MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

MICROORGANISMOS EN SUELOS, AGUAS,

PLANTA, MATERIALES ORGÁNICOS:

DE LA TEORÍA
A LA PRÁCTICA
Reservados todos los derechos Editorial Pontificia Universidad Javeriana
@Pontificia Universidad Javeriana Carrera 7 No 37 - 25- oficina 1301
@Aura Marina Pedroza-Rodriguez, Bogotá, Edificio Lutaima
María Mercedes Martínez Salgado, Teléfono: 601 320 8320 Ext. 4205
Rodrigo Ortega Blu, Marcela Franco-Correa, [Link]/editorial
Claudia Marcela Rivera Hoyos, editorialpuj@[Link]
Luis David Gómez Méndez,
Lucía Ana Díaz Ariza, Luis Camilo Jiménez, Diseño de pauta: Manolo Perdomo
Juan Carlos Salcedo Reyes,
Ana Karina Carrascal-Camacho, Diseño de cubierta: Manolo Perdomo
Adriana Inés Paéz Morales,
Raúl Alberto Poutou-Piñales, Pontificia Universidad Javeriana
Adriana Matiz Villamil Vigilada Mineducación.
Reconocimiento como Universidad.
Primera edición: mayo de 2024 Decreto 1270 del 30 de mayo de 1964.
ISNB: 978-958-781-925-0 Reconocimiento como personería jurídica:
Resolución 73 del 12 de diciembre
Hecho en Colombia del Ministerio de Gobierno.
Made in Colombia
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
MICROORGANISMOS EN SUELOS, AGUAS,
PLANTA, MATERIALES ORGÁNICOS:

DE LA TEORÍA
A LA PRÁCTICA
EDITORES
AURA MARINA PEDROZA RODRÍGUEZ

Bacterióloga, MSc. PhD. Profesor titular II,

Departamento de Microbiología,
Facultad de Ciencias.
Pontificia Universidad Javeriana.
Bogotá, Colombia.

MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ SALGADO

Microbióloga. MSc. PhD.

Investigadora de la Universidad de Bonn.
Alemania.

RODRIGO ORTEGA BLU

Ingeniero Agrónomo. MSc. PhD.

Académico del Departamento de Ingeniería Comercial.
Universidad Técnica Federico Santa María,
Santiago de Chile, Chile.
AUTORES POR CAPÍTULOS
RODRIGO ORTEGA BLU. Ingeniero Agrónomo. PhD.
VIVIANA GUTIÉRREZ ROMERO. Microbióloga [Link].
MARCELA FRANCO CORREA. Microbióloga [Link]. PhD.
AURA MARINA PEDROZA RODRÍGUEZ. Bacterióloga. [Link]. PhD.
MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ SALGADO. Microbióloga [Link]. PhD.
CLAUDIA MARCELA RIVERA HOYOS. Bióloga. [Link]. PhD.
LUIS DAVID GÓMEZ MÉNDEZ. Microbiólogo [Link]. PhD.
RENE NOVO. Ingeniero Agrónomo M. Sc., PhD (Profesor Emerito) QEPD.
LUCIA ANA DÍAZ ARIZA. Microbióloga. [Link].
NATALIA SÁNCHEZ SÁNCHEZ. Microbióloga Industrial.
LUIS CAMILO JIMÉNEZ. Físico matemático. Maestría en Física.
JUAN CARLOS SALCEDO REYES. Físico. PhD. F.M.
MARÍA CLAUDIA CAMPOS PINILLA. Bacterióloga [Link]. PhD.
ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. Bacterióloga [Link].
EDWIN DAVID MORALES. Biólogo. [Link]. Ph.D.
FIDSON JUARISMY VESGA PÉREZ. Bióloga. [Link]. PhD.
ADRIANA INÉS PÁEZ MORALES. Microbióloga Industrial. MSc.
RAÚL ALBERTO POUTOU PIÑALES. BQ., [Link]., PhD.
ILLIANA CHAMORRO. Microbióloga Industrial. [Link].
ADRIANA MATIZ VILLAMIL. Bacterióloga. [Link].
LUCAS DAVID PEDROZA CAMACHO. Ingeniero Ambiental y Sanitario. Biólogo.
JUAN CAMILO LORES ACOSTA. Ingeniero Ambiental y Sanitario.
JUAN FELIPE MATEUS MALDONADO. Microbiólogo Industrial. [Link].
NICOLAS YUSEB BULLA. Microbiólogo Industrial. Estudiante de Maestría en Ingeniería Ambiental.
NELSON ALEJANDRO AMAYA OROZCO. Ingeniero Químico.
COEDITORES
DIANA CORINA ZAMBRANO, Microbióloga Industrial. Ph D.
ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. Bacterióloga, M. Sc.
CLAUDIA MARCELA RIVERA HOYOS. Bióloga, Ph. D Ciencias biológicas.
TABLA DE CONTENIDO

Presentación del libro / Pág. 31

Capítulo 1 Pág. 33
Importancia del muestreo de suelos en el análisis microbiológico
y su correlación con otras propiedades del suelo, agua y ambiente

1.1. Muestreo de suelos 35

1.1.1. Introducción 35
1.1.2. Objetivos de muestreo de suelos 36
1.1.3. Métodos de muestreo de suelos 36
[Link]. Muestreo simple al aza 36
[Link]. Muestreo estratificado al azar 37
[Link]. Muestreo compuesto 38
1.1.4. Variabilidad espacial de las propiedades químicas del suelo 39
1.1.5. Dependencia espacial 39
1.1.6. Herramientas de muestreo 39
1.1.7. Fuentes de error 40
1.1.8. Profundidad del muestreo 40
1.1.9. Variación estacional de las profundidades del suelo 40
1.1.10. Recomendaciones para el muestreo de suelos 40
1.2. Muestreo de pilas de compost y materiales orgánicos apilados 42
1.2.1. Muestreo de materiales orgánicos 42
1.3. Recomendaciones para la recolección de muestras de suelo 42
para análisis microbiológico
1.4. Materiales 43
1.5. Metodología 43
1.6. Referencias 43
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 2 / Pág. 45
Ecología y relaciones microbianas

2.1. Introducción 47
2.1.1. Ecología microbiana 47
2.1.2. Interacciones microbianas 48
2.1.3. Control biológico de microorganismos fitopatógenos 48
2.2. Objetivos 50
2.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo 50
2.3.1. Enfrentamiento dual interacción hongo-hongo 50
2.3.2. Interacción bacterias no filamentos-hongo 51
2.3.3. Interacción bacteria filamentosa-hongo 51
2.3.4 Interacción bacteria-bacteria 51
2.4. Equipos 51
2.5. Metodología 51
2.5.1. Enfrentamiento dual interacción hongo-hongo 51
2.5.2. Interacción bacterias no filamentosa-hongo 50
2.5.3 Interacción bacteria filamentosa-hongo 52
2.5.4 Interacción bacteria-bacteria 52
2.6. Referencias 53
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 3 / Pág. 57
Ciclo del Carbono: Transformación de polímeros de origen natural

3.1. Introducción 59
3.1.1. Foras de carbono en el ambiente: Suelo, agua y aire 59
3.1.2. Mineralización aeróbica de la materia orgánica. 61
Humificación directa
3.1.3. Humificación indirecta, producción de sustancias húmicas 64
3.1.4. Biotransformación o mineralización anaeróbica de la 65
materia orgánica
3.2. Objetivos 66
3.3 Materiales, reactivos y medios de cultivo 66
3.3.1. Actividades enzimáticas semi cuantitativas 66
3.3.2 Grado de condensación o formación de sustancias húmicas 66
3.4. Equipos 67
3.5. Metodología 67
3.5.1. Recuento de microorganismos productores de proteasas, lipasas,67
amilasas, pectinasas y celulasas
3.5.2. Actividad lacasa y manganeso peroxidasa semicuantitativa 67
en agar extracto salvado de trigo con inductores
3.5.3. Degradación de lignina bajo tres condiciones nutricionales 68
3.5.4 Determinación del grado de condensación y/ humificación 68
3.6. Referencias 69

11
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 4 / Pág. 73
Ciclo del carbono: Transformación de hidrocarburos y plásticos

4.1. Introducción 75
4.1.1. Degradación de hidrocarburos y derivados 75
4.1.2. Degradación de plástico 77
4.2. Objetivos 78
4.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo 78
4.3.1. Inducción de la producción de biosurfactantes 78
4.3.2. Pruebas semi cuantitativas para la producción 78
de biosurfactantes
4.3.3. Pruebas de emulsificación in vitro 78
4.3.4. Degradación de láminas de polietileno de baja 78
densidad (PEBD)
[Link]. Pretratamientos por fotólisis de las láminas de PEBD 78
[Link]. Biodegradación de las láminas de PEBD 78
4.4. Equipos 79
4.5. Metodología 79
4.5.1. Inducción de la producción de biosurfactantes 79
4.5.2. Pruebas semi cuantitativas para la producción 79
de biosurfactantes
4.5.3. Pruebas de emulsificación in vitro 79
4.5.4. Degradación de láminas de polietileno de baja 80
densidad (PEBD)
[Link]. Determinación de la hidrofobicidad de las láminas de PEBD 80
(Medición del ángulo de contacto estático)
81
[Link]. Ensayos de biotransformación de láminas de PEBD
4.6. Referencias 81
Capítulo 5 / Pág. 85
Ciclo del nitrógeno

5.1. Introducción 87
5.1.1. Fijación de nitrógeno atmosférico 88
5.1.2. Oxidación y reducción de nitrógeno 90
5.2. Objetivos 92
5.3. Materiales, medios de cultivo reactivos 92
5.3.1. Aislamiento de microorganismos fijadores de nitrógeno 92
asociativos o simbióticos a partir de raíces de arveja, frijol,
trébol, alfalfa u otra leguminosa nodulada: Rhizobium sp.
5.3.2. Aislamiento de microorganismos fijadores de nitrógeno 92
no asociativos: Azotobacter sp.
5.3.3. Aislamiento de microorganismos microaerofílicos de 92
nitrógeno asociativos
5.3.4. Curva de calibración para la detección de nitrato 93
(NO3- - como producto de la oxidación de amonio)
5.3.5. Curva de calibración para la detección de amonio 93
(NH4+ - Como producto de la reducción asimilativa de NO3=)
5.3.6 Determinación de número más probable (NMP) 93
para microorganismos nitrificantes y denitrificantes
5.4. Equipos 93
5.5. Metodología 93
5.5.1. Aislamiento de microorganismos fijadores de nitrógeno 93
asociativos o simbióticos a partir de raíces de arveja, frijol,
trébol, alfalfa u otra leguminosa nodulada: Rhizobium sp.
5.5.2. Aislamiento de microorganismos fijadores de nitrógeno 94
no asociativos: Azotobacter sp.
5.5.3. Aislamiento de microorganismos microaerofílicos 94
de nitrógeno asociativos
5.5.4. Curva de calibración para la detección de nitrato 95
(NO3- - como producto de la oxidación de amonio)
5.5.5. Curva de calibración para la detección de amonio 95
(NH4+ - Como producto de la reducción asimilativa de NO3=)
5.5.6. Determinación de número más probable (NMP) 96
para microorganismos nitrificantes y denitrificantes
5.6. Referencias 98

13
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 6 / Pág. 101

Ciclo del fósforo

6.1. Introducción 103

6.1.1. Solubilización de fósforo 105
6.1.2. Mineralización de fósforo 106
6.1.3. Micorrizas, simbiosis para la inmovilización y transferencia 106
de fósforo
[Link]. Tipos de micorrizas 106
6.2. Objetivos 109
6.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo 109
6.3.1. Recuento de microorganismos solubilizadores de fósforo 109
6.3.2. Actividad fosfatasa alcalina 109
6.3.3. Actividad fitasa 109
6.3.4. Colonización de hongos formadores de micorriza arbuscular 110
en raíces
6.3.5. Análisis de fósforo en suelo 110
6.4. Equipos 110
6.5. Metodología 110
6.5.1. Recuento de microorganismos solubilizadores de fósforo 110
6.5.2. Actividad fosfatasa alcalina 111
6.5.3. Actividad fitasa 111
6.5.4. Metodología de reconocimiento de estructuras de Micorrizas, 112
aclarado y tinción de raíces
6.5.5 Análisis de fósforo en suelo 112
[Link]. Preparación de la muestra 112
[Link]. Procedimiento de extracción 112
[Link]. Cuantificación de fósforo disponible mediante para el método 113
de P-Olsen
[Link]. Cálculos de la concentración de P-Olsen en suelo 113
6.6. Referencias 113
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 7 / Pág. 117

Ciclo del azufre

7.1 Introducción 119

7.1.1. Reacciones de óxido-reducción asociadas al ciclo del Azufre: 122
Columna de Winogradsky, como modelo
7.1.2. Corrosión electroquímica 124
7.2. Objetivos 125
7.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo 125
7.3.1. Montaje de columna de Winogradsky 125
7.3.2. Número mpas probable de bacterias sulfato reductoras 125
7.3.3. Enriquecimiento de Thiobacillus 125
7.3.4. Corrosión electroquímica 126
7.4. Equipos 126
7.5. Metodología 126
7.5.1. Montaje de columna de Winogradsky 126
7.5.2. Número mpas probable de bacterias sulfato reductoras 126
7.5.3. Enriquecimiento de Thiobacillus 127
7.5.4 Corrosión electroquímica 127
7.6. Referencias 127

15
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 8 / Pág. 131

Tratamiento de aguas residuales

8.1. Introducción 133

8.1.2. Tratamiento de aguas residuales 134
8.2. Objetivos 140
8.3 Materiales, medio y reactivos 140
8.3.1. Preparación del lodo activado fúngico/bacteriano 140
8.3.2. Montaje de la planta piloto 140
8.3.3. Clarifloculador de la biomasa algal (prueba de jarras) 140
8.3.4. Determinación de parámetros físicos 140
[Link]. Color verdadero y unidades de color por el método 140
espectrofotométrico
[Link]. Determinación de sólidos totales, suspendidos, 140
disueltos y sedimentables
[Link]. Determinación de pH por el método potenciométrico 141
[Link]. Determinación de la demanda química de oxígeno (DQO) 141
por el método de oxido reducción con dicromato de potasio
[Link]. Determinación de la demanda bioquímica de oxígeno 141
al quinto día (DBO5) por el método de respirométrico
[Link]. Determinación de carbono orgánico total (COT) por el método 141
termo químico de oxidación con persulfato de amonio
[Link]. Determinación de Nitrógeno total por el método oxidación 141
con persulfato, amonio (NH4+) por el método de salicilato,
nitratos y nitritos (NO3=) por el método de reducción de Cadmio 141
y nitritos NO2- por el método del sulfato ferroso
[Link]. Determinación de sulfatos (SO4=) por el método de sulfato 141
de Bario
[Link]. Determinación de ortofosfatos (PO4 3-) por el método 141
del ácido ascórbico
[Link]. Análisis microbiológico para microorganismos responsables 141
de la biotransformación o lodo fúngico/bacteriano
[Link]. Análisis microbiológico para coliformes termotolerantes
por NMP
[Link].1.Técnica de fermentación de tubos múltiples (Standard
Methods 9221 E), la identificación de los coliformes
termotolerantes se basa en la capacidad de fermentar
la lactosa a 44,5 °C ± 0,2 °C en 24 ± 2 h. utilizando el Caldo A1.
[Link].2. Técnica de multicelda (NMP/100 mL utilizando la técnica
de Colillert®
8.4. Equipos
8.5. Metodología
8.5.1. Preparación del lodo activado fúngico/bacteriano
8.5.2. Montaje de la planta piloto pretratamiento, tratamiento primario,
tratamiento secundario y tratamiento terciario
[Link]. Pretratamiento
[Link]. Tratamiento primario (trampa de grasas)
[Link]. Tratamiento secundario (reactor de los activados modificados)
[Link]. Sedimentación secundaria
[Link]. Tratamiento terciario (microalgas)
[Link]. Prueba de jarras para determinar la dosis de coagulante
[Link]. Floculación/coagulación terciaria para la recuperación
de las microalgas
[Link]. Fotocatálisis con TiO2/UV
[Link]. Filtración con arena cuarcítica
8.5.3. Determinación de parámetros físicos
[Link]. Determinación de color verdadero, unidades de color
y curva espectral
[Link]. Determinación de sólidos
[Link].1. Sólidos totales por el método gravimétrico
[Link].2 Sólidos sedimentables
[Link].3. Sólidos suspendidos totales
[Link].4. Sólidos disueltos totales
8.5.4. Determinación de parámetros químicos
[Link] Determinación de pH
[Link] Determinación de conductividad eléctrica por el método
de conductividad eléctrica con sensor de conductividad
[Link]. Determinación de la Demanda Química de Oxígeno (DQO)

17
[Link]. Determinación de la concentración de carbono orgánico
total (COT)) por el método de termoquímico de oxidación
con persulfato de amonio
[Link]. Determinación de la Demanda bioquímica de oxígeno al
quinto día (DBO5)
[Link]. Determinación de NT, amoniacal, nitratos y nitritos
[Link].1. Nitrógeno total por el método de oxidación
con persulfato de amonio
[Link].2. Determinación de nitrógeno amoniacal por el método
del método de salicilato
[Link].3. Determinación de nitratos por el método de reducción
de Cadmio
[Link].4. Determinación de nitritos por el método del
sulfato ferroso
[Link]. Determinación de sulfatos por el método del sulfato
de Bario
[Link]. Determinación de ortofosfatos por el método
del ácido ascórbico
8.5.5. Análisis microbiológico para los microorganismos responsables
de la biotransformación o consorcio fúngico/bacteriano
8.5.6. Análisis microbiológico para coliformes termotolerantes
por NMP: Técnica de Fermentación de tubos múltiples
(Standard Methods 9221 E)
8.5.7. Análisis microbiológico para coliformes termotolerantes
por NMP: por la técnica de multicelda (NMP/100 mL)
utilizando el sustrato definido Colilert®-18.
8.6. Referencias
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 9 / Pág. 157

Bacteriófagos como indicadores de contaminación acuática

9.1. Introducción
9.2. Objetivos
9.3. Reactivos y medios de cultivo
9.4. Equipos
9.5. Metodología
9.5.1. Inoculación de Escherichia coli WG5 para su crecimiento
exponencial en medio MSB
9.5.2. Preparación del inóculo de E. coli WG5
9.5.3. Preparación de la muestra
9.5.4. Determinación y cuantificación de colifagos somáticos
en aguas residuales

19
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 9 / Pág. 157

Bacteriófagos como indicadores de contaminación acuática

9.1. Introducción
9.2. Objetivos
9.3. Reactivos y medios de cultivo
9.4. Equipos
9.5. Metodología
9.5.1. Inoculación de Escherichia coli WG5 para su crecimiento
exponencial en medio MSB
9.5.2. Preparación del inóculo de E. coli WG5
9.5.3. Preparación de la muestra
9.5.4. Determinación y cuantificación de colifagos somáticos
en aguas residuales
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 10 / Pág. 167

Montaje para evaluación de toxicidad en aguas con Lactuca sativa (Mc Innis)

10.1. Introducción
10.2. Objetivos
10.3. Materiales, medios y reactivos
10.3.1. Preparación de las diferentes concentraciones
del agua residual
10.3.2. Montaje del bioensayo
10.4. Equipos
10.5. Metodología
10.6. Referencias

21
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 11 / Pág. 177

Transformación y aprovechamiento de residuos orgánicos sólidos

11.1. Introducción
11.1.1. Valorización de residuos orgánicos a través de un modelo
de economía circular
11.1.2. Compostaje
11.1.3. Biogas y biodigestatos
11.1.4. Sustratos de siembra
11.1.5. Conversión termoquímica o pirólisis- biochar
11.2. Objetivos
11.3. Materiales, reactivos y medios de cultivos
11.3.1. Sistemas de transformación de materiales orgánicos
bajo fermentación sólida aeróbica en microcosmos
11.3.2. Evaluación del crecimiento vegetal en sustratos
de siembra
11.3.3. Producción de biochar
11.3.4. Caracterización física y química de residuos orgánicos
y bio-productos
11.4. Equipos
11.5. Metodología
11.5.1. Sistemas de fermentación en sólido aeróbicos a escala
de microcosmos in vitro
11.5.2. Evaluación del crecimiento vegetal en sustratos
de siembra
[Link]. Preparación del material vegetal
[Link]. Preparación de los sustratos de siembra
[Link]. Siembra del material vegetal
[Link].Medición del crecimiento vegetal
11.5.3. Producción de biochar
11.5.4. Determinación del porcentaje de humedad
11.5.5. Determinación de pH
11.5.6. Determinación de materia orgánica y carbono orgánico
total (COT) para materiales sólidos
11.5.7. Determinación del grado de condensación E4/E6
11.5.8. Determinación del grado de condensación y contenido
de lignina
11.6. Referencias

23
TABLA DE CONTENIDO

Capítulo 12 / Pág. 193

Inocuidad microbiológica e indicadores de madurez en enmiendas orgánicas

12.1. Introducción
12.1.1. Indicadores de madurez
12.1.2. Inocuidad microbiana en enmiendas orgánica
[Link].Bacterias patógenas
12.2. Objetivos
12.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo
12.3.1. Método 1682 para Salmonella (U.S. EPA, 2006)
12.3.2. Método 1680. Número más probable usando caldo
lauril sulfato y medio EC para coliformes fecales
(U.S. EPA, 2004)
12.3.3. Ensayos de fitotoxicidad de los biomateriales obtenidos
con uso en fertilización
12.3.4. Actividades enzimáticas en enmiendas orgánicas
[Link].Actividad fosfatasa
[Link]. Actividad amonio monoxigensa
[Link]. Concentración de amonio en compost
y materiales orgánicos
12.4. Equipos
12.5. Metodología
12.5.1. NMP para Salmonella de acuerdo al método
1682 (EPA, 2006)
[Link]. Determinación de sólidos totales
[Link]. Análisis de datos y cálculos
12.5.2. Método 1680. Número más probable usando
caldo lauril sulfato y medio EC para coliformes fecales
(U.S. EPA, 2004)
12.5.3. Fitotoxicidad (Basado en el método propuesto
por Zucconi, 1981)
12.5.4. Actividades enzimáticas
[Link]. Actividad fosfatasa
[Link]. Amonio monoxigenasa
[Link]. Concentración de amonio en suelo
[Link].1. Preparación de la muestra
[Link].2. Cuantificación de Nitrógeno amoniacal (N-NH4),
mediante el Método azul de indofenol
12.6. Referencias
13. Herramientas moleculares, ómicos y biológicas sintéticas:
Aplicación ambiental
13.1. Introducción
13.2. Investigación del genoma
13.3. Genómica funcional
13.4. Biología de sistemas
13.5. Ingeniería genética y biología sintética
13.6. Protocolo básico para el análisis de la distribución
temporal y espacial de comunidades microbianas
en un modelo de ecosistema como las columnas
de Winogradsky
13.7. Referencias
14 Anexos
14.1 Anexo A. Preparación de medios de cultivo
14.2. Anexo B. Preparación de reactivos y soluciones

25
LISTADO DE TABLAS

1/ Enzimas que participan en la mineralización y/o humificación

directa de la materia orgánica en suelo
2/ Diferentes rutas de la degradación de plásticos
3/ Ejemplos de microorganismos diazótrofos simbióticos
y de vida libre reportados en el suelo
4/ Cálculos para preparación de soluciones Stock curva
patrón de nitratos
5/ Cálculos para preparación de soluciones Stock curva
patrón de amonio
6/ Tipos de micorriza
7/ Operaciones unitarias para plantas de tratamiento
de aguas residuales
8/ Parámetros físicos, químicos y microbiológicos a monitorear
en una planta de tratamiento para aguas residuales
domésticas y no domésticas
9/ Volumen de muestra por serie de tubos para análisis
de coliformes termotolerantes
10/ Interpretación de resultados para Colilert®
11/ Bacteriófagos utilizados para evaluar contaminación
de origen fecal en aguas y las diferencias en la técnica
de doble capa en agar según ISO
12/ Normas sobre los requisitos que debe cumplir
las enmiendas orgánicas para cultivos
13/ Ejemplo para el cálculo para NMP/g de Salmonella sp.
14/ Ejemplo de cálculo para NMP
15/ Métodos de secuenciación del ADN
16/ Genes de uso frecuente para la evaluación
de grupos funcionales microbianos específicos en una
muestra ambiental

26
LISTADO DE FIGURAS

1/ Diseño de muestreo sistemático alineado

2/ Pruebas de interacción in vitro para hongos.
(A) Interacción hongo-hongo, crecimiento influenciado.
(B) Interacción hongo-hongo, crecimiento no influenciado
o libre.
(C) Crecimiento miceliar influenciado en presencia
de una actinobacteria.
(D) Interacción actinobacteria-hongo
3/ Pruebas de interacción para bacterias in vitro.
(A) Interacción bacteria-hongo: Crecimiento miceliar influenciado.
(B) Crecimiento miceliar libre del fitopatógeno.
(C) Interacción negativa entre bacterias Gram negativas.
(D) Inhibición entre bacterias Gram negativas.
(E) Interacción negativa entre bacterias Gram positivas.
(F) Inhibición entre bacterias Gram positivas
4/ Transformación de la materia orgánica en suelo
asociado con el proceso de humificación aeróbica
y anaeróbica
5/ Hidrólisis de polímeros in vitro asociada con procesos
de humificación directa.
(A) Microorganismos productores de proteasas an agar leche.
(B) Microorganismos productores de lipasas en agar tributirina.
(C) Microrganismos productores de amilasas en agar almidón.
(D) Microorganismos productores de celulasas en agar celulosa.
(E) Microorganismos productores de lacasa en agar extracto
salvado de trigo con sal de diamonio 2,2’-Azino-bis
(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), (ABTS).
(F) Microorganismos productores de pectinasas
en agar pectina

27
LISTADO DE FIGURAS

6/ Selección de microorganismos productores de biosurfactantes.

(A) Colonias positivas para la producción de biosurfactantes
en agar Siegmund and Wagner (SW).
(B) Colonias de Pseudomonas fluorescens productoras
de pigmentos fluorescentes.
(C) Pruebas de emulsificación in vitro empleando biosurfactantes
y diferentes derivados del petróleo
7/ Gotas de agua desionizada sobre una lámina de polietileno
de baja densidad PEBD. Mediciones a la gota de agua
para determinar el ángulo de contacto estático
8/ Ciclo general del Nitrógeno en suelo
9/ Aislamiento y recuento de microorganismos fijadores de N2.
(A) Azospirillum lipoferum en Agar Rojo Congo;
(B) Rhizobium sp. en Agar YMA;
(C) Prueba de NMP positiva para fijadores de N2 microaerófilos;
(D) Azospirillum lipoferum en médio semisólido NFB
10/ Resultado de las curvas patrón para la determinación
de nitrato y amonio
11/ Posibles resultados del NMP/g de suelo a partir de clado
amonio y caldo nitrato
12/ Ciclo general del fósforo
13/ Solubilización de fósforo inorgánico.
(a) Agar SMRS1.
(b) Agar Pikovskaya
14/ Esporas de diferentes Glomeromycota aislados de suelos
colombianos. Acaulospora colombiana en PVGL,
pared de germinación y pared externa.
b. Acaulospora colombiana en PVGL con Melzer.
c. Espora con hifa de suspensión

28
LISTADO DE FIGURAS

15/ Estructuras intraradicales de hongos formadores de micorriza

arbuscular observadas a través de la coloración de xx con
un aumento de 40 x
16/ Ciclo general del azufre
17/ Sistemas de transformación bifásica para estudio de ciclo
del azufre en la columna de Winograsdky
18/ Enriquecimiento de bacterias oxidadoras de azufre en medios
para Thiobacillus neutrófilos y Thiobacillus acidófilos y número
más probable de bacterias sulfato reductoras (BSR) en caldo
API y Thiobacillus.
19/ Sistema in vitro para la evaluación de corrosión electroquímica.
20/ Esquema de la planta de tratamiento a escala piloto.
21/ Diluciones seriadas salteada pares
22/ Diluciones seriadas salteada impares
23/ Cuantificación de Coliformes termotolerantes por el método
sustrato enzimático Colilert® - 18, formato multicelda
(utilizando la cepa de Klebsiella variicola ATCC 31488)
24/ Agar Scholtens modificado (MSA) inoculado con la cepa
E. coli WG5 y la muestra de agua residual evaluada tras 24 h
de incubación a 37 ºC. Se observan las placas de lisis por
la acción del bacteriófago.
25/ Resultados del ensayo de toxicidad aguda
con Lactuca sativa
26/ Comparación entre transformación aeróbica y anaeróbica
27/ Montaje de microcosmos
28 / Esquema de la Degradación anaeróbica de los residuos
orgánicos animales o vegetales

29
LISTADO DE FIGURAS

29/ Crecimiento de en diferentes sustratos de siembra: a y b.

Semillas germinadas en papel de germinación y turba; c y d.
Plantas de tomate
30/ Ensayos de fitotoxicidad para materiales orgánicos frescos
y transformados
31/ Curva patrón de amonio
32/ Diferentes niveles de integración (ADN, ARN, proteínas
y metabolitos) en las técnicas de microbiología molecular
para el estudio de un solo tipo de microorganismo
o comunidades microbianas
33/ Esquema general para el estudio de la distribución temporal
y espacial de las comunidades microbianas en columnas
de Winogradsky

30
PRESENTACIÓN DEL LIBRO

C
uando se piensa en microbiología ambiental, casi podríamos estar
pensando en el papel de los microorganismos en el ambiente. Sin
embargo, queda la duda de lo que se considera ambiente, y ahí
es cuando se descubre que el área de estudio de la microbiología
ambiental no se suscribe a un solo objeto de estudio, sino que incluye los más
diversos y muchas veces extraños lugares.

Suelo, agua, aire, son los ecosistemas globales que involucran a la microbiología
ambiental y con ello la participación de los microorganismos para lograr efectos
positivos en los mismos. Desarrollo de inoculantes para agricultura, evaluación de
agentes biocidas para el control de organismos causantes de deterioro ambiental
o metodologías para el control de calidad de aire y aguas, son algunas de las
técnicas que se incluyen en este Manual de Microbiología Ambiental.

Se pretende ofrecer un material de apoyo a las asignaturas relacionadas con la

microbiología ambiental, de manera que el estudiante adquiera la destreza y
conocimiento práctico de estrategias que le permiten aproximarse al estudio de
los microorganismos y su relación con distintos ambientes.

Este libro lo escribimos alumnos, colegas, amigos, a la memoria del Prof. René Novo
Sordo, Ing. Agrónomo, Doctor en Microbiologia de Suelos, Profesor Emérito de la
Universidad Agraria de la Habana, Cuba, quien contribuyó en diferentes países
de Latinoamérica a la formación de numerosas generaciones de microbiólogos;
escuelas de microbiología agrícola y desarrollos e innovación en el área de
los bioproductos de origen microbiano. Su sencillez y claridad para transmitir
conocimientos básicos y aplicados, quedarán en nuestra memoria.

El presente manual contó con el apoyo de la Pontificia Universidad Javeriana,

Bogotá Colombia, La Asociación Porkcolombia - FNP y la Universidad Técnica
Federico Santa María. Santiago de Chile. Chile. A través de convocatoria Movilidad
de profesores para desarrollar investigación con instituciones extranjeras de la
Vicerrectoría de Investigación de la Pontificia Universidad Javeriana. Propuesta
No 20070. 2019.

El presente libro contiene un total de 13 capítulos, en cada uno de ellos se presenta

una introducción, materiales, metodología y referencias, para realizar algunas
determinaciones en laboratorio. Adicionalmente, el libro tiene dos anexos. El primero
denominado con la letra A, presenta todos los medios de cultivo, composición y
preparación. El segundo denominado con la letra B, presenta todos los reactivos
utilizados y la forma de prepararlos.

31
32
Capítulo 1
IMPORTANCIA DEL MUESTREO EN EL ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO Y CORRELACIONES CON
OTRAS PROPIEDADES DE SUELO, AGUA, Y AMBIENTE

33
34
Capítulo 1

IMPORTANCIA DEL MUESTREO EN EL ANÁLISIS

MICROBIOLÓGICO Y CORRELACIONES CON
OTRAS PROPIEDADES DE SUELO, AGUA, Y AMBIENTE
Rodrigo Ortega Blu

1.1. Muestreo de suelos operadores, debieran dar resultados similares

dentro de un margen de error aceptable. Una
1.1.1. Introducción gran proporción de los errores en los estudios
microbiológicos se debe al inadecuado
La etapa más crítica para el estudio de muestreo de suelos y al deficiente manejo de
las propiedades biológicas del suelo y de las muestras, previo a su ingreso al laboratorio.
otras matrices de interés es el muestreo. En el presente capítulo se discuten algunos
En efecto, la mayor dificultad radica en conceptos claves en el muestreo de suelos
describir adecuadamente las propiedades tales como: tipos de muestreo, número de
de interés ya que éstas varían espacialmente, observaciones necesarias, dependencia
en longitud (X), latitud (Y), profundidad espacial, etc., para finalmente entregar
(Z), y temporalmente (época del año). Un algunas recomendaciones prácticas. Estos
correcto muestreo debe permitir describir, conceptos son aplicables a cualquier matriz
con una exactitud aceptable (lo más cerca que se desee muestrear, sin embargo,
del promedio verdadero), la característica al final de este capítulo se entregan
deseada dentro del área a muestrear, así recomendaciones específicas para otras
como tener una buena repetitividad. Esto matrices de especial interés, tales como
significa que muestras desde una misma compost y materiales orgánicos.
área de muestreo, tomadas por distintos

35
1.1.2. Objetivo del muestreo de suelos 1.1.3. Métodos de muestreo de suelos

El muestreo tiene como objetivo principal [Link]. Muestreo simple al azar

obtener información acerca de un suelo
en particular. Estadísticamente, el objetivo Una vez definida la población de estudio (ej.
es describir una población a través de la población de volúmenes de suelos) se extrae
estimación de sus parámetros. Los principales un número determinado de muestras desde
parámetros de una población son el promedio el área a muestrear (lote, parcela), cada
(μ) y la desviación estándar (σ). En suelos, una una de las cuales tiene la misma posibilidad
población puede ser todo el suelo contenido de ser elegida. La posición de cada muestra
en una cierta profundidad, un conjunto de dentro del área puede hacerse a través de la
lotes, un conjunto de unidades dentro de generación de coordenadas x, y aleatorias, o
un lote, etc. En este caso consideraremos la bien numerando todas las posibles muestras y
población como un conjunto de volúmenes extrayendo el número deseado de ellas.
de suelo (tomados con un barreno tipo
tubo) en un área determinada (ej. 31.830.989 De un muestreo simple al azar, pueden
barrenos de 2 cm de diámetro/ha) que serán estimarse algunos parámetros de la población
analizados para propiedades biológicas de a través del cálculo de algunos estadísticos.
acuerdo a procedimientos estándar. Cada Los más comunes son el promedio y la varianza
población posee ciertas características que la (desviación estándar) (Ecuaciones 1 y 2).
describen. Estas características pueden incluir,
n
concentración de mesófilos totales (UFC/g),
actividad enzimática, evolución de CO2, etc. ∑y i
El valor verdadero de cada característica y=
i
Promedio
en la población es llamado parámetro. n
Estadísticamente, los parámetros más usados
(Ecuación 1)
son el promedio y la desviación estándar.
Así, con el muestreo se desea estimar los
parámetros de la población, es decir, por n
ejemplo, estimar el contenido promedio de ∑ (yi - y) 2

organismos mesófilos en una población, o su i Varianza

S2 =
actividad enzimática promedio. Cuando se n-1
hace una muestra compuesta solo es posible
estimar el promedio de la población, debido a (Ecuación 2)
que no hay repeticiones. Si se desea obtener
ambos parámetros, es decir promedio y La desviación estándar (s) corresponde a la
desviación estándar, las submuestras debieran raíz cuadrada de la varianza. El tamaño de
analizarse separadamente. la varianza (valor absoluto) es afectado por
el tamaño de las unidades de medición de
la propiedad de interés. Por ejemplo, para un
El muestreo tiene como mismo set de muestras, el contenido de materia
objetivo principal obtener orgánica (%) tendrá una menor varianza que
la biomasa microbiana expresada en UFC/g.
información acerca de Para comparar la variación de distintas
propiedades en una misma base, se calcula
un suelo en particular. el coeficiente de variación que corresponde
al % de la desviación estándar con respecto
Estadísticamente, al promedio de cada propiedad medida, de
acuerdo a la ecuación 3:
el objetivo es describir
S
una población a través CV= *100 Coeficiente de variación
y
de la estimación
(Ecuación 3)
de sus parámetros.

