Tema 12.

1: Técnicas utilizadas
1. Clonación
• Clonación: consiste en obtener múltiples copias de un fragmento específico de ADN
• Materiales empleados
▪ Plásmido: moléculas de ADN circular, de doble cadena, que se replican de forma
extracromosomal en bacterias o levaduras
o Contienen genes de resistencia a antibióticos y sitios de restricción
o Son capaces de transportar fragmentos cortos de ADN (hasta 15 kb)
▪ Enzimas de restricción: endonucleasas que reconocen secuencias específicas de ADN
(generalmente palindrómicas) y cortan los enlaces fosfodiéster en esos sitios
o Estas enzimas son extraídas de bacterias, donde actúan como un mecanismo de defensa frente a
material genético extraño
o Toman el nombre de las bacterias que las producen como EcoRI, cuyo nombre proviene de: E: género
(Escherichia); Co: Especie (coli); R: cepa; I: primera enzima aislada en esa cepa
▪ Ligasa: enzima que une los extremos del ADN, formando enlaces fosfodiéster entre fragmentos
▪ Antibiótico: se utilizan para seleccionar bacterias que han incorporado el plásmido
• Proceso: consiste en insertar un fragmento de ADN en un plásmido,
que luego se introduce en bacterias para su replicación
▪ Primero, se selecciona un plásmido que contiene un gen de
resistencia a antibióticos y sitios de restricción específicos
▪ Tanto el plásmido como el fragmento de ADN a clonar se
cortan utilizando enzimas de restricción, que reconocen
secuencias palindrómicas y generan extremos cohesivos
▪ A continuación, el fragmento de ADN se une al plásmido
gracias a la acción de una ligasa, que restablece los enlaces
fosfodiéster
▪ El plásmido recombinante se introduce en bacterias mediante
transformación, y estas se cultivan en un medio con
antibióticos para seleccionar únicamente aquellas que han
adquirido el plásmido
2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• PCR: método de amplificación de ADN desarrollado en los años 80 por Kary Mullis
• Se realiza mediante polimerasas de ADN estable y cebadores de
hebra simple en hebras opuestas
• Se debe realizar con un programa de temperaturas específicas
(desnaturalización, anillamiento, elongación)
• Estas polimerasas permiten tener más sensibilidad y robustez
• Variaciones de PCR
▪ PCR anidada: se emplean los productos de la primera reacción
de ADN para realizar una nueva tras meter nuevos primers
▪ PCR in situ: se realiza directamente sobre portaobjetos, asegurando una adecuada desnaturalización para
que los primers puedan acceder al ADN objetivo
 ▪ PCR múltiple: emplea varios pares de primers en una misma reacción para amplificar simultáneamente
múltiples fragmentos de ADN sin solaparse
▪ RT-PCR: usa una transcriptasa inversa para convertir ARN en ADN complementario (ADNc), que luego es
amplificado mediante PCR
▪ Q-PCR: permite cuantificar el ADN amplificado en tiempo real utilizando sondas fluorescentes
▪ Otras:
o Asimétrica: se ajusta la cantidad de uno de los primers para obtener más copias de una de las cadenas
o Especifica de alelo: diseñada para amplificar selectivamente un alelo específico en presencia de
polimorfismos
o Hot start: comienza con una desnaturalización inicial a alta temperatura para evitar amplificaciones
inespecíficas antes de que la reacción alcance el equilibrio
o Touch down: utiliza ciclos con T de alineamiento gradualmente decrecientes para aumentar la
especificidad y robustez del proceso
2.1. PCR a tiempo real
• PCR a tiempo real: técnica que combina la amplificación de ADN con la detección
simultánea y cuantificación de los productos amplificados en cada ciclo del
proceso
• Existen 2 tipos
▪ PCR en tiempo real basada en colorantes fluorescentes: permite la
cuantificación fluorescente del ADN amplificado en termocicladores
especialmente diseñados
o Estos equipos están equipados con láseres que detectan fluoróforos y
muestran en tiempo real cómo se produce la amplificación en una pantalla
o A medida que se forma la cadena de ADN, la fluorescencia aumenta y puede cuantificarse
o Este método es más sensible que la PCR convencional
