agentes infecciosos, responde produciendo anticuerpos aglutinantes contra ellos los cuales se
ponen de manifiesto al entrar en contacto el antígeno con el anticuerpo específico. El título
(valor) del anticuerpo depende del tipo y curso de la enfermedad. Para que los resultados
tengan un valor diagnóstico el título de ellos debe aumentar, por lo que se deben tomar 2
muestras separadas por un periodo de tiempo de 4 semanas para ser comparadas.

El informe del resultado de la prueba se hace tomando en consideración la dilución más alta
que se observe en la reacción positiva.

Las reacciones febriles incluyen:

Fiebre tifoidea (Salmonella). La reacción de Widal en un método serológico usado

comúnmente en el diagnóstico de las fiebres tifoideas, entérica y ondulante, la reacción mide el
título del suero contra una suspensión de microorganismo conocidos.

La fiebre tifoidea es una enfermedad infectocontagiosa de alta prevalencia a nivel mundial,

deriva su nombre del latín tyvphos, que significa oscurecimiento de los sentidos o mente turbia;
es causada por la bacteria Salmonella typhi, nombrada así en honor del bacteriólogo
estadounidense David Salmon.

Cuadro clínico: La fiebre tifoidea está caracterizada por fiebre alta constante (40º), sudoración
profusa, gastroenteritis y diarrea. Menos comúnmente puede aparecer un sarpullido de
manchas aplanadas de color rosáceo (roséola). Tradicionalmente se divide en cuatro fases,
durando cada una de ellas una semana aproximadamente.

Primera semana: Durante esta fase sube lentamente la temperatura con una bradicardia
relativa, malestar general, dolor de cabeza y tos. Se ha observado epistaxis en una cuarta parte
de los casos. Hay leucopenia con eosinopenia y linfocitosis relativa.

Segunda semana: Durante esta fase se produce la postración. Llegando la fiebre a los 40º C.
Hay bradicardia con un pulso dicrótico. El delirio es frecuente (este delirio le da a la Fiebre
Tifoidea el nombre de fiebre nerviosa). En un tercio de los pacientes se han observado puntos
rojos en la parte inferior del pecho y abdomen. Hay respiración agitada. El abdomen está
distendido y dolorido en cuadrante derecho inferior. La diarrea puede también ocurrir en esta
fase, de apariencia verde y olor característico con apariencia de puré de guisantes. No
obstante, el estreñimiento también es frecuente. El bazo e hígado están inflamados con un
aumento del nivel de transaminasas.

Tercera semana: En esta semana si la fiebre tifoidea no se trata, las complicaciones son
frecuentes: Hemorragias Intestinales debidas a la congestión de las Placas de Peyer (serias,
pero no necesariamente mortales); Perforación intestinal en el Íleon que puede dar lugar a
Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 78
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peritonitis; abscesos que pueden derivar en encefalitis, colecistitis, endocarditis y osteítis; y fallo
renal.

Finales de Tercera semana/Principios de la cuarta: La temperatura corporal se va

restableciendo, pero el debilitamiento aun persiste
El género Salmonella tiene una estructura con tres tipos de antígenos:
1. Antígeno somático (O)
2. Antígeno flagelar (H) o (d)
3. Antígeno capsular o de envoltura (Vi) o (K).

Brucelosis (Brucella abortus). La Brucelosis (conocida también como fiebre de Malta, fiebre
ondulante, enfermedad de Bang o fiebre del Mediterráneo) es una Zoonosis es decir una
enfermedad que es transmitida de los animales al humano causada por bacterias del genero
Brucella. La enfermedad se adquiere por ingerir alimentos contaminados o mantener un
estrecho contacto con el ganado. La incidencia y prevalencia de la brucelosis tienen
importantes variaciones geográficas. Las zonas de mayor prevalencia corresponden a la región
del Mediterráneo, Asia occidental, algunas partes de África y América (Estados Unidos, México,
Brasil, Perú, Colombia y Argentina).