36
A partir de la varianza también puede Primero se elige un valor de t desde la tabla
calcularse el error estándar (Sy) que indica el usando un número arbitrario de observaciones,
grado de error en la estimación del promedio por ejemplo, n =10, lo que significa 9 grados de
de la población (Ecuación 4). libertad (gl), con los que con p=0,05 se obtiene
un valor de t =2,262.
√ Sn
2
Sy= Error estándar
Se estima la varianza S2
(Ecuación 4)
2 2
El error estándar más un valor de t obtenido 1x107 - 2x105 UFC
S=2
= 6x10 12
desde una tabla para un cierto nivel de 4 g
confianza, permite calcular intervalos de
confianza alrededor del promedio (Ecuaciones
5 y 6). D = 3 x 105 UFC/g

ls=y+t0,025*sy Límite superior

Así, n será igual a:
(Ecuación 5)

li=y-t0,025*sy Límite inferior [(2,262)2 * 6x1012]

= 123
(5x105)2
(Ecuación 6)

De acuerdo a esta misma fórmula rearreglada,

es posible calcular cuántas muestras se Debido a que n = 123 es mucho mayor que
requerirían para estimar el promedio de la n = 10, se debe hacer el cálculo nuevamente,
población con un cierto nivel de error a un hasta que el n de entrada sea igual al n de
nivel de probabilidad dado (Ecuación 7). salida. En este ejemplo, se requerirían n=95
muestras (submuestras) para estimar el
promedio de biomasa (UFC/g) con un 95%
t2s2 Número de observaciones de confianza y 5 x 105 UFC/g de exactitud,
n=
D2 (Ecuación 7) que corresponde a un error de 10%. Ahora si
se permitiera un error mayor, digamos 20%, el
número de muestras requeridas disminuye a
Dónde: 25. Esto significa que mientras más cerca se
desee estar del promedio de la población que
•t = valor de la tabla de t elegido se está estimando, mayor será el número de
arbitrariamente en primera instancia y muestras necesarias.
modificado luego por reiteración (anexo)
[Link]. Muestreo estratificado al azar
•s = variancia de la muestra estimada
de estudios o experiencias anteriores, o La población es dividida en un número
calculada de acuerdo al rango de valores determinado de subpoblaciones y muestreada
esperado (s2 = (R/4)2) al azar. Por ejemplo, el área a muestrear
puede ser dividida por topografía, manejo,
•D = nivel de exactitud permitida (error) en textura, etc. y cada unidad muestreada
la estimación del promedio, es decir que separadamente. Las razones técnicas para
tan cerca se quiere estar del promedio de muestrear el suelo de esta manera incluyen:
la población a través de la muestra.
1) hacer inferencias acerca de cada
Por ejemplo, se desea estimar el promedio de una de las sub-poblaciones (zonas)
biomasa de microorganismos (expresada en separadamente y
UFC/g) en una población de volúmenes de
suelo dada, con una probabilidad del 95% y un 2) incrementar la precisión de las
nivel de exactitud de 5 x105 UFC/g. El rango de estimaciones (media, desviación estándar,
valores estimados es de 2 x 105 a 1 x107 UFC/g. etc.) sobre la población entera.

37
[Link]. Muestreo compuesto suelo, deberían extraerse alrededor de 25
muestras, por cada unidad homogénea de
El muestreo compuesto es la forma más muestreo la cual no debería exceder las
operativa de extraer muestras de suelo desde 10 hectáreas. De acuerdo a antecedentes
un área de muestreo. Básicamente es similar al de literatura, poco se gana en precisión
muestreo simple al azar (o estratificado al azar) cuando se excede 25 puntos de muestreo.
pero difiere de este en el sentido de que toda Asimismo, el coeficiente de variación no se
la unidad de muestreo es cubierta y no existen afecta demasiado sobre un mínimo de 8 a 12
repeticiones ya que el suelo, proveniente de hectáreas. Si se requiriera una mejor estimación
los puntos muestreados, es mezclado en una del promedio, el área debería ser subdividida
sola muestra. Además, la localización de las en más sectores homogéneos. La ubicación
muestras no es al azar, sino que se sigue un dentro del área a muestrear se hace a juicio
cierto patrón, cuyo inicio y distanciamiento personal, siguiendo un recorrido en X o Zig –
queda a juicio del operador. Zag, el cual, ha arrojado menores coeficientes
de variación que el muestreo simple al azar,
En la práctica, debiera extraerse el número de acuerdo a algunos autores.
de submuestras determinadas a través del
cálculo de n en una superficie que no debería El muestreo sistemático (en grilla) arroja
exceder las 10 ha. Estas submuestras deben ser resultados muy satisfactorios dado que se cubre
compuestas en una sola muestra que se envía toda el área de interés (Figura 1). De hecho,
al laboratorio. La composición de la muestra este tipo de muestreo es el recomendado
debe hacerse considerando igual volumen cuando se dispone de un receptor de GPS
para cada submuestra. para navegar a cada punto de muestreo en
una grilla predeterminada.
Según la mayoría de las normas internacionales,
en el caso de las propiedades químicas del

Figura 1.
Diseño de muestreo sistemático alineado.

0 250 500

meters

38
1.1.4. Variabilidad espacial de las propiedades entre ellas, sin embargo, cuando las muestras
químicas del suelo son dependientes la variancia aumenta con
el incremento de la distancia entre ellas. Un
Las propiedades del suelo son altamente variograma típico tiene tres componentes:
variables dentro de un área considerada el nugget, que corresponde a la variancia
visualmente homogénea. En la figura 2 entre muestras cuando la distancia entre
se muestra la variabilidad espacial de la ellas es cero y que correspondería al error de
mineralización de N en un lote de 2 hectáreas. medición, el rango, que es la distancia a la
Se puede apreciar que incluso dentro de cual las muestras se hacen independientes y
superficies tan pequeñas como la de la figura, el sill que corresponde al valor de variancia a
las propiedades biológicas del suelo varían la distancia = rango y que debe ser similar al
ampliamente. Por supuesto, la variabilidad valor de la variancia de todas las muestras.
aumenta a medida que se aumenta el
tamaño de la superficie a muestrear, aunque Lamentablemente, la dependencia espacial
de acuerdo a la literatura, este aumento no es es sitio y propiedad específica, por lo cual
muy significativo sobre las 12 hectáreas. los parámetros obtenidos en suelos similares
debieran tomarse solo como referencia.
La mayor variabilidad está representada por Respecto a las propiedades químicas,
aquellas propiedades susceptibles de sufrir elementos más variables como el nitrógeno
rápidas oscilaciones en espacio y tiempo. disponible tendrán rangos de dependencia
Por esta razón se recomienda muestrear una espacial más cortos en comparación a
superficie no superior a las 10 hectáreas. propiedades más estables como el pH, por
lo tanto, si se desea obtener muestras de
1.1.5. Dependencia espacial suelo para propiedades de distinto rango, las
distancias entre muestras debieran ser las de
Los procedimientos estadísticos clásicos, en los la propiedad de rango más corto. En el caso
cuales se basa el muestreo de suelos, asumen de propiedades biológicas, dada su elevada
que las observaciones en el campo son variabilidad, sus rangos de dependencia
independientes unas de otras no importando espacial son muy cortos, lo que significa que,
su ubicación en el terreno. Sin embargo, si se desean mapear, debiera muestrearse
debido a la naturaleza continua del paisaje, con una alta intensidad. En la figura 9 se
a procesos de formación de suelos, y a zonas presentan mapas de la actividad de la enzima
climáticas, es razonable esperar que exista β-glucosidasa en suelos de Colombia.
autocorrelación (dependencia) espacial,
es decir que muestras tomadas cerca unas 1.1.6. Herramientas de muestreo
de otras, sean más parecidas que muestras
tomadas a mayor distancia entre ellas. La En la actualidad existe una gran oferta
cuantificación de la dependencia espacial de equipos de muestreo que trabajan
de propiedades del suelo es crítica para adecuadamente en la obtención de muestras
definir estrategias de muestreo adecuadas, de suelo. Estos varían desde herramientas
debido a que, por un lado, aumentando el manuales (palas, barrenos, etc.) hasta
número de observaciones no necesariamente barrenos hidráulicos montados en vehículos
se aumenta la exactitud del estudio, pues todo terreno, tractores o camionetas.
se puede producir información redundante,
mientras que, por otro, si se desea interpolar La consideración más importante cuando
lugares no muestreados dentro del área se selecciona una herramienta de muestreo
de interés, para mapear la propiedad bajo es que esta debe ser de fácil limpieza entre
estudio, se requiere dependencia espacial. submuestras y que permita alcanzar la
profundidad de muestreo deseada con
La dependencia espacial es usualmente exactitud. Los más usados son los barrenos
cuantificada a través del uso de un variograma. manuales de tubo, los cuales debieran ser
Esta es una relación entre variancia y distancia de acero inoxidable para una fácil limpieza
entre muestras. Cuando las observaciones y evitar óxidos que pudieran contaminar la
son independientes, la variancia entre las muestra, especialmente cuando se desea
muestras es similar, no importando la distancia determinar elementos traza. Los barrenos tipo

39
rosca son más efectivos que los de tubo para
el muestreo de suelos pedregosos. • Error de medición: la medición observada
no corresponde con el valor verdadero
El recipiente en el cual se mezclan las de la unidad muestreada. Normalmente
submuestras es muy importante. El mejor es el error de muestreo es mayor que el error
un balde plástico, debido a su bajo peso y de medición.
su fácil limpieza. Además, no contamina
la muestra con óxidos. En general, un buen 1.1.8. Profundidad de muestreo
equipo de muestreo debiera tener las
siguientes características: La profundidad de muestreo, dependerá del
objetivo del estudio y del manejo del suelo.
•Tomar una muestra pequeña, suficiente Debe considerarse que, en general, la actividad
y de igual volumen en cada lugar de biológica disminuye con la profundidad del
muestreo, de manera que la muestra suelo, al igual que lo hacen los contenidos
compuesta sea de tamaño apropiado de materia orgánica. La mayor actividad
para el análisis de suelo. biológica se concentra normalmente en los
cinco primeros cm de profundidad.
•Ser fácil de limpiar.
Para la mayoría de las propiedades del suelo en
•Adaptable a suelos arenosos secos como cultivos agrícolas, la profundidad de muestreo
también a suelos arcillosos húmedos. debe ser equivalente a la capa arable, es
decir 20 cm. En cultivos en cero labranza y
•Ser resistente a la oxidación y construido praderas fertilizadas, la profundidad usada es
para resistir un posible doblamiento o quiebre. normalmente de 10 cm. Para el muestreo de
suelos en futuro huerto frutal, se considera un
•Ser fácil de usar. muestreo por horizonte o estrata, hasta 1 m de
profundidad. Para efectos de evaluación de
Sin lugar a dudas, la característica más la fertilidad de suelos frutales una profundidad
importante de una herramienta de muestreo de 30 cm es adecuada.
es que debe proveer submuestras uniformes de
igual volumen en todos los puntos de muestreo 1.1.9. Variación estacional de las propiedades
a ser mezclados en una muestra compuesta. del suelo

1.1.7. Fuentes de error Algunas propiedades bioquímicas del

suelo varían estacionalmente, es decir su
Los errores asociados al muestreo de suelos concentración en el suelo será distinta
pueden caer en tres categorías: dependiendo de la época del año. La
variación estacional en algunas propiedades,
•Error de muestreo: causado por el hecho puede deberse a cambios en la actividad
de que la muestra incluye solo los puntos microbiológica, producto de cambios en la
muestreados en vez de toda la población temperatura y la humedad del suelo (con
de puntos posibles de muestrear. La única efecto sobre propiedades como N, pH, P,
posibilidad de eliminar el error es incluir en el etc.) y cambios en la concentración de
muestreo a toda la población. En el cálculo sales, producto de la variación del contenido
del número de muestras (submuestras) de humedad del suelo (pH del suelo). Para
necesarias se incluye este error. hacer seguimientos interanuales y minimizar
los efectos de la variación estacional, deben
•Error de selección: causado por la establecerse épocas de muestreo definidas.
tendencia a seleccionar algunas unidades
muestrales dentro de la población con mayor 1.1.10. Recomendaciones para el muestreo
o menor frecuencia. Por ejemplo, evitar los de suelos
sitios pedregosos del lote o sobremuestrear
los bordes de un lote. El muestreo simple al •Recordar que la mayor fuente de error
azar puede eliminar parte de este sesgo. del análisis de suelo proviene del muestreo
de suelos.

40
 •Hacer muestreo de suelos con suficiente requeridos. Recordar que se requiere al
antelación. Recordar que el tiempo menos ½ litro (½ kilogramo) de suelo. Para
promedio que toma un laboratorio en los determinar la cantidad mínima de puntos
análisis es entre 10 a 15 días. a muestrear, cuando se utiliza un barreno
tipo tubo, usar la siguiente relación
•Cuando se muestree un área de interés (Ecuación 8).
para determinar la evolución interanual
de propiedades de interés, debe hacerse P
N=
siempre en la misma época. [(0,79D2L)*dap]
(Ecuación 8)
•Si se conoce el área a muestrear, preparar
un plan de muestreo a priori. Donde:

•Dividir el lote o área muestral en •N = número mínimo de puntos a muestrear
sectores homogéneos, de acuerdo a para obtener P (g) de muestra.
su topografía, manejo anterior u otro
criterio visible o conocido. Recordar que •P = peso de la muestra compuesta
cada área muestral no debería exceder deseado (g).
las 10 hectáreas.
•D = diámetro interno del barreno de
•Recorrer cada unidad de muestreo en tubo (cm).
X o zig-zag, cubriendo toda el área de
interés. Evitar sectores no representativos • L = profundidad de muestreo (cm).
tales como: entradas del lote, sectores de
descarga de fertilizantes, desagües, etc. •Dap = densidad aparente del suelo (g/cm3)
Idealmente establecer una grilla y colectar (use 1 si no la conoce)
las submuestras en cada punto de la grilla.
•Mezclar bien el suelo en el balde y
•Colectar al menos 25 submuestras/área obtener una alícuota de al menos 500 g.
homogénea y colocarlas en un balde plástico de suelo.
limpio, para su posterior homogenización.
•Identificar claramente el sector, lote y
•Cuidar que el volumen de suelo predio muestreado. No olvidar incluir la
muestreado sea similar en cada punto fecha de muestreo y cualquier información
a muestrear. Vigilar la profundidad de relevante. Seguir las instrucciones de su
muestreo si se usa barreno de tubo o pala laboratorio.
y el ancho del prisma si se utiliza pala.
•Enviar muestra inmediatamente al
•Calcular que el volumen de suelo laboratorio. Mientras se envía, mantener la
colectado, sea suficiente para los análisis muestra refrigerada a 4 – 6 °C (sin congelar).

Cuando se muestree un área de interés para determinar

la evolución interanual de propiedades de interés, debe
hacerse siempre en la misma época.

41
1.2. Muestreo de pilas de compost y materiales
orgánicos apilados
1.3. Recomendaciones para la recolección de
1.2.1. Muestreo de materiales orgánicos muestras de suelo para análisis microbiológico

La heterogeneidad del compost y pilas de Cuando se va a realizar cualquier tipo de

materiales orgánicos, puede ser aún más alta análisis al suelo ya sea químico, físico o
que aquella observada en suelos. Por eso el microbiológico, la toma de la muestra debe
muestreo debe incluir un número suficiente de reunir una serie de condiciones imprescindibles
muestras; de lo contrario, los resultados no serán para que los resultados obtenidos puedan ser
representativos de la realidad del material. interpretados correctamente. Las condiciones
son tres fundamentalmente:
Para muestrear una pila de sustrato orgánico
o compost, se aplican los mismos conceptos La primera de ellas es que la muestra o muestras
descritos para suelo: se deben colectar entre sean lo suficientemente representativas del
20-25 submuestras, intentando cubrir la pila área donde se colecten; esta condición se
completamente. El muestreo sistemático cumple si se colecta un número suficiente de
también es recomendable en este caso, submuestras, tal como se indicó anteriormente.
es decir, dividir la pila en celdas o grillas La segunda condición requerida es que no
(cuadrantes) virtuales, de acuerdo a la se produzcan contaminaciones durante
intensidad requerida (ej. 20 celdas) y colectar la colecta y el traslado de las muestras al
una submuestra en cada una de ellas. laboratorio y, la tercera condición es la rápida
ejecución del análisis microbiológico. Existen
Si la pila ha sido volteada recientemente, la algunas investigaciones que señalan que
profundidad de muestreo es irrelevante, sin muestras colectadas, refrigeradas o no, sufren
embargo, si la pila no ha sido volteada, es grandes modificaciones en su biota entre los
conveniente obtener una muestra de una 2 y 14 días. Después de este tiempo y hasta
profundidad que llegue al centro de la pila (ej. 6 meses la biota se estabiliza. Independiente
0-100 cm); si esto no es factible, se pueden ir a ello, la mayoría de los autores recomiendan
colectando muestras a distintas profundidades que las muestras colectadas se procesen en
hasta llegar al centro de la pila (ej. 0-20 cm, un lapso no mayor de las 48 horas.
20-40 cm, 40-60 cm, 60-80 cm y 80-100 cm).
Cuando se pretende estimar índices
El volumen de material colectado en cada más generales como la capacidad de
punto de muestreo debe ser homogéneo, mineralización del nitrógeno, nitrificación o
por lo que debe usarse algún implemento de respiración, puede haber una mayor libertad
muestreo que permita su control, tal como un en cuanto al tiempo entre la toma o colecta
tubo de cloruro de polivinilo (PVC). y el momento del análisis microbiológico, pero
siempre se debe trabajar con la muestra de
Según la TMECC, para una muestra compuesta, suelo lo más fresca posible.
se toman 20 muestras al azar (5 profundidades
de cada uno de 4 transectos en las pilas de La cantidad de suelo a recolectar dependerá
compost) y se combinan en un recipiente de los análisis a realizar, no debiendo ser
limpio de 20 L. Mezclar y tomar una muestra de menor de 200 gramos para el conteo de
0,75-1 Kg de muestra compuesta. Mantener la microorganismos viables, mientras que para
muestra refrigerada hasta que sea analizada. los métodos bioquímicos como respiración y
nitrificación se requieren cantidades mayores
Las muestras de materias primas deben de los 5 kilogramos.
tomarse antes de la preparación de las pilas,
es decir, antes de la trituración o reducción de Cuando las muestras se recolecten desde
tamaño, y antes de la adición de nutrientes calicatas, es recomendable que el microbiólogo
suplementarios, agentes de carga o de agua. se haga acompañar del especialista de suelos
con vista a realizar una descripción correcta del
perfil y se proceda a realizar la caracterización
química de las muestras.

42
1.4. Materiales

•Frascos de boca ancha o bolsas plásticas

estériles.

•Cucharillas o espátulas de metal estériles.

•Palas, picos, tarjetas de cartón, hilo de
algodón, libreta de anotaciones.
1.6. Referencias
1.5. Metodología
Ameen, F., Reda, S., El-Shatoury, S., Riad, E.,
•Elegir las zonas de muestreo y limpiar Enany, M., y Alarfaj, A. (2019). Prevalence of
cuidadosamente la superficie del suelo antibiotic resistant mastitis pathogens in dairy
de todo material extraño incluyendo la cows in Egypt and potential biological control
vegetación. agents produced from plant endophytic
actinobacteria. Saudi Journal of Biological
•Realizar un corte en forma de trinchera Sciences. 26 (7), 1492-1498.
con la ayuda del pico y la pala de manera
que no se produzcan derrumbes. Procure Crépin, J., Johnson, RL. (1993). Soil sampling
una buena iluminación orientando la for environmental assessment. p. 5 – 18. In M.
cala de manera que el sol esté a su R. Carter (ed.) Soil sampling and methods of
espalda iluminando la superficie puesta analysis. Canadian Society of soil Science.
al descubierto. Lewis Publishers, USA.

•Con espátulas o cucharillas estériles INN., (1999). Norma Chilena NCh 2060-1999.
tomar las cantidades de suelo requeridas Suelos-Muestreo para análisis de fertilidad.
siempre de abajo a arriba para evitar Primera edición 1999. 9 pp.
contaminaciones.
Kitchen, NR., Havlin, JK., Westfall DG. (1990).
•Depositar en los recipientes adecuados. Soil sampling under no-till banded phosphorus.
Soil Science Society American Journal. 54,
•Anotar en los envases los datos de 1661-1665.
profundidad, tipo de suelo, vegetación
existentes y demás datos que se Petersen, RG., Calvin LD. (1996). Sampling. p.
consideren necesarios. 1-17. In J.M. Bartelset al. (ed.) Methods of soil
analysis: Part 3. Chemical methods. 3rd edition.
•Trasladar las muestras al laboratorio y Book series no. 5. ASA and SSSA, Madison, WI.
realizar los análisis correspondientes antes
de las 48 horas. Rojas, WC., Rodríguez, SN. (1997). Manual
de muestreo para análisis de fertilidad.
•Mezclar lo mejor posible las muestras Servicio Agrícola y Ganadero. Departamento
colectadas bajo condiciones de asepsia de Protección de los recursos Naturales
sin utilizar las manos y pesar 10 gramos Renovables. Santiago-Chile. 23 pp.
para determinar humedad del suelo.
Sabbe, WE., Marx, DB. (1987). Soil sampling:
•Si en el campo se tomaron submuestras spatial and temporal variability. p. 1-14. In J.R.
separadas es posible realizar los análisis Brown (ed.) Soil testing: sampling, correlation,
para cada muestra independiente o hacer calibration, and interpretation. SSSA Spec.
una muestra total, procediendo igual que Publ. 21. Madison, WI.
en el punto No 6.
Test Methods for the Examination of
Composting and Compost TMEC (2001).
Sample Collection and Laboratory Preparation
02.01 Field Sampling of Compost Materials.

43
44
Capítulo 2
ECOLOGÍA Y RELACIONES MICROBIANAS

45
46
Capítulo 2

ECOLOGÍA Y RELACIONES MICROBIANAS

Viviana Gutiérrez Romero y Marcela Franco Correa

2.1. Introducción interactúan las diversas comunidades

de microorganismos y el papel de dicha
2.1.1. Ecología microbiana interacción en cada ecosistema ha sido
fundamental para entender el funcionamiento
El desarrollo de las actividades biológicas de la naturaleza. En los últimos años, con el
en el planeta tierra es imprescindible para el desarrollo de las llamadas técnicas OMICA´s,
mantenimiento de muchas especies entre se ha avanzado en el conocimiento no solo
ellas la microbiota, donde se estudia el del microbioma, sino también de la ecología
comportamiento de cada microorganismo microbiana y su relación con los diferentes
en su ambiente natural, debido al gran ambientes (Madigan et al., 2021; Ossowicki et
protagonismo que tienen en la dinámica de al., 2021).
muchos ecosistemas (terrestres, acuáticos
y aéreos); su papel en todos los ciclos El microbioma del suelo incluye la totalidad de
biogeoquímicos es imprescindible en sistemas los microorganismos cultivables y no cultivables
como el suelo, donde participan activamente de un suelo, que a su vez forman diversas
en el área agrícola proporcionando la comunidades con funciones biológicas
fertilidad del mismo (Sokol et al., 2022). específicas y se regulan a través de relaciones
entre genes y señalización. El microbioma
Entender la interacción entre los elementos participa en el ciclo de los diferentes elementos
bióticos y abióticos de un determinado como carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, entre
ambiente, así como la forma en que otros. Afecta directamente la fertilidad del

47
suelo y está implicado en el almacenamiento 2014; Tariq et al., 2020; Boro et al., 2022). El control
de carbono en suelo con un efecto directo e biológico es un método de gran potencial e
indirecto sobre la salud de plantas y animales importancia en cultivos, convirtiéndose en
en ecosistemas terrestres (Naylor et al., 2020). una de las alternativas que ofrecen un control
Es por esto que es de gran relevancia conocer duradero del patógeno u organismo nocivo.
que tipo de comunidades existen en el suelo Dentro de los microorganismos más conocidos
y cuales son las interacciones biológicas que y estudiados para el control biológico se
se desarrollan entre ellas, para favorecer la emplean hongos como Trichoderma sp.,
transformación de los elementos a través Gliocladium sp., Penicillium sp., Beauveria
de los diferentes ciclos biogeoquímicos y bassiana, Beauveria brongniartii, Metarhizium
conocer cómo se pueden controlar aquellos anisopliae, Metarhizium flavoviride, Paecilomyces
microorganismos que bajo ciertas condiciones fumosoroseus, Lecanicilium (Verticillium) lecanii,
ambientales incrementan su población y entre otros. También se incluyen bacterias
pueden tener un efecto adverso para plantas como Pseudomonas sp., diferentes especies
(Naylor et al., 2020; Dhaliwal et al., 2022). de Bacillus, como B. thuringiensis, B. subtilis, B.
pumillus, B. polimixa, entre otros. Por otro lado,
2.1.2. Interacciones biológicas bacterias del género Serratia sp., Pantoea sp. y
actinobacterias (ej. Streptomyces coelicolor),
La microbiota de los diferentes ecosistemas también han sido empleadas exitosamente
están regulados por el mantenimiento de la para control biológico (Ávila-Cortés et al.,
estabilidad de las comunidades en ambientes 2014; Tariq et al., 2020; Bonaterra et al., 2022).
variables (homeostasis); esta estabilidad Diferentes estudios han demostrado que el uso
es producida durante las asociaciones y/o de microrganismos antagonistas y productos
interacciones positivas o negativas de todos naturales pueden ser efectivos en el control de
los individuos que se encuentran en dicha enfermedades postcosecha; por tal razón los
comunidad. Dentro de una misma población agentes microbianos y sus productos derivados
pueden presentarse dichas interacciones, representan una alternativa de control segura
debido a que la microbiota coopera cuando las y de baja toxicidad para el medio ambiente
densidades celulares son bajas, pero compiten (Moraes et al., 2019).
cuando son altas. Una población puede
beneficiarse de otra en una relación comensal Las especies de Trichoderma han sido
unilateral, o dos poblaciones diferentes pueden investigadas como agentes de control
interaccionar sinérgicamente (Pii et al., 2015; biológico (BCAs) de enfermedades asociadas
Martínez et al., 2013; Ávila-Cortes et al., 2014; con hongos fitopatógenos por cerca de 80 años
Boro et al., 2022). Dentro de estos aspectos (Shafawati et al., 2013; Ferreirra and Musumeci,
intervienen los factores bióticos y/o abióticos 2021) y su éxito como BCAs, es consecuencia
que hacen parte del ecosistema donde estén de su alta capacidad reproductiva, habilidad
habitando, lo que conlleva a que se generen para sobrevivir bajo condiciones ambientales
patrones evolutivos internos que regulan las desfavorables, eficiencia en la utilización
diferentes poblaciones que interactúan (Karimi de nutrientes y promoción de crecimiento
et al., 2019). vegetal, capacidad para modificar la rizosfera,
inducción de mecanismos de defensa
2.1.3. Control biológico de microorganismos (Ghazanfar et al., 2018) y antagonismo hongos
fitopatógenos fitopatógenos, mediante mecanismos como:
competencia, antibiosis, micoparasitismo,
El control biológico y su sinónimo abreviado: inducción de resistencia sistémica, entre
“Biocontrol”, ha sido ampliamente utilizado otros (Lecomte et al., 2016). El amensalismo,
en los campos de la biología, especialmente comúnmente denominado antibiosis, consiste
en la entomología y en la fitopatología. En en la secreción de metabolitos secundarios
fitopatología el término se aplica a la utilización que inhiben el desarrollo de microorganismos
de microorganismos antagonistas (agente de patógenos. Entre los metabolitos secundarios
control biológico) con el fin de suprimir las inhibitorios se encuentran: trichodermina,
enfermedades, así como el uso de patógenos gliovirina, gliotoxina, y compuestos furanónicos
específicos de un huésped para el control de antimicrobiales como la 3-(1-hexanil)-5-hidroxi-
plantas arvenses (malezas), (Ávila-Cortes et al., 5-metil-2,5 (H) furanona, y la 6-pentil-α-pirona

48
(Lecomte et al., 2016; Asad 2022), entre otros. diferentes mecanismos de defensa como
La competencia ocurre principalmente por resistencia sistémica adquirida, resistencia
nutrientes, espacio y factores de crecimiento sistémica inducida y resistencia local adquirida
(Lecomte et al., 2016). Por último, el (Poveda et al., 2020; Asad 2022).
micoparasitismo no solamente consiste en
la producción de enzimas líticas (quitinasas, Otros de los microorganismos que han
celulasas y proteinasas), las cuales permiten sido estudiados como biocontroloadores
la degradación de la pared celular del (BCAs), son las actinobacterias, las cuales
microorganismo patógeno (Reithner et al., presentan capacidad antagónica por medio
2011; Asad 2022), sino en la interacción entre de mecanismos como la antibiosis, siendo
sus estructuras que permiten la destrucción ésta la más estudiada. Algunas especies
de algunas de las estructuras del patógeno de actinobacterias tienen la capacidad de
huésped (ej: micelio, esporas y esclerocios), producir un amplio espectro de antibióticos
utilizándolos como una fuente de carbono y y antifúngicos como metabolitos secundarios
nitrógeno (Bhat, 2017; Ferreirra and Musumeci, y una gran variedad de enzimas que
2021). Así mismo, Trichoderma es reconocido hidrolizan la pared de los hongos, tales como:
como elicitor, por su capacidad de producir celulasas, hemicelulasas, quitinasas, amilasas,
compuestos con diferentes características glucanasas, entre otras (Franco-Correa, M. &
químicas que sirven cmo activadores de Chavarro, V., 2016; Ameen et al., 2019; Law et
reacciones defensivas en plantas. Estos al., 2019), (Figura 2 y Figura 3).
compuestos son capaces de promover

Figura 2.
Pruebas de interacción in vitro para hongos. (A) Interacción hongo-hongo, crecimiento
influenciado. (B) Interacción hongo-hongo, crecimiento no influenciado o libre.
(C) Crecimiento miceliar influenciado en presencia de una actinobacteria.

A B

Cortesía de Viviana Gutierrez Romero.

49
 Figura 3.
Pruebas de interacción para bacterias in vitro. (A) Interacción bacteria-hongo: Crecimiento
miceliar influenciado. (B) Crecimiento miceliar libre del fitopatógeno. (C) Interacción negativa
entre bacterias Gram negativas. (D) Inhibición entre bacterias Gram negativas.

A B

C D

Cortesía de Aura Marina Pedroza Rodríguez

2.2. Objetivos 2.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo

Objetivo general 2.3.1. Enfrentamiento dual interacción hongo-

hongo
•Evaluar in vitro algunas de las iteraciones
positivas y negativas, que se pueden • 1 caja de Petri con agar papa dextrosa
desarrollar entre microorganismos de (PDA) sembrado con Trichoderma harzianum
diferentes géneros. (anexo A, numeral 1).

Objetivos específicos • 1 caja de Petri con agar PDA sembrado

con Fusarium oxysporum.
•Evaluar las diferentes técnicas de
antagonismo utilizadas para ensayos in vitro. • 2 cajas de Petri con agar PDA.

•Determinar los porcentajes de inhibición • Aguja de disección recta.

miceliar en las técnicas de antagonismo
contra hongos. • Bisturí.

•Determinar la inhibición en milímetros

en las técnicas de antagonismo contra
bacterias.

50
2.3.2. Interacción bacteria no filamentosa-hongo 2.5. Metodología

• 1 caja de Petri con Agar PDA sembrado 2.5.1. Enfrentamiento dual interacción hongo-
con Fusarium oxysporum. hongo

• 1 caja de Petri con agar nutritivo sembrado • Cortar con la aguja de disección o
con una bacteria no filamentosa como con el bisturí 3 cuadrados de 0,5 cm x
Bacillus sp. o Pseudomonas fluorescens 0,5 cm de agar con micelio de Fusarium
(anexo A, numeral 2). oxysporum, y un cuadrado de las mismas
dimensiones de agar con micelio de
• 2 cajas de Petri con agar PDA. Trichoderma harzianum.