▪ PCR en tiempo real basada en sondas de ADN (TaqMan): se utilizan sondas marcadas con fluoróforos y
quenchers (molécula que bloquea la fluorescencia de una
sonda)
o Mientras la sonda no se haya hibridado con la secuencia
diana, el fluoróforo y el quencher permanecen cerca el
uno del otro, lo que impide que el fluoróforo emita luz
porque la energía del fluoróforo es absorbida por el
quencher, bloqueando la fluorescencia
o Cuando la Taq polimerasa amplifica la secuencia diana
en la reacción, esta sonda se descompone debido a la
actividad exonucleasa de la Taq polimerasa, separando
el fluoróforo y el quencher
o Esta separación permite que el fluoróforo emita luz, la cual es detectada por el termociclador
 o En un termociclador TaqMan, se monitorea la fluorescencia a medida
que la PCR progresa
❖ Inicialmente, en los primeros ciclos, la fluorescencia es baja
debido a un ruido de fondo (baseline) que permite identificar la
señal real
❖ A medida que avanza la amplificación, la señal de fluorescencia se
incrementa, y el valor de Ct (umbral de ciclo) se determina cuando la fluorescencia supera un
umbral definido
❖ El valor Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra: cuanto
menor sea el valor de Ct, mayor será la cantidad de ADN inicial
Figura: a parir del ctresor (ct) (línea roja), a partir de ahí eso
tiene valor estadístico
Si se tiene un valor ct de 25 es que en el ciclo 25 ya tiene una
valor estadístico
o Este sistema permite no solo cuantificar ADN con precisión, sino
también realizar un genotipado rápido
❖ Ej: En este caso tenemos una secuencia de ADN con 2 sondas
y como solo se les amplifica el alelo 1, la muestra será
homocigota (rojo)
AA: rojo; AT: verde; TT: azul
2.2. PCR digital
• PCR digital: permite contar de manera precisa y directa el
número de copias de un ADN objetivo en una muestra sin
necesidad de utilizar estándares o curvas de calibración
• Posee una alta sensibilidad, que permite detectar cantidades
extremadamente bajas de ADN
• Proceso: la muestra se pasa por un sistema que genera
microgotas, en las cuales se realiza una PCR individual
▪ Dentro de estas gotas, se incluyen primers, ARN y
polimerasa, lo que permite realizar una amplificación
de ADN en cada gota de forma independiente
▪ Los primers generalmente están marcados, y mediante
el uso de un láser, se puede observar y seleccionar qué
porcentaje de gotas ha amplificado el ADN objetivo
▪ En este proceso, el sistema introduce aire en un medio
de aceite, creando miles de pequeñas gotas, cada una
de las cuales contiene las condiciones necesarias para
realizar la PCR
▪ A medida que las gotas se mueven y amplifican el ADN, se detecta si la amplificación ha tenido lugar
• Esta técnica permite obtener una cuantificación absoluta sin necesidad de amplificación previa
• Aplicaciones: detectar expresión génica y mutaciones raras
3. Hibridación de ácidos nucleicos
• Hibridación de ácidos nucleicos proceso en el que se unen dos cadenas de ácidos nucleicos a través de enlaces
de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (2 AT, 3 GC)
• Este proceso se compone de dos etapas principales: desnaturalización, donde las cadenas de ADN se separan
por calor, y renaturalización, en la que las cadenas se emparejan nuevamente formando un heterodúplex,
siempre que sean complementarias
• Sin embargo, en ocasiones pueden formarse heteroduplexes o emparejamientos incorrectos (mismatches),
donde no se da una complementariedad perfecta entre las bases
• Puede ser útil para localizar secuencias parecidas, ya que dos cadenas de polinucleótidos (ADN; ARN) o una
hebra oligonucleótida simple formarán un dúplex/híbrido si el grado de complementariedad de bases entre
ellas es significativo
▪ Las condiciones del experimento determinaran el grado de no complementaridad permitida (mismatch)
▪ Para esto se emplea una sonda, una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para
encontrar su secuencia complementaria en el genoma de una muestra
o La sonda se coloca en contacto con la muestra bajo condiciones que permitan que la secuencia de la