La brucelosis en el hombre se transmite por la ingesta de leche, sus productos y derivados

contaminados, no pasteurizados, por contacto con productos, subproductos y desechos como
tejidos o excreciones de animales enfermos, y por inoculación de brucelas o inhalación del
polvo de corrales o mataderos, donde éstas se encuentran; de ahí que atender animales que
se sospeche que han estado en contacto con el agente, manipular carne y vísceras de
animales infectados y trabajar en laboratorios, se consideren actividades ocupacionales de alto
riesgo.

Cuadro clínico:
Es una enfermedad que se autolimita o se vuelve crónica. Muchos pacientes padecen
infecciones asintomáticas.

• La forma aguda de la brucelosis se caracteriza por fiebre que en la mayoría de los casos es
alta e intermitente (ondulante), presentándose generalmente por la tarde/noche acompañada
de cefalea intensa frontal y occipital, y diaforesis. En bazo, hígado, ganglios linfáticos aparecen
nódulos granulomatosos que pueden evolucionar hasta convertirse en abscesos.

• En la forma crónica, las manifestaciones más comunes son:

1. Síndrome febril: habitualmente de poca intensidad en la mayoría de los casos.

2. Osteoarticulares: poli o monoartritis, gránulos óseos, abscesos.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 79

 MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGIA MÉDICA. QFB-UMSNH

3. Psíquicas: síndrome depresivo, nerviosismo, irritabilidad.

4. Digestivas: esplenopahetomegalía, hepatitis.
5. Neurológicas: meningobrucelosis, polineuritis, síndrome ciático, síndrome radicular.
6. Hematológicas: anemia hemolítica, anemia ferropriva.
7. Respiratorias: bronquitis, neumonía

Diagnóstico:
El diagnóstico de certeza se establece aislando al microorganismo a partir de cultivos de
sangre, médula ósea u otros tejidos. Los métodos serológicos como las reacciones febriles sólo
aportan un diagnóstico presuntivo. Existen varios métodos serológicos para el diagnóstico de
Brucelosis como el Rosa de Bengala, 2-mercapto-etanol, y la reacción de Huddleson, esta
última es la utilizada en la prueba de reacciones febriles.

Reacción de Huddleson: es una reacción de aglutinación rápida en placa donde se enfrentan

cantidades decrecientes del suero a investigar con cantidades constantes de antígeno y se
observa la presencia o no de aglutinación. Existe una escala de títulos, establecida por
convención, que permite la expresión de resultados. Se utiliza una suspensión Antígenos de B.
abortus al 3-10% de gérmenes en fenol, con verde brillante y cristal violeta para la búsqueda de
anticuerpos.

Interpretación:
En la interpretación de estos resultados, se deben tomar en consideración los aspectos clínico-
epidemiológicos de cada caso, hay que considerar los falsos positivos y falsos negativos.

El tratamiento del paciente sospechoso o confirmado debe indicarse bajo vigilancia médica, o
por personal debidamente capacitado

Rickettsiosis (Proteus 0X-19): Las Rickettsias son bacterias cocobacilares, muchas de ellas
son transmitidas por vectores como pulgas, garrapatas y piojos. En general la Rickettsiosis se
considera una zoonosis, siendo el humano un huésped accidental excepto por el tifo epidémico
(transmitido por piojos).

Son parásitos intracelulares estrictos, por eso existieron dudas mucho tiempo sobre si
pertenecían a los virus o a las bacterias. Son muy sensibles y raramente sobreviven fuera del
huésped (reservorio o vector), a excepción de Coxiella burnetii (productora de la fiebre Q) que
es resistente a la desecación, al calor y la luz solar y se transmite fundamentalmente por vía
aérea. El resto es inoculado al huésped directamente a través de una picadura (indolora) en la
dermis producida por el vector, por contaminación de la picadura con las heces del insecto o
bien por inoculación de las mucosas con las heces contaminadas del mismo.