• Asa redonda. • En una de las cajas de Petri con agar PDA

sembrar en la parte central el cuadrado
• Aguja de disección recta. de Fusarium oxysporum para evaluar el
crecimiento libre o no influenciado por el
2.3.3. Interacción bacteria filamentosa-hongo microorganismo biocontrolador.

•1 caja de Petri con Agar PDA sembrada • Dividir la otra caja de Petri con agar PDA
con Fusarium oxysporum. en 3 zonas iguales de 3 cm.

•1 caja de Petri con agar avena sembrada • En el primer segmento colocar el cuadrado
con una bacteria filamentosa como con Fusarium oxysporum.
Streptomyces sp. (anexo A, numeral 3).
• En el segundo segmento colocar el cuadro
• 2 cajas de Petri con agar PDA. con Trichoderma harzianum.

• Asa redonda. • Incubar a 25 ºC durante 5 a 7 días.

• Aguja de disección recta. • Medir diámetro de la colonia en milímetros

del hongo a evaluar en los dos agares PDA
2.3.4. Interacción bacteria-bacteria y determinar la inhibición de crecimiento
miceliar en la caja de Petri que contiene el
• 1 caja de Petri con agar nutritivo sembrada posible hongo antagonista y el crecimiento
con bacteria Gram positiva o Gram negativa. libre en la caja de Petri que sólo tiene el
hongo filamentoso (Fusarium oxysporum).
•1 caja de Petri con agar nutritivo sembrada
con una bacteria Gram positiva o Gram • Determinar el porcentaje de inhibición
negativa. del crecimiento miceliar empleando la
ecuación 9.
•1 caja de Petri con agar nutritivo PDA.
(CML-CMIb)
•Asa redonda. % ICM= x 100
(CML)
2.4. Equipos
(CML-CMIb) x100
• Incubadora. ICM (%)=
(CML)

• Microscopio. (Ecuación 9)

• Estereoscopio. Dónde: ICM (%): Corresponde al porcentaje

de inhibición del crecimiento miceliar. CML:
corresponde al crecimiento miceliar libre en
milímetros. CMI: corresponde al crecimiento
miceliar influenciado en milímetros.

51
2.5.2. Interacción bacteria no filamentosa-hongo •Dejar adsorber la suspensión por 5 minutos
a 20 ºC.
•Cortar con la aguja de disección o con el
bisturí 3 cuadrados de 0,5 cm x 0,5 cm de •Sembrar en la parte central de agar PDA
agar con micelio de Fusarium oxysporum. inoculado con la suspensión de conidios
de la actinobacteria el cuadrado de
•En una de las cajas de Petri con agar agar con micelio de Fusarium oxysporum,
PDA sembrar de forma masiva 0,1 mL de para evaluar el crecimiento influenciado
una suspensión bacteriana (Bacillus sp. por la bacteria.
o Pseudomonas fluorescens) con una
concentración igual a 1x104 células/mL y •En la otra caja de Petri con agar PDA
distribuir uniformemente con una espátula sembrar en la parte central el cuadrado
de vidrio. de Fusarium oxysporum para evaluar el
crecimiento libre o no influenciado.
•Dejar adsorber la suspensión por 5 minutos
a 20 ºC. •Incubar a 25 ºC durante 5 a 7 días.

•Sembrar en la parte central de agar PDA •Medir diámetro de la colonia en milímetros

inoculado con la suspensión bacteriana del hongo a evaluar en los dos agares PDA
el cuadrado de Fusarium oxysporum. y determinar la inhibición de crecimiento
En esta caja se evalúa el crecimiento miceliar en la caja que contiene la
miceliar influenciado. suspensión de la actinobacteria y el
crecimiento libre en la caja que sólo tiene
•En la otra caja de Petri con agar PDA el hongo filamentoso.
sembrar en la parte central el cuadrado
de agar con micelio de Fusarium •Determinar el porcentaje de inhibición
oxysporum para evaluar el crecimiento del crecimiento miceliar empleando la
libre o no influenciado. ecuación 9.

•Incubar a 25 ºC durante 5 a 7 días. 2.5.4. Interacción bacteria-bacteria

•Medir diámetro de la colonia en •Preparar una suspensión de cada una de

milímetros del hongo a evaluar en los dos las bacterias a evaluar en solución salina
agares PDA y determinar la inhibición al 0,85 % (m/v) con una concentración de
de crecimiento miceliar en la caja que 1x106 UFC/mL (anexo B, numeral 1).
contiene la suspensión bacteriana y el
crecimiento libre en la caja que sólo tiene •Sembrar en superficie y de forma masiva
el hongo filamentoso. 0,1 mL de cada bacteria agar nutritivo.

• Determinar el porcentaje de inhibición •Distribuir homogéneamente sobre la

del crecimiento miceliar empleando la caja con una espátula de vidrio y dejar
ecuación 9. adsorber 10 minutos a 20 ºC.

2.5.3. Interacción bacteria filamentosa-hongo •Colocar 4 anillos de plástico estériles

de 1,0 cm de alto x 0,5 cm de diámetro,
•Cortar con la aguja de disección o con el formando un cuadrado a una distancia
bisturí 3 cuadrados de 0,5 cm x 0,5 cm de de 3 cm entre anillos.
agar con micelio de Fusarium oxysporum.
•Adicionar 0,1 mL de la bacteria a
•En una de las cajas de Petri con agar enfrentar con la que se sembró de forma
PDA sembrar de forma masiva 0,1 mL de masiva en el agar nutritivo.
una suspensión de conidios (Streptomyces
sp.) con una concentración igual a 1x104 •No invertir las cajas para evitar que la
conidios/mL y distribuir uniformemente con suspensión de microorganismos se salga
una espátula de vidrio. de los anillos plásticos.

52
 •Sembrar el control negativo de la misma Boro, M., Sannyasi, S., Chettri, D., et al., (2022).
forma que los tratamientos, pero en los Microorganims in biological control strategies
anillos colocar 0,1 mL de solución salina al to manage microbial plant pathogens: A
0,85 % (m/v). review. Archives of Microbiology. [Link]
org/10.1007/s00203-022-03279-w.
•Sembrar el control positivo de la misma
forma que los tratamientos, pero en los Dhaliwal, S.S., Gupta, R., Singh, A.K., et
anillos colocar 0,1 mL de un antibiótico de al. (2022). Impact of cropping systems on
amplio espectro con una concentración pedigenic distribution and transformations
de 100 mg/L. of micronutrients, plants accumulations
and microbial community compositions in
•Incubar de 24 a 48 horas a 30 ºC. soil: a review. Tropical Ecology. [Link]
org/10.1007/s42965-022-00272-8.
•Observar la formación de halos de
inhibición en la zona aledaña al anillo la cual Franco-Correa, M., Chavarro-Anzola, V. (2016).
se considera como prueba de interacción Actinobacteria as Plant Growth-Promoting
positiva o inhibición del crecimiento Rhizobacteria. En D. Dhanasekaran, Y. Jiang.
bacteriano en mm. La bacteria sembrada Actinobacteria. Basis and Biotechnological
en el anillo es la que inhibe a la que está applications. Croacia: InTech. Pags, 249-270.
sembrada de forma masiva.
Ferreirra, F and Musumeci, M. (2021).
2.6. Referencias Trichoderma as biological control: scope and
prospects to improve efficacy. World Journal
Ameen, F., Reda, S., El-Shatoury, S., Riad, E., Microbiology and Biotechnology. [Link]
Enany, M., Alarfaj, A. (2019). Prevalence of org/10.1007/s11274-021-03058-7.
antibiotic resistant mastitis pathogens in dairy
cows in Egypt and potential biological control Ghazanfar, U., Raza, M., Raza, W., Qamar, I.
agents produced from plant endophytic (2018). Trichoderma as potential biocontrol
actinobacteria. Saudi Journal of Biological agent, its exploitation in agriculture: a review.
Sciences. 26 (7), 1492-1498. Plant Protection. 2 (3).

Asad, S. (2022). Mechanims of action and Karimi, B., Dequiedt, S., Terrat, S. et al.
biocontrol potential of Trichoderma against Biogeography of Soil Bacterial Networks along
fungal plant diseases. A review. Ecologial a Gradient of Cropping Intensity. (2019). Sci
Complexity.[Link] Rep 9, 3812 [Link]
ecocom.2021.100978. 019-40422-y

Ávila, I., Rodríguez, M., Franco, M., Pedroza, A., Law, F., Pusparajah, P., Mutalib, N., Wong,
y Gutiérrez, I. (2014). Use of agricultural wastes S., Goh, B. y Lee, L. (2019). A review on
for biomass production of the plant growth mangrove actinobacterial diversity: The roles
promoter actinobacteria. Streptomyces sp. of Streptomyces and novel species discovery.
MCR26. Journal of Experimental Biology and Progress In Microbes & Molecular Biology. 2 (1).
Agricultural Sciences. 2(5), 460-472.
Lecomte, C., Alabouvette, C., Edel, V., Robert,
Bhat, KA. (2017). A New Agar Plate Assisted Slide F., Steinberg, C. (2016). Biological control of
Culture Technique to Study Mycoparasitism ornamental plant diseases caused by Fusarium
of Trichoderma sp. on Rhizoctonia solani and oxysporum: a review. Biological Control. 101,
Fusarium oxysporium. International Journal of 17-30.
Current Microbiology and Applied Science.
6(8), 3176-3180. Martínez. M., Gutiérrez, V., Pedroza, A. (2013)
Bonaterra, A., Badosa, E., Daranas, N., et al. Métodos Microbiológicos, físicos y químicos
(2022). Bacteria as Biological Control Agents con aplicación ambiental. Manual de
of Plant Diseases. Microorganims. [Link] Microbiología. Chile: Editorial Universidad
org/10.3390/microorganisms10091759. Federico Lleras San María 132p. p.

53
Madigan, M., Bender, K., Buckley, D.,
Sattley, W., Stahl, D. (2021). Brock Biology of
Microorganims.16 edición. Editorial Pearson.
Moraes-Bazioli, J., Belinato, JR., Henrique-
Costa, J., Yuri-Akiyama, D., Moraes-Pontes,
JG., Kupper, KC., Augusto, F., Carvalho, JE.,
Pacheco, FT. (2019). Biological Control of Citrus
Postharvest Phytopathogens. Toxins. 11(8), 460.

Naylor, D., Sadler, N., Bhattacharjee, A., et

al. (2020). Soil Microbiomes Under Climate
Change and Implications for Carbon
Cycling. Annual Review of Environmental and
Resoyrces.45, 29-59.

Ossowicki, A., Raaijmakers, J., Garbeva,

P. (2021). Minireview Disentangling soil
microbiome functions by perturbation,
Envirmental Microbiology Reports. 13, 582-590.

Pii, Y., Mimmo, T., Tomasi, N., et al., (2015).

MIcrobial interactions in the rhizophere:
benefical influences of plant growth-promoting
rhizobacteria on nutrient adquisition process. A
review. Biology Fertility Soil. DOI 10.1007/s00374-
015-0996-1.

Poveda, J., Abril-Urias, P., Escobar, C. (2020).

Biological Control of Plant-Parasitic Nematodes
by filamentous Fungi Inducrs of Resistance:
Trichoderma, Mycorrhizal and Endophytic
Fungi. Frontiers in Microbiology. doi: 10.3389/
fmicb.2020.00992.

Reithner, B., Ibarra-Laclette, E., Mach, R.L.,

Herrera-Esttrella, A. (2011). Identification of
mycoparasitism-related genes in Trichoderma
atroviride. Applied Environmental Microbiology.
77, 4361-4370.

Shafawati, S., Siddiquee, S. (2013). Composting

of oil palm fibres and Trichoderma spp. as the
biological control agent: A review. International
Biodeterioration & Biodegradation. 85, 243-253.

Sokol, N., Slessarev, E., Marschman, G., et al.

(2022). Life and death in the soil microbiome: how
ecological processes influence biogeochemistry.
A review. Nature Review Microbiology. 20, 417-430.

Tariq, M., Khan, A., Sif, M., et al. (2020). Biological

control: a sustainable and practical approach
for plant disease management. Acta
Agriculturae Scandinavica, Section B. Soil & Plant
Science. DOI: 10.1080/09064710.2020.1784262.

54
55
56
Capítulo 3
CICLO DEL CARBONO
TRANSFORMACIÓN DE POLÍMEROS DE ORIGEN NATURAL

57
58
Capítulo 3

CICLO DEL CARBONO

TRANSFORMACIÓN DE POLÍMEROS DE ORIGEN NATURAL

3.1. Introducción remueve cerca del 29 % de las emisiones de

CO2, representando aproximadamente 1,6 x
3.1.1. Formas de carbono en el ambiente: Suelo, 1010 Toneladas de este gas fijado anualmente
agua y aire (importancia para el ecosistema) por los organismos (Ryu et al., 2019).
Constituyéndose en el proceso biológico
El carbono es el elemento esencial de la vida, más importante en la naturaleza para
constituye aproximadamente el 50 % de todos disminuir las emisiones gaseosas producidas
los organismos vivos y está presente en todos de forma natural y antropogénica, las cuales
los ecosistemas (Piao et al., 2019). De manera se han incrementado sustancialmente por
general la transformación del carbono en la el desarrollo industrial y crecimiento de la
naturaleza involucra dos procesos principales: población mundial (Campbell et al., 2017;
La fotosíntesis que es la conversión de la forma Gougoulias et al., 2014).
más oxidada del carbono (CO2) a formas
reducidas para la producción de nuevos El segundo proceso se relaciona con la
componentes celulares en los diferentes liberación a la atmósfera de CO2 y CH4, que se
organimos vivos (Ryu et al., 2019). Este proceso logra a través de la mineralización de la materia
es realizado por las plantas, algas y algunos orgánica mediado por microorganismos
microorganismos fotoautotróficos (Enamala heterotróficos, bajo condiciones aeróbicas
et al., 2020; Céspedes et al., 2021; Piao et al., y anaeróbicas (Bhattacharya et al., 2016;
2019). A través del proceso de fotosíntesis se Gougoulias et al., 2014; Rao and Mohanty,

59
2019). Los organismos heterotróficos emplean como fuentes de carbono por diversos
el carbono orgánico para síntesis de nuevos microorganismos y una fracción de estos
componentes celulares y la obtención de intermediarios se convierten en los precursores
energía. Durante este proceso se produce para la formación de las sustancias húmicas
nuevamente CO2 que es liberado a la del suelo (Ácidos fúlvicos, ácidos húmicos y
atmósfera, cerrando así el ciclo del Carbono huminas), (Wall et al., 2019; Rao and Mohanty,
(Bhattacharya et al., 2016). 2019). En la figura 4 se presenta de forma
general cómo se realiza la transformación de
En el suelo, la materia orgánica que contiene la materia orgánica en suelo, hasta llegar a la
carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y otros formación de la reserva de carbono en suelo
elementos, esta formada materiales o residuos (sustancias húmicas). Por otro lado, parte de
de origen animal, vegetal y microbiano, frescos la materia orgánica transformada puede
o con diferentes grados de biotransformación. convertirse en materiales fósiles (petróleo
Estos materiales se transforman o mineralizan o carbón), bajo condiciones reducidas de
bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas, oxígeno, elevada presión y a través de millones
produciendo intermediarios que son utilizados de años (Li et al., 2022; Stepanova et al., 2022).

Figura 4.
Transformación de la materia orgánica en suelo asociado con el proceso de humificación
aeróbica y anaeróbica.

Mineralización Mineralización

Compuestos
Minerales

MATERIA Degradación
ORGÁNICA Humificación
FRESCA Compuestos Compuestos
Simples húmicos

Lignina Precursores Oxidación Núcleo AF

Compuestos aromáticos Taninos Fenótico Polimerización Polimerizado

Polimerización
Celulosa Azúcares
Compuestos alifáticos Hemicelulosa aminoacidos Condesación
Proteinas con compuestos Suministro
nitrogenados cadenas
alifáticas
Soporte energético BIOMASA AU
para microorganismos MICROBIANA

Cortesía de Lucas David Pedroza Camacho.

En el suelo, la materia orgánica que contiene carbono,

nitrógeno, fósforo, azufre y otros elementos, esta formada
materiales o residuos de origen animal, vegetal y microbiano,
frescos o con diferentes grados de biotransformación.

60
3.1.2. Mineralización aeróbica de la materia Una vez se ha disminuido el tamaño de los
orgánica. Humificación directa residuos, se inicia el proceso de hidrólisis o
también llamada humificación directa la
La materia orgánica del suelo hace referencia a cual es realizada por diferentes comunidades
la totalidad de compuestos orgánicos presentes de microorganismos propios del suelo que
en el mismo que proviene de los residuos de producen enzimas extracelulares que hidrolizan
plantas, animales y microorganismos, con los polímeros para dejar intermediarios de bajo
diferentes estados de transformación (Xu et peso molecular que puedan ser transportados
al., 2020). Estos compuestos son transformados al interior de las células y ser empleados
en función del tiempo, por la acción de como fuentes de carbono y energía (Wall
factores físicos, químicos y biológicos (Wall et et al., 2019). En la tabla 1 se presentan las
al., 2019). Este proceso se conoce como la principales enzimas que pueden participar
degradación de la materia orgánica o proceso en el proceso de humificación directa de la
de humificación, que se sub divide en directa e materia orgánica en suelo. Estas actividades
indirecta. El proceso inicia con la fragmentación enzimáticas pueden observarse in vitro al
mecánica de los residuos vegetales o animales, cultivar los microorganismos en medios sólidos
la cual es realizada por la mesofauna edáfica que contengan los sustratos inductores (Figura
del suelo y tiene como objetivo disminuir 5). A partir de la humificación directa se
el tamaño de partícula para facilitar la producen intermediarios que son asimilados
biodisponibilidad para los microorganismos. por los microorganismos para la obtención de
Adicionalmente, la materia orgánica puede carbono y energía, para liberar nuevamente
sufrir un pre tratamiento bioquímico mediado el carbono como CO2 a la atmósfera (Rashad
por hidrolasas y ácidos producidos por estos et al., 2022). Por otro lado, parte de los
organismos (Socarras, 2013; Lefèvre et al., 2017; intermediarios que no son asimilados, quedan
Morales-Rojas et al., 2021). en el suelo y se convierten en los precursores
para la formación de las sustancias húmicas a
através del proceso de humificación indirecta
(Moreno et al., 2019; Tadini et al., 2022).

61
 Tabla 1.
Enzimas que participan en la mineralización y/o humificación directa
de la materia orgánica en suelo

Compuesto Composición Bacterias Hongos

Función biológica Enzimas Referencia
o polímero química productores productores

Proteasas ácidas
Proteasas neutras
Proteasas alcalinas.
Moléculas
orgánicas que
Diferentes tipos Aminopetidasas Bacillus subtilis
forma parte de
de aminoácidos y (E.C.3.4.11)
las estructuras
otros elementos en Bacillus circulans
celulares y
menor proporción Dipetidasas Aspergillus
tienen diferentes
como azufre, (E.C.3.4.13) Bacillus cereus fumigatus
funciones
fósforo, cobre,
biológicas.
hierro, magnesio, Tripeptilpeptidasas Bacillus Aspegillus niger
etc. (E.C.3.4.14.-) licheniformis Naeem et
Proteínas Estructural
Aspergillus al., 2022
Los aminoácidos Serina carboxipeptidasa Brevibacterium flavus
Catalítica
se unen entre sí a (E.C.3.4.16) sp.
través de enlaces Trichoderma
Regulación
peptídicos entre Cisteína carboxipeptidasa Thermus sp.
el grupo amino y (E.C.3.4.18) termophilus
Defensa
carboxilo de dos
aminoácidos. Aspartico peptidasa Stretomyces sp.
Transporte
(E.C.3.4.23)

Metalocarboxipeptidasas
(E.C.3.4.24)

Penicillium sp.
Pseudomonas
Grupo de flurescens
Penicillium
moléculas
expansum
Moléculas biológicas Serratia sp.
orgánicas que compuestas
Aspergillus
actúan como por carbono, Lipasas o triacil glicerol Alcaligenes sp.
niger
compuestos de hidrógeno y otros hidrolasas (E.C. [Link]) Chandra
Lípidos
reserva energética elementos. Burkholderia sp. et al., 2020
Candida
y forman parte de Esterasas
lipolytica
las membranas Unidos a través de Bacillus
celulares. enlaces carbono- coagulans
Colletotrichum
hidrógeno y
gloesporioides
enlaces éster. B.
thermoleovorans

Pseudomonas
Compuestos fluorescens
Compuestos ricos en carbono,
presentes en la nitrógeno y Fosfatasas ácidas Pseudomonas sp.
materia orgánica fósforo, unidos por
que tiene en su enlaces éster. Fosfatasas alcalinas Serratia sp.
Penicillium sp.
estructura fósforo. Blanco et
Fósforo orgánico
Pueden estar Fosfo monoesterasas Kosakonia sp. al., 2021
Aspergillus sp.
Forman parte presentes como (EC 3.1.3)
las membranas gránulos de Bacillus
celulares, ATP, inclusión de fósforo Fosfo diesterasas (EC 3.1.4) magaterium var.
entre otros. en estructuras phosphaticum
como gránulos.
Streptomyces sp.

Bacillus sp.

Endoquitinasas Bacillus Beauveria

(EC [Link]) thuringiensis bassiana
Sub unidades
de N-acetil
Polímero estructural Quitobiasa Serratia Trichoderma
glucosamina (β
y de protección (EC [Link]) marcescens harzianum Satoque et
Quitina 1.4- acetamida-
en crustáceos, al., 2007
D-glucosa) unidas
insectos y hongos. N-acatilglucosaminidasa Paenibacillus sp. Metarhizium
por enlaces
(EC [Link]) anisopliae
glicosídicos β 1-4
Salinivibrio sp
N-acetylglucosaminidasa
Streptomyces sp.

62
 Tabla 1.
Enzimas que participan en la mineralización y/o humificación directa
de la materia orgánica en suelo

Compuesto Composición Bacterias Hongos

Función biológica Enzimas Referencia
o polímero química productores productores

Endoamilasas α-amilasas
(EC [Link])

Exoamilasas
Bacillus Trichoderma
Sub unidades de Glucoamilasa (EC [Link]) licheniformis sp.
glucosa unidas
Polímero de
Almidón por enlaces β-amilasas (EC [Link]) Bacillus Penicillum sp.
reserva en plantas
glicosidicos α 1-4, amyloliquefaciens
α 1-6 y β 1-4. Amilasa maltogénica Aspergillus sp.
Streptomyces sp.
Amilasa productora de
maltotetralosa

Pululanasa o isoamilasa

Aspergillus
niger
Sub unidades
Pectin liasa ([Link])
de ácido Bacillus sp.
Penicillium sp.
Polímero estructural galacturónico con
Poligalacturonidasa
Pectina y de protección diferentes grados Klebsiella sp.
(EC. [Link]) Rhizopus sp.
para frutos y flores de metilación
unidos por enlaces Pseudomonas sp.
Pectin esterasa ([Link]) Rhizomucor sp.
β 1-4
Trichoderma sp.

Bacillus cereus
Endo β-1,4 glucanasa
Leifsonia xyli Trichoderma
(E.C. [Link])
reseii
Moreno et
Polímero estructural Sub unidades de Bacillus sp.
Exo β-1,4 celobiohidrolasa al., 2019;
Celulosa y de protección en glucosa unidas por Trichoderma
(E.C. [Link]) Seidl et al.,
plantas. enlaces β 1-4 Streptomycess hamatum
2016
fumigatiscleroticus
Exo β-1,4 celobiohidrolasa
(E.C. [Link])
Clostridium
cellulolyticum

Sub unidades
Endo-β-1,4-xilanasa
de hexosas
(EC [Link])
(D-manosa,
Trichoderma
D-glucosa y Bacillus cereus
β-xilosidasa (EC [Link]) reseii
D-galactosa)
Leifsonia xyli
Polímero estructural α Larabinofuranosidasa Trichoderma
Subunidades de Gómez et
Hemicelulosa de protección en (EC [Link]) hamatum
pentosas (D-xilosa, Bacillus sp. al., 2018
plantas
L-arabinosa)
α-glucuronidasa (EC Absidia sp.
Streptomycess
[Link])
Los azúcares están fumigatiscleroticus
Aspergillus sp.
unidos entre sí por
Acetilxilano esterasa
enlaces β-1,4 y
(EC [Link])
β-1,3-glucosídicos

Lacasas (EC [Link]) Datta et

Sub unidades al., 2017;
aromáticas de Manganeso Peroxidasa Pleurotus ostreatus, Phanerochaete Janusz et
Polímero estructural
fenil propano (EC [Link]) chrysosporium, Trametes versicolor, al., 2017;
Lignina de protección en
unidos por enlaces Ganoderma lucidu, Letinula Madadi et
plantas
carbono-carbono, Lignina peroxidasa edodes, Phebia radiata al., 2017;
éter y aril carbono (EC [Link]) Rivera et
al., 2013

63
 Figura 5.
Hidrólisis de polímeros in vitro asociada con procesos de humificación directa.
(A) Microorganismos productores de proteasas en agar leche. (B) Microorganismos productores
de lipasas en agar tributirina. (C) Microrganismos productores de amilasas en agar almidón.
(D) Microorganismos productores de celulasas en agar celulosa. (E) Microorganismos productores
de lacasa en agar extracto salvado de trigo con ABTS.
(F) Microorganismos productores de pectinasas en agar pectina.

A B C

D E F

Cortesia de Aura Marina Pedroza y Viviana Gutierrez Romero

3.1.3. Humificación indirecta producción de del suelo y por lo tanto son los indicadores
sustancias húmicas. Grado de condensación más confiables para monitorear su estado de
de la materia orgánica conservación (Ortega y Martinez, 2020; Rao
et al., 2019). Posterior a la mineralización se
La materia orgánica del suelo (SOM) es un inicia el proceso de humificación indirecta,
sistema complejo compuesto por diferentes donde se polimerizan residuos de C, y se
fracciones de C (aunque también contiene estabilizan químicamente en ácidos húmicos
N, P, K y otros elementos). Las fracciones y fúlvicos. La estabilización de C en el suelo se
carbonadas presentan diferente labilidad y, debe principalmente a: i) a las reacciones de
por ende, según las propiedades químicas polimerización de compuestos carbonados;
y físicas de los materiales orgánicos, los ii) protección física y iii) asociaciones órgano-
productos de la degradación microbiana y minerales, especialmente las relacionadas con
mineralización de la materia orgánica son silicatos de arcilla y óxidos de hierro (Moreno et
también difierentes, dependiendo además de al., 2019; Reddy et al., 2014; Yang et al., 2021).
las condiciones ambientales y el tiempo (Reddy
et al., 2014; Moreno et al., 2019; Tadini et al., Dentro de la composición de la materia
2022). Las diferentes fracciones de la materia orgánica se encuentran las sustancias húmicas
orgánica en el suelo, tanto en cantidad como que corresponden a la mayor fracción (85 %)
en calidad, son la base de la calidad y salud de ésta, y tienen una influencia directa sobre la

64
fertilidad de los suelos ya que regulan algunos 3.1.4. Biotransformación o mineralización
procesos como: solubilidad y disponibilidad de anaeróbica de la materia orgánica.
nutrientes para la planta, fuente de energía
y carbono para la comunidad microbiana, La digestión anaeróbica es un proceso a través
capacidad de retención de agua, entre otros del cual se lleva a cabo la mineralización de
(Fincheira et al., 2016; Carlderín-García et compuestos orgánicos en ausencia de oxigeno
al., 2019; Rashad et al., 2022). Las sustancias liberando productos como metano (CH4) y
húmicas se diferencian por su capacidad dióxido de carbono (CO2), los cuales pueden
de extracción-precipitación en soluciones ser utilizados para generar electricidad o calor.
alcalinas/ácidas formando tres fracciones: El proceso de digestión anaeróbica tiene
AH (ácidos húmicos), AF (ácidos fúlvicos) y grandes ventajas frente a otras tecnologías ya
huminas, éstas últimas insolubles tanto en que trabaja con consorcios microbianos con
condiciones ácidas como alcalinas (Nardi et actividad metabólica diferente, lo cual genera
al., 2021; Rashad et al., 2022). En cualquier la eficiencia en la degradación de materiales
ecosistema, el estado y la composición de orgánicos (Kong et al., 2019). Este proceso
estas sustancias están dados por el manejo inicia con bacterias hidrolíticas que rompen
del suelo, clima, biota, topografía y tiempo moléculas de gran peso molecular para
de formación (Carlderín-García et al., 2019; hacerlas disponibles como fuente de energía
Rashad et al., 2022). para los microorganismos, posteriormente,
bacterias acidogénicas convierten amino
De esta manera, la caracterización y azúcares en CO2, H+, NH4+ y ácidos orgánicos,
funcionalidad de las sustancias húmicas puede que van a ser sustratos para microorganismos
inferir sobre el estado y calidad de la materia acetogénicos y metanogénicos que liberan
orgánica en el suelo, por lo que metodologías como productos finales metano y dióxido de
como la densidad óptica de soluciones carbono (Kong et al., 2019).
acuosas de ácidos húmicos y fúlvicos a 465 nm
y 665 nm (relación E4/E6) han sido ampliamente Además de la liberación de productos
usadas por los científicos para establecer el combustibles, se generan productos orgánicos
contenido de grupos carboxílicos, el porcentaje que pueden ser utilizados a nivel agrícola como
en el contenido de carbono y oxigeno, y la lodos sólidos, bio productos líquidos, entre
media del peso molecular de las sustancias otros, que contienen un alto nivel nutricional
húmicas (Reddy et al., 2014; Moreno et al., y pueden ser aprovechados en granjas
2019; Castillo et al., 2021). La absorbancia a 665 sostenibles generando un menor impacto a
nm está relacionada con la etapa inicial de nivel ambiental, ya que no hay generación de
degradación de la materia orgánica, mientras residuos, sino que son recirculados al sistema
que la absorbancia a 465 nm se puede atribuir a productivo de las fincas.
la presencia de estructuras con alto contenido
de humificación (Martínez et al., 2013). Es así,
como el aumento en el grado de humificación,
la condensación de las estructuras aromáticas
y la “edad” de la materia orgánica se verán
reflejados en un aumento del coeficiente E4/ La caracterización
E6. Finalmente, es importante mencionar que
éstos valores estarán relacionados con: a)
y funcionalidad de las
tamaño de partícula; b) pH; c) concentración sustancias húmicas
de radicales libres, contenido de C, O, CO2H
y la acidez total y es d) independiente de la puede inferir sobre
concentración de ácidos húmicos y fúlvicos.
Por esta razón, los valores para la longitud de el estado y calidad
onda 465 nm serán mayores que los obtenidos
a 665 nm debido a la presencia mayoritaria de de la materia orgánica
compuestos de bajo peso molecular y menos
polimerizados, valores que son reportados en el suelo
en suelos agrícolas y materiales orgánicos en
proceso de degradación (Castillo et al., 2021).

65
3.2. Objetivos •1 caja de Petri pequeñas con agar lignina
I (anexo A, numeral 11).
Objetivo general
•1 caja de Petri pequeñas con agar lignina
• Evaluar in vitro el proceso de transformación II (anexo A, numeral 12).
de la materia orgánica (polímeros) y su
relación con las etapas de humificación •1 caja de Petri pequeñas con agar lignina
directa e indirecta, como indicadores de III (anexo A, numeral 13).
calidad de suelo.
•1 caja de Petri grande con agar agua
Objetivos específicos suplementado con glucosa y extracto de
lavadura (anexo A, numeral 14).
•Evaluar semi cuantitativamente las
actividades enzimáticas asociadas con •1 frasco Schott de 250 mL con 90 mL de
la hidrólisis de proteínas, lípidos, almidón, agua peptonada al 0,1 % (m/v), (anexo B,
pectina, celulosa y lignina, como indicadores numeral 2).
de calidad en suelos y materiales orgánicos.
•6 tubos de 16x150 mm tapa rosca con
•Estimar el grado de condensación agua peptonada al 0,1 % (m/v).
de carbono como componente en la
formación de sustancias húmicas en •Puntas para pipeta de 100-1000 µL.
diferentes materiales orgánicos.
•Pipeta automática de 100-1000 µL.
3.3. Materiales, reactivos y medios
•5 rastrillos.
3.3.1. Actividades enzimáticas semi cuantitativas
•Pipeta Pasteur de vidrio.
•100 g de suelo o material orgánico.
•Laminas portaobjeto.
•1 caja de Petri con agar salvado de trigo
sembrada con un hongo de podredumbre •Laminillas.
blanca. (anexo A, numeral 9).
•Bisturí.
•5 cajas de Petri con agar leche al 1%
(m/v), (anexo A, numeral 4). •Agujas de disección.

•5 cajas de Petri con agar tributirina (anexo •Lugol de Gram.

A, numeral 5).
•Colorante rojo congo 1 % (m/v), (anexo
•5 cajas de Petri con agar almidón al 1% B, numeral 3).
(m/v), (anexo A, numeral 6).
•Cloruro de sodio (NaCl) 2 M, (anexo B,
•5 cajas de Petri con agar pectina al 1% numeral 4).
(m/v), (anexo A, numeral 7).
3.3.2. Grado de condensación o formación de
•5 cajas de Petri con agar celulosa al 1% sustancias húmicas
(m/v), (anexo A, numeral 8).
•100 g de suelo o material orgánico.
•1 caja de Petri con agar salvado de trigo
con sal de diamonio 2,2’-Azino-bis (ácido •1 tubo Falcon de 50 mL.
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), (ABTS) 0,5
M (anexo A, numeral 9). •Hidróxido de potasio (KOH) 0,5 M (anexo
B, numeral 5).
•1 caja de Petri con agar salvado de trigo
con MnCl2 0,5 M (Anexo A, numeral 10). •Agua destilada.

66
3.4. Equipos •Para el recuento de microorganismos
proteolíticos no se adiciona ningún
•Incubadora. revelador, los microorganismos productores
de proteasas producen un halo transparente
•Balanza digital. alrededor de la colonia y el resto de la caja
se observa de color blanco opaco.
•Microscopio óptico.
•Para el recuento de microorganismos
•Espectrofotómetro UV/VIS. lipolíticos no se adiciona ningún revelador,
los microorganismos productores de
•Estereoscopio. lipasas producen un halo transparente
alrededor de la colonia y el resto de la
•Centrífuga. caja se observa de color amarillo opaco.