sonda se hibride con su secuencia complementaria
o La sonda está marcada con un marcador radiactivo o químico que permite visualizarla
o De manera similar, se utilizan anticuerpos marcados para sondear una muestra para detectar la
presencia de una proteína específica
▪ Tipos de Marcaje: basados en proteínas (isoenzimas, proteínas de reserva) o basados en el ADN (RFLP,
AFLP, RAPD, VNTR, microsatélites, SNP, SFP, TRAPs)
4. Southern-Blot
• Southern-Blot: técnica molecular utilizada para identificar y analizar secuencias
específicas de ADN
▪ Es particularmente útil para identificar alelos de repeticiones, como en el caso del
síndrome del X frágil, y para detectar variaciones en la longitud de los fragmentos
de ADN que pueden estar relacionadas con enfermedades genéticas
▪ Esta técnica es especialmente útil para identificar repeticiones largas o secuencias específicas de ADN en
muestras complejas
• Proceso: comienza con la digestión del ADN utilizando enzimas de
restricción, lo que fragmenta el ADN en piezas de diferentes tamaños
▪ Luego, se realiza una electroforesis en gel de agarosa para separar
estos fragmentos según su tamaño
▪ Una vez separados, los fragmentos de ADN se transfieren a una
membrana de nitrocelulosa mediante un proceso de capilaridad,
utilizando una solución tampón y papeles absorbentes que
facilitan el movimiento del líquido a través de las capas,
permitiendo que el ADN se adhiera a la membrana
▪ Posteriormente, se hibrida la membrana con una sonda marcada que se une específicamente a la
secuencia de interés
▪ Finalmente, la presencia de la secuencia objetivo se revela mediante rayos X o un sistema de detección por
color, dependiendo del tipo de marcador utilizado
5. Microarray
• Microarray: técnica que permite analizar la expresión
génica o realizar estudios genéticos a gran escala
• Proceso: comienza con la preparación de un soporte sólido
(spotting), similar a un portaobjetos, en el que se fijan
sondas específicas generadas por PCR
▪ Estas sondas corresponden a fragmentos de ADN o
ARN que representan secuencias génicas de interés
▪ A continuación, se extraen dos muestras de ARN de
interés y se marcan con fluoróforos de colores diferentes, como rojo y verde, para diferenciarlas
▪ Las muestras marcadas se incuban con las sondas en el microarray, donde las hebras de ARN se hibridan
con las sondas complementarias presentes
▪ Después de la hibridación, se ilumina el microarray, lo que hace que los fluoróforos emitan luz
▪ La señal emitida se captura en imágenes, y el color de la señal indica la fuente de la muestra: rojo para la
muestra 1, verde para la muestra 2 y amarillo cuando ambas muestras se hibridan igualmente
• Este proceso permite observar la expresión de diferentes genes y, en el caso de realizar un array genómico, se
puede analizar el genoma completo
• La técnica también se utiliza en chips de genotipado para identificar variaciones genéticas en todo el genoma
5.1. Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH)
• Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH): técnica utilizada para detectar microdeleciones,
duplicaciones y otras alteraciones genómicas
• Es capaz de cubrir todo el geno, ofreciendo una visión
más detallas de las variaciones genómicas
• En este proceso, se preparan dos muestras de ADN: una
del paciente y otra de control
▪ Ambas muestras se marcan con tintes fluorescentes
de diferentes colores, generalmente verde para el
ADN del paciente y rojo para el control
▪ Luego, se hibridan con un soporte que contiene
secuencias representativas de todo el genoma
▪ Tras la hibridación, el microarray permite observar las áreas donde se han unido las muestras y visualizar
las regiones genómicas que presentan variaciones
▪ La señal fluorescente generada se mide mediante un
escáner, y el software analiza los datos para determinar la
cantidad de hibridación de cada muestra en las distintas
regiones
o Si la muestra del paciente muestra más verde, indica
una pérdida de material genético, mientras que si es