Las Rickettsiosis se puede dividir en 3 grandes grupos.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 80

 MANUAL DE PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGIA MÉDICA. QFB-UMSNH

1. Grupo Tifus: tifo epidémico, por Rickettsia prowazekii, transmitido por piojos (Poulex
ivitans) y tifo clásico endémico, por Rickettsia typha por la pulga.
2. Grupo de Fiebre manchada: Rickettsia rickettsii, que implica más de 30 especies,
transmitido principalmente por ácaros y pulgas (Fiebre manchada de las montañas
rocallosas).
3. Tifus Scrub: Orientia tsutsugamushi, también llamado tifo de los matorrales, transmitido
por ácaros.

Otras Rickettsiosis como la Fiebre Q ocasionada por Coxiella burnetti y la Ehrlichiosis (causada
por Ehrlichia sp).

Cuadro clínico: El periodo de incubación es de aproximadamente 7 días y varia de 2 a 14

días. Los síntomas en general, se caracterizan por fiebre, cefalea (dolor de cabeza), rash
(erupciones cutáneas), dolor abdominal, hepatomegalia, esplenomegalia y síntomas
respiratorios como tos, entre otros síntomas, acompañados de anormalidades en las muestras
de laboratorios como: anemia, neutrofilia, elevación de las enzimas hepáticas, trombocitosis e
hipoalbuminemia, que se pueden confundir con leptospirosis, otras Rickettsiosis.

Diagnóstico: es fundamental para el diagnóstico considerar el contexto epidemiológico: zona

geográfica, viajes a zonas endémicas, contacto con animales reservorio, antecedentes de
acampadas y medio profesional.

La confirmación del diagnóstico de una enfermedad por Rickettsias requiere estudios

serológicos ya que cultivar la bacteria sólo es posible en laboratorios especializados y además
se precisan cultivos celulares (parecidos a los cultivos virales).

En las reacciones febriles se utiliza la reacción de Weil-Felix, esta prueba en si no busca

Rickettsias, se basa en la capacidad del suero del paciente infectado por Rickettsias para
aglutinar ciertas cepas de Proteus (Reacción cruzada) por lo que es poco sensible y específica
y siempre deberá seguirse de pruebas confirmatorias (fijación del complemento,
hemaglutinación indirecta, inmunofluorescencia directa e indirecta y otras). La reacción de Weil
–Felix siempre es negativa en la fiebre Q.

METODOLOGÍA.
Extracción de Sangre.
1.- En condiciones asépticas realizar extracción venosa.
2.- Esperar aproximadamente 10 min para que la muestra coagule.
3.- Centrifugar 3000 rpm por 5 min.
4.- Obtener suero y colocar en otro tubo limpio.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 81

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Metodología para realizar las reacciones febriles.

El kit de reacciones febriles contiene 6 pruebas, es decir:
• Reactivo para Salmonella paratyphi AH (antígeno a flagelar).
• Reactivo para Salmonella paratyphi BH (antígeno b flagelar).
• Reactivo para Salmonella typhi H (d flagelar).
• Reactivo para Salmonella typhi O (somático).
• Reactivo para Brucella abortus.
• Reactivo para Proteus OX19.

PROCEDIMIENTO.

Método de aglutinación en porta objetos (cualitativo).

1.- Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.

2.- Depositar en seis círculos diferentes 50 µl del suero a ensayar.
3.- Homogeneizar el reactivo suavemente antes del ensayo.
4.- A cada gota de muestra agregar una gota de los seis reactivos que incluye el kit. Es decir,
una gota para cada uno de los reactivos.
5.- Mezclar con la ayuda de un palillo, procurando la extensión de las gotas en todo el círculo.
6.- Agitar durante un minuto y observar la aglutinación.

Método de aglutinación en porta objetos (titulación).

1.- Utilizando una micropipeta, dispensar 40, 20, 10 y 5 µl de muestra no diluida en círculos
separados de un portaobjetos.
2.- Depositar 50 µl del antígeno que aglutino en las diferentes cantidades de muestra a
ensayar.
3.- Mezclar con la ayuda de un palillo, procurando la extensión de las gotas en todo el círculo.
4.- Agitar durante un minuto y observar la aglutinación.

RESULTADOS.

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFIA.

Vega, R; Guzmán, J; Torres, M; Suárez, S; Ayala, J; Figueroa, P. Página 82