•Shaker o agitador horizontal. •Para el recuento de microorganismos

pectinolíticos adicionar a las cajas en las
3.5 Metodología que realizó el recuento total 2 mL de lugol
o rojo de rutenio para revelar los halos de
[Link] de microorganismos productores hidrólisis y realizar el recuento específico, el
de proteasas, lipasas, amilasas, pectinasas y cual se visualiza por la producción de una
celulasas zona de aclaramiento de color amarillo
claro o rojo claro alrededor de la colonia
•Pesar en balanza y cerca al mechero 10g y el resto de la caja se observa de color
de suelo. amarillo oscuro o rojo oscuro.

•Depositar el suelo en el frasco Schott •Para el recuento de microorganismos

de 250 mL y homogenizar la preparación amilolíticos adicionar a las cajas en las
(dilución 10-1). que realizó el recuento total 2 mL de
lugol para revelar los halos de hidrólisis y
•Transferir 1,0 mL del frasco Schott (dilución realizar el recuento específico, el cual se
10-1) a los tubos de 16x150 mm para visualiza por la producción de una zona de
obtener las diluciones 10-2 10-7. aclaramiento de color amarillo alrededor
de la colonia y el resto de la caja se
•Marcar las cajas de agar leche, tributirina, observa azul oscuro.
almidón, pectina y celulosa como
diluciones 10-3 hasta 10-7. •Para el recuento de microorganismos
celulolíticos adicionar a las cajas en las
•Sembrar 0,1 mL en superficie de las que realizó el recuento total 2 mL de rojo
diluciones 10-3 a 10-7. Congo al 1 % (m/v), esperar por cinco
minutos, retirar el exceso y adicionar 2 mL
•Distribuir homogéneamente la muestra de NaCl 2 M. Retirar el exceso e incubar
con el rastrillo. por 12 horas a 30 ºC. Posteriormente,
realizar el recuento específico, el cual se
•Incubar a 30 ± 5ºC por 48 horas. visualiza por la producción de una zona de
aclaramiento de color amarillo alrededor
•Realizar el recuento total de de la colonia y el resto de la caja se
microorganismos en las cajas en las que observa de color rojo.
observe colonias que oscilen entre 10 y
100 colonias. 3.5.2. Actividad lacasa (EC. [Link]) y manganeso
peroxidasas (EC. [Link]), semi cuantitativas en
•Realizar el recuento específico de agar salvado de trigo con inductores
microorganismos productores de enzimas
extracelulares en las cajas en las que •Marcar las cajas de Petri con agar
observe colonias que oscilen entre 10 y 100 salvado de trigo con el nombre del hongo
colonias (proteasas y lipasas). ligninolítico a evaluar.

67
 •Destapar al pie del mechero la caja de •Sembrar el disco de biomasa invertido en
Petri con agar salvado de trigo que tiene la parte central del agar lignina III.
el hongo ligninolítico crecido previamente.
•Incubar a 25 ± 3 ºC por 8 días.
•Cortar con la pipeta Pasteur invertida un
círculo de 5 mm de diámetro de agar con •Observar cada 2 días el crecimiento del
biomasa fúngica. micelio en milímetros.

•Sembrar el disco de biomasa invertido •Observar cada 2 días la aparición de

en el centro de la caja de agar salvado halos de decoloración alrededor del
de trigo que contiene los sustratos ABTS disco sembrado, que se relacionan con
(lacasa) y MnCl2 (manganeso peroxidasa). la degradación de lignina, por la acción
de las enzimas ligninolíticas que oxidan los
•Incubar a 25 ± 3 ºC por 8 días. grupos cromóforos de la lignina.

•Observar cada 2 días el crecimiento del •Observar cada 2 días la aparición de

micelio en milímetros. halos de color amarillo o café alrededor
del disco inoculado que se relacionan con
•Observar cada 2 días la aparición de la producción de melaninas.
halos de color verde y/o morado alrededor
del disco sembrado en agar salvado de •Medir el diámetro de los halos de
trigo con ABTS el cual se relaciona con la decoloración en los medios lignina I, II y III.
actividad lacasa semi- cuantitativa.
•Convertir los milímetros de decoloración
•Medir el diámetro en mm del halo de a porcentaje de decoloración empleando
color verde y/o morado. la ecuación 10.

•Observar cada 2 días la aparición de halos Xmm*100

Decoloración (%) =
de color café oscuro al pie del disco sembrado 50mm
en el agar salvado de trigo con MnCl2 para (Ecuación 10)
actividad manganeso peroxidasa.
[Link]ón del grado de condensación
•Medir el diámetro del halo de color café y/o humificación
como actividad manganeso peroxidasa.
• Pesar 4 g de la biomasa lignocelulósica,
3.5.3. Degradación de lignina soluble bajo tres suelo, aserrín o corteza.
condiciones nutricionales
• Colocarlos en tubos Falcon de 50 mL con
•Marcar las cajas de Petri con agar 40 mL de KOH 0,5 M.
lignina I, II y III, con el nombre del hongo
ligninolítico a evaluar. • Extraer las sustancias húmicas totales por 24
horas con una agitación de 150 rpm a 19 ºC.
•Destapar al pie del mechero la caja de
Petri con agar salvado de trigo que tiene • Centrifugar a 8000 rpm por 15 min y recuperar
el hongo ligninolítico crecido previamente. el sobrenadante en un tubo limpio.
•Cortar con la pipeta Pasteur invertida un
círculo de 5 mm de diámetro de agar con • Leer la absorbancia del sobrenadante
biomasa fúngica invertida. a 465 nm y 665 nm, empleando como
blanco agua destilada.
•Sembrar el disco de biomasa invertido en
la parte central del agar lignina I. • Si la absorbancia supera el valor de 1,0,
realizar una dilución con agua destilada.
•Sembrar el disco de biomasa invertido en
la parte central del agar lignina II. • Registrar los valores y calcular la relación E4/
E6, dividendo los dos valores de absorbancia.

68
3.6. Referencias Datta, R., Kelkar, A., Baraniya, D., Molaei, A.,
Moulick, A., Meena, R. y Formanek, P. (2017).
Bhattacharya et al., 2016. Enzymatic degradation of lignin in soil: a
review. Sustainability. 9(7), 1163.
Blanco-Vargas, A., Rodríguez-Gacha, LM.,
Sánchez-Castro, N., Herrera-Carlosama, L., Enamala, M., Dixit, R., Tangellapally, A., et al.
Poutou-Piñales, RA., Díaz-Ariza, LA., Gutiérrez- (2020). Photosynthetic microorganisms (algae)
Romero, EV., Rivera-Hoyos, CM., Ardila-Leal, LD., mediated bioelectricity generation fuel cell:
Pedroza-Rodríguez, AM. (2021). Bio-inoculant Conceise Review. Environmental Technology
Production Composed by Pseudomonas sp., & Innovation. [Link]
Serratia sp., and Kosakonia sp.: Preliminary eti.2020.100959.
effect on Allium cepa L. growth at Plot Scale.
Universitas Sceitierum. Fincheira-Robles, P., Martínez-Salgado, MM.,
Ortega-Blu, R., Janssens, M. (2016). Compost
Calderín, A., van Tol de Castro, T., Santos and humic substance effects on soil parameters
L., et al. (2019). Structure-Property Function of Vitis vinifera L cv Thompson seedless. Scientia
Relationship pf humic substance in modulating Agropecuaria, 7(3), 291-296.
the root Growth of Plants: A review. Journal
of Environmental Quallity. doi:10.2134/ Gómez, D. (2018). Transformación física,
jeq2019.01.0027. química y microbiológica de polietileno de
baja densidad (PEBD) empleando plasma
Cambell, J., Berry, J., Seibt, U., Smith, S., de Oxígeno, fotocatálisis TiO2/UV y Pleurotus
Montzka, S., Launois, T., Belviso, S., Bopp, L., ostreatus. Tesis de Doctorado en Ciencias
Laine, M. (2017). Large historical growth in Biológicas. Pontificia Universidad Javeriana.
global terrestrial gross primary production. 1-166.
Nature. 544, 84-88.
Castillo, A., Matus, J.F., Céspedes N., et al. Gougoulias et al., 2014
(2021). Evaluation of two microcosm systems
for co-treatment of LDPEoxo ang lignocellulosic Janusz, G., Pawlik, A., Sulej, J., Świderska-Burek,
biomass for biochar production. Biomaterials U., Jarosz-Wilkołazka, A., Paszczyński, A. (2017).
Research. [Link] Lignin degradation: microorganisms, enzymes
00222-w. involved, genomes analysis and evolution.
FEMS Microbiology Reviews. 41(6), 941-962.
Céspedes-Bernal, DN., Mateus-Maldonado,
JF., Rengel-Bustamante, JA., Quintero-Duque, Kong et al., 2019.
MC., Rivera-Hoyos, CM., Poutou-Piñales, RA.,
Díaz-Ariza, LA., Castillo-Carvajal, LC., Páez- Lefèvre, C., Rekik, F., Alcantara, V., Wiese,
Morales, AI., Pedroza-Rodríguez, AM. (2021) L. (2017). Soil organic carbon: the hidden
Non‑domestic wastewater treatment with potential. Food and Agriculture Organization
fungal/bacterial consortium followed by of the United Nations (FAO).
Chlorella sp., and thermal conversion of the
generated sludge. 3 Biotech. 11, 227. https:// Li, Li., Huang, J., Chen, L., Faisal, S., Abomohra,
[Link]/10.1007/s13205-021-02780-1. A. (2022). Evaluation of crude bio-oil
production from green tea waste through
Chandra, P., Singh, E., Arora P. (2020). Microbial pyrolysis over clamshell waste as a natural
Lipases and their industrial applications: a catalyst. Sustainable Energy Technologies
comprehensive review. Microbial Cells Factories. and Assessments. [Link]
[Link] seta.2022.102453.

Chen, Y., Senesi, N., Schnitzer, M. (1977). Madadi, M., Abbas, A. (2017). Lignin
Information provided on humic substances by degradation by fungal pretreatment: a review.
E4/E6 ratios. Soil Science Society of American Journal Plant Pathology Microbiology. 8(2), 1-6.
Journal. 41 (2), 352-358.
Martínez. M., Gutiérrez, V., Pedroza, A. (2013)
Métodos Microbiológicos, físicos y químicos

69
con aplicación ambiental. Manual de Reddy, S., Nagaraja, S., Raj, P., Patil, P.,
Microbiología. Chile: Editorial Universidad Dumgond, P., (2014). Elemental analisys, E4/E6
Federico Lleras San María 132 p. p. ratio and total acidity of soil humic and fulvic
acids from different land use systems. Annals of
Morales, E., Chávez, S., Hurtado, R., Milla, M., Plant and Soil Research. 16, 89-92.
et al., (2021). Edaphic macrofauna associated
with the cultivation of maize. Journal of the Rivera, C., Morales, D., Poutou, R., Pedroza, A.,
Selva Andina Biosphere. 9 (1): 15-25. Rodríguez, R., Delgado, J. (2013). Review. Fungal
laccases. Fungal Biology Review. 27, 67-82.
Moreno, D., Gómez, D., Blanco, A., Castillo,
A., Herrera, L., Poutou, R., Pedroza, A. (2019). Sastoque, L., Mercado, M., Martínez, M.,
Simultaneous bioconversion of lignocellulosic Quevedo, B., Pedroza, A. (2007). Producción
residues and oxodegradable polyethylene de quitinasas extracelulares con una cepa
by Pleurotus ostreatus for biochar production, alcalófila halotolerante de Streptomyces
enriched with phosphate solubilizing bacteria sp. aislada de residuos de camarón. Revista
for agricultural use. PloS One. 14(5). Mexicana de Ingeniería Química. 6(2), 137-146.

Naeem, M., Manzoor, S., Abid, M., et al. (2022). Seidl, R., Goulart, A. (2016). Pretreatment
Fungal Proteases as Emerging Biocatalyst processes for lignocellulosic biomass conversion
to meet the current challenges and Recent to biofuels and bioproducts. Current Opinion in
Developments in Biomedical Therapies: An Green and Sustainable Chemistry. 2, 48-53.
Updated Reivew. Jounral of Fungi. [Link]
org/10.3390/jof8020109. Socarrás, A. (2013). Soil mesofauna:
Nardi, S., Schiavon, M., Francioso, O. (2021). biological indicator of soil quality. Pastos y
Chemical Structure anf Biological activity pf Forrajes. 36(1), 14-21.
Humic substances define their role as Plant
Growth Promoters. Molecules. [Link] Stepanova, A., Gladkov, E., Osipova, E., et al.
org/10.3390/molecules26082256. (2022). Review. Biorremediation of Soil from
Petroleum Contamination. Process. https://
Ortega, R., Martinez, M. (2020). Mejorar [Link]/10.3390/pr10061224.
la calidad de suelos: una estrategia de
adaptación al cambio climático. Mundoagro. Tadini, A., Nicolodelli, G., Hajjoul, H., et al. (2022).
Piao, S., Zhang, X., Chen A., et al. (2019). The Humic Fractions from Amazonic soil: Lifetime
impacts of climate extremes on the terrestrial study and humifaction process by fluorescence
carbon cycle: A review. Earth Science. https:// Spectroscopy. Applied Biochemistry. https://
[Link]/10.1007/s11430-018-9363-5. [Link]/10.1016/[Link].2022.105486.

Rao, D.L.N., Aparna, K., Mohanty, S.R. (2019). Xu, P., Liu Y., Shi, L., Fu, Q., Chen, J., Hu, H.,
Microbiology and Biochemistry of soil Organic Huang Q. Influence mechanisms of long-
Matter, Carbon Sequestration and Soil Health. term fertilizations on the mineralization of
Indian Journal and Fertiliser. 15(2): 124-138. organic matter in Ultisol. (2020). Soil and Tillage
Research. 201. 104594
Rashad, M., Hafez, M., Popov A. (2022). Humic
substances composition and properties as an Yang, F., Tang, Ch., Antonietti, M. (2021).
environmentally sustainable system: A review Natural and Artificial humic substances
and way forward to soil conservation. Jounal to manage minerals, ions, water, and soil
of Plant Nutrition. [Link] microorganism. Chemistry Society Rev. DOI:
4167.2021.2005801. 10.1039/d0cs01363c.
Wall et al., 2019;
Ryu, Y., Berry, J., Baldocchi, D. (2019). What is
global photosynthesis? History, uncertainties
and opportunities. Remote Sensing and
Environmental. [Link]
rse.2019.01.016.

70
71
72
Capítulo 4
CICLO DEL CARBONO
TRANSFORMACIÓN DE HIDROCARBUROS Y PLÁSTICOS

73
74
Capítulo 4

CICLO DEL CARBONO

TRANSFORMACIÓN DE HIDROCARBUROS Y PLÁSTICOS
Aura Marina Pedroza Rodríguez, Luis David Gómez Méndez

4.1. Introducción a la industria petrolera y petroquímica ya

que el petróleo genera contaminación en
El uso de combustibles fósiles como su extracción, transporte, refinación y uso
carbón o derivados del petróleo permitió (Bejarano, 2015; Jiménez et al., 2022).
la industrialización y grandes avances
en transporte, energía, materiales, etc. 4.1.1. Degradación de hidrocarburos y derivados
Sin embargo, las consecuencias de este
desarrollo acelerado se ven actualmente no Los hidrocarburos son compuestos de carbono
solo en el cambio climático, sino también e hidrógeno derivados de la hulla y el petróleo.
en la contaminación de aguas, suelos y Se clasifican en: Lineales o alifáticos: Solventes
acumulación de residuos de diferente grado o combustibles derivados del petróleo. Según
de toxicidad (Li et al., 2020; Ossai et al., 2020). su peso pueden ser gases: (metano, butano);
líquidos (bencina, nafta, kerosene) o viscosos
Las fuentes de contaminación antropogénica (aceites, lubricantes y parafinas). Derivados
son variadas, siendo las principales las halogenados clorados: cloroformo, tetracloruro
relacionadas con las actividades industriales, de carbono, cloruro de metilo. Cíclicos o
el transporte y la actividad urbana. La industria aromáticos: solventes como benceno, xileno y
es fuente de contaminación al generar tolueno (Varjani, 2017).
residuos sólidos, efluentes y emisiones gaseosas,
que contaminan el suelo, el agua y el aire. La biodegradación de hidrocarburos en suelo
Aquí se tiene, entre las más contaminantes, y agua, es un reto para la biotecnología

75
ambiental, principalmente porque estos Los biosurfactantes son moléculas de origen
compuestos tienen baja relación C/N, biológico que tienen propiedades semejantes
se requiere suplemento de nutrientes, a los detergentes o tensoactivos de origen
su biodisponibilidad es baja al tener químico. Estos compuestos se ubican en
características hidrofóbicas (Li et al., 2020; la interfase entre el agua y los compuestos
Ossai et al., 2020; Anno et al., 2021) y no todos insolubles en ella (hidrocarburos), reduciendo
los microorganismos tienen la capacidad la tensión superficial y facilitando la formación
metabólica para biodegradarlos y emplearlos de emulsiones entre el agua y el compuesto
como fuente de carbono y energía insoluble. Esta propiedad se debe a la
(Ławniczak et al 2020). Determinando que se estructura de la molécula del biosurfactante,
deban implementar diferentes biotecnologías que tiene dos zonas diferenciadas, una
empleando microorganismos aeróbicos y más afín por el agua (hidrófila) y otra poco
anaeróbicos solos o combinados (Anno et al., afín por el agua (hidrófoba), por lo que
2021). Estos tratamientos se pueden realizar se les denomina compuestos anfipáticos,
in situ y ex situ, empleando tecnologías de como es el caso de algunos ácidos grasos,
bioaumentación y bioestimulación. En las dos lipopolisacáridos, y fosfolípidos (Othman et al.,
están implicadas comunidades microbianas 2022; Zahed et al., 2022). La producción de
que tienen capacidad de adsorción, biosurfactantes ha sido utilizada exitosamente
pueden formar biopelículas y producen para la limpieza de los tanques de petróleo,
diferentes tipos de enzimas como mono- di así como para la dispersión y biodegradación
oxigenasas, citocromo, polifenol oxidasas, de los hidrocarburos de zonas contaminadas
entre otras, para los procesos aeróbicos por un derrame accidental (Sastoque
y reductasas en los sistemas anaeróbicos et al., 2010; Othman et al., 2022; Ossai et
(Anno et al., 2021; Zhen et al., 2021). Por otro al., 2020; Chebbi et al., 2022). A nivel de
lado, tanto los microorganismos aeróbicos laboratorio los microorganismos productores
como anaeróbicos, pueden producir bajo de biosurfactantes (ramnolípidos) pueden
ciertas condiciones nutricionales compuestos observarse al sembrarlos en medios que
orgánicos extracelulares que incrementan induzcan la producción de estos compuestos
la biodisponibilidad de los hidrocarburos y se y generen emulsificación (Figura 6), (Sastoque
denomina biosurfactantes (Li et al., 2020; Ossai et al., 2010; Chebbi et al., 2022).
et al., 2020).

Figura 6.
Selección de microorganismos productores de biosurfactantes.
(A) Colonias positivas para la producción de biosurfactantes en agar Siegmund and Wagner (SW).
(B) Colonias de Pseudomonas fluorescens productoras de pigmentos fluorescentes.
(C) Pruebas de emulsificación in vitro empleando biosurfactantes y diferentes derivados
del petróleo.

A B

Cortesía de Leonardo Sastoque Cala.

76
4.1.2. Degradación de plásticos Ante esta problemática, el manejo actual
de residuos de plásticos está orientado hacia
La presencia de plásticos en los residuos el reciclaje (Lazarevic et al., 2010; Gómez
sólidos, tanto domésticos como industriales, et al., 2018) y el desarrollo de alternativas
se ha incrementado de forma exponencial en biodegradables o a su biodegradación
las últimas décadas debido principalmente (O’Brine & Thompson, 2010). Los plásticos
por ser tratados como productos de vida útil pueden dividirse en dos grupos: aquellos
corta que son desechados rápidamente por que son intrínsecamente biodegradables,
los usuarios; se calcula que alrededor del cuya estructura química permite la acción
50 % de los plásticos que se producen en el directa de enzimas (como polifenol oxidasas,
mundo se utilizan una sola vez (los llamados peroxisadas, celulasas, entre otras) y aquellos
plásticos de “un solo uso”); entre el 20 y el 25 que llegan a ser biodegradables después de la
% se emplean en la construcción y el resto acción de uno o más procesos fisicoquímicos,
en la fabricación de otros productos, como como hidrólisis, fotólisis o pirolisis (Ojeda et al.,
aparatos electrónicos, muebles y partes de 2009; Moreno et al., 2019; Gómez et al., 2021).
vehículos (Hopewell et al., 2009; Alabi et
al 2019; Gómez et al., 2021). Como la gran La degradación del PE puede ser clasificada
mayoría de los plásticos no son degradables, como abiótica o biótica; la primera se define
una vez que se desechan se acumulan en como un deterioro causado por factores
los rellenos sanitarios o botadero de basura, naturales como temperatura y radiación UV,
o son abandonados en calles y parques. mientras que la segunda es definida como la
Además de los problemas asociados a biodegradación causada por la participación
su manejo como residuos, los plásticos de microorganismos que modifican y
generan impactos en el ambiente debido al consumen el polímero generado cambios en
agotamiento de los recursos no renovables, sus propiedades (Kumar et al., 2015; Gómez,
ya que se calcula que el 4 % del petróleo y 2018). Dentro de la clasificación de la
gases extraídos, se usan como materia prima degradación abiótica está la fotodegradación
para la producción de plásticos y entre el 3 y la termodegradación mientras que en la
y 4 % para generar la energía requerida en degradación biótica está la biodegradación
su manufactura (Subramanian, 2000; Alabi (Gómez et al., 2021). Por su parte la
et al 2019). oxobiodegradación involucra ambos tipos de
degradación (Srikanth et al., 2022), (Tabla 2).

Tabla 2.
Diferentes rutas de la degradación de plásticos (Adaptado de [Link] 2020)

Factores
Degradación
(requerimiento/ Fotodegradación Biodegradación
Termo-oxidativa
actividad)
Luz UV o radiación de alta
Agente activo Calor y oxígeno Microorganismos
energía
Más alta que la
Requerimiento de calor No requiere No requiere
temperatura ambiental
Tasa de degradación Inicialmente lenta pero su Rápida Moderado
propagación es rápida.

Otras consideraciones Amigable con el ambiente Ambientalmente no Amigable con el

si no se usa radiación de aceptable ambiente
alta energía
Bajo costo y muy bien
Aceptación general Aceptable, pero costosa No aceptable
aceptada

77
4.2. Objetivos •1 caja de Petri con agar King B (anexo A,
numeral 17).
Objetivos generales
4.3.3. Pruebas de emulsificación in vitro
•Evaluar el proceso de emulsificación
de derivados del petróleo valorando •1 tubo 16x150 mm con 5 mL cultivo de
la producción de biosurfactantes para Pseudomonas fluorescens inducido para
aumentar la biodisponibilidad del la producción de ramnolípidos.
contaminante en fase acuosa.
•1 tubo 16x150 mm con 12 mL agua
•Evaluar la biodegradación in vitro de destilada.
láminas de polietileno de baja densidad
(PEBD) tradicionales u oxobiodegradables •2 tubos de 16x150 mm con 0,5 mL de
pretratadas fisicoquímicamente, empleando gasolina o benceno.
hongos ligninolíticos.
•1 tubo de 13x150 mm con 2 mL Triton x.
Objetivos específicos
•4 pipetas de 5 mL.
•Realizar la inducción del biosurfactante del
tipo ramnolípido empleando compuestos •1 pipeta de 10 mL.
lipídicos de bajo peso molecular.
•Asa curva.
•Evaluar la capacidad emulsificante del
biosufactante producido por Pseudomonas •Petróleo, gasolina o benceno.
fluorescens empleando un hidrocarburo.
•Agua destilada.
•Determinar, a través de mediciones
físicas y químicas, la biodegradación de •Colorantes de Gram.
láminas de PEBD por Pleurotus ostreatus,
Phanerochaete chrysosporium, Trametes 4.3.4. Degradación de láminas de polietileno
versicolor y/o Ganoderma lucidum. de baja densidad (PEBD)

4.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo [Link]. Pretratamiento por fotólisis de láminas
de PEBD
4.3.1. Inducción de la producción
de bio surfactantes •Nueve láminas de PEBD de (3,0 ± 0,1)
cm x (1,0 ± 0,1) cm limpios, a las cuales
•3 Erlenmeyer 250 mL con 50 mL de medio previamente se les ha determinado peso,
mineral inductor (anexo A, numeral 15). hidrofobicidad y grupos químicos presentes
(Figura 8).
•1 caja de agar nutritivo sembrada con
Pseudomonas fluorescens (anexo A, •Cámara de irradiación UV/254 nm.
numeral 2).
•Tres cajas de Petri limpias.
•Asa curva.
[Link].Biodegradación de las láminas de PEBD
•Agua peptonada 0,1% (m/v), (anexo B, pretratadas
numeral 2).
•Una caja de Petri con agar salvado de
4.3.2. Prueba semi cuantitativa para producción trigo (Figura 7) crecido con el hongo de
de biosurfactantes interés (anexo A, numeral 9).

•1 caja de Petri con agar Siegmund and •Tres Erlenmeyer de 500 mL, con 250 mL de
Wagner (SW), (anexo A, numeral 16). caldo salvado de trigo suplementado con
cloranfenicol 0,1 g/L (anexo A, numeral 9).

78
 •Puntas para pipeta automática estériles. •Alicuotar 5 mL del cultivo en un tubo
de 16x150 mm y refrigerar a 4 ºC hasta el
•Asa redonda o aguja de disección. montaje de los ensayos de emulsificación.

•Tres cajas de Petri con agar Radha (anexo [Link] semi cuantitativa para producción
A, numeral 18). de biosurfactantes

•Solución salina al 0,85 % (m/v) (anexo B, •Sembrar por aislamiento la cepa de

numeral 1). Pseudomonas fluorescens en agar nutritivo
24 h a 37 ºC
•1000 mL de solución de glucosa (0,625
g/L) y cloruro de amonio (0,050 g/L) (anexo •Tomar una colonia aislada de
B, numeral 6). Pseudomonas fluorescens y sembrar por
aislamiento sobre agar SW y King B.
•Tres frascos de polipropileno estériles,
para centrifuga. •Incubar por 48 horas a 37 ºC.

•Espátulas o baja lenguas estériles. •Realizar coloración de Gram.

4.4. Equipos •Observar la formación de un pigmento

de color azul alrededor de las colonias
•Incubadora. presuntivas productoras de biosurfactantes
en agar SW.
•Balanza digital.
•Observar la formación de halos amarillos
•Microscopio. alrededor de las colonias presuntivas
productoras de biosurfactantes en agar SW.
•Shaker o agitador horizontal.
•Observar la florescencia de las colonias
•Lámpara de mano para luz ultravioleta. en King B expuestas a la luz UV de 366 nm
generada por lámparas de mano.
4.5. Metodología
4.5.3. Pruebas de emulsificación in vitro
[Link]ón de la producción de bio
surfactantes •Tomar una alicuota 0,5 mL de gasolina
o benceno y colocarla en dos tubos de
•Sembrar por aislamiento la cepa de 16x150 mm.
Pseudomonas fluorescens en agar King B
24 h a 37 ºC. •Adicionar 4 mL de agua destilada a cada
tubo.
•Preparar 30 mL de una suspensión
de Pseudomonas fluorescens en agua •Adicional a uno de los tubos 0,5 mL de
peptonada 0,1 % (m/v) con una sobrenadante del cultivo de Pseudomonas
contracción igual al tubo 1 del Nefelómetro flurescens productora de ramnolípidos.
de Mac Farland.
•Adicionar 0,5 mL de Triton X al segundo tubo.
•Inocular 10 mL de la suspensión a 40 mL de
medio mineral inductor para ramnolípidos. •Homogenizar la mezcla por 30 segundos
empleando vortex.
•Incubar por 8 días 37 ºC a 120 rpm.
•Incubar los tubos a 37ºC por 48 horas.
•Realizar coloración de Gram y observar
al microscopio con aumento de 100 x. •Observar y medir la altura del anillo
de emulsificación en el tratamiento con
surfactante químico y biológico.

79
 •Calcular el porcentaje de emulsificación •Con la ayuda de un programa de análisis
tomando como el 100 % la altura del anillo de imágenes (o Power Point ™) determine la
obtenido con el surfactante químico altura (h) y el radio (a) de las gotas de agua
(Triton X). empleando estas ecuaciones 11 y 12.

4.5.4. Degradación de plástico

R= (α2 + ℎ2) /2ℎ (Ecuación 11)
[Link]. Determinación de la hidrofobicidad
de láminas de PEBD (Medición del ángulo de
a
contacto estático) α=( R
) (Ecuación 12)

•Con ayuda de una pipeta automática

(micropipeta), depositar dos gotas de 50 Dónde: R es el segmento del radio de la esfera
µL de agua desionizada (una al lado de la que describe la gota de agua. A manera de
otra) sobre lámina PEBD. Con el uso de un ejemplo:
teléfono celular o videocámara, capturar
una imagen como se observa en la figura 7.

Figura 7.
Gotas de agua desionizada sobre una lámina de PEBD. Mediciones a la gota de agua
para determinar el ángulo de contacto estático

d= 3.47
a= 1.735
h= 1.29

h R= (α2 + ℎ2) /2ℎ = 1.83

a
a
α=sin-1( )=sin-1 1.735 =71.45o
R R 1.83

Phywe. Plasma physics: Surface treatment

Cortesía dede Luis David Gómez.

80
[Link]. Ensayos de biotransformación crecimiento miceliar, liberación o no de
de láminas de PEBD pigmentos difusibles.

•Tomar, con ayuda de una punta azul estéril, •Retirar, después de 8 semanas, las cajas
entre 8 a 10 fragmentos o círculos de agar de Petri de la incubadora; con pinzas
salvado de trigo con crecimiento miceliar de estériles, retirar las láminas de PEBD y
Pleurotus ostreatus y disponerlos dentro de un realizar un lavado con agua tibia, para
Erlenmeyer con caldo salvado de trigo. eliminar biomasa adherida.

•Incubar los Erlenmeyer durante 10 días, a •Secar al ambiente y determinar

120 rpm y 25°C.
•Cambio en peso.
•Tomar la biomasa formada después de
la incubación y trasvasarla a los frascos de •Cambio en hidrofobicidad.
polipropileno estériles.
•Modificación en grupos químicos
•Centrifugar a 8000 rpm por 10 minutos y a (espectroscopia UV/Vis o IR)
4ºC.
4.6. Referencias
•Descartar sobrenadantes y lavar la
biomasa cinco veces (cuatro veces en Alabi, O., Ologbonjaye, K., Awosolu, O., et
solución salina al 0,85 % (m/v) y la última al. (2019). Public and Environmental Health
en una solución de glucosa y cloruro de Effects of Plastic Wastes Disposal: A Review.
amonio); los lavados también se realizan Journal Toxicology and Risk Assessment. DOI:
en centrífuga bajo las mismas condiciones 10.23937/2572-4061.1510021.
del punto anterior.
Anno, F., Rastelli, E., Sansone, C., et al.
•Tomar las nueve láminas de PEBD limpias (2021). Bacteria, FUnfi, and Microalgae, for
(libres de grasa) y colocarlas dentro de la the Bioremadiation of Marine Sediments
cámara de irradiación UV (separadas, no Contaminated by Petroleum Hudrocarbons
unas sobre otras). in the Omic Era. Microorganims. [Link]
org/10.3390/ microorganisms9081695.
•Exponer las láminas durante 24 horas a
fotólisis UV/254 nm (12 horas por cada lado Alabi, O., Ologbonjaye, K., Awosolu, O., et
de la lámina). al. (2019). Public and Environmental Health
Effects of Plastic Wastes Disposal: A Review.
•Tomar las tres cajas de Petri con agar Journal Toxicology and Risk Assessment. DOI:
Radha y, con ayuda de un cortador 10.23937/2572-4061.1510021.
estéril, de la aguja de disección o asa
flameada, hacer tres (3) cortes en el Bejarano, F. (2015). La contaminación química
agar, cada uno de (3 x 1) cm, en cada mundial. Ecologista. 38, 34-36.
caja; retirar el agar cortado.
Chebbi, A., Franzetti, A., Formicola, F., et
•Disponer en los rectángulos formados al. (2022). Insights into rhamnolipid-based
dentro del agar, las láminas de PEBD soil remediation technologies by safe
recién irradiadas. microorganisms: A critical review. Journal of
Cleaner Production. [Link]
•Colocar sobre las láminas de PEBD, la jclepro.2022.133088.
biomasa fúngica lavada y centrifugada.
Gómez, D. (2018). Transformación física,
•Incubar las cajas de Petri a 25°C, química y microbiológica de polietileno de
durante 8 semanas. Durante este tiempo, baja densidad (PEBD) empleando plasma
realizar observaciones cada 8 días del de Oxígeno, fotocatálisis TiO2/UV y Pleurotus
crecimiento miceliar teniendo en cuenta: ostreatus. Tesis doctoral. Pontificia Universidad
crecimiento radial (mm), morfología del Javeriana. Bogotá-Colombia.