roja, hay una ganancia en comparación con el control
o Si ambas muestras muestran una hibridación similar, se
observa color amarillo, lo que indica que no hay
variaciones entre ellas
6. Multiple Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA)
• Multiple Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA): técnica que combina sondas específicas con la
amplificación por PCR para analizar variaciones en el ADN, como mutaciones, repeticiones de secuencias y
pérdidas o ganancias de material genético
• Proceso: se emplean 2 tipos de sonda
▪ La primera sonda es complementaria a la región que se quiere
analizar, y contiene una secuencia que se empareja con el ADN
objetivo
o Esta sonda también tiene una secuencia adicional que es
complementaria al primer, lo que facilita la unión con la
segunda sonda
▪ La segunda sonda tiene una secuencia complementaria al primer utilizado y una longitud diferente, lo que
permite diferenciarla de la primera
▪ Una vez que las sondas se unen a su región complementaria en el
ADN, se lleva a cabo una reacción de ligación con una ligasa
▪ Solo las sondas que están correctamente emparejadas se ligarán,
formando un fragmento específico
▪ Luego, este fragmento se amplifica mediante PCR con primers
específicos, lo que genera fragmentos de diferentes tamaños
dependiendo de las repeticiones presentes en la región de interés
▪ Durante la amplificación, los primers están m arcados con fluoróforos, permitiendo la detección de los
fragmentos amplificados
o La intensidad de la fluorescencia indica la cantidad de
repeticiones o la presencia de mutaciones
o Si hay muchas repeticiones, se generarán picos de fluorescencia
más altos, mientras que en el caso de deleciones o pérdidas de
secuencias, se observará una disminución de la fluorescencia
7. Secuenciación Sanger
• Secuenciación Sanger: técnica ampliamente utilizada para confirmar y estudiar la segregación familiar de
enfermedades genéticas, ya que permite identificar mutaciones específicas en el ADN en regiones pequeñas
• La secuenciación se basa en el principio de la síntesis del ADN mediada por la ADN polimerasa
▪ Esta enzima se une a un cebador en una cadena de ADN y comienza a añadir nucleótidos para formar una
nueva cadena
▪ Sin embargo, en lugar de usar los nucleótidos
normales, se incorporan didesoxinucleótidos
(ddNTPs), nucleótidos carecen de un grupo 3'-OH en
el azúcar, lo que impide la adición de más nucleótidos,
deteniendo así la síntesis de la cadena de ADN
▪ Como resultado, se generan fragmentos de ADN de diferentes longitudes, que luego se separan por
electroforesis en un gel
▪ Cada fragmento termina en un ddNTP específico, lo que permite identificar en qué posición se detuvo la
cadena
▪ Los fragmentos generados se leen en forma de picos en un cromatograma
• Un ejemplo común es cuando ambos padres son portadores de una mutación, y en la secuenciación, se
observan dos picos que indican heterocigosidad, lo
que significa que ambos alelos en ese locus son
diferentes
▪ En los hijos, si ambos alelos son idénticos, como
en el caso de homocigotos para la mutación, los
picos se solapan, lo que indica que ambos alelos
son iguales y responsables de la condición
Tema 12.2: Diagnóstico molecular
1. Indicaciones para las pruebas
• Si tu médico ha observado síntomas que pueden indicar una enfermedad genética
• Si en la familia ha habido algún caso de enfermedad hereditaria, cáncer hereditario, malformaciones congénitas
o alteraciones cromosómicas
• Si padeces infertilidad, has tenido dos o más abortos involuntarios o el bebé nació muerto
• Si existe algún tipo de parentesco con tu pareja y os estáis planteando tener hijos
• Si has tenido un niño con retraso mental, alteraciones en el desarrollo o malformaciones congénitas
• Si te quedas embarazada o estás pensando en quedarte embarazada a partir de los 35 años
• Si te han hecho hallazgos anormales en las ecografías o en cualquier otra prueba realizada durante el embarazo
que puedan sugerir posibles desórdenes genéticos o cromosómicos
