Bioquímica Practica 7 Cuantificación de Proteínas
Cargado por
Itzel TorresBioquímica Practica 7 Cuantificación de Proteínas
Cargado por
Itzel TorresUNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 7.
CUANTIFICACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD Y LOWRY
Grupo: 1103
Número del equipo: 5
Integrantes del equipo:
Arteaga Pineda Natalia
Bustamante Rueda Abril
García Monreal Jacqueline
Torres García Itzel
Profesores
QFB Juana Alicia Alquicira Camacho
MVZ Francisco Javier Cervantes Aguilar
M en M Esperanza García López
Fecha: 19 de octubre de 2012
ÍNDICE
Pagina
Resumen
1
Introducción
2
Objetivos
5
Hipótesis
5
Materiales
6
Metodología
7
Resultados obtenidos
9
Discusión
12
Conclusiones
12
13
Recomendaciones y sugerencias
Referencias
13
Resumen
Las proteínas son uniones de 1 o varios aminoácidos y cuentan con 4 tipos de
estructura distintas:
La estructura primaria es la más sencilla ya que son cadenas de aminoácidos
unidos por enlaces peptídicos, la segunda estructura cuenta con en forma de
hélice que pueden ser de 2 tipos α-hélice o β- hélice formadas por puentes de
hidrogeno, las estructuras terciaria y cuaternaria son las más complejas ya que
presentan tridimensionalidad lo cual le da a la proteína su funcionalidad.
Existen muchos métodos para la cuantificación de proteínas que responden a
ciertos criterios:
La cantidad total de proteínas en la muestra
La concentración de la proteína
Le especificad del método
La presencia de otras sustancias que pudieran interferir
La facilidad y reproducibilidad del método
En este caso usaremos el método de Bradford en el cual se utiliza azul de
Coomassie, está diseñado para cuantificar 1-10mg de proteínas, es un método
sencillo de realizar y la cantidad de reactivo que se desperdicia es muy poca ya
que se utilizan µL
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Introducción
Qué es una enzima?
Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas. Son las
biomoleculas más esenciales de la vida debido a su extraordinaria capacidad catalítica (acelerar
una determinada reacción bioquímica) y su especificidad al actuar con uno o varios sustratos ( se
refiere a las moléculas sobre la cual ejercerá la enzima su acción catalítica)para después
convertirlos en productos. Se han identificado más de 2000 enzimas diferentes y mayor parte de
estas enzimas se relacionan con el metabolismo básico de una célula .
Las enzimas se clasifican acorde al tipo de reacción que vayan a tener sobre el sustrato:
1.- Óxido reductasas: reacciones de óxido reducción
2.-Transferasas: transferencia de grupos funcionales
3.-Hidrolasas (reacciones de hidrólisis)
4.-Liasas (Adición de dobles enlaces)
5.- Isomerasas (Reacciones de isomerización)
6.- Ligasas (Formación de enlaces con escisión de ATP)
Hay que tener en consideración que todas las reacciones químicas se llevan a término debido a
que las moléculas involucradas tienen una velocidad de “arranque”, es decir que llegan a cierto
nivel de energía para poder alcanzar un estado activo; a esto se le llama energía de activación o de
transición, en este estado las probabilidades de que se establezca un rompimiento químico para
formar el producto P. Además siempre se debe recordar que para llegar a este estado debió haber
existido un estado energético inicial de los productos y un estado energético de transición o
intermedio.
Por lo tanto se entenderá al concepto de enzima como: una proteína capaz de acelerar ciertos
procesos a nivel celular para poder obtener nuevos compuestos a partir de un sustrato específico.
Si hay ausencia de la enzima se presentan problemas de salud debido a que las reacciones
tardarán demasiado en presentarse, no se presentaran o utilizarán demasiada energía como para
abastecer a todos los demás procesos metabólicos.
En la imagen anterior se explica la diferencia entre una reaccion catalizada y otra que no fue
catalizada.
Cinética enzimática
La cinética enzimática es el estudio de la velocidad de reacción en una enzima específica y las
condiciones que pueden afectar a la enzima a acelerar o retardar su velocidad o acelerarla ;
existen dos variables condicionantes para que exista una reacción, estos son el sustrato ( S) y el
producto (P). Además es de suma importancia conocer y entender el funcionamiento de los
sistemas enzimáticos dentro de la célula cuando nuestras variables se ven afectadas por ciertos
fenómenos como son:
- El pH, la temperatura, la concentración de sustrato contra la cantidad de enzimas y la
concentración de enzimas contra la cantidad de sustrado.