81
Gómez, D., Moreno, D., Poutou, R., Salcedo, J., O’Brine, T., Thompson, R. (2010). Degradation of
Pedroza, M., Vargas, A. (2018) Biodeterioration plastic carrier bags in the marine environment.
of plasma pretreated LDPE sheets by Pleurotus Marine Pollution Bulletin. 60 (12), 2279-2283.
ostreatus. PLoS ONE. 13(9), e0203786.
Ojeda, M., Dalmolin, E., Forte, C., Jacques, S.,
Gómez-Méndez, L., Luis C. Jiménez-Borrego, Bento, F. (2009). Abiotic and biotic degradation
Alejandro Pérez-Flórez, Raúl A. Poutou-Piñales, of oxo-biodegradable polyethylenes. Polymer
Aura M. Pedroza-Rodríguez, Juan C. Salcedo- Degradation and Stability. 94, 965–970.
Reyes, Andrés Vargas, and Johan M. Bogoya.
(2021). LDPE transformation by exposure to Othman, A., Ismail, N., Addullah, S., et al.
sequential low-pressure plasma and TiO2/UV (2022). Potential of indigenous biosurfactant-
photocatalysis. Molecules. producing fungi from real crude oil sludge in
total petroleum hydrocarbon degradation
Hopewell, J., Dvorak, R., Kosior, E. (2009). and its future research prospects. Journal of
“Plastics recycling: challenges and Environmental Chemical Engineering. https://
opportunities,” Philos. Trans. Royal Society [Link]/10.1016/[Link].2022.107621.
B: Biological Sciences. vol. 364, no. 1526, pp.
2115–2126. Ossai, IC., Aziz, A, Hassan, A., Hamid, FS.
(2020). Remediation of soil and water
[Link] 2020. contaminated with petroleum hydrocarbon:
A review. Environmental Technology &
[Link] 2020. Innovation. 17, 100526.

Jiménez, V., Pedroza, A.M., Ramos, O., Castillo Sastoque, L., Pedroza, A., Rodríguez, R., Cotes,
L. (2022). Synthetic Biology: A new era in A. (2010). Effect of nutrients and fermentation
Hydrocarbon Bioremediation. Processes. conditions on the production of biosurfactants
[Link] using rhizobacteria isolated from fique plants.
Universitas Scientiarum. 15 (3), 251-264.
Kumar, S., Raut, S. (2015). Microbial degradation
of low-density polyethylene (PEBD): a Srikanth, M., Sandeep, T., Sucharitha, K., et
review. Journal of Environmental Chemical al. (2022). Biodegradation of plastic polymers
Engineering. 3 (1), 462-473. by fungi: a brief review. Bioresources and
Bioprocessing. [Link]
Lazarevic. D., Aoustin, E., Buclet, N., Brandt, 022-00532-4.
N. (2010). Plastic waste management in the
context of a European recycling society: Subramanian, P. (2020). Plastics recycling
Comparing results and uncertainties in a life and waste management in the US. Resource.
cycle perspective. Resources Conservation Conservation. Recycle. 28 (3–4), 253–263.
and Recycling. 55 (2), 246-259.
Varjani, SJ. (2017). Microbial degradation
Li, Q., Liu, J., Gadd, G. (2020). Fungal of petroleum hydrocarbons. Bioresource
biorremediation of soil co-contaminated Technology. 223, 277–286.
with petroleum and heavy metals. Applied
Microbiology and Biotechnology. [Link] Zahed, M., Matinvafa, M., Azari, A., et al. (2022).
org/10.1007/s00253-020-10854-y. Biosurfactant, a green and effective solution
for bioremediation of petroleum hydrocarbons
Moreno, D., Gómez, L., Blanco, A., Castillo, in the aquatic environment. Discover Water.
A., Herrera, L., Poutou, R., Salcedo, J., Díaz, [Link]
L., Castillo, L., Rojas, S., Pedroza, A. (2019).
Simultaneous bioconversion of lignocellulosic Zhen, L., Hu, T., Lv, R., et al. (2021). Succesion of
residues and oxodegradable polyethylene microbial communities and synergic effects during
by Pleurotus ostreatus to biochar production, bioremediation of petroleum hydrocarbon-
enriched with phosphate solubilizing bacteria contaminated soil enhacec by chemical
for agricultural use. PLOS ONE. oxidation. Journal of Hazardous Materials. https://
[Link]/10.1016/[Link].2020.124869.

82
83
84
Capítulo 5
CICLO DEL NITRÓGENO

85
86
Capítulo 5

CICLO DEL NITRÓGENO

Viviana Gutiérrez Romero, Claudia Marcela Rivera Hoyos.
Lucía Ana Díaz Ariza, Rodrigo Ortega Blu

5.1. Introducción los cultivos, existe la posibilidad que cantidades

excesivas de nitrato (NO3-N) pasen a tejidos
El nitrógeno es uno de los nutrientes fuertemente de plantas y de ahí a los animales y el hombre
limitantes para la producción de cultivos, y su causando incluso enfermedades como el
uso adecuado puede dar como resultado “síndrome del bebé azul” en donde el O2 de
un retorno económico sustancial para los la sangre es desplazado por el NO3=, o lleguen
agricultores para asegurar la producción de a aguas subterráneas o superficiales (Ramm et
alimentos a nivel mundial, así como mantener al., 2022).
la sostenibilidad y calidad de los ecosistemas.
Se presenta en formas reducidas como N2 o El comportamiento del nitrógeno en el sistema
nitrógeno atmosférico, NH4+ (ion amonio), NH2+ del suelo es complejo, pero comprender
(aminas), u oxidado como N2O (óxido nitroso) el ciclaje de este nutriente bajo diversas
importante gas de efecto invernadero, NO2- condiciones es esencial para un manejo
(nitrito) o NO3= (nitrato). A diferencia de los más eficiente tanto de fuentes orgánicas e
microorganismos fijadores de N, las plantas no inorgánicas y lograr así un equilibrio entre
aprovechan directamente el N2, por lo que el producción sostenible y el manejo racional
N debe estar en solución (NH4+ o NO3=) para ser de este nutriente en el medio ambiente. En
aprovechado y metabolizado por las plantas. la figura 8 se observa el ciclo general del
Sin embargo, cuando los aportes de N al nitrógeno en suelo.
sistema del suelo exceden las necesidades de

87
 Figura 8.
Ciclo general del Nitrógeno en suelo.

Fertilizante Pérdidas por

N2
NH3 volatilización
N2O

Adsorción UREA
Pérdidas por
desnitrificación

NO3- NO2- Mineralización

NH4+
Inmovilización
Nitrificación Catión
intercambiable
MATERIA
ORGÁNICA

Arcilla Pérdidas por

Pérdidas por lixiviación
lixiviación

Cortesia de Rodrigo Ortega Blu. Modificado por Lucas David Pedroza Camacho.

La fijación biológica ocurre cuando el nitrógeno

atmosférico es reducido a formas disponibles para
la planta, como el amonio, gracias a la acción
del complejo enzimático Nitrogenasa, presente
únicamente en microorganismos procariotas.

5.1.1. Fijación de nitrógeno atmosférico cultivos, así como de los más complejos para
su estudio (Cerón & Ariztizabal, 2012; Bellenger
En la dinámica del N, compuestos como el et al., 2020).
nitrato y amonio son nutrientes indispensables
en la nutrición vegetal, y su disponibilidad La fijación biológica ocurre cuando el
está relacionada en su gran mayoría con la nitrógeno atmosférico es reducido a formas
aplicación de productos químicos y orgánicos disponibles para la planta, como el amonio,
y con las transformaciones que pueden ocurrir gracias a la acción del complejo enzimático
en suelo bajo diferentes condiciones bióticas Nitrogenasa, presente únicamente en
y abióticas. Debido a la no reactividad del microorganismos procariotas. La enzima
nitrógeno molecular (N2), su entrada a la está codificada por los genes nifH, nifD y nifK
biosfera se realiza a través de su fijación con una (Baulikar et al., 2020). Las bacterias y archaeas
contribución global estimada de 180 millones diazótrofas (fijadoras de nitrógeno) pueden
de toneladas métricas de amonio por año. ser simbióticas (obligadas o asociativas) y de
Por esta razón, el proceso de fijación ha sido vida libre. En la tabla 3 se presentan algunos
reconocido como uno de los más importantes de los géneros asociados con este proceso.
para la sostenibilidad y productividad de los

88
 Tabla 3.
Ejemplos de microorganismos diazótrofos simbióticos y de vida libre reportados en el suelo

Microorganismos simbióticos Microorganismos de vida libre

Obligados Asociativos
Rhizobium Azospirillum Achromobacter
Bradyrhizoibium Herbaspirillum Acetobacter
Azorhizobium Acetobacter Alcaligenes
Sinorhizobium Azoarcus Bacillus sp.
Allorhizobium Burkholderia Beijerinckia
Frankia Enterobacter Methanosarcina
Anabaena Serratia Methanococcus
Nostoc Sphingomonas Azotobacter
Pseudomonas
Derxia

Estos microorganismos se encuentran en menos precisas como el aislamiento en placa

numerosos cultivos de gramíneas y leguminosas de diazótrofos, NMP de fijadores de N2, la
como maíz, arroz, caña de azúcar, bambú, diferencia del N total (unidad experimental y
pasto, alfalfa, soya y frijol y con otras muchas control), balance de N en el sistema, análisis
especies vegetales incluyendo forestales, de reducción de acetileno (determinación
ornamentales, frutales y hortalizas. Sin embargo, de la actividad de la enzima nitrogenasa),
su actividad biológica está condicionada modificaciones del método Kjeldhal, contenido
por diversos factores como: el tipo de suelo, de Leg-Hemoglobina entre otras, que pueden
la humedad, el pH, el estado fenológico del brindar también información relevante en
cultivo y el manejo, entre otros (Baulikar et al., la dinámica del N. Su selección dependerá
2020). Específicamente, el tipo de fertilización exclusivamente de los objetivos planteados en
ejerce selectividad sobre la comunidad la investigación (Fonseca et al., 2020).
fijadora del suelo, y se ha reportado que el
manejo orgánico proporciona condiciones En los estudios de microbiología clásica se
ambientales favorables en el incremento de la incluyen los métodos de recuento y aislamiento
diversidad y abundancia de filotipos, contrario de microorganismos diazótrofos aerobios
a lo que sucede con la fertilización mineral. (aislamiento en placa) o microaerofos (cultivo
Adicionalmente, las bajas concentraciones en medio semisólido y análisis por NMP). En la
de C y P en sistemas agrícolas pueden limitar figura 9 se presentan imágenes de aislamientos,
no solo la deficiencia y absorción de nutrientes recuento y crecimiento en medio semisólidos
en el sistema, sino también la efectividad en para microorganismos fijadores de nitrógeno.
los procesos de fijación de N2 y la reducción
en el tamaño de las poblaciones diazótrofas Estos microorganismos se
(Fan et al., 2019; Huang et al., 2019; Torabian
et al., 2019: Cerón & Aristizabal, 2012). encuentran en numerosos
Para el análisis de estas comunidades cultivos de gramíneas y
microbianas se han implementado técnicas
muy sensibles como la identificación de
leguminosas como maíz,
genes nifH, análisis del 16S rRNA, dilución de arroz, caña de azúcar,
isótopos de nitrógeno y uso de espectros para
identificación de 15N, las cuales requieren bambú, pasto, alfalfa,
equipos de alta tecnología, mano de obra
calificada y reactivos de alto costo. No soya y frijol
obstante, son utilizadas también técnicas

89
 Figura 9.
Aislamiento y recuento de microorganismos fijadores de N2. (A) Azospirillum lipoferum en Agar
Rojo Congo; (B) Rhizobium sp. en Agar YMA; (C) Prueba de NMP positiva para fijadores de N2
microaerófilos; (D) Azospirillum lipoferum en medio semisólido NFB.

A B C D

Cortesía Lucía Ana Díaz Ariza y Viviana Gutierrez Romero.

5.1.2. Oxidación y reducción de nitrógeno fijación de nitrógeno y la reducción asimilativa

y desasimilativa de nitrito), nitrificación,
El nitrógeno se encuentra presente en todos los denitrificación, anammox (como una forma
ecosistemas, en diversos estados de oxidación combinada de nitrificación y denitrificación) y la
como: nitrógeno molecular (N2), nitrógeno interconversión de nitrito-nitrato; terminando el
orgánico (en plantas, animales, biomasa ciclaje y transformaciones del nitrógeno con los
microbiana y materia orgánica del suelo), procesos de mineralización (mineralización de
amonio (NH4+) y iones de nitrato (NO3-). De la materia orgánica generando principalmente
manera tradicional, el ciclo del nitrógeno desde amonio) y asimilación de amonio (Han and
el punto de vista de los grupos microbianos Zhou, 2022).
involucrados, se ha dividido en tres grandes
procesos (fijación de nitrógeno, nitrificación
y desnitrificación) y los microorganismos que Los microorganismos cumplen un rol fundamental
participan en estas transformaciones se han en el ciclaje de este nutriente, llevando a cabo
agrupado de acuerdo a su función eco procesos de oxido-reducción a partir de las
fisiológica como “fijadores de nitrógeno”, cuales, se liberan formas inorgánicas disponibles
“nitrificantes” y “denitrificantes” (Bellenger importantes para la nutrición vegetal y el desarrollo
et al., 2020; Song et al., 2021; Han and Zhou, y mantención de la microbiota del suelo (Ramm
2022). Sin embargo, en los últimos años, el et al., 2022). Como se mencionó anteriormente,
entendimiento del ciclo se ha incrementado además del proceso de la fijación de N,
y se han descrito nuevas rutas que involucran existen otros procesos como la amonificación/
procesos de asimilativos como la reducción inmovilización, nitrificación y denitrificación,
de nitrito a óxido nítrico y óxidos nitrosos en responsables del movimiento del nitrógeno fijado
ambientes óxicos (nitrificación denitrificante de una forma a otra en suelo y agua (He et al.,
o “nitrifier denitrification”), la reducción de 2022; Han and Zhou, 2022). La amonificación, es
nitrito a amonio (respiración amonificante o el proceso enzimático que libera NH3 a partir de
“respiratory ammonification”), la oxidación de compuestos orgánicos nitrogenados; ocurre por
amonio en ambientes anóxicos (anammox) y, proteólisis y la degradación de ácidos nucleicos,
más recientemente, la oxidación completa de urea y aminoazúcares como la quitina y N-
amonio a nitrato (comammox), (Stain & Klotz, acetilglucosamina (Song et al., 2021; Han and
2016; He et al., 2022). Por lo que, actualmente, Zhou, 2022).
se aceptan cinco flujos de transformación
del nitrógeno: Amonificación (incluye la

90
Por su parte, el proceso de nitrificación es a 65ºC. Microorganismos como Alcaligenes
aerobio y generalmente es considerado como sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Thiobacilus
un proceso de dos pasos; primero el amonio denitrificans y Azospirillum sp., pueden realizar
es oxidado a nitrito por la acción de bacterias este proceso. Se puede llevar a cabo de
Gram negativas quimioautótrofas de la familia forma asimilativa, un proceso independiente
Nitrobacteriaceae (Bacterias Oxidadoras del oxígeno (cuando el nitrato es utilizado
de Amonio – BOA), y finalmente el nitrito es para la síntesis de compuestos orgánicos)
oxidado a nitrato gracias a la actividad de las o desasimilativa (cuando el nitrato es
Bacterias Oxidadoras de Nitrito (BON), donde utilizado como aceptor final de electrones:
se encuentran bacterias como Nitrobacter respiración de nitrato). En el primer caso,
sp., Nitrospira sp. y Nitrococcus sp., que se ven el producto es amonio, mientras que, en el
inhibidas a pH alcalino (Soliman and Eldyasti segundo, el producto es nitrógeno molecular
2018; Lu et al., 2019; Song et al., 2021). Sin o dióxido de nitrógeno (Shi et al., 2020). Estas
embargo, recientemente se han descrito transformaciones del nitrógeno pueden
bacterias del género Nitrospira y algunas evidenciarse mediante la utilización de
arqueas como microorganismos capaces medios de cultivo que contengan sustratos
de llevar a cabo la oxidación completa del para las enzimas implicadas en el proceso
amonio (comammox: complete ammonia de nitrificación y desnitrificación (Stain &
oxidation) realizando de forma secuencial la Klotz, 2016).
oxidación de amonio y oxidación de nitrito
(Van Kessel et al., 2015; Ren et al., 2020; Zhu et Finalmente, es importante tener en cuenta
al., 2022), llevando a cabo procesos eficientes y que la medición de estos procesos en distintas
relevantes en varios ecosistemas (Li et al., 2018). matrices se hace complejo, por lo que se han
implementado diversas metodologías como
Para que se lleven a cabo estos procesos, la la determinación de las tasas de nitrificación,
enzima Amonio Monooxigenasa (AMO) que estimación de la diversidad, abundancia y
actúa a pH neutro, y la enzima Hidroxilamina crecimiento de oxidadores de amonio, así como
Oxidasa (HAO), que se encuentra en el la determinación de la actividad enzimática
periplasma celular (Daims et al., 2015; Soliman como medida directa y sensible en cada etapa
and Eldyasti 2018; Lu et al., 2019; Song et al., de oxidación (Martínez et al., 2013).
2021; Zhu et al., 2022), catalizan la oxidación
del amonio a nitrito; y la enzima Nitrito Oxidasa De manera rápida y sencilla, la detección
(NO), que se encuentra en el citoplasma es la del proceso de nitrificación -denitrificación
responsable de la oxidación de nitrito a nitrato se puede realizar mediante la prueba de
(Daims et al., 2015; Soliman and Eldyasti 2018; color para amonio y nitrato (Martínez et al.,
Lu et al., 2019; Song et al., 2021). 2013). Para la detección de NH4+, se utiliza el
reactivo de Nessler con la liberación de un
De otra manera, la desnitrificación describe color amarillo en el medio o precipitado rojo
el proceso de respiración anaeróbica de en el caso de una prueba positiva; en el caso
nitrito (NO2-), óxido nítrico (NO) y óxido nitroso de una prueba negativa no hay cambio de
(N2O) a nitrógeno molecular (N2), (Martínez- color del medio (transparente con precipitado
Espinosa et al., 2021). Los microorganismos de sales). El reactivo actúa como una solución
heterótrofos que pueden llevar a cabo estas alcalina compuesta por yoduro de potasio y
tres reacciones de manera acoplada junto yoduro de mercurio que reacciona con los
con la reducción de nitrato a nitrito son iones amonio, formando un compuesto pardo
llamados denitrificantes clásicos o canónicos, amarillento llamado yodomercurinato de
ya que se sabe que tanto bacterias como potasio alcalino (Kifle & Laing, 2015).
archaeas expresan parcialmente las enzimas
involucradas en la secuencia completa de Por su parte, el reactivo de Griess-Ilosvay es
desnitrificación. Dichas rutas incompletas utilizado para la detección de nitrito, aunque
pueden ser causantes de la acumulación también puede suponer la presencia de
de nitrato y de algunos gases como NO y nitratos. El reactivo está compuesto de ácido
N2O en los ambientes (Stain & Klotz, 2016). La sulfanílico, ácido acético y α-naftilamina. Si el
desnitrificación o reducción del nitrato, ocurre Nitrato es reducido a nitrito, este reacciona
en pH de 6–6,5, y en temperaturas desde 2 con el ácido sufánilico incoloro para

91
convertirse en ácido sulfanílico diazotizado •1 frasco de compota con 10 mL de
más agua. Posteriormente el grupo azo (-N=N) hipoclorito 2,5% (v/v), (anexo B, numeral 8).
reacciona con dimetil-α-naftilamina para
formar p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina que •1 frasco de compota con 10 mL de agua
es un colorante rosado azo soluble en agua y destilada estéril.
confirma la presencia de nitritos en la muestra
analizada (Elbanna et al., 2012). •1 mortero estéril.

Si la reacción es negativa o incolora, se •Pinzas.

procede a adicionar polvo de Zn, el cual
reduce por vía química el nitrato a nitrito •Colorantes de Gram.
confirmando que el nitrato está presente en el
medio. En caso contrario, indica que el nitrato •Aceite de inmersión.
pudo seguir siendo reducido por vía asimilativa
o desasimialativa. •Bisturí.

5.2. Objetivos 5.3.2. Aislamiento de microorganismos fijadores

de nitrógeno no asociativos: Azotobacter sp.
Objetivos generales
•10 g de muestra de suelo.
•Determinar las densidades poblacionales y
la actividad biológica de bacterias asociadas •1 caja de Petri con agar Ashby (anexo A,
con el ciclaje del nitrógeno en suelos. numeral 20).

•Recuperar microorganismos nitrificantes •Pinzas.

y reductivos a partir de muestras de suelo
o agua. •Suelo agrícola.

Objetivos específicos 5.3.3. Aislamiento de microorganismos

microaerofílicos de nitrógeno asociativos
•Aislar y cuantificar microorganismos fijadores
de N atmosférico. •1 g de raíces de gramíneas.

•Determinar cuantitativamente la liberación •3 tubos de ensayo 16x150 mm, con 9 mL

de productos finales dentro de las reacciones de solución salina 0,85 % (m/v), (anexo B,
óxido-reductivas del ciclo, para confirmar numeral 1).
la presencia de microorganismos que
participan en él. •9 tubos de ensayo 16x150 mm, con 9
mL de medio NFB semisólido (anexo A,
•Realizar pruebas químicas cualitativas numeral 21).
relacionadas con las etapas oxidativas y
reductivas del ciclo del nitrógeno. •9 tubos de ensayo 16x150 mm, con 9 mL de
medio LGI semisólido (anexo A, numeral 22).
5.3. Materiales, medios de cultivo y reactivos
•1 caja de Petri con agar NFB (anexo A,
5.3.1. Aislamiento de microorganismos fijadores numeral 21).
de nitrógeno asociativos o simbióticos a partir
de raíces de arveja, frijol, trébol, alfalfa u otra •1 caja de Petri con agar LGI (anexo A,
leguminosa nodulada: Rhizobium sp. numeral 22).

•1 caja de Petri con agar levadura manitol •1 caja de Petri con agar Rojo Congo LGI
(YMA), (anexo A, numeral 19). (anexo A, numeral 23).

•1 frasco de compota con 10 mL de alcohol •1 frasco de compota con 10 mL de alcohol

etílico al 20 % (v/v), (anexo B, numeral 7). etílico al 20% (v/v), (anexo B, numeral 7).

92
 •1 frasco de compota con 10 mL de •6 tubos de 16x150 mm para las reacciones
hipoclorito 2,5% (v/v), (anexo B, numeral 8). de cuentificación de NO3.

•1 frasco de compota con 10 mL de agua 5.3.6. Determinación de número más probable

destilada estéril. (NMP) para microorganismos nitrificantes y
denitrificantes
•Mortero con brazos estériles.
•1 frasco de 200 mL, con 90 mL de solución
•Micropipeta de 100 a 1000 uL. salina 0,85% (m/v) ajustar pH a 7,0 con
hidróxido de sodio 1 N o HCl 1 N (anexo B,
•Puntas para pipeta de 100 a 1000 uL. numerales 43 y 44).

•Asa redonda. •4 tubos 16x150 mm, con 9 mL de solución

salina 0,85% (m/v), (anexo B, numeral 1).
•Bisturí.
•16 tubos 16x150 mm tapa rosca anchos
5.3.4. Curva de calibración para la detección y fondo plano, con 9 mL de caldo amonio
de nitrato (NO3- - como producto de la (anexo A, numeral 24).
oxidación de amonio)
•16 tubos de 16x150 mm tapa rosca
•2 mL de solución stock de KNO3 de 1000 anchos y fondo plano, con 9 mL de caldo
ppm (anexo B, numeral 9). nitrato (anexo A, numeral 25).

•6 mL de solución A compuesta por: Ácido •5 pipetas de 5 mL.

salicílico 5 % (m/v), disuelto en H2SO4 al 98%
v/v) (anexo B, numeral 9). •10 g de muestra de suelo, lodo o agua
residual.
•120 mL de solución B compuesta por
NaOH 2N (anexo B, numeral 10). •Reactivo de Nessler (anexo B, numeral 14).

•6 tubos eppendorf de 2 mL para preparar •Reactivo de Gries (anexo B, numeral 15).

las concentraciones patrón de KNO3.
•Polvo de Zinc.
•20 mL de agua destilada.
5.4. Equipos
•6 tubos de 16X150 mm para las reacciones
de cuentificación de NO3. •Incubadora.

5.3.5. Curva de calibración para la detección •Microscopio óptico.

de amonio (NH4+ - Como producto de la
reducción asimilativa de NO3=) •Espectrofotómetro.

•1 mL de solución stock de (NH4)2SO4 de •Balanza.

1000 ppm (anexo B, numeral 11).
5.5. Metodología
•5 mL de solución A para curva de calibración
de amonio (anexo B, numeral 12). [Link] de microorganismos fijadores de
nitrógeno asociativos o simbióticos: Rhizobium sp.
•10 mL de solución de hipoclorito de sodio
al 0,2 % (v/v) (anexo B, numeral 13). •Lavar las raíces con abundante agua
corriente o de la llave.
•150 mL de agua destilada.
•Seleccionar y aislar los nódulos turgentes,
•6 tubos eppendorf de 2 mL para preparar utilice el bisturí.
las concentraciones patrón de (NH4)2SO4.

93
 •Llevarlos al frasco compota con etanol al •Realizar coloración de Gram al
20% (v/v) y dejarlos allí durante 2 minutos. expolisacárido producido alrededor de los
gránulos de suelo.
•Extraer los nódulos del etanol con las
pinzas y sumergirlos en la solución de •Observar al microscopio en objetivo
hipoclorito de sodio. 100x buscando la presencia de quistes de
Azotobacter sp. y exopolisacárido.
•Agitar durante 2 minutos.
5.5.3. Aislamiento de microorganismos
•Extraer los nódulos con las pinzas y microaerófilos fijadores de
sumergirlos en el agua destilada estéril. nitrógeno asociativos

•Agitar durante 2 minutos. •Tomar la raíz de la planta y lavarla con

agua corriente para eliminar la mayor
•Macerarlos cerca del mechero hasta cantidad de partículas de suelo.
obtener una mezcla líquida.
•Pesar 1 g de raíces jóvenes poco pigmentadas
•Realizar coloración de Gram. y con aspecto turgente, utilice el bisturí para
cortar los fragmentos seleccionados.
•Observar células Gram negativas en
forma de Y y/o polimórficas por la ausencia •Con las pinzas llevar las raíces al frasco
de pared celular. compota con alcohol etílico al 20 % (v/v) y
agitar durante 3 minutos.
•Sembrar por agotamiento en agar YMA.
•Sacar las raíces del etanol con las pinzas
•Incubar a 35°C durante 48 horas. y sumergirlos en la solución de hipoclorito
de sodio. Agitar durante 2 minutos.
•Observar colonias brillantes y de color
rosa pálido presuntivas de Rhizobium sp. •Sacar las raíces con las pinzas y sumergirlos
en el agua destilada estéril. Agitar durante
•Realizar coloración de Gram para 2 minutos.
observar bacilos Gram negativos cortos y
delgados típicos de Rhizobium sp. •Sacar con las pinzas y disponer en el mortero.

[Link] de microorganismos fijadores •Macerar suavemente y recuperar el

de nitrógeno no asociativos: Azotobacter sp. contenido total en un tubo de solución
salina (dilución 10-1)
•10 g de muestra de suelo.
•Realizar las diluciones 10-2 y 10-3.
•Tomar la muestra de suelo y formar
gránulos de suelo con pinzas. •A partir de la dilución 10-1, tome 1 mL y
sembrar los tubos con los medios NFb y LGI.
•Sembrar 25 gránulos de suelo equidistantes Haga lo mismo hasta sembrar tres tubos
en cada caja de agar Ashby. por dilución. En total se sembrarán 9 tubos.

•Incubar a 30°C durante 2 semanas. •Incubar a 30ºC durante 3 días.

•Contar los gránulos que presenten •Observar la formación de la biopelícula

expolisacárido y determinar el porcentaje debajo de la superficie de la columna
de positivos. formada por el medio (2mm bajo la
superficie). Verifique la alcalinización del
•Determinar si los gránulos positivos medio por el cambio de la tonalidad hacia
presentan pigmentación e informar el color. un azul más intenso. En el caso del medio
LGI el viraje será de amarillo a azul.

94
 •Tomar una asada de la biopelícula •Agregar 19 mL de la Solución B (NaOH 2N).
formada en los medios semisólidos y
sembrar por agotamiento en los medios •Esperar la formación de color (Figura 10A)
sólidos respectivos y en agar Rojo Congo. y a que la reacción se enfríe, y medir la
absorbancia a 410 nm, ajustando el cero
•Incubar a 30ºC durante 48 horas. del equipo con el patrón correspondiente.

•Realizar coloración de Gram y observar 5.5.5. Curva de calibración para la detección

al microscopio en objetivo 100x. de amonio (NH4+ - como producto de la
reducción asimilativa de NO3=)
Realizar el conteo de tubos positivos por cada
dilución y determinar el NMP/g en la tabla A partir de una solución stock de (NH4)2SO4 de 1000
para serie de 3 tubos. Se toma como positivo ppm, preparar las siguientes concentraciones
la formación de película, con o sin cambio de para la curva: (anexo B, numeral 11).
color en el medio.
•Tomar 0,5 mL de cada estándar y
5.5.4. Curva de calibración para la detección adicionar 0,5 mL de la solución A.
de nitrato (NO3- - como producto final de la
oxidación de amonio). •Agregar inmediatamente 0,5 mL de
solución de hipoclorito de sodio al 0,2 % (v/v).
A partir de una solución stock de KNO3 de 1000
ppm, preparar las siguientes concentraciones •Esperar 20 minutos para la formación de
para la curva: (anexo B, numeral 15). color (Figura 10B).

Tomar 0,2 mL de cada estándar y adicionar •Adicionar 20 mL de agua destilada.

0,8 mL de la solución A (Ácido salicílico 5%
m/v, disuelto en H2SO4 al 98% v/v). •Esperar 15 min y medir la absorbancia a
650 nm, ajustando el cero del equipo con
•Esperar 20 minutos hasta que la reacción el patrón correspondiente.
se estabilice.

Tabla 4.
Cálculos para preparación de soluciones Stock curva patrón de nitratos
[KNO3] ppm Vol. Stock Vol. de agua destilada mL Vol. final de la reacción mL Abs410 nm
0 2
40 2
60 2
100 2
120 2
200 2
Tabla 5.
Cálculos para preparación de soluciones Stock curva patrón de amonio.

[NH4] ppm Vol. Stock Vol. de agua destilada mL Vol. final de la reacción mL Abs650 nm
0 2
2,5 2
7,5 2
12,5 2
17,5 2
20 2

95
 Figura 10.
Resultado de las curvas patrón para la determinación de nitrato y amonio. (A). Se observa la
formación de color azul para las distintas concentraciones de KNO3 (0 – 40 – 60 – 100 - 120 y 200
ppm) por la nitración del ácido salicílico bajo condiciones de acidéz elevada en la reacción;
el cromóforo tiene su máxima absorbancia a 410 nm en soluciones a pH básico (>12). (B) Se
observa la formación de color amarillo para las distintas concentraciones de (NH4)2SO4 (0 - 2,5
– 7,5 – 12,5 – 17,5 y 20 ppm) ya que el amonio reacciona con el salicilato y el hipoclorito en
presencia del catalizador nitroprusiato (reacción de Betherlot).

A B

0 40 60 100 120 200 0 2,5 7,5 12,5 17,5 20

ppm ppm

5.5.6. Determinación de número más probable •Prueba negativa (-): Incoloro.

(NMP) para microorganismos nitrificantes y
denitrificantes •A los tubos con reacción (-), adicionar
una pizca de polvo de Zinc.
Procesos de nitrificación (Microorganismos
nitrificantes): •Prueba positiva (+): Rosado.

•Pesar 10 g de material y llevarlos al frasco •Realizar el conteo de tubos positivos para

con 90 mL de solución salina 0,85 % (m/v). las determinaciones de NH4 y NO3= por
cada dilución y determinar el NMP/g en la
•Realizar diluciones seriadas hasta 10-3. tabla para serie de 5 tubos (Figura 11).

•Dividir 15 tubos de caldo amonio en tres Procesos de Denitrificación (Microorganismos

series de 5 tubos cada una. denitrificantes):

•Inocular 1 mL de cada dilución por cada •Pesar 10 g de material y llevarlos al frasco

serie de tubos. con 90 mL de solución salina 0,85% (m/v).

•El tubo restante de cada caldo •Realizar diluciones seriadas hasta 10-3.
corresponderá al control, SIN inocular.
•Dividir 15 tubos de caldo amonio en tres
•Incubar a 30ºC durante 16 días. series de 5 tubos cada una.

•Luego de la incubación durante 16 días, •Inocular 1 mL de cada dilución por cada

adicionar 4 gotas del reactivo de Griess a serie de tubos.
cada tubo (Figura 11).
•El tubo restante de cada caldo
•Prueba positiva (+): Rosado. corresponderá al control, SIN inocular.

96
 •Incubar a 30ºC durante 16 días. •En caso de tener resultado incoloro,
adicionar 4 gotas del reactivo de Nessler a
•Luego de la incubación durante 16 días, cada tubo.
adicionar 4 gotas del reactivo de Griess a
cada tubo. - Prueba positiva (+): Amarillo

- Prueba positiva (+): Rosado •Realizar el conteo de tubos positivos para

- Prueba negativa (-): Incoloro las determinaciones de NH4 y NO3= por
cada dilución y determinar el NMP/g en la
tabla para serie de 5 tubos (Figura 11).

Figura 11.
Posibles resultados del NMP/g de suelo a partir de clado amonio y caldo nitrato

Control NMP - Grupos funcionales

abiótico A
4 tubos positivos 1 tubos positivos

10-

3 tubos positivos 2 tubos positivos

10-

2 tubos positivos 3 tubos positivos

10-

Nitrificación parcial (grupo nitroso) Nitrificación total (grupo nitro)

Control
abiótico
B
4 tubos positivos 1 tubos positivos

10-1

3 tubos positivos 2 tubos positivos

10-2

2 tubos positivos 3 tubos positivos

10-3

Reducción de NO3 a NO2 Reducción desasimilativa

o asimilativa de NO2 a NH4
Cortesía de Claudia Marcela Rivera Hoyos.