• Si perteneces a un grupo étnico con alta incidencia de ciertas enfermedades genéticas
2. Diagnóstico postnatal
• Pruebas genéticas ante sospecha clínica
• Trastornos autosómicos dominantes de aparición tardía o penetrancia incompleta
▪ Pruebas genéticas directas: se efectúan cuando ya hay un familiar afectado, pero se debe ser cauteloso,
ya que el diagnóstico podría ser incierto, especialmente en menores que deben ser evaluados
psicológicamente
▪ Exploración clínica: puede incluir la observación de características como manchas café en la piel
▪ Investigación especializada: puede incluir pruebas como el TAC, que en algunos casos revela características
específicas como calcificación en la esclerosis
▪ Pruebas bioquímica: permiten detectar alteraciones, como niveles elevados de colesterol, que pueden
llevar a un diagnóstico molecular
• Portadores enfermedad recesiva y ligada al X
▪ Manifestaciones clínicas en portadores: asintomático o presentar patologías leves
o Ej: Enfermedades oftalmológicas, donde se pueden observar anomalías en el fondo del ojo
▪ Presentan anomalías bioquímicas
o Ej: Enfermedad de Tay-Sachs, prevalente en comunidades judías ortodoxas, donde se observa un valor
intermedio de beta-hexosaminidasa, lo que indica que la persona es portadora
3. Diagnóstico prenatal
• Ecografía: permite observar características físicas del feto que pueden indicar enfermedades
▪ Ej: un pliegue de translucencia bucal incrementado puede ser un signo de síndrome de
Down, y una mandíbula estrecha también puede ser indicativa de ciertas patologías
• Amniocentesis: consiste en extraer una muestra de líquido amniótico para analizar las células fetales, que
corresponden a la piel del feto
▪ Esto permite realizar un cariotipado y detectar trisomías, así como determinar el sexo del feto
▪ También se mide la alfa-fetoproteína, un marcador que puede indicar anomalías genéticas
• Vellosidad coriónica: se extrae un tejido fetal que dará lugar a la placenta, generalmente entre las semanas 9 y
11 del embarazo
▪ Esta muestra se puede usar para realizar técnicas de secuenciación genética y otras pruebas diagnósticas
▪ Ej: trisomía, que puede ser detectada por la presencia de tres picos característicos en los análisis
4. Diagnóstico preimplantacional
• Diagnóstico preimplantacional: técnica de selección de embriones que permite detectar enfermedades
genéticas antes de la implantación en el útero
• Procedimiento
▪ Estimulación ovárica: se estimula a la mujer para que produzca varios óvulos
▪ Micromanipulación embrionaria: se extrae un blastómero (una célula del
embrión) en la fase temprana del desarrollo embrionario (generalmente en la
etapa de 8 células), con el fin de obtener su ADN para su análisis genético
▪ Análisis genético: se analiza el ADN extraído para detectar la presencia o ausencia de la mutación genética
específica que se quiere evitar
o Esto permite identificar a los embriones portadores de la mutación
▪ Transferencia embrionaria: los embriones que no presentan la mutación se seleccionan
para ser transferidos al útero materno, mientras que los portadores de la mutación son descartados
5. Prenatal en sangre materna
• Diagnóstico prenatal en sangre materna: técnica no invasiva que permite obtener
información genética sobre el feto a partir de la sangre de la madre
▪ Esta práctica se combina con valores bioquímicos y la edad materna para calcular el
riesgo de enfermedades genéticas o cromosómicas en el feto
• En el torrente circulatorio materno circulan células fetales, lo que facilita la
extracción de ADN fetal a partir de una muestra de sangre de la madre
• La técnica fue introducida en 1997 y se puede realizar a partir de la séptima
semana de gestación
• A través de esta prueba, se pueden detectar varios aspectos clave, tales como:
cromosoma Y, valoración Rh y trisomía
5. Diagnóstico indirecto
• Diagnóstico indirecto: identificación de mutaciones genéticas mediante la
observación de cómo afecta un gen a un fenotipo o la presencia de ciertos