Para comprender cómo es que se ve afectada la velocidad de reacción de enzima sustrato es
fundamental comprender que en primer lugar el sustrato (S) y la enzima (E) se unen y forman un
complejo enzima-sustrato (ES). Una vez formado el complejo ES, este o bien se disocia en enzima
más el sustrato o se transforma el sustrato en producto formado el complejo enzima-producto (EP),
que se disocia para dar enzima (E) más producto (P).
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El complejo enzima producto puede ser irreversible
Para medir y comparar el nivel de velocidad de la actividad enzimática se considera una unidad de
tiempo determinada.
Lo que sucede en cada fenómeno:
V V
[E] [S]
Enzima Ureasa
La ureasa es una proteína que se categoriza como enzima ya que actúa específicamente por un
solo sustrato la urea (la urea se produce en el hígado), esta enzima cataliza la hidrólisis de la urea
a dióxido de carbono y amoniaco. Se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e
invertebrados. En las plantas, la ureasa es un hexámero y consiste en seis cadenas idénticas y se
encuentra en el citoplasma. En bacteria, consiste en dos o tres subunidades diferentes. Para su
activación, la ureasa necesita unir dos iones de níquel por subunidad.
Recomendaciones
Reacción de la hidrólisis de la urea por enzima ureasa.
4
Objetivos
Determinar la concentración de proteína en una muestra utilizando la proteína
estándar de albumina de suero bovino
Se realizara una curva de calibración con la concentración μg/μL de Albúmina de
suero bovino en el eje de las abscisas X, y la concentración de esta en el eje de
las ordenadas Y.
Determinar la concentración de proteínas de una muestra a través del método de
Bradford
Aprender el uso del espectrofotómetro para medio la absorbancia
Hipótesis
Por medio del reactivo de Bradford intentaremos contabilizar el número de
proteínas presentes en la albumina de suero bovino tratando de que la diferencia
entre cada pozo sea de décimas.
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Discusión:
Las curvas de calibración presentaron reproducibilidad ya que en los duplicados
de estas los datos no variaron en demasiado , sin embargo en la curva de la
determinación existieron valores que caen muy por debajo de la línea de
tendencia, esto se debe; al comparar estos dos datos con los restantes, a un error
en el analista y que pudo haberse causado en la medición de las concentraciones
de los tubos que se sometieron a lectura del espectrofotómetro, se presenta una
interferencia negativa con el surfactante y el detergente comercial, la reacción que
se presenta en estos casos es la apertura de la molécula de albumina, ya que son
agente tenso activos se intercalan entre las moléculas de albumina reduciendo
considerablemente su absorbancia, la cantidad de proteína es la misma en la
muestra pero la incapacidad de absorber la luz provoca que parezca que la
proteína desaparece.
Otros puntos importantes]:
* La intensidad de color aumenta de manera proporcional con respecto a la
concentración del analito.
* Se observó el efecto tanto negativo como positivo de las sustancias
interferentes de naturaleza no proteínica dependiendo de factores fisicoquímicos
de los analitos e interferencias.
* Se realizaron curvas de calibración por medio de métodos fotométricos los
cuales son altamente confiables, sensibles y reproducibles (esto último depende
una gran parte del analista)
* Existen errores en las determinaciones que pueden afectar notablemente los
resultados del análisis.
Recomendaciones y sugerencias:
Que el maestro encargado de sección realice el tubo blanco para evitar error
humano en nuestros resultados.
Tener además dos máquinas de baño María, ya que al ser solo una los alumnos
se aglomeraban en un solo espacio retrasando la práctica y probablemente
afectando los resultados.
Al inicio de clase explicar no solo teoría sino también para qué sirven cada uno de
los materiales y repasar cómo se deben medir los reactivos y soluciones.
FUENTES:
Lehninger Principios En Bioquímica(2000) 4ta Edición
Bioquímica(2004), PeNa, Arroyo, Gómez, Tapia, Gómez,. México, Limusa
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enzima5.html
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