97
5.6. Referencias fertilization imbalances potential N acquisition
and transformations by soil microbes. Science
Baulikar, R., Chaluvadi, SR., Torres, I., Mosali, of The Total Environment. 562-571. [Link]
J., Bennetzen, JL., Udvardi, M. (2020). org/10.1016/[Link].2019.07.154
Nitrogen Fertilization reduces nitrogen fixation
activity of diverse Diazotrophs in Switchgrass Elbanna, K., Shahawy, EL., Atalla, KM. (2012).
Roots. Phytobiomes Journal. 1-8. [Link] A new simple method for the enumeration of
org/10.1094/PBIOMES-09-19-0050-FI. nitrifying bacteria in different environments.
Plant and Soil Environment. 49-53.
Bellenger, J.P., Darnajoux, R., Zhang X., et al.
(2020). Biological nitrogen fixation by alternative Kifle, MH., Laing, MD. (2015). Isolation and
nitrogenases in terrestrial ecosystems: a review. screening of bacteria for their diazotrophic
Biogeochemistry. [Link] potential and their influence on growth
s10533-020-00666-7 promotion of maize seedlings in greenhouses.
Frontiers in Plant Science. 1225.
Cerón, L., Aristizabal, FA. (2012). Dinámica del
ciclo del nitrógeno y fósforo en suelos. Revista Li, Y., Chapman, SJ., Nicol, GW., Yao, H. (2018).
Colombiana de Biotecnología. 14(1), 285-295. Nitrification and nitrifiers in acidic soils. Soil
Daims, H., Lebedeva, EV., Pjevac, P., Han, Biology and Biochemistry. 290-301.
P., Herbold, C., Albertsen, M., Jehmlich,
N., Palatinszky, M., Vierheilig, J., Bulaev, A., Lu, Sh., Liu, X., Liu, Ch., et al. (2019). Review of
Kirkegaard, RH., von Bergen, M., Rattei, T., ammonia-oxidizing bacteria and archaea in
Bendinger, B., Nielsen, PH., Wagner, M. (2015). freshwater ponds. Reviews in Environmental
Complete nitrification by Nitrospira bacteria. Science and BioTechnology. [Link]
Nature. 528(7583), 504–509. [Link] org/10.1007/s11157-018-9486-.
org/10.1038/nature16461.
Martínez. M., Gutiérrez, V., Pedroza, A. (2013)
Fan, K., Delgado-Baquerizo, M., Guo, X., Wang Métodos Microbiológicos, físicos y químicos
, D., Wu, Y., Zhu, M., Chu, H. (2019). Suppressed con aplicación ambiental. Manual de
N fixation and diazotrophs after four decades Microbiología. Chile: Editorial Universidad
of fertilization. Microbiome. (143), [Link] Federico Lleras San María 132p. p.
org/10.1186/s40168-019-0757-8.
Martínez, C., Sauvage, S., Bitar, A., et al. (2021).
Fonseca-Lopez, D., Vivas-Quila, NJ., Balaguera- Denitrification in wetlands: A review towards a
Lopez, HE. (2020). Técnicas aplicadas en la quantification at global scale. Science of the
investigación agrícola para cuantificar la Total Environmental. [Link]
fijación de nitrógeno: una revisión sistemática. scitotenv.2020.142398.
Ciencia y Tecnología Agropecuaria. 21(1),
1-19. Ramm, E., Liu, Ch., Ambus P., et al. (2022). A
review of the importance of mineral nitrogen
Han, F and Zhou, W. (2022). Nitrogen recovery cycling in the plant-soil-microbe system of
from wastewater by microbial assimilation – A permafrost-affected soils—changing the
review. Bioresource Technology. [Link] paradigm. Environmental Research Letters.
org/10.1016/[Link].2022.127933. 17013004.

He, Sh., Zhao, Zh., Tina, Zh., et al. (2022). Ren Y., Ngo, H., Guo, W. (2021). New
Comammox bacteria predominate among perspectives on microbial communities and
ammonia-oxidizing microorganisms in biological nitrogen removal processes in
municipal but not in refinery wastewater wastewater treatment systems. Bioresource
treatment plants. Journal Environmental Technology. [Link]
Management. [Link] biortech.2019.122491.
jenvman.2022.115271.
Shi, M., Zhao, Y., Zhu, L., et al. (2020).
Huang, L., Riggins, CW., Rodriguez-Zas, S., Denitrification during composting: Biochemistry,
Zabaloy, MC., Villamil, MB. (2019). Long-term N implication and perspective. International

98
Biodeterioration & Biodegradation. [Link]
org/10.1016/[Link].2020.105043.

Soliman M and Eldyasti A. (2018). Ammonia-

Oxidizing Bacteria (AOB): opportunities
and applications—a review. Reviews in
Environmental Science and BioTechnology.
DOI 10.1007/s11157-018-9463-4.

Song, T., Zhang, X., Li, J., et al. (2021). Review of

research progress of heterotrophic nitrification
and aerobic

denitrification microorganisms (HNADMs).

Science of the Total Environmental. [Link]
org/10.1016/[Link].2021.149319.
Stain, LY., Klotz, MG. (2016). The nitrogen cycles.
Current biology: Current Biology. 26(3), R94–
R98. [Link]

Torabian, S., Farhanfi-Abriz., Denton, M. (2019).

Do tillage systems influence nitrogen fixation
in legumes? A review. Soil & Tillage Research.
[Link]

Van-Kessel, MA., Speth, DR., Albertsen, M.,

Nielsen, PH., Op den Camp, HJ., Kartal, B.,
Jetten, MS., Lücker, S. (2015). Complete
nitrification by a single microorganism. Nature.
528(7583), 555–559. [Link]
nature16459.

Zhu, G., Wang, X., Wang, Sh., et al. (2022).

Towards a more labor-saving way in microbial
ammonium oxidation: A review on complete
ammonia oxidization (comammox). Science
of the Total Environmenta lSciencience. http://
[Link]/10.1016/[Link].2022.154590.

99
100
Capítulo 6
CICLO DEL FÓSFORO

101
102
Capítulo 6

CICLO DEL FÓSFORO

Claudia Marcela Rivera Hoyos, Viviana Gutiérrez Romero, Lucía Ana Díaz-Ariza,
Natalia Sánchez Sánchez, Rodrigo Ortega Blu, María Mercedes Martínez

6.1. Introducción negativos de la explotación del P mineral

sobre suelo (ácido fosfórico) o en aguas
El fósforo es un elemento esencial para todos (eutroficación), y generando alternativas
los seres vivos, y juega un papel relevante en para incorporar materia orgánica rica en P
el ambiente en especial porque hace parte al suelo (Golroudbary et al., 2020; Ylivainio et
de moléculas tan importantes como el ADN al., 2021) El ciclo de este elemento presenta
o el ATP. Y por tanto está en la naturaleza en una diferencia importante con el ciclo
formas orgánicas, pero también en formas biogeoquímico de otros elemento, pues
minerales como la roca fosfórica (Hallama aunque presenta forma gaseosa, fosfito (PH3),
et al., 2019: Kalayu, G 2019: Bindraban et no se reconoce, el componente atmosférico
al., 2020; Alewell et al., 2020). Igualmente del ciclo (Turner y Raboy, 2019). Aunque se
existen otras fuentes de P como los residuos encuentra presente en el suelo, se destaca
orgánicos municipales, lodos de depuradora como un factor nutricional limitante en suelos
y estiércoles o purines de animales (Ortega & por su baja movilidad generando zonas de
Martínez 2019; Ylivainio et al., 2021). Hoy por agotamiento en la rizosfera y deficiencias
hoy la economía circular de los residuos invita del elemento en la planta (Penn et al.,
a los países y a los productores a mejorar las 2019). Microorganismos de diferentes grupos
prácticas agrícolas, y valorar los residuos en taxonómicos, incluyendo bacterias y hongos
relación al contenido de P o N, entre otros tanto filamentosos como levaduriformes (Ferrol
elementos, limitando además los efectos et al., 2019; Kalayu, 2019) juegan un papel

103
importante en el aumento de la disponibilidad procesos de meteorización y precipitación,
de formas de fósforo asimilable a través de mineralización e inmovilización, adsorción y
procesos de solubilización y de mineralización desorción. De los anteriores, la meteorización,
y en la movilización del elemento hacia la la mineralización y la desorción son aquellos
planta (Blanco et al., 2020: Blanco et al., 2021; procesos que aumentan la disponibilidad
Blanco et al., 2022). del elemento en el suelo (Stevenson y Cole,
1999; Hyland et al., 2005; Tian et al., 2021).
Los compuestos químicos en los que el elemento Los microorganismos que participan en
está presente en el suelo se pueden agrupar el ciclaje del elemento en suelos y aguas
en cuatro formas generales: fósforo inorgánico tienen la capacidad de solubilizar fósforo a
disponible para plantas y otros organismos, partir de minerales primarios y secundarios
fósforo orgánico no disponible, fósforo (meteorización y desorción), de mineralizarlo
inorgánico adsorbido a otros componentes a partir de diferentes fuentes orgánicas y de
del suelo (minerales secundarios) y fósforo en movilizarlo desde el suelo hacia la planta
minerales primarios (Doydora et al., 2020). Estas (Wahid et al., 2020; Bargaz et al., 2021). En la
formas cambian y el elemento fluye en el suelo figura 12 se presente el esquema general del
y hacia otras esferas en los ecosistemas en ciclo de fósforo.

Figura 12.
Ciclo general del fósforo

Degradación

Absorción
microbiana

PO4
Orgánico
Absorción
insoluble
microbiana

Muerte

Seres
vivos Exudación
PO4 PO4
Inorgánico Orgánico
soluble soluble

Degradación

Liberación por
ácido y H2S
PO4
Fertilizantes Inorgánico insoluble Sedimentos

Precipitación

Erosión Depósito

Cortesía de Lucas David Pedroza Camacho.

104
6.1.1. Solubilización de fósforo constituyentes de los minerales arcillosos en
suelos con pH entre 3,5 y 5,5, mientras que en
Los microorganismos fosfato solubilizadores suelos alcalinos (por arriba de 8,0) se hacen
son capaces de crecer en medios con evidentes los fosfatos con altos contenidos de
Ca3(PO4)2 o minerales insolubles semejantes calcio (Kour et al., 2021; Blanco et al., 2022).
como única fuente de fosfato, éstos asimilan el
elemento y hacen soluble una porción la cual Otros mecanismos de solubilización, incluyen
es liberada al medio (Wahid et al., 2020; Bargaz la oxido Reducción como estrategia
et al., 2021). El fósforo inorgánico se presenta microbiana de transformación de las formas
como compuestos de calcio, aluminio, hierro de fósforo no solubles, esto, debido a que el
donde puede ser soluble o insoluble (Blanco fósforo se encuentra en estados de oxidación
et al., 2020). Las formas solubles provienen de que varían desde el -3 de la fosfina al estado
la mineralización de la materia orgánica en el oxidado +5 del ortofosfato. Las reacciones de
suelo o la solubilización de rocas fosfatadas y oxidación por los microorganismos se realizan
de fertilizantes (Basílio et al., 2022; Blanco et al., con la utilización del fosfito, el cual se oxida en
2021). Estos ácidos orgánicos se producen a la célula a compuestos orgánicos de fosfato.
partir de la oxidación de - fuentes de carbono Las bacterias utilizan preferentemente fosfatos
disponibles, principalmente por vía glucolítica en lugar de fosfito (Kour et al., 2021; Blanco
y la oxidación directa de la glucosa hasta la et al., 2020). La producción de sideróforos es
producción de diferentes ácidos carboxílicos otro mecanismo de solubilización realizada
que glucónico, ácido cítrico, ácido oxálico) por algunos microorganismos en el que se
originan la acidificación de la célula y sus quelan elementos que están unidos al fósforo
alrededores (Blanco et al., 2022). Como como el hierro, liberando fosfato (Cui et al.,
consecuencia, el fósforo es liberado desde el 2022). Algunos de los quelantes como el
fosfato mineral por la sustitución de un protón 2-cetogluconato, citrato, oxalato y lactato
de calcio. Los ácidos orgánicos producidos forman un complejo con la porción catiónica
comúnmente por especies bacterianas del fosfato insoluble forzando de esta manera
incluyen: ácido láctico, succínico, isovalérico, su disociación (Kour et al., 2021; Blanco et
isobutírico y acético (Kalayu, 2019; Blanco et al., 2020; Blanco et al., 2022). Finalmente, se
al., 2020ª; Blanco et al., 2021b), (Figura 13). encuentra la reducción de formas minerales
Esta capacidad de permanecer soluble, de fosfato férrico donde el sulfuro de
depende de varios factores, siendo el pH hidrógeno (H2S) producido, reacciona con el
del suelo el más importante. A pH bajo (por hierro del fosfato y lo precipita como sulfuro
debajo de 6,0) se favorece la formación de de hierro, liberando así el fosfato (Alori &
fosfatos de hierro, aluminio y manganeso, Babalola, 2017).

Figura 13.
Solubilización de fósforo inorgánico. (A) Agar SMRS1. (B) Agar Pikovskaya

A B

Cortesía de Viviana Gutierrez Romero.

105
6.1.2. Mineralización de fósforo principalmente fósforo, mientras que
transfiere componentes orgánicos al hongo
La forma esencial del fósforo es el fosfato, (Brundrett 2004; Brundrett, 2009; Wahid et al.,
presente tanto en forma inorgánica como 2020). Además del aumento en la captación
orgánica haciendo parte de la materia de nutrientes que favorece el crecimiento
orgánica presente en el suelo. Sin embargo, las de la planta, hay otras funciones de la
formas orgánicas son insolubles, por lo que es micorriza que han sido descritas, tales como
precisa la participación de microorganismos el incremento en la captación de agua y
para lograr el proceso de mineralización de la tolerancia a estrés biótico y abiótico en
la materia orgánica y el P entre a la solución las plantas, además del mejoramiento de la
de suelo como fosfato soluble. Sin embargo, estructura del suelo (Gianinazzi et al., 2010;
las condiciones de alcalinidad o acidez de Díaz-Ariza et al., 2013).
los suelos hacen que el fósforo se convierta
en un elemento de baja disponibilidad. Bajo [Link]. Tipos de micorriza
condiciones neutras, la tasa de mineralización
de los compuestos orgánicos es muy alta, En la tabla 5 se describen los tipos de
los microorganismos mineralizan el fósforo micorrizas que se conocen actualmente: la
orgánico, a través de la secreción de enzimas ectomicorriza, la ectendomicorriza y cinco
extracelulares (fosfatasas) liberando de nuevo tipos de endomicorriza. Cada uno de ellos
H2PO4- (ortofosfato) a la solución de suelo presenta diferentes estructuras formadas por
(Blanco et al., 2021b). Las fosfatasas, catalizan los organismos simbiontes, que a su vez son
la hidrólisis de ésteres y anhídridos de H3PO4 y distintos según el tipo de micorriza la clase de
son responsables de la mineralización orgánica compuestos que se intercambian entre los
del fósforo en el suelo y de la consecuente organismos involucrados (Cuenca, 2015; van
liberación del fósforo inorgánico (Shaw et der Heijden et al., 2015; Smith and Read, 2008).
al., 2020). Las más estudiadas en ecosistemas
agrícolas son las fosfomonoesterasas, pueden Micorriza arbuscular
tener carácter ácido o alcalino, de acuerdo
con la actividad óptima del pH, y actúan sobre Este tipo de micorriza es el más ampliamente
compuestos de P de bajo peso molecular que distribuido en ecosistemas y agroecosistemas
incluyen mononucleótidos, azúcares de fosfato tropicales. Una de lass estrategias de las
y polifosfatos (Behera et al., 2017). Las fitasas plantas en suelos con baja disponibilidad
(EC [Link]), son un un grupo de fosfatasas de fósforo es la formación de la micorriza
que realizan la hidrólisis parcial o total de arbuscular. Los hongos colonizan las células
los ortofosfatos presentes en el ácido fítico, vegetales y desarrollan micelio extraradical
principal forma de fósforo orgánico presente que permite ampliar el área del suelo más allá
en cereales, leguminosas y en las semillas de la raíz para captar nutrientes, traslocarlos
oleaginosas. Estas enzimas actúan rompiendo hacia la raíz y transferirlos a las células
los enlaces fosfomonoéster, degradando vegetales. En la mayoría de las plantas, una
los fitatos a mioinositolhexafosfato y fósforo parte del fósforo es adquirido vía micorriza y
inorgánico. Entre los principales microorganismos otra a través de la epidermis de la raíz, pero
productores de fitasas se encuentran Aspergillus otras veces, específicamente en plantas que
spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. y dependen de la micorriza, todo el fósforo
levaduras (Naves et al., 2014). que la planta adquiere es por medio de la
simbiosis (Ferrol et al., 2019).
6.1.3. Micorrizas, simbiosis para la movilización
y transferencia de fósforo Durante el estudio de la micorriza arbuscular
es posible observar sus estructuras y
La micorriza es una asociación simbiótica cuantificar la colonización fúngica dentro
mutualista entre hongos de suelo y la raíz de la raíz de la planta hospedera a través
viva de una planta, caracterizada por de microscopía luego de pasar las raíces
la transferencia de nutrientes entre los colonizadas por un proceso de aclarado y
organismos que conforman la asociación tinción (ICONTEC, 2018; Phillips y Hayman,
a través de estructuras especializadas. La 1970). Los hongos formadores de micorriza
planta adquiere compuestos inorgánicos, arbuscular, pertenecientes a la división

106
Glomeromycota (Tedersoo et al., 2018), tamaño, el color, la presencia de diferente
se propagan por medio de esporas. Las número y tipo de paredes, la presencia
características de estos propágulos varían de ornamentaciones en ellas, presencia
entre taxones, y su observación ha sido una de distinto número de capas en cada
de las formas tradicionales de llevar a cabo pared, la reacción al reactivo Melzer y las
aproximaciones taxonómicas. Las esporas estructuras de germinación (Cuenca, 2015).
generalmente son aisladas del suelo para En la figura 14 se observan tres esporas de
su estudio (Gerdemann y Nicholson, 1963; Glomeromycota. Adicionalmente, en figura
ICONTEC, 2018; Jenkins, 1964). Las estructuras 15 se observan estructuras intraradicales de
morfológicas más importantes de las esporas hongos formadores de micorriza arbuscular.
en el momento se su clasificación es: el

Tabla 6.
Tipos de micorriza (basada en Brundrett, 2004)

Estructuras características
Tipo de micorriza Hongos simbiontes Plantas hospederas
y colonización
Ectomicorrizas
Hifas septadas
Basidiomycota Angiospermas
Ectomicorriza Red de Hartig
Ascomycota Gimnospermas
Manto
Hifas septadas
Red de Hartig
Arbutoide Basidiomycota Orden Ericales Manto (puede estar
presente)
Enrollados intracelulares
Hifas septadas
Red de Hartig
Familia
Monotropoide Basidiomycota Manto (puede estar
Monotropaceae
presente)
Estructuras intracelulares

Ectendomicorriza

Hifas septadas
Red de Hartig
Basidiomycota Angiospermas Manto reducido o
Ectendomicorriza
Ascomycota Gimnospermas inexistente
Puede haber colonización
intracelular
Endomicorrizas
Hifas septadas
Ericoide Ascomycota Orden Ericales
Estructuras intracelulares
Hifas septadas
Orquidioide Basidiomycota Familia Orchidaceae
Enrollados intracelulares
Hifas aseptadas
Angiospermas
Estructuras intracelulares:
Arbuscular Glomeromycota Gimnospermas
Arbúsculos, enrollados,
Briofitas Pteridófitas
vesículas

107
 Figura 14.
Esporas de diferentes Glomeromycota aislados de suelos colombianos. Acaulospora colombiana
en PVGL, pared de germinación y pared externa. b. Acaulospora colombiana en PVGL
con Melzer. c. Espora con hifa de suspensión.

A Paredes de B C
germinación

Paredes de
germinación

10 μm 10 μm 45 μ m
Pared externa

Cortesía de Luciana Díaz.

Figura 15.
Estructuras intraradicales de hongos formadores de micorriza arbuscular con un aumento de 40 x.

50 μm 10 μm

Arbúsculos
Vesículas
en raíz de
en raíz de
Guadua
Cynodon sp.
angustifolia

10 μm

Arbúsculos y
enrrollados en Arbúsculos en
raíz de Guadua raíz de Cordia
angustifolia alliodora

A
Díaz - Ariza et al
(2013) 40 μm

25 μm

Vesículas
Hifas y vesículas
en raíz de
en raíz Guadua
Maclura
angustifolia
tincoria

25 μm

Cortesía de Luciana Díaz.

108
6.2. Objetivos •Colorantes de Gram.

Objetivo general •Aceite de inmersión.

• Realizar el aislamiento y la caracterización 6.3.2. Actividad fosfatasas alcalinas

de microorganismos del ciclo del fósforo a
partir de muestras de suelo y de raíces. •10 mL de cultivo de microorganismos
fosfato solubilizadores.
Objetivos específicos
•5 tubos de 2 mL para centrífuga.
•Conocer los mecanismos biológicos para
la solubilización de fósforo empleados por •2 tubo 16 x 150 mm con 1 mL de
diferentes grupos microbianos. 4-p-nitrofenil fosfato (0,025 mM), (anexo
B, numeral 16) preparado en una solución
•Realizar la recuperación cuantitativa de buffer universal MUB a pH 7,0 (anexo B,
microorganismos solubilzadores fosfato- numeral 17).
asociados con la producción de ácidos
orgánicos sobre medios específicos. •5 tubos 16 x 150 mm.

•Reconocer estructuras de micorriza •1 frasco Schott de 50 mL con 20 mL NaOH

arbuscular en suelos, bioinoculantes y (0,5 M), (anexo B, numeral 18).
raíces de plantas.
•1 frasco Schott de 50 mL con 10 mL CaCl2
•Determinar las actividades enzimáticas (0,5 M), (anexo B, numeral 19).
de varios tipos de fosfatasas.
•1 frasco Schott de 25 mL p-nitrofenol
6.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo (0,01 – 0,06 µmol/L), (anexo B, numeral 20).

[Link] de microorganismos •Papel filtro Whatman No 42.

solubilizadores de fósforo
•Embudo.
•1 frasco Shcott de 250 mL, con 90 mL de
medio SMRS1 líquido, sin indicador de pH •Pipeta automática de 100-1000 µL.
(anexo A, numeral 26).
•Puntas para pipetaautomática.
•4 cajas de Petri con agar sólido SMRS1
(Baschan, 1998), con indicador de pH 6.3.3. Actividad fitasas
(anexo A, numeral 27).
•Buffer acetato de Sodio 200 mM, (pH
•4 cajas de agar Petri con agar Pikovskaya 5.0), (anexo B, numeral 21).
(Pikosvskaya, 1948; Novo, 1983), (anexo A,
numeral 28). •Solución de 1 g/L-1 Ácido fítico (Sodium
Salt Phytate, Sigma), (anexo B, numeral 22).
•7 tubos de 16x150 mm, 9 mL de agua
peptonada al 0,1% (m/v), (anexo B, •Mezcla reveladora para fitasas (AAM:
numeral 2). [Link] de Molibdato de amonio 10 mM,
H2SO4 2,5 M y Acetona 100 %), (anexo B,
•Pipeta automática de 100-1000 µL. numera 23).

•Puntas para pipeta automática. •Solución de ácido cítrico 1 M (anexo B,
numeral 24).
•5 rastrillos de vidrio.
•1 tubo de 16 x 150 mm por reacción
•10 g de suelo rizosférico. enzimática.

109
 •Pipeta automática de 100-1000 µL. •Puntas para micropipeta.

•Puntas para pipeta automática. •NaHCO3 0,5 M. (anexo B, numeral 29).

6.3.4. Colonización de hongos formadores de •Solución patrón de KH2PO4 (anexo B,

micorriza arbuscular en raíces. numeral 30).

•Raíces de plantas hospederas de hongos •Reactivo A para cuantificar fósforo (anexo

de micorriza arbuscular. B, numeral 31).

•Bisturí. •Reactivo B (anexo B, numeral 32).

•Pinzas de punta fina. •Celdas de cuarzo.

•Tubos de 50 mL. 6.4. Equipos

•Láminas portaobjetos. •Balanza de tres brazos.

•Laminillas cubreobjetos de 22 x 44 mm. •Incubadora.

•KOH 10% (m/v), (anexo B, numeral 25). •Microscopio óptico.

•H2O2 (10% o 30% v/v), (anexo B, numeral 26). •Agitador horizontal termostatado.

•HCl (1% v/v), (anexo 2, numeral 27). •Baño serológico.

•Azul de tripano (0,05% m/v) https:// •pHmetro.

[Link]/methods/recipes , (anexo
B, numeral 28). •Shaker.

•Polivinil lactoglicerol (PVGL) https:// •Balanza.

[Link]/methods/recipes.
•Espectrofotómetro.
6.3.5. Análisis de fósforo en suelo
•Centrifuga.
•2,5 gramos de muestra (suelo) tamizado
a 2 mm. 6.5. Metodología

•2 erlenmeyer de 100 mL. 6.5.1. Recuento de microorganismos solubilizadores

de fósforo
•2 papel filtro wathman N 42 o similar.
•Pesar 10 g de suelo.
•2 embudos.
•Inocular en 90 mL de medio SMRS1 sin
•8 tubos de vidrio de 25x155 mm. indicador de pH.

•2 balón aforado de 1000 mL. •Incubar a 30ºC durante 2 días.

•1 balón aforado de 250 mL. •A partir del medio realizar diluciones

hasta 10-7.
•2 balón aforado de 200 mL.
•Sembrar en agar SMRS1 con indicador
•Handy-step y 2 jeringas de 50 mL. de pH 0,1 mL las diluciones 10-2 a 10-7.

•Micropipetas de 1000 mL. •Incubar a 30ºC durante 48 horas.

110
 •Realizar el recuento de colonias que 6.5.3. Actividad fitasas
presentan zonas de aclaramiento y
acidificación a su alrededor. Mezcla de reacción:

•Informar el recuento en UFC/g de muestra •1 mL de muestra (blanco, patrón de Pi,

analizada y realizar coloración de Gram y sobrenadante, o extracto enzimático).
azul de lactofenol según el caso.
•4 mL de Buffer Acetato de Sodio 200 mM,
•Sembrar en agar Pikovskaya 0,1 mL de (pH 5.0).
las diluciones 10-2 a 10-7.
•1 g/L-1 Ácido fítico (Sodium Salt Phytate,
•Incubar a 30 ºC durante 48 horas. Sigma).

•Realizar el recuento de colonias que •Incubar la mezcla de reación durante 15

presentan zonas de aclaramiento a su min a 40oC.
alrededor.
•Tomar 500 μL de la mezcla y agregar
•Informar el recuento en UFC/g de muestra inmediatamente a 4 mL de la mezcla
analizada y realizar coloración de Gram y AAM (Revelador), ([Link] de Molibdato de
azul de lactofenol según el caso. amonio 10 mM, H2SO4 2,5 M y Acetona
100%).
6.5.2. Actividad fosfatasa alcalina
•Vórtex durante 15 seg para homogenizar
•Centrifugar 1,5 mL de cultivo bacteriano la muestra y para que se forme el amarillo
a 10000 rpm durante 10 min. del ácido fosfomolíbdico.

•En un tubo limpio colocar 1 mL del •Agregar 400 μL de Ácido Cítrico 1 M

sobrenadante microbiano y 1 mL del (para formar un complejo con el exceso
sustrato p-nitrofenil fosfato (0,025 mM) y 4 de Molibdato).
mL de buffer universal modificado MUB a
pH 11. •En caso de que se forme un precipitado,
centrifugar antes de medir la absorbancia.
•Incubar a 37ºC durante una hora en
agitación contínua. •Medir la Absorbancia a 355 nm y
determinar los μM de fosfato liberado
•Adicionar 4 mL de NaOH (0,5 M) y 1 mL según la curva standard de KH2PO4.
de CaCl2 (0,5 M) para detener la reacción
enzimática. •Para la determinación de los μM de
fosfato liberados se despeja en la curva
•Filtrar el contenido de la reacción a patrón de KH2PO4 y se usa la ecuación 13
través de papel filtro Whatman No. 42. para determinar la actividad enzimática.

•Leer la absorbancia de la muestra a una Unidades µM de fosfato liberado x FD

longitud de onda de λ420 nm. de enzima=
mL (15)x(0,5)

•Transformar los valores a concentración

de p-nitrofenol empleando la ecuación (Ecuación 13)
de la recta obtenida en la curva patrón
(0,01 - 0,06 µmol/L). Donde:

•Calcular la actividad enzimática FD: Factor de dilución

definida como: una unidad fosfatasa
(1UP) es igual a una µmoL min/mL de 15: Tiempo (en minutos) de incubación de la
p-nitrofenol liberado, bajo las condiciones mezcla de reacción para la definición de las
de reacción. unidades enzimáticas.

111
0,5: Volumen (en mililitros) de la enzima Observación de estructuras y cuantificación
usada (sobrenadante del cultivo o extracto del porcentaje de colonización
enzimático).
•Observar la lámina bajo el microscopio
Para la actividad Fitasa, basada en el análisis con el objetivo 10x, moviendo el carro
de Pi liberado, una unidad enzimática (U) se portaobjeto de manera perpendicular.
define como la cantidad de enzima requerida
para liberar 1 μM de Pi del ensayo enzimático •Buscar estructuras como hifas, arbúsculos,
por minuto (i.e. fosfato liberado de todos los enrollados y vesículas. Tomar como referencia
inositoles fosfato presentes). las estructuras presentadas en la figura 15.

6.5.4. Metodología reconocimiento de estructuras •A medida que se mueve el carro

de Micorrizas aclarado y tinción de raíces portaobjeto, en cada campo observado
registrar si hay presencia o no de alguna
• Lavar las raíces y disponerlas en los tubos. estructura de la micorriza arbuscular.

• Adicionar el KOH y llevar los tubos a 90ºC •Calcular el porcentaje de colonización

en el baño termostatado durante 15-25 con la ecuación 14:
minutos (observar frecuentemente las
raíces). Si están claras y el haz vascular es Número de campos
Porcentaje colonizados
visible, pasar al siguiente paso. de colonización Número de campos X 100
=
observados
•Lavar las raíces con agua corriente.
(Ecuación 14)
•Añadir el H2O2 a las raíces durante 10 minutos.
6.5.5. Análisis de fósforo en suelo
•Lavar con agua corriente.
[Link]. Preparación de la muestra
•Acidificar con el HCl por 15 minutos.
•Secar la muestra temperatura ambiente.
•Eliminar el HCl y sin lavar adicionar el azul
de tripano. •Tamizar la muestra a 2 mm.

•Llevar nuevamente los tubos con las [Link]. Procedimiento de extracción

raíces al baño termostatado a 90ºC
durante 10 minutos. •Pesar 2,5 g de la muestra previamente
preparada en un Erlenmeyer de 100 mL, y
•Retirar las raíces y lavar con agua corriente. adicionar 40 mL de extractante.

•Cortar fragmentos de raíz de 2cm. •Agitar en Shaker oscilatorio a 180 rpm

durante 30 min.
•Disponer los fragmentos paralelamente
al lado más corto de la lámina, en el •Transcurrido el tiempo de agitación
portaobjetos. se debe filtrar la solución a través de un
papel filtro Whatman 42 o similar, si el
•Añadir PVGL formando una línea filtrado se ve turbio se debe volver a filtrar.
horizontal delgada sobre las raíces y cubrir
con un cubreobjetos de 22 x 44 mm. •Preparar el blanco de muestra, de
acuerdo a los pasos anteriores con una
solución de extractante sin muestra, cada
15 muestras.

•A partir del filtrado obtenido previamente,

se realiza la determinación de P-Olsen
contenido en la muestra.

112
[Link]. Cuantificación de fósforo disponible 6.6. Referencias
(PO4-), mediante el método P-Olsen.
Alewell, Ch., Ringeval, B., Ballabio, C., et
•Tomar 1 mL de cada estándar, del al. (2020). Global phosphorus shortage
extracto de suelo, o blanco según will be aggravated by soil erosion. Nature
corresponda en un tubo de ensayo de Comunications. [Link]
25x155. s41467-020-18326-7.

•Agregar 12 mL de agua destilada. Alori, ET., Glick BR., Babalola, OO. (2017).
Microbial Phosphorus Solubilization and Its
•Adicionar 2 mL de reactivo de color. Se Potential for Use in Sustainable Agriculture.
sugiere agregar solución de cloro cada Frontiers in microbiology. 8, 971. [Link]
66 muestras. org/10.3389/fmicb.2017.00971.

•Agitar en vortex hasta homogenizar. Bargaz, A., Elhaissoufi, W., Khourchi, S., et
al. (2021). Benefits of phosphate solubilizing
•Dejar 10 min para estabilizar reacción. bacteria on belowground crop performance
for improved crop acquisition of phosphorus.
•Medir la absorbancia a λ= 882 nm, Microbial Research. [Link]
ajustando el cero con el estándar de 0 ppm. micres.2021.126842.

[Link]. Cálculo de la concentración de P-olsen Basilio F., Dias, T., Santana, M., et al. (2022).
en suelo Multiple modes of action are needed to
unlock soil phosphorus fractions unavailable
•Realizar la regresión lineal con los datos for plants: The example of bacteria- and
de la curva de calibración graficando fungi-based biofertilizers. Applied Soil Ecology.
absorbancia vs concentración para hallar [Link]
la ecuación de la recta (y = mx + b)
Behera, BC., Yadav, H., Singh, S., Mishra,
•Reemplazar el valor de absorbancia RR., Sethi, BK., Dutta, SK., Thatoi, HN.
obtenido de la muestra, en la ecuación de (2017). Phosphate solubilization and acid
la recta, siendo este valor correspondiente phosphatase activity of Serratia sp. isolated
a “y” en la ecuación, obteniendo así la from mangrove soil of Mahanadi river delta,
ppm de PO4- presentes en la muestra. Odisha, India. Journal of Genetic Engineering
and Biotechnology. 15(1), 169-178.
•Multiplicar dicho valor por el factor de
dilución, en el caso de que se haya realizado. Bindraban, P., Dimkpa, Ch., Pandey, R.
(2020). Exploring phosphorus fertilizers and
•Restar al valor la concentración obtenida fertilization strategies for improved human
en el blanco. and environmental health. Biology and Fertility
od Soils. [Link]
•Multiplicar dicho resultado por 16, con el 01430-2.
fin de que el resultado sea expresado en
mg PO4-/Kg de suelo (ecuación 15). Blanco-Vargas, A., Rodríguez-Gacha, LM.,
Sánchez-Castro, N., Garzón-Jaramillo, R.,
Pedroza-Camacho, LD., Poutou-Piñales, RA.,
mL extractante
P - olsen (mg/kg) = (a-b) x xD Rivera-Hoyos, CM., Díaz-Ariza, LA., Pedroza-
g mx
Rodríguez, AM. (2020). Phosphate-solubilizing
a = ppm muestra b = ppm blanco Pseudomonas sp. and Serratia sp., co-culture
D = factor de dilución (si aplica) for Allium cepa L. growth promotion. Heliyon
6 (2020) e05218. [Link]
(Ecuación 15) heliyon.2020.e05218.