marcadores genéticos, sin necesidad de analizar directamente la mutación en el gen
específico
• Se puede utilizar una técnica como la PCR digital a partir de suero materno para
establecer si el feto presenta un defecto genético o no
▪ Esto se logra mediante el análisis de fragmentos de ADN fetal circulante en la
sangre materna, permitiendo identificar haplotipos específicos que indican
la presencia o ausencia de ciertas mutaciones
6. Asesoramiento genético
• Asesoramiento genético: proceso de comunicación en donde se proporciona información médica compleja al
paciente y/o familiares de forma sencilla respecto a la enfermedad, herencia, riesgo de recurrencia y opciones
disponibles (WEB SEAGEN)
▪ Problemas médicos de la enfermedad (curso, causas, manejo clínico)
▪ Herencia y riesgo de recurrencia
▪ Alternativas para reducir ocurrencia y recurrencia reproductivas
▪ Promover la salud/ ajustes mejora calidad vida
▪ Minimizar trauma
▪ Entender las implicaciones, limitaciones y resultados de un estudio genético
6.1. Consulta
• 1ª Fase
▪ Cuestionario: cuestiones demográficas, tipo de trabajo, contacto con sustancias, antecedentes de alguna
enfermedad, tabaco, medicación, alcohol y drogas, embarazos, cuestiones de relación familiar
(consanguinidad, origen), cuestiones familiares en relación a aspectos médico
Hay que ver si está expuesta a un tóxico, pues puede formar una fenocopia
▪ Pruebas o informes
▪ Árbol genealógico
• Informe
▪ Patrón hereditario o no: modo de herencia, mecanismo genético, relación con el afectado en la familia,
historia familiar, condicionantes ambientales o modificadores
▪ Estimación riesgo familiar
o Probabilidad de desarrollar la enfermedad
o Probabilidad de ser portador
o Probabilidad de transmisión de la enfermedad
▪ Pruebas genéticas específicas
• 2ª Fase
▪ Conveniencia pruebas genéticas: beneficios y riesgos del test, implicaciones del test, implicaciones
familiares, probabilidades de herencia, prevención alternativas
▪ Resultados y limitaciones de las pruebas
▪ Impacto emocional
▪ Información
o Debe de ser apropiada, honesta, objetiva, suficiente, apropiada a la edad
o Es necesario que el paciente lo entienda y hay que asegurarse de ello
o Folletos informativos
6.2. Consentimiento informado
• Libre autonomía de las personas
• Información por escrito
• Representación si incapacitado legalmente
• Revocable
• Sin prejuicio en la asistencia sanitaria
• Derecho a la información o a la no información
• Protección de datos 3/2018
• Ley biomédica 14/2007. BOE 159, 4 de julio 2007
▪ Garantiza la accesibilidad, equidad y gratuidad
▪ Asegura la obligatoriedad del consentimiento y el deber de confidencialidad
▪ Reconoce el derecho a la información y a no ser informado
▪ Regula los cribados genético
6.3. Situaciones
• Test diagnóstico
• Test predictivo
• Test de susceptibilidad
• Test farmacogenético
• Test de portador
• Test prenatal
• Test preimplantacional
• Screening genético
6.4. Consejero Genético
• Profesional sanitario
• Preparado académicamente
• Grupo multidisciplinar
• Dar información comprensiva sobre riesgo
• Efectividad de las tecnologías
• Facilitar un proceso informado de decisión
• Apoyo psicológico
• Contacto con organizaciones
6.5. Familia
• Los aspectos genéticos son generales a la familia y esto es fuente de conflicto
• Consejo debe de ser accesible para aquellos individuos a riesgo
• Hay que pensar como contactar con ellos antes del test
• Hay que tener en cuenta los aspectos culturales y étnicos
• Incapaces de consentir: las pruebas se realizarían pensando en lo mejor para el paciente, o en la salud de la
familia
▪ Se necesita autorización de la persona que tenga la tutela
• Niños: las pruebas se realizarán en el mejor de los intereses de la salud del niño o de la familia
▪ La edad de consentimiento de un niño debe de ser flexible
6.6. Principios Generales
• Autonomía: para que las personas tengan capacidad de toma de decisiones
• Beneficencia: las decisiones para hacer el bien
• No maleficencia
• Justicia: que no se produzca discriminación