Blanco-Vargas, A., Rodríguez-Gacha, LM.,

Sánchez-Castro, N., Herrera-Carlosama, L.,

113
Poutou-Piñales, RA., Díaz-Ariza, LA., Gutiérrez- Gerdemann, JW., Nicholson, TH. (1963). Spores
Romero, EV., Rivera-Hoyos, CM., Ardila- of mycorrhizal Endogone species extracted
Leal, LD., Pedroza-Rodríguez, AM. (2021). from soil by wet sieving and decanting.
Bio-inoculant Production Composed by Transactions of the British Mycological Society.
Pseudomonas sp., Serratia sp., and Kosakonia 46, 235–244.
sp.: Preliminary effect on Allium cepa L. growth
at Plot Scale. Universitas Sceitierum. Gianinazzi, S., Gollotte, A., Binet, MN., van
Tuinen, D., Redecker, D., Wipf, D. (2010).
Blanco, A., Chacón, Ma A., Quintero, Ma. Agroecology: The key role of arbuscular
Ca., et al. (2022). Production of pine sawdust mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza.
biochar supporting phosphate‑solubilizing 20, 519–530.
bacteria as an alternative bioinoculant in
Allium cepa L., culture. Scientific Reports. Golroudbary, S., Wali, M., Kraslawski, A. (2020).
[Link] Rationality of using phosphorus primary and
secondary sources in circular economy:
Brundrett, M. (2004). Diversity and classification Game-theory-based analysis. Environmental
of mycorrhizal associations. Biological Reviews. Science and Policy. [Link]
79, 473–495. doi: 10.1017/S14647931030063. envsci.2020.02.004.

Brundrett, MC. (2009). Mycorrhizal associations Hakkou, R., Benzaazoua, M., Bussière, B.
and other means of nutrition of vascular (2016). Valorization of phosphate waste rocks
plants: understanding the global diversity of and sludge from the moroccan phosphate
host plants by resolving conflicting information mines: challenges and perspectives.
and developing reliable means of diagnosis. Procedia Engineering. 138, 110-118, 10.1016/j.
Plant Soil. 320, 37–77. proeng.2016.02.068.

Cuenca, G. (2015). Las micorrizas arbusculares: Hallama, M., Pekrum, C., Lambers, H. (2019).
aspectos teóricos y aplicados. Las micorrizas Hidden miners – the roles of cover crops and
arbusculares: aspectos teóricos y aplicados soilmicroorganisms in phosphorus cycling
(Ediciones IVIC, Ed.). Instituto Venezolano de through agroecosystems. Plant Soil. https://
Investigaciones Científicas (IVIC). Caracas, [Link]/10.1007/s11104-018-3810-7.
Venezuela.
Hyland, C., Ketterings, Q., Dewing, D., Stockin,
Cui, K., Xu, T., Chen, J., et al. (2022). K., Czymmek, K., Albrecht, G., Geohring, L.
Siderophores, a potential phosphate solubilizer (2005). Phosphorus Basics – The Phosphorus
from the endophyte Streptomyces sp. CoT10, Cycle. Nutrient Management Spear Program.
improved phosphorus mobilization for host [Link]
plant growth and rhizosphere modulation. ICONTEC. Norma Técnica Colombiana NTC
Journalof Cleaner Production. [Link] 5842:2018. Bioinsumos para uso agrícola.
org/10.1016/[Link].2022.133110. Inoculantes biológicos. Requisitos. 2018.
Díaz-Ariza, LA., García, A., Sandoval, W.
(2013). Constantino S. Importancia de Jenkins, WR. (1964). A rapid centrifugal-
los microorganismos rizosféricos en la flotation technique for separating nematodes
propagación de especies leñosas. Suelos from soil. Plant disease reporter. 48, 692.
Ecuatoriales. 43, 95-107. Kalayu, G. (2019). Phosphate Solubilizing
Microorganisms: Promising Approach as
Doydora, S., Gatiboni, L., Grieger, K., et al. Biofertilizers. International Journal of Agronomy.
(2020). Accessing Legacy Phosphorus in Soils. [Link]
Soil Systems. doi:10.3390/soilsystems4040074.
Ferrol, N., Azcón-Aguilar, C., Pérez-Tienda, J. Kour, D., Rana, K., Kaur, T., et al. (2021).
(2019). Arbuscular mycorrhizas as key players Biodiversity, current developments and
in sustainable plant phosphorus acquisition: potential biotechnological applications
An overview on the mechanisms involved. of phosphorus-solubilizing and -mobilizing
Plant Science. 280, 441–447. microbes: A review. Pedosphere. doi:10.1016/
S1002-0160(20)60057-1.

114
Naves, L., Rodrigues, PB., Bertechini, AG., level classification of the Fungi and a tool
Corrêa, AD., de Oliveira, DH., de Oliveira, for evolutionary ecological analyses. Fungal
EC., Duarte, WF., da Cunha, MR. (2014). Diversity. 90, 135-159.
Comparison of methodologies to quantify
phytate phosphorus in diets containing Tian, J., Ge, F., Zhang D., et al. (2021). Roles
phytase and excreta from broilers. Asian- of Phosphate Solubilizing Microorganisms
Australasian journal of animal sciences. from Managing Soil Phosphorus Deficiency to
27(7), 1003–1012. [Link] Mediating Biogeochemical P Cycle. Biology.
ajas.2013.13538. [Link]

Novo, R., Quintana, E., Valdés, R. (1983). Turner, BL., Raboy, V. (2019). Phosphorus cycle.
Prácticas de microbiología. Primera edición. Access Science. Retrieved June 16, 2020, from
Instituto Superior de Ciencias Agropecuarias [Link]
de La Habana. Facultad de Agronomía.
Cuba. 47. Van der Heijden, MGA., Martin, FM., Selosse,
MA., Sanders, IR. (2015). Mycorrhizal ecology
Ortega y Martinez. (2019). Sustainable Use and evolution: the past, the present, and the
of Animal Slurries in Chile. (2019). Journal of future. New Phytologist. 205, 1406–1423.
Dairy, Veterinary & Animal Research. 13(2).
Phillips, JM., Hayman, DS. (1970). Improved Wahid, F., Fahad, S., Danish S., et l.
procedures for clearing roots and staining (2020). Sustainable Management with
parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal Mycorrhizae and Phosphate Solubilizing
fungi for rapid assessment of infection. Bacteria for Enhanced Phosphorus Uptake
Transactions of the British Mycological Society. in Calcareous Soils. Agriculture. doi:10.3390/
55, 158–161. agriculture10080334.

Pikovskaya, RI. (1948). Mobilization of

phosphorus in soil connection with the
vital activity of some microbial species.
Mikrobiologiya. 17, 362-370.

Pen, Ch and Camberato, J. (2019). Critical

Review on Soil Chemical Processes that
Control How Soil pH A_ects Phosphorus
Availability to Plants. Agriculture. doi:10.3390/
agriculture9060120.

Shaw, A and Cleveland C. (2020). The effects

of temperature on soil phosphorus availability
and phosphatase enzyme activities: a cross-
ecosystem study from the tropics to the Arctic.
Biogeochemistry. [Link]
s10533-020-00710-6.

Smith, SE., Read, DJ. (2008). Mycorrhizal

Symbiosis. Third edit. Academic Press.

Stevenson, FJ., Cole, MA. (1999). Cycles of

Soil: Carbon, Nitrogen, Phosphorus, Sulfur,
Micronutrients. 2nd. Edition. New York Wiley.
427.

Tedersoo, L., Sánchez-Ramírez, S., Koljalg,

U., Bahram, M., Döring, M., Schigel, D., May,
T., Ryberg, M., Abarenkov, K. (2018). High-

115
116
Capítulo 7
CICLO DEL AZUFRE

117
118
Capítulo 7

CICLO DEL AZUFRE

Claudia Marcela Rivera Hoyos, Viviana Gutiérrez Romero, René Novo,
María Mercedes Martínez, Camilo Jiménez.

7.1. Introducción El ciclo del azufre es complejo, debido a que

este elemento presenta un amplio rango
El Azufre (S) es uno de los elementos más de estados de oxidación que va desde -2
abundantes sobre la tierra, y es un elemento (completamente reducido), como el sulfuro
esencial para los organismos vivos (Novo, - H2S, hasta +6 (completamente oxidado),
1983) y se encuentra principalmente en como el sulfato – SO4. Así mismo, el azufre
forma de pirita (FeS2) o yeso (CaSO4) en puede ser transformado tanto biológica
rocas y sedimentos y como sulfato (SO4) en como químicamente en la naturaleza.
los océanos. Es requerido para la formación Adicionalmente, el ciclo del azufre se
de proteínas, grupos prostéticos, y recursos encuentra estrechamente relacionado
de las fitoquelatinas como alinas en cebolla con otros ciclos, como los del carbono y el
o ajo o glucosinolatos en repollo), polímeros nitrógeno (Liu et al., 2021; Grubba et al.,
y enzimas como ferrodoxinas o nitrogenasa 2022). Los microorganismos juegan un papel
que dependen para su acción catalítica de fundamental en las transformaciones de
la presencia de grupos –SH. En el ambiente azufre, donde, por ejemplo, el azufre que está
se encuentra tanto en suelo, como agua y presente en la atmosfera como SO4, producto
atmósfera. En suelo y agua se encuentra en de la oxidación de compuestos reducidos (ej.
forma orgánica e inorgánica, siendo esta H2S) puede ser reducido por microorganismos
última la más abundante pero no disponible para producir nuevamente H2S proceso
(Liu et al., 2021). que se lleva a cabo principalmente por

119
las bacterias sulfato reductoras (BSR) que et al., 2021). Así mismo, en el proceso de
pueden usar el SO4 como aceptor final de reducción en condiciones de bajas tensiones
electrones (respiración anaeróbica de SO4) en de O2, se destacan microorganismos como
la degradación de materia orgánica (Muyzer Desulfovibrio spp., Desullfobacter spp.,
& Stams, 2008; Wu et al., 2021). Por otra parte, Desulfococcus spp., etc (Zhang et al., 2022).
el sulfuro (H2S) producido por las BSR puede En la figura 16 se presenta el esquema general
usarse en procesos de oxidación por bacterias del ciclo del azufre. Estas bacterias, aunque se
quimiolitótrofas para la generación de encuentran en el suelo, participan en procesos
energía (desasimilación), produciendo azufre ambientales en condiciones extremas, como
elemental (S0) y SO4, este último, puede ser volcanes, fuentes termales, profundidades de
asimilado por plantas o retenido en depósitos los océanos o sistemas agrícolas anaeróbicos
sedimentarios en el mar (Jorgensen et al., (arroz bajo inundación). Igualmente son muy
2021; Wu et al., 2021). En el ciclaje de azufre, importantes en los procesos de corrosión
las bacterias rojas y verdes del azufre, en biológica de materiales, que ocasionan
condiciones anaeróbicas, realizan el proceso pérdidas importantes en la industria petrolera,
de fotosíntesis anoxigénica, utilizando el SO4 de la construcción, naval y participan en
como aceptor de electrones. Igualmente, los procesos de biodeterioro de materiales
en el ciclo del azufre se destacan bacterias expuestos al aire libre (biodeterioro de
quimioheterótrofas oxidadoras, empleadas monumentos y estructuras metálicas), (Lou et
en los procesos de biolixiviación de metales, al., 2021).
como Thiobacillus, Thiotrix y Thiospira (Nguyen

Figura 16.
Estructuras intraradicales de hongos formadores de micorriza arbuscular con un aumento de 40x.

SO4
Atmósferica

Azufre Orgánico
reducido

Plantas Animales
FIJACIÓN
Thiobacillus sp

Desulfovibrio sp Microorganismos

SO4 REDUCCIÓN H2S

Descomposición
Combustión
S Mineria
Fotosíntesis
Desulfovibrio sp Anoxñigenica Meteorización
Vulcanismo
Industria
Erosión

Sulfobacterias
Microorganismos

Depósitos Sulfuros
Sedimentarios Metalicos
Carbones

Cortesía de Lucas David Pedroza Camacho.

120
La columna de Winogradsky es un modelo inicia con los productores primarios, los cuales
de ecosistema microbiano preparado por usan la luz como fuente de energía quienes
adición de sedimentos en un cilindro con favorecen el establecimiento de un ecosistema
suplementos adicionales e incubado con microbiano estructurado en el que ocurren
luz (Pérez and Guzmán 2020; Suleiman et al., procesos fundamentales para mantener el
2021). A lo largo del tiempo se desarrollan ciclaje de todos los nutrientes (Babcsányi
gradientes ambientales que facilitan la et al., 2017; Sujata and Nandkumar 2022).
conformación de diferentes nichos y a su Aunque la columna de Winogradsky se usa
vez enriquecen y permiten el desarrollo de principalmente con fines pedagógicos para
grupos específicos de bacterias (Figura 17). estudiar la diversidad microbiana y el ciclaje de
Este medio enriquecido puede ser empleado nutrientes, tiene numerosas aplicaciones como
para el estudio de comunidades microbianas el enriquecimiento de cultivos, aislamiento de
en suelo, sedimentos, sistemas de manglar nuevos microorganismos, biorremediación y la
o cultivos bajo inundación como el arroz, la generación de biohidrógeno, además de ser
estructura y su función (Novo, 1983; Esteban un modelo útil para estudiar la influencia del
et al., 2015; Sujata and Nandkumar 2022). ambiente en la estructura de las comunidades
En la medida que el tiempo transcurre, microbianas, ya que las comunidades más
gracias a la actividad microbiana se complejas se pueden mantener o manipular en
establecen gradientes de O2 y nutrientes a condiciones de laboratorio cuidadosamente
lo largo de la columna, resultando en una controladas (Esteban et al., 2015; Sujata and
multitud de nichos para el crecimiento de Nandkumar 2022).
los microorganismos. La dinámica ecológica

Figura 17.
Sistemas de transformación bifásica para el estudio de ciclo del azufre en la columna de
Winograsdky. La columna de Winogradsky representa el comportamiento ecológico de las
comunidades microbianas en ambientes estratificados donde se establecen gradientes
de nutrientes, oxígeno y luz. Es un modelo útil para estudiar la influencia del ambiente en la
estructura de las comunidades, ya que las más complejas se pueden mantener o manipular en
condiciones de laboratorio cuidadosamente controladas.

Thiobacillus

Zona aeróbica

Zona microaerofílica
Cristales de
Acidófilos Neutrófilos
(HFe(SO4)2(OH6)

Bacterias Sulfato reductoras

Zona anaeróbica

Crecimiento de BSR
Caldo API
en Caldo API
Cortesía de Claudia Marcela Rivera Hoyos.

121
 7.1.1. Reacciones de óxido-reducción asociadas
al ciclo del Azufre: Columna de Winogradsky,
como modelo

Como se mencionó anteriormente, uno de los

mecanismos para evidenciar el crecimiento
de microorganismos involucrados en la
transformación del azufre, es la columna de
Winogradsky. Esta columna es un ecosistema
que simula una columna de lodo y agua con
gradiente de oxígeno que recibe luz, donde
se desarrollan bacterias fotoautotróficas
y heterótrofas. La altura de la columna
permite el desarrollo de una zona aeróbica
en la superficie del lodo, de una zona
microaerofílica en la parte media, y de una
zona anóxica en la parte inferior (Figura 17).
La columna se expone a la luz de manera
que diversas poblaciones fotosintéticas se
desarrollan a diferentes profundidades (Yaşa
et al., 2006; Fernández-Rendón et al., 2021). El
lodo o sedimento presente, contiene sustratos
de carbono orgánico, sulfuro y sulfatos.
Esto permite el desarrollo de numerosas
poblaciones heterótrofas y fotoautótrofas,
entre las cuales se encuentran bacterias
anaerobias y fotosintéticas del azufre
(Khasimov et al., 2021). Las cianobacterias
y algas (microorganismos fotosintéticos
oxigénicos) crecen en la superficie
aeróbica, el oxígeno producido por estos
organismos mantiene una zona aeróbica
en la que pueden desarrollarse poblaciones
heterótrofas aerobias de bacterias y hongos
(Khasimov et al., 2021; Fernández-Rendón et
al., 2021).

La concentración de oxígeno disuelto en

el sistema disminuye conforme se gana en
profundidad, de forma que la capa de agua
inmediatamente por encima del sedimento
tiene una concentración de oxígeno baja y
recibe H2S que difunde desde el sedimento
como producto del metabolismo de las
bacterias sulfato reductoras. Esta zona es
ideal para el crecimiento de Beggiatoa y
Thiobacillus que son aerobios oxidadores de
sulfuro (Khasimov et al., 2021; Fernández-
Rendón et al., 2021). La parte superior de la
columna adquiere tonos marrón-rojizo debido
al crecimiento bacterias Rodospiraláceas,
fotoheterótrofos anaerobios no del azufre
que utilizan compuestos orgánicos reducidos
como donadores de electrones. Por debajo
de éstos, se desarrollan las bacterias rojas

122
del azufre (Cromatiáceas) las cuales oxidan Las bacterias sulfato reductoras poseen la
el sulfuro dando a la zona una coloración desulfoviridina, una sulfatorreductasa que se
roja vivo (Fernández-Rendón et al., 2021). encuentra en algunos de los géneros y sirve
Aún más abajo, una capa verdosa indica para identificarlas mediante la adición de
el crecimiento de bacterias verdes del NaOH y el sometimiento del caldo a Luz UV
azufre (Clorobiáceas), estas bacterias son a 366 nm (Figura 18), (Yaşa et al., 2006; Zhang
anaerobias estrictas, que llevan a cabo el et al., 2022).
metabolismo fotoautótrofo y fotoheterótrofo
usando sulfuro y azufre como donadores
de electrones. Los sulfuros producidos por el
Una capa verdosa
metabolismo de los reductores del sulfato son indica el crecimiento
utilizados por las bacterias fotosintéticas del
azufre verdes y rojas. La zona de color negro de bacterias verdes del
intenso que se extiende hacia arriba desde
el fondo de la columna denota la actividad azufre (Clorobiáceas),
de los reductores de sulfato (Desulfovibrio,
Desulfotomaculum, etc.), (Zhang et al., 2022). estas bacterias son
El color negro se debe a los sulfuros metálicos,
principalmente sulfuros ferrosos (FeS), (Bottrell anaerobias estrictas.
and Newton, 2006).

Figura 18.
Enriquecimiento de bacterias oxidadoras de azufre en medios para Thiobacillus nutrófilos y
Thiobacillus acidófilos y número más probable de bacterias sulfato reductoras (BSR) en caldo API
y Thiobacillus. Cortesía de Claudia Rivera Hoyos.

Cultivo bacterias sulfato reductoras y sulfuro oxidadoras Bacterias sulfato oxidadoras neutrófilas y acidófilas

Bacterias sulfato reductoras (BSR) BSR productoras de Desulfoviridna (sulfito reductasa)

Cortesía de Claudia Rivera Hoyos

123
7.1.2. Corrosión electroquímica a la velocidad total de reducción, dicho
de otra manera, los electrones generados
La corrosión electroquímica se puede en la oxidación se deben consumir en la
definir como el deterioro de un metal como reacción (Callister, 2000). Como presencia
consecuencia de un ataque químico debido de la oxidación, los iones metálicos pueden
a que tienen electrones libres y son capaces incorporarse a la disolución, o pueden formar
de establecer pilas electroquímicas dentro componentes con elementos no metálicos
de su estructura (Parra y Martínez, 2003), (Callister, 2000).
(Figura 19).
En el suelo, sistemas hidráulicos o marinos, por
La corrosión electroquímica es un proceso su contenido de humedad variable, sales y
espontáneo, que implica la existencia de materia orgánica en descomposición, puede
una zona anódica, que sufre corrosión, una ocurrir el proceso, siendo el agua la que
zona catódica y un electrolito, además de actúa como electrolito. La corrosión de este
una unión eléctrica entre ánodos y cátodos sistema se debe principalmente a los procesos
(Parras y Martínez, 2003). La reacción de degradación observados en estructuras
electroquímica total consiste en la suma de las enterradas, la intensidad dependerá de
reacciones de óxido-reducción y no puede factores como el contenido de humedad, pH,
resultar acumulación de iones, es decir, la presencia de microorganismos, composición
velocidad total de oxidación debe ser igual química, entre otros (Parra y Martínez, 2003).

Figura 19.
Sistema in vitro para la evaluación de corrosión electroquímica.

Fuente
de tensión

Amperímetro

Fe Cu

Electrólisis
y corrosión

Cortesía de Luis Camilo Jimenez.

124
7.2. Objetivos •Puntilla de hierro.

Objetivos generales •Vinilpel o petrifilm.

•Evaluar in vitro el comportamiento •Tiras indicadoras de pH.

de las bacterias responsables de la
transformación biológica del azufre, •Frasco de vidrio de 50 mL.
empleando como modelo la columna de
Winogradsky. •Pipetas de 1 mL.

•Evaluar in vitro un proceso de corrosión •Aceite de inmersión.

electroquímica.
•Agua destilada.
Objetivos específicos
•Colorantes de Gram.
•Realizar el montaje de la columna de
Winogradsky empleando lodos y agua •0,5 g CaSO4.
proveniente de ecosistemas anaeróbicos
o facultativos. •0,5 g CaCO3.

•Evaluar en función del tiempo las 7.3.2. Número más probable para bacterias
sucesiones microbianas implicadas en las sulfato reductoras
etapas reactivas y oxidativas del ciclo del
azufre. •1 pipeta de 1mL.

•Determinar el NMP/mL de bacterias •1 frasco Schott de 250 mL con 90 mL de

sulfato reductoras valorando la presencia solución salina al 0,85 % (m/v), (anexo B,
de FeS y desulfoviridina. numeral 1).

•Pre enriquecer y observar en medios •9 tubos de 16x150 mm tapa rosca con 9

líquidos las reacciones in vitro desarrolladas mL de medio API (anexo A, numeral 29).
por bacterias del género Thiobacillus
acidófilos y Thiobacillus neutrófilos. •Campana de anaerobiosis.

•Evaluar el efecto de la corriente eléctrica •1 sobre de Gas-Pak o AnareroGen®.

sobre un material metálico.
•1 sobre de indicador de óxido-reducción
•Evaluar el efecto de la corriente eléctrica resarzurina.
y sales sobre un material metálico.
7.3.3. Enriquecimiento de Thiobacillus
7.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo
•2 tubos de 16 x 150 mm con 10 mL de
7.3.1. Montaje de columnas de Winogradsky medio Thiobacillus acidófilos (anexo A,
numeral 30).
•Lodos de alcantarilla o de humedal.
•2 tubos de 16 x 150 con 10 mL de
•Papel periódico picado sin tinta. medio Thiobacillus neutrófilos (anexo
A, numeral 31).
•Agua residual.
•2 pipetas de 0,1 mL.
•Columnas de vidrio o acrílico de 50 cm
de alto por 19 cm de ancho. Sellada en •Tiras indicadoras de pH.
unos de sus extremos para que puede
adicionarse los lodos y el agua.

125
7.3.4. Corrosión electro química •Realizar una vez a la semana, coloración
de Gram de la zona baja, media y alta.
•1 puntilla de hierro.
•Observar al microscopio en el objetivo 100x.
•1 alambre de Cobre No. 12.
7.5.2. Número más probable para bacterias
•Beaker de 500 mL con agua. sulfato reductoras

•Sal de cocina. •Tomar 10 g o 10 mL de lodo de la columna

de la parte media baja.
•Agua.
•Transferirlos a un frasco Schott de 250 mL
7.4. Equipos que contiene 90 mL de solución salina al
0,85 % (m/v).
•Incubadora.
•Homogenizar la muestra que corresponde
•Balanza de tres brazos. a la dilución 10-1.

•Lámpara de luz ultravioleta de 366 nm. •Realiza diluciones seriadas 10-2 y 10-3.

•Voltímetro. •Transferir 1 mL de cada dilución a cada

uno de los tubos de 16x150 tapa rosca
•Amperímetro que contiene el caldo API.

•Balanza de tres brazos. •Colocar los tubos en la campana de

Anaerogen®.
•Sensor de pH.
•Colocar el sobre con el catalizador
•Lámpara de luz visible o fluresente o dentro de la campana.
cintillas LED pegadas al cilindro de vidrio
o acrílico •Cerrar herméticamente la campaña.

7.5. Metodología •Incubar los tubos por 15 días a 19ºC.

7.5.1. Montaje de columnas de Winogradsky •Retirar los tubos de la campana y

colocarlos en una gradilla de acuerdo
•Adicionar el papel periódico picado con la dilución.
en el fondo de los cilindros de vidrio o
acrílico que funciona como columnas de •Realizar la lectura de los tubos que
Winograsdky. presenten color negro por la producción
de sulfuro del hierro (Fe2S).
•Adicionar el lodo hasta 2/3 del frasco de
la columna. •Registrar el número de tubos positivos
por dilución y buscar la combinación
•Adicionar 200 mL de agua residual de tubos en la tabla para número más
doméstica. probable para serie de tres tubos.

•Adicionar el CaSO4 y CaCO3. •El resultado se reporta como NMP/g o

NMP/mL para bacterias sulfato reductoras.
•Cubrir con vinipel la boca del frasco.
•Colocar los tubos positivos en una zona
•Iluminar con lámpara durante 1 - 1,5 meses. oscura y exponerlos a la luz ultravioleta a
366 nm.
•Con tiras indicadoras, medir una vez por
semana el pH de la zona baja, media y alta.

126
 •Registrar el número de tubos positivos que •Encender la fuente eléctrica y ajustar a 6
presenten fluorescencia roja, asociada voltios.
con la producción de sulfoviridina.
•Observar y anotar los cambios ocurridos
•Registrar el número de tubos positivos en el transcurso de 30 minutos.
por dilución y buscar la combinación de
tubos en la tabla para el número más •Pesar la puntilla nuevamente.
probable para serie de tres tubos.
•Al ponerse en contacto el soluto con las
•El resultado se reporta como NMP/g moléculas de agua se disminuye la fuerza
o NMP/mL para bacterias sulfato de atracción entre los iones de sal y a
reductoras productoras de sulfoviridina su vez los dipolos del agua son atraídos
asociados posiblemente con el género por ellos rodeándolos y removiendo los
de Desulfovibrio spp. iones que están en la superficie del cristal
impidiendo que vuelvan al mismo y así
7.5.3. Enriquecimiento de Thiobacillus spp. se van difundiendo por todo el solvente
hasta llegar a disolverse por completo. Al
•Extraer 5 mL del líquido presente en la disociarse el NaCl cada ion va a reaccionar
zona alta de la columna. con el hierro formando color verde oscuro
difuminado por todo el beaker debido a
•Incubar en oscuridad, a 28°C durante las siguientes reacciones:
2 semanas.
Fe + NαCl FeCl + Nα+
•Lectura para Thiobacillus acidophilus,
el hierro férrico (Fe3+) forma un complejo
sulfato mineral [Hfe(SO4)2(OH6)], observar Fe + NaCl → FeCl + Na+ (Ecuacion 16)
turbidez en el medio, a causa del Na+ + H2O → NaOH + H2 (Ecuacion 17)
crecimiento de los microorganismos 3Fe + 4H2O → Fe3O4 + 4H2 (Ecuacion 18)
Fe+3 + OH- → FeOH (Ecuacion 19)
•Medir pH, realizar coloración de Gram, y El Fe+3(OH)3 se deshidrata, y forma Fe+2(OH)2
observar al microscopio.
(Ecuacion 20)
•Lectura para Thiobacillus neutrophilus el
medio contiene tiosulfato (S2O3) que se
rompe a sulfito (SO3 2+) con producción de •Es así que estas reacciones se presentan
ATP, y el otro átomo de azufre se convierte simultáneamente y el Fe+3(OH) forma
en S0 insoluble, observar turbidez en el el color amarillo junto con el Fe3O4.
medio, a causa del crecimiento de los Igualmente, se presenta una coloración
microorganismos. negra debido a la formación de Fe+2(OH)2,
y presencia de burbujas debido al
•Medir pH, realizar coloración de Gram, y desprendimiento de H2 en las reacciones.
observar al microscopio Finalmente, se logrará reducir el peso de
la puntilla, de manera proporcional a la
7.5.4. Corrosión electroquímica. cantidad de NaCl añadida al comienzo
de la práctica, infiriéndose de esta
•Adicionar 20 g de sal en el frasco de manera que hubo corrosión del hierro.
precipitado que contiene agua y disolver.
7.6. Referencias
•Pesar la puntilla de hierro antes de iniciar
el proceso. Babcsányi, I., Meite, F., Imfeld, G. (2017).
Biogeochemical gradients and microbial
•Conectar la puntilla al ánodo, y el communities in Winogradsky columns established
alambre al cátodo de la fuente de poder. with polluted wetland sediments. FEMS
microbiology ecology. 93(8), 10.1093/femsec/
fix089. [Link]

127
Bottrell, SH., Newton, RJ., (2006). Reconstruction Novo, R., La Vida Microbiana en el suelo. La
of changes in global sulfur cycling from marine Habana, Cuba: Instituto Superior de Ciencias
sulfate isotopes. Earth-Science Reviews. 75,59– 83. Agrarias.

Callister, W. (2000). Ciencia e Ingeniería de los Parra, A., Martínez, M. (2003). Influencia de
materiales. Editorial Reverté. Barcelona, España. 67. los microorganismos en la corrosión del acero
Esteban, DJ., Hysa, B., Bartow-McKenney, al carbono enterrado. Trabajo de grado.
C. (2015). Temporal and Spatial Distribution Microbiología Industrial. Pontificia Universidad
of the Microbial Community of Winogradsky Javeriana. 89.
Columns. PloS one. 10(8), e0134588. https://
[Link]/10.1371/[Link].0134588. Pérez, M and Guzmán R. (2020).
Microorganisms on StageWinogradsky
Fernández, C.l., Barrera, G., Romero, H., et al. columns as performative displays in art and
(2021). Influence of the cellulose and sulfate ratio science. Performance Research a Journal of
on voltage generation inWinogradsky columns. the Performing Arts. http: //[Link]/10.1080
Revista Mexicána de Inegenieria Química. /13528165.2020.1807748.
[Link]
Sujata, D and Nandkumar, K. (2022). Use
Grubba, D., Yin, Z., Majtacz, J., et al. (2022). of the Modified Winogradsky Microcosm
Incorporation of the sulfur cycle in sustainable Technique to Help in Building an Indigenous
nitrogen removal systems - A review. Journal of Culture. Collection of Iron and Sulphur
Cleaner Production. [Link] Bacteria Valuable in Green Synthesis of
jclepro.2022.133495. Gold Nanoparticles. Ecology Environmental
and Conservation. [Link]
Jorgensen, B., Findaly A., Pellerin A. (2019). EEC.2022.v28i01s.034.
The Biogeochemical Sulfur Cycle of Marine
Sediments. Frontiersin Microbiology. doi: Suleiman, M., Choffat, Y., Daugaard U., et
10.3389/fmicb.2019.00849. al. (2021). Large and interacting effects of
temperature and nutrient addition on stratified
Khasimov, M., Laurinavichene, T., Petushkova, microbial ecosystems in a small, replicated,
E., et al. (2021). Relations between Hydrogen and liquid-dominated Winogradsky column
and Sulfur Metabolism in Purple Sulfur Bacteria. approach. Microbiology Open. [Link]
Mikrobiologiya. 90(5): 515-530. org/10.1002/mbo3.1189.

Liu, Lu., Xie, G., Xing, D., et al. (2021). Sulfate Yaşa, İ., Çadırcı, B., Koçyigit, A., Öztürk, T.
dependent ammonium oxidation: A microbial (2006). Enrichment and Isolation of Anoxygenic
process linked nitrogen with sulfur cycle and Phototrophic Bacteria in Winogradsky
potential application. Environmetal Research. Column. E.U. Journal of Ficheries & Aquatic
[Link] Science. 23, 71-73.
Lou, Y., Chang, W., Cui, T., et al. (2021).
Microbiologically influenced corrosion Wu, B., Liu, F., Fang, W., et al. (2021). Microbial
inhibition mechanisms in corrosion protection: sulfur metabolism and environmental
A review. Bioelectrochemistry. [Link] implications. Science of The Total
org/10.1016/[Link].2021.107883. Environment. [Link]
scitotenv.2021.146085.
Muyzer, G., & Stams, AJ. (2008). The ecology
and biotechnology of sulphate-reducing Zhang, Z., Zhang, C., Yang, Y., et al. (2022).
bacteria. Nature reviews. Microbiology, 6(6), A review of sulfate-reducing bacteria:
441–454. [Link] Metabolism, influencing factors and
application in wastewater treatment.
Nguyen, T., Won, S., HA, M., et al. (2021). Bioleaching Journal of Cleaner Production. [Link]
for environmental remediation of toxic metals org/10.1016/[Link].2022.134109.
and metalloids: A review on soils, sediments,
and mine tailings. Chemosphere. [Link]
org/10.1016/[Link].2021.131108.

128
129
130
Capítulo 8
TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

131
132
Capítulo 8

TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

Aura Marina Pedroza-Rodríguez, Lucas David Pedroza Camacho. Juan Felipe Mateus.
Juan Camilo Lores Acosta. Nicolas Yuseb Bulla. Nelson Alejandro Amaya Orozco;
Juan Carlos Salcedo Reyes, Claudia Rivera Hoyos. Adriana Ines Páez Moraeles.
Fidson-Juarismy Vesga Pérez.

8.1. Introducción A nivel internacional los diferentes países

también cuentan con una normatividad
El agua residual es cualquier tipo de agua ambiental rigurosa para aguas residuales,
cuyas características físicas, químicas reutilización de las mismas y para aguas
y microbiológicas se modificaron o potables. En Estados Unidos la Agencia de
alteraron por la influencia antropogénica Protección Ambiental (EPA) es la responsable
(Thanigaivel et al., 2022). El agua residual de administrar, implementar y hacer cumplir
puede ser clasificada según su origen las leyes ambientales. En especial la ley
como aguas residuales domésticas (ARD) Federal de Agua Limpia (Clean Water Act), la
y aguas residuales no domésticas (ARnD); cual regula, controla la contaminación de las
dependiendo la actividad agro-industrial o aguas y desarrolló los estándares nacionales
de servicios, sus características físicas, química para la calidad del agua y los límites de
y microbiológica cambian, generando descarga de aguas residuales a aguas
diferentes impactos ambientales si no son navegables (EPA, 2020).
tratadas antes de realizar el vertimiento a los
sistemas de alcantarillado, cuerpos de agua La Ley de Agua Limpia también prohíbe
superficiales de agua dulce o agua marína derramamientos potencialmente dañinos
(Ministerio del Medio Ambiente y Desarrollo de aceite y de ciertas sustancias peligrosas.
Sostenible, 2015; Ministerio del Medio Estos estándares son controlados tanto a nivel
Ambiente y Desarrollo Sostenible, 2018). nacional como estatal. Adicionalmente, la

133
EPA, a través del Título 40, partes 401 a 471, enorme esfuerzo por evitar que lleguen a ríos,
del Código de Regulaciones Federales (cfr lagos o mares sin un tratamiento previo, al
por sus siglas en inglés), promulgó las Guías igual que la variedad de contaminantes que
y Normas de Descarga de Efluentes (Effluent pueden estar presentes en estos subproductos
Guidelines and Standards) para 56 tipos de líquidos también existe una variedad de
industria (EPA, 2020). impactos negativos que derivan del vertido sin
tratamiento previo a cuerpos de agua como,
En la Comunidad Europea la normatividad disminución de la calidad eco sistémica,
esta dada por Directiva 2000/60/CE, la cual cambios en las calidades fisicoquímicas y
establece el marco comunitario de actuación microbiológicas, olores ofensivos, muerte de
en el ámbito de política de aguas superficiales especies especialmente sensibles a cambios,
continentales, aguas de transición, aguas etc (Sánchez et al., 2018; Ahmad et al., 2019).
costeras y subterráneas. Adicionalmente,
establece los procedimientos que deberán Independiente del origen del agua residual
seguir los estados miembros de la Unión (doméstica, no doméstica industrial y no
Europea para el establecimiento de las doméstica agroindustrial), se debe realizar un
normas de calidad química. Esta directiva tratamiento antes del vertimiento y buscar la
tiene por objeto lograr la eliminación de posibilidad de re uso en diferentes sectores
todas las sustancias peligrosas prioritarias y productivos (Puentes et al., 2021; Chen et
contribuir a conseguir concentraciones en al., 2022). Por lo tanto, debe cumplir con los
el medio acuático cercanas a los valores estándares para vertimiento y re uso. Es por
básicos para las sustancias de origen natural. esto que los sistemas de tratamiento para
aguas pueden tener diferentes mecanismos
En relación del uso del agua residual tratada que van desde el tratamiento in situ por
para riego en agricultura o también llamado medio de sistemas tratamiento unificados
reutilización de aguas; existen dos referentes específicos para cada vertimiento o bien
internacionales. Por un lado, está la escuela pueden ser transportados por líneas de
del estado de California, con el Título 22, tuberías que conducen el vertimiento a un
que ha sido la base de las recomendaciones tren de tratamiento más especializado, es de
de la Agencia de Protección Ambiental de gran importancia que este tipo de vertimientos
los Estados Unidos (2021). Por otro, están las cumplan concentraciones óptimas para su
directrices de la Organización Mundial de la descarga (Chen et al., 2022). Sin importar
Salud (OMS. 1989). El Título 22 busca disminuir el su naturaleza se encuentran sujetos a
riesgo en la población involucrada en el reuso regulaciones legales locales, departamentales
y al emplearla a su vez no se generen nuevos y nacionales (MADS, 2015; Pedroza et al.,
impactos ambientales. Por el contrario, la 2018). En una estación depuradora básica se
OMS ha centrado sus directrices en estudios llevan a cabo las etapas de pre tratamiento,
de cuantificación del peligro microbiológico tratamiento primario, tratamiento secundario y
y estudios epidemiológicos para garantizar tratamiento terciario. Con manejo interno de
un riesgo tolerable que puede estar entre 10-6 la línea de aguas (afluentes contaminados),
y 10-4, lo que implica que sólo una persona línea de lodos (subproductos del tratamiento
en un millón de casos o una en 10 000 se del agua de tipo primario y secundario) y
vea afectada en su salud por una actividad la línea de gases (productos gaseosos de la
de reúso (Campos y Saconi, 2014; Weber y línea de lodos cuando son estabilizados por
Campos, 2016). vía anaeróbica (Pedroza et al., 2018; Rivera
et al., 2018; Céspedes et al., 2021). En la tabla
8.1.2. Tratamiento de aguas residuales 7 se presentan la descripción de las etapas
de tratamiento, tecnologías empleadas y
El tratamiento de aguas residuales presenta que tipo de contaminante que se elimina.
una gran relevancia frente a las problemáticas Adicionalmente, en la figura 20 se presenta el
ambientales de los recursos hídricos a escala esquema general de una planta de tratamiento
global, estos subproductos líquidos pueden básica para aguas residuales industriales.
ser generados normalmente por sectores
domésticos, industriales y comerciales, en
condiciones muy variadas lo que supone un

134
 Tabla 7.
Operaciones unitarias para plantas de tratamiento de aguas residuales.

Etapas de tratamiento
Contaminante que
y unidades Definición Referencia
reducen/ eliminan
representativas
Tratamiento primario

Operación física que

Sólidos de gran
Rejillas de desbaste elimina sólidos por
tamaño que generan Ramírez et al., 2019
grueso, medio y fino separación diferencial
obstrucción
de tamaño

Operación física
que elimina sólidos
Sólidos sedimentables
Desarenado inorgánicos por Sánchez et al., 2018
de tipo inorgánico
diferencia de
densidad
No elimina ningún
contaminante,
permite reducir
la variación de
Operación física
carga y caudal que
Igualación/ que permite ajustar Pedroza et al., 2018
entra al sistema de
neutralización los caudales, Sánchez et al., 2018
tratamiento, es usado
temperatura y pH
por lo general como
sistema preventivo
previo al tratamiento
biológico
Operación física
que elimina
Sedimentación Sólidos sedimentables
sólidos orgánicos Sánchez et al., 2018
primaria de tipo inorgánico y
e inorgánicos por Guo et al., 2014
convencional orgánico
diferencia de
densidad
Proceso Físico que
elimina grasas
Desengrasado/ Sánchez et al., 2018
y aceites por la Grasas y aceites
desaceitado Guo et al., 2014
diferencia de
densidad y flotación

Independiente del origen del agua residual (doméstica,

no doméstica industrial y no doméstica agroindustrial),
se debe realizar un tratamiento antes del vertimiento y buscar
la posibilidad de re uso en diferentes sectores productivos

135
Etapas de tratamiento
Contaminante que
y unidades Definición Referencia
reducen/ eliminan
representativas
Tratamiento secundario
Proceso biológico en
presencia de oxígeno Materia orgánica
Reactores aeróbicos
como aceptor final expresada como
con biomasa en
de electrones que DQO, DBO5, Guo et al., 2014
suspensión
utiliza diferentes nitrógeno orgánico, Puentes et al., 2021
Reactor de lodos
comunidades fósforo orgánico y
activados
microbianas en sólidos disueltos
suspensión
Proceso biológico en
presencia de oxígeno
Reactores aeróbicos
como aceptor final Materia orgánica
con biomasa
de electrones que expresada como
inmovilizadas Hernández et al., 2020
utiliza diferentes DQO, DBO5,
Reactores de Blanco et al., 2018
comunidades nitrógeno orgánico,
membrana (MBR) Martínez et al., 2019
microbianas fósforo orgánico y
Reactores de lecho
soportadas o sólidos disueltos
fluidizado
inmovilizadas sobre
diferentes soportes
Proceso biológico
en ausencia de
oxígeno, empleando
como aceptor Materia orgánica
Reactores final de electrones expresada como
Hernández et al., 2020
anaeróbicos compuestos como DQO, DBO5,
Blanco et al., 2018
con biomasa en NO3, PO4, SO4, nitrógeno orgánico,
Martínez et al., 2019
suspensión CO2 y/o H2O que fósforo orgánico y
utiliza diferentes sólidos disueltos
comunidades
microbianas en
suspensión
Proceso biológico en
presencia de oxígeno
como aceptor final Materia orgánica
de electrones que expresada como
Reactores
utiliza diferentes DQO, DBO5,
anaeróbicos con Martínez et al., 2019
comunidades nitrógeno orgánico,
biomasa inmovilizadas
microbianas fósforo orgánico y
soportadas o sólidos disueltos
inmovilizadas sobre
diferentes soportes
Operación física
que elimina sólidos
orgánicos e
inorgánicos (lodos Sólidos sedimentables, Pedroza et al 2018
Sedimentación se
microbianos) por materia orgánica y Pedroza y Rodríguez
cundaria
diferencia de microorganismos 2013
densidad a las salido
de los reactores
biológicos

136
Etapas de tratamiento
Contaminante que
y unidades Definición Referencia
reducen/ eliminan
representativas

Tratamiento terciario

Operación física que

elimina sólidos en
Sólidos suspendidos,
suspensión o disueltos,
sólidos disueltos, color
Filtración por separación García et al., 2018
residual y metales
diferencial de
pesados
tamaño y adsorción
al material filtrante

Proceso Físico/
químico que elimina
sólidos coloidales
Coagulación/ por la modificación Sólidos suspendidos y Loarte et al., 2018
Floculación de la carga sólidos disueltos Banchon et al., 2016
superficial generando
sedimentación física y
modificación química.

Operación biológica
empleando
microalgas
o bacterias
Remoción de Sólidos disueltos Ardila et al., 2020
fotosintéticas en
nutrientes con Fósforo Muñiz 2019
condición de luz que
microalgas Nitrógeno Céspedes et al., 2021
elimina nutrientes
como nitrógeno y
fósforo, presentes
como iones disueltos.
Proceso físico y
químico empleando
especies reactivas de
Materia orgánica Blanco et al., 2018;
oxígeno, que elimina
Procesos de Contaminantes Fernández et al., 2016
contaminantes
oxidación avanzada persistentes Valencia et al., 2020
por la oxidación
Microorganismos Puentes et al., 2021
no selectiva de los
mismos vía radicales
libres
Proceso químico en
el que se emplean
Elimina
productos como
microorganismos
hipolorito de sodio, Weber y Campos,
patógenos, no
Desinfección química ácido peracético, 2016
patógenos e
amonios cuaternarios, Valencia et al., 2020
indicadores de
entre otros que
contaminación fecal
busca eliminar
microorganismos

137
Finalmente, en cada una de las unidades que presencia de grupos indicadores, se puede
hacen parte de una planta de tratamiento se deducir que los patógenos se encuentran
deben determinar una serie de parámetros presentes en la misma concentración y
de tipo físico, químico y microbiológico, para que su comportamiento frente a diferentes
determinar la eficiencia parcial y global de la factores como pH, temperatura, presencia
planta (Aghalari et al., 2020). Estos parámetros de nutrientes, tiempo de retención hidráulica
se comparan con la normatividad ambiental o sistemas de desinfección es similar a la del
vigente para establecer que se cumpla indicador (USEPA, 2004; WHO, 2006).
con los valores máximos permisibles (MADS,
2015). De lo contrario, se deben realizar Los coliformes termotolerantes (anteriormente
una revisión del desempeño de la planta y denominados fecales) son un subgrupo de
realizar los ajustes necesarios para mejorar los coliformes totales, capaz de fermentar
la remoción en el menor tiempo posible y la lactosa a 44.5°C y soportar temperaturas
a bajo o mediado costo (Saravanan et al., más elevadas. Aproximadamente el 95%
2021). Adicionalmente, se debe tener en del grupo de los coliformes presentes en
cuenta que para cada sector productivo los heces, están formados por Escherichia coli
parámetros de vertimiento pueden cambiar y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los
en función del tipo de proceso productivo y coliformes termotolerantes se encuentran
carga inicial contaminante. En la tabla 8 se casi exclusivamente en las heces de animales
presenta una clasificación resumida de los de sangre caliente, se considera que reflejan
principales parámetros a monitorear. mejor la presencia de contaminación fecal.
Los coliformes termotolerantes y E. coli,
El control de los parámetros físico-químicos presentan tasas de supervivencia semejantes
y microbiológicos es muy importante tanto a la de los patógenos entéricos (Hachich et
en los sistemas de potabilización como de al., 2012; Rossi et al., 2022).
depuración del agua (Saravanan et al.,
2021). Sin embargo, en los lugares donde La exigencia de las normativas en cada
el agua es consumida por el hombre o es país puede variar y en la mayoría de los
reutilizada, el factor de riesgo más importante casos incluyen solo el control de bacterias
está asociado con la exposición a agentes indicadoras como: Enterococos fecales,
biológicos que incluyen bacterias patógenas, coliformes totales, coliformes termotolerantes
helmintos, protozoos y virus entéricos. El riesgo y Escherichia coli (EPA US 2017). En el caso
de contaminación tanto a nivel humano de Colombia, la normativa para aguas
como ambiental hace necesario el control residuales, requiere únicamente el análisis de
de la presencia de microorganismos en Coliformes termotolerantes.
el agua (Some et al., 2021). Determinar el
tipo de microorganismos presentes y su
concentración proporciona herramientas
indispensables para conocer la calidad del El riesgo de
agua y para la toma de decisiones en relación
al control de vertidos, tratamiento de aguas y contaminación tanto
conservación de ecosistemas (USEPA, 2004).
a nivel humano como
Dada la dificultad de determinar la presencia
de todos los patógenos y la necesidad de
ambiental hace
hacer una evaluación rápida y fiable, se necesario el control
ha planteado la necesidad de trabajar
con organismos indicadores (Toribio- de la presencia de
Avedillo et al., 2021). Los microorganismos
indicadores son aquellos que tienen un microorganismos en
comportamiento similar a los patógenos
(concentración y reacción frente a factores el agua.
ambientales y barreras artificiales), pero
son más rápidos, económicos y fáciles de
identificar. Una vez se ha evidenciado la

138
 Tabla 8.
Parámetros físicos, químicos y microbiológicos a monitorear en una planta de tratamiento para
aguas residuales domésticas y no domésticas.

Parámetros
Tipo de agua residual Parámetros físicos Parámetros Químicos
microbiológicos
pH, demanda
química de oxígeno,
demanda bioquímica
Sólidos suspendidos Coliformes
Agua residual de oxígeno
totales, sólidos termotolerantes
doméstica Nitratos, nitritos,
sedimentables Escherichia coli
ortofosfatos,
detergentes Sulfuros,
sulfatos, entre otros
pH, demanda
química de oxígeno,
demanda bioquímica
Sólidos suspendidos de oxígeno
totales, sólidos Hidrocarburos, Coliformes
Agua residual no
sedimentables, plaguicidas, termotolerantes*
doméstica
unidades de color, explosivos Escherichia coli
temperatura Nitratos, nitritos,
amonio, ortofosfatos,
sulfatos, sufuros, entre
otros

Figura 20.
El esquema de la planta de tratamiento a escala piloto.

2 4 5 6

7
10
1

8
Operación unitaria
1. Tanque de igualización 6. Reactor foto trófico
2. Sistema de bombeo 7. Inyección de coagulante
3. Trampa grasas 8. Floculador
4. Reactor Biológico 9. Sistema de filtración
5. Sedimentador secundario 10. Reactor fotocalitico

Cortesía de Lucas David Pedroza Camacho y Juan Camilo Lores Acosta.

139
8.2. Objetivos •1 trampa de grasas de 8 L.

Objetivo general •1reactor biológico de aireación extendida

de 20 L.
•Realizar el montaje y operación de una
planta piloto para el tratamiento de aguas •1 sedimentador secundario de 15 L.
residuales no domésticas generadas al
realizar tinciones biológicas en laboratorios •1 reactor fototrófico de 2,5 L.
de docencia e investigación.
•1 reactor fotocatalítico de 3 L.
Objetivos específicos
•1 clarifloculador o floculador de 15 L.
•Conocer las operaciones y procesos
unitarios que se llevan a cabo en una •1 filtro de arena cuarcítica de 8 L.
planta piloto para el tratamiento de
aguas residuales no domésticas. •10 aireadores o motores de pecera.

•Evaluar el comportamiento de parámetros •2 bombas sumergibles.

físicos, químicos y microbiológicos de
control de calidad del proceso con miras •Manguera de silicona.
a demostrar la disminución de la carga
contaminante del agua residual, post •Difusores porosos rectangulares de
tratamiento. 2x10x1cm.

8.3. Materiales, medios y reactivos [Link]ón de parámetros físicos

[Link]ón del lodo activado fúngico/ [Link]. Color verdadero y unidades de color
bacteriano por el método espectrofotométrico

•5 erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de •1 frasco Schott de 250 mL.

caldo nutritivo (anexo A, numeral 32).
•2 tubos Falcon de 15 mL.
•5 erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de
caldo extracto salvado de trigo (anexo A, •1 pipeta de 10 mL.
numeral 9).
[Link]. Determinación de sólidos suspendidos
•5 cajas de Petri con agar nutritivo (anexo y sedimentables
A, numeral 2).
•1 filtro de fibra de vidrio de 1,58 µm.
•5 cajas de Petri con agar extracto
salvado de trigo (anexo A, numeral 9). •1 unidad de filtración al vacío.

•5 cajas de Petri con agar mínimo de •1 vaso de precipitado de 250 mL.

Bold suplementado con 1 g/L de glucosa
(anexo A, numeral 33). •Pinzas.

•Licuadora. •Probeta de 500 mL.

•Probeta de 1 L. •1 cono Imhoff.

[Link] de la planta piloto pretratamiento, •1 soportes para conos Imhoff.

tratamiento primario, tratamiento secundario y
tratamiento terciario

•1 tanque de igualación de 60 L.

140
[Link]. Determinación de pH por el método [Link]. Determinación de amonio (NH4+) por
potenciométrico el método de salicilato, nitratos y nitritos (NO3=)
por el método de reducción de Cadmio y
•1 frasco Schott de 250 mL. nitritos NO2- por el método del sulfato ferroso

•Buffer de calibración pH 4,0 y 7,0. •6 tubos Falcon de 15 mL.

•Frasco lavador. •6 tubos HACH® vacíos.

[Link].Determinación de la Demanda •2 sobre de NitraVer 5 HACH®.

Química de Oxígeno (DQO) por el método
de oxidación-reducción con dicromato •2 sobre de NitriVer 3 HACH®.
de potasio
•2 sobres de reactivo salicilato de amonio
•2 tubos Falcon del 15 mL. HACH®.

•1 tubo de digestión para DQO de HACH®. •2 sobres de reactivo cianurato de

amonio HACH®.
•Pipeta automática de 100-1000 µL.
•Agua desionizada.
•Puntas plásticas para pipeta automática.
•Pipeta automática de 100-1000 µL.
[Link].Determinación de la demanda bioquímica
de oxígeno por el método respirométrico •1 embudo plástico.

•1 botella respirometría de 500 mL. •Puntas para pipeta automática.

•1 sensor para oxígeno disuelto. [Link]. Determinación de sulfatos (SO4=) por

el método de sulfato de Bario
•1 tubo Falcon con 1 mL de solución de
sales minerales A (anexo B, numeral 33). •2 tubo Falcon de 15 mL.

•1 tubo Falcon con 1 mL de solución de •2 tubos de reacción HACH® para la

sulfato de magnesio heptahidratado o determinación de sulfatos.
solución B (anexo B, numeral 34).
•2 sobres de SulfaVer 4 HACH®.
•1 tubo Falcon con 1 mL de solución de
cloruro de calcio o solución C (anexo B, [Link]. Determinación de ortofosfatos (PO4 3-)
numeral 35). por el método del ácido ascórbico

•1 tubo Falcon con 1 mL de solución de •2 tubo Falcon de 15 mL.

cloruro férrico hexahidratado o solución D
(anexo B, numeral 36). •2 tubos de reacción HACH® para la
determinación de ortofosfatos.
•1 tubo Falcon con 1 mL de inóculo
bacteriano para DBO5 (anexo B, numeral 37). •2 sobres de PhosVer 4 HACH®.

•1 frasco Schott de 250 mL 100 mL de [Link]. Análisis microbiológico para

agua destilada. microorganismos responsables de la
biotransformación o lodo fúngico/bacteriano
•1 pipeta de 10 mL.
•Tubos de 16x150 mm tapa rosca con 9
•1 frasco Shcott de 25 mL con 1,5 g de KOH. mL de agua peptonada al 0,1 % (m/v),
(anexo B, numeral 2).
•1 probeta de 100 mL.

141
 •Pipeta automática de 100-1000 µL. La US-EPA (US Environmental Protection
Agency, Federal Register Volume 82, No. 165;
•7 cajas de Petri con agar nutritivo (anexo 40 CFR Part 136), en 2017, aprobó la técnica de
A, numeral 2). multicelda (NMP/100 mL) utilizando Colilert®-
18 (sustrato definido), para la determinación
•7 cajas de Petri con agar rosa de bengala de Coliformes termotolerantes.
(anexo A., numeral 34).
•Agua destilada estéril (para realizar las
•5 cajas de Petri con agar mineral Bold diluciones).
suplementado con glucosa (anexo A,
numeral 33). •Medio sustrato definido Colilert®- 18
(anexo A, numeral 36).
•5 rastrillos de vidrio.
•Bolsas de cuantificación Quanti-tray 2000.
•Pipeta automática de 100-1000 µL.
•Frasco de vidrio con capacidad de 100
•Puntas para pipeta automática. mL, para realizar las diluciones.

[Link]. Análisis microbiológico para coliformes •Micropipeta de 100 a 1000 µL.

termotolerantes por NMP. Para la determinación
de los coliformes termotolerantes (fecales) •Pipeta automática de 1 a 10 mL.
se utilizan 2 métodos, basados en la técnica
de NMP: Fermentación de tubos múltiples •Probeta de 100 mL.
(Standard Methods 9221 E) y utilizando Colilert®-
18 (sustrato definido) (US-EPA; 40 CFR Part 136 •Puntas para micropipetas de 100 a 1000 µL.
en 2017).
•Puntas para pipetas automáticas de 1 a
[Link].1. Técnica de fermentación de tubos 10 mL.
múltiples (Standard Methods 9221 E), la
identificación de los coliformes termotolerantes 8.4. Equipos
se basa en la capacidad de fermentar la
lactosa a 44,5 °C ± 0,2 °C en 24 ± 2 h. utilizando •Centrífuga.
el Caldo A1.
•Termodigestor HACH®.
•5 tubos 16 x 150 mm tapa rosca y
campana Durham dentro, con 10 mL de •Espectrofotómetro HACH®.
caldo A-1 a doble concentración* (anexo
A, numeral 35). •Sistema de agitación para botellas
respirométricas.
•10 tubos 16 x 150 mm tapa rosca y
campana Durham dentro con 10 mL de •Incubadora a 25,5ºC ± 0,2ºC para
caldo A-1 a concentración sencilla. botellas respirométricas de DBO5.

•Pipeta automática de 100-1000 µL. •Sensor para oxígeno disuelto.

•Pipeta automática de 1-10 mL. •Termobalanza.

•Puntas para pipeta automática de 100- •Espectrofotómetros UV/VIS.

1000 µL y 1-10 mL.
•Equipo test de jarras.
•Gradillas.
•Cronómetro.
[Link].2. Técnica de multicelda (NMP/100
mL utilizando la técnica de Colillert® •Aireadores o motores de pecera.

142
 •Bombas sumergibles. •Sembrar un disco de biomasa fúngica
en agar extracto salvado de trigo.
•Licuadora.
•Incubar por 8 días a 30 ºC.
•Baño termostático a 44,5 ºC ± 0,2 ºC.
•Retirar con una pipeta Pasteur invertida
•Autoclave. 5 discos de agar con micelio fúngico de
la parte periférica de la caja.
•Vortex.
•Inocular los discos en Erlenmeyer de 250
•Balanza analítica. mL con caldo extracto de salvado de trigo.

•Autoclave. •Incubar por 8 días a 30 ºC y 120 rpm.

•Incubadora a 44,5 ºC ± 0,2 ºC. •Adicionar el contenido de todos los

erlenmeyer que contienen los inóculos
•Incubadora a 20,5 ºC ± 0,2 ºC. de bacterias y hongos en una licuadora
previamente desinfectada con alcohol al
•Incubadora a 35ºC ± 0,5 ºC. 70 % (v/v) e irradiada por luz ultravioleta a
254 nm por 12 h.
•Incubadora a 30 ºC ± 2,0 ºC.
•Homogenizar los cultivos por 1 minuto.
•Sellador Quanti-trayTM Sealer Plus.
•Transferir la suspensión de microorganismos
8.5. Metodología a un frasco Schott de 2 L.

8.5.1. Preparación del lodo activado fúngico/ •Refrigerar a 4 °C hasta el momento de

bacteriano inocular el reactor de lodos activados
(reactor secundario).
•Retirar del congelador de -20 ºC los viales
de las bacterias que hacen parte del 8.5.2. Preparación del inóculo a base de
lodo activado modificado (Pseudomonas Chlorella sp. para tratamiento terciario
fluorescens,Bacilluslicheniformis,Pseudomonas
sp., Steptomyces sp, Nitrosococcus oceani •Retirar del congelador de -20 ºC dos
ATCC 19707 y Nitrosospira multiformis ATCC viales de Chlorella sp. que hace parte del
25196). lodo algal para tratamiento terciario.

•Descongelar los viales que contienen las •Descongelar los viales que contienen la
bacterias. microalga.

•Sembrar por aislamiento las bacterias •Tomar una asada del vial y sembrar por
que hacen parte del lodo bacteriano. agotamiento a Chlorella sp.

•Incubar 12 h a 30 ºC. •Incubar 12 h a 30 ºC.

•Tomar una asada de cada una de las •Tomar una asada del aislamiento de
bacterias e inocular a caldo nutritivo. Chlorella sp. e inocular a caldo nutritivo.
•Cultivar por 12 h a 30 ºC y 120 rpm.
•Cultivar por 4 días a 28 ºC, 120 rpm y 400 Lx.
•Retirar del congelador de 4 ºC los vialesde
los hongos ligninolíticos que hacen 8.5.3 Montaje de la planta piloto pretratamiento,
parte del lodo activado modificado tratamiento primario, tratamiento secundario
(Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor y y tratamiento terciario
Phanerochaete sp.).

143
[Link]. Pretratamiento activados con agua residual hasta
completar el 80 % del volumen efectivo
•Recolectar en los laboratorios de de trabajo con agua residual proveniente
docencia e investigación el agua residual de la trampa de grasas.
no doméstica en garrafones de 20 L.
•Apagar la bomba de succión cuando
•Transferirla al tanque de igualación/ se complete el 80 % del volumen efectivo
neutralización. de trabajo.

•Medir el pH y conductividad eléctrica inicial. [Link].Tratamiento secundario (reactor de

lodos activados modificado)
•Ajustar el pH con NaOH 1 N o HCl 1 N
para obtener un valor inicial de 6,5±0,5 •Verificar que los difusores de piedra
(anexo B, numeral 43 y 44). porosa estén conectados a las mangueras
y a los puertos de entrada para aire.
•Conectar las mangueras de succión del
agua residual y la bomba sumergible. •Verificar que los aireadores están
conectados a las mangueras que
•Introducir la bomba sumergible en el distribuyen el aire.
agua residual.
•Adicionar al reactor biológico el 80 %
•Conectar la manguera de succión a la (v/v) de agua residual a tratar.
trampa de grasas.
•Encender los aireadores a máxima
[Link]. Tratamiento primario (trampa de grasas) capacidad.

•Verificar que la trampa de grasas esté •Adicionar por el puerto de muestreo 1 L

desocupada. del lodo activado modificado (consorcio
fúngico/bacteriano).
•Verificar que la manguera de succión
que proviene de la bomba esté •Airear y homogenizar por 5 minutos a
conectada al puerto de entrada de la razón de 1 L/min.
trampa de grasas.
•Abrir el puerto de muestreo y tomar
•Verificar que la manguera de salida y 0,5 L de agua residual para realizar la
distribución de la trampa de grasas esté caracterización inicial.
conectada al puerto de entrada del
reactor de lodos activados modificado. [Link]. Sedimentación secundaria

•Encender la bomba de succión para •Verificar que la manguera del puerto

que inicie el paso del agua residual del de salida del reactor biológico este
tanque de igualación/neutralización a la conectada y colocada a la entrada del
trampa de grasas. sedimentador secundario.

•Verificar que el agua residual está •Abrir la llave del puerto de salida del
pasando por los compartimentos de agua residual.
la trampa de grasas a través de los
deflectores que tiene la unidad. •Transferir el contenido total del reactor
biológico al sedimentador secundario.
•Verificar que el agua residual está
saliendo de la trampa de grasas a través •Sedimentar los lodos activados
del puerto de salida y está ingresando al modificados por 1 hora.
reactor de lodos activados modificado.
•Introducir la bomba sumergible al
•Llenar el reactor biológico o de lodos sedimentador secundario.

144
 •Conectar la manguera de salida de la •Realizar el tratamiento fotocatalítico por
bomba sumergible al puerto de entrada 6 horas.
del reactor fototrófico con microalgas
(terciario). •Recuperar el efluente final y realizar la
determinación de parámetros.
[Link]. Tratamiento terciario (microalgas)
•Recuperar el TiO2
•Verificar que los difusores de piedra
porosa estén conectados a las mangueras [Link]. Filtración con arena quarcítica
y a los puertos de entrada para aire en el
fondo del reactor fototrófico. •Verificar que la manguera de la bomba
sumergible esté conectada a la entrada
•Verificar que los aireadores están del filtro de arena
conectados a las mangueras que
distribuyen el aire. •Filtrar el 90% del efluente que sale del
reactor de fotocatálisis.
•Verificar que la lámpara de luz
fluorescente esta conectada y colocada •Abrir el puerto de salida del filtro de arena.
en la parte central del reactor fototrófico.
•Recuperar el efluente final para realizar
•Verificar que la manguera de salida de la caracterización final y reutilizarlo como
la bomba sumergible este conectada al agua de riego para zonas verdes y jardines.
reactor fototrófico.
8.5.4. Determinación de parámetros físicos de
•Encender la bomba sumergible. control de proceso

•Adicionar al reactor fototrófico el 80 % [Link]. Determinación de color verdadero y

(v/v) del efluente secundario. unidades de color

•Encender los aireadores a máxima •Tomar 10 mL del agua residual y

capacidad. transferirlos a un tubo falcón de 15 mL.

•Adicionar por el puerto de muestreo 1 L •Colocarlos en la centrífuga y nivelar con

de microalgas. un tubo con igual peso. Centrifugar 15
minutos a 5000 rpm.
•Airear y homogenizar por 5 minutos a
razón de 1 L/min. •Transferir el sobrenadante a un tubo
Falcón limpio.
•Abrir el puerto de muestreo y tomar
0,5 L del efluente para realizar la •Encender el espectrofotómetro y dejar
caracterización inicial que ingresa a calibrar.
tratamiento terciario.
•Realizar barrido UV/VIS para determinar
•Muestrear 0,5 L cada 24 o 72 h para la longitud de onda de máxima absorción.
seguir la evolución del tratamiento, o
realizar únicamente un muestreo final a •Ajustar el espectrofotómetro a la longitud
las 120 h aproximadamente. de onda máxima absorción.

[Link]. Fotocatálisis con TiO2/UV •Ajustar el blanco con agua destilada.

•Leer la absorbancia de la muestra de
•Transferir 2 L de efluente coagulado al agua residual inicial.
reactor de fotocatálisis que contiene 10 g
de TiO2. •Si la absorbancia es superior a una
absorbancia de 1,0, realizar la dilución
correspondiente con agua destilada.

145
 •Convertir la absorbancia a unidades de •Colocarlo en el porta muestras de la
color empleando la ecuación 21. (Livernoche balanza de tres dígitos.
et al., 1983; Hernández et al., 2020).
•Evaporar el agua por 5 minutos a 105 ºC.
ABS X 500 ABS X 500
UC = UC =
0.132 0.132 •Registrar el peso final del filtro seco y con
los sólidos suspendidos totales.
(Ecuación 21)
•Calcular los mg/L de sólidos suspendidos
Convertir las UC a porcentaje de decoloración totales empelando la ecuación 23.
empleando la ecuación 22. (Livernoche et
al., 1983; Hernández et al., 2020). Sólidos suspendidos mg Pff-pffi
totales = X 1000
L 10 o 20 mL
% Decoloración = uci-ucf X 100 (Ecuación 23)
uci
(Ecuación 22) Donde: Pfi: Peso en mg del filtro inicial. Pff:
Peso final en mg del filtro con los sólidos
después de evaporar.
Donde: UCi: Unidad de color inicial. UCf:
Unidad de color final. [Link].2. Sólidos sedimentables

•Realizar el mismo procedimiento a •Tomar 1 L del agua residual inicial del

la muestra que ingresa a la planta de reactor biológico.
tratamiento, a la salida de cada unidad de
tratamiento y al final tratamiento terciario. •Transferir a un cono Imhoff de 1 L.

[Link]. Determinación de sólidos •Colocar el cono en el soporte metálico.

[Link].1. Sólidos suspendidos totales •Sedimentar por 1 hora.

•Tomar 50 mL del agua residual inicial, del •Determinar los mL/L de sólidos
reactor biológico y transferir a un frasco sedimentables midiendo los mL de
Schott de 250 mL. sólidos desde la base del cono Imhoff
hasta donde se observe con claridad la
•Homogenizar por inversión el contenido columna de sólidos.
del frasco Schott.
8.5.5. Determinación de parámetros químicos
•Pesar el filtro de fibra de vidrio en balanza
de tres dígitos. [Link]. Determinación de pH

•Colocar el filtro con pinzas en el sistema •Tomar 50 mL del agua residual y

de filtración al vacío de 500 mL. colocarlos en un frasco Schott de 250 mL.

•Tapar el sistema de filtración al vacío. •Introducir el sensor de pH previamente

calibrado.
•Conectar la manguera a la bomba de
vacío. •Registrar el valor de pH del agua residual.

•Adicionar 20 o 50 mL del agua residual. •Retirar el electrodo y lavar con agua

•Encender la bomba de vacío y dejar destilada.
pasar la totalidad del agua residual.
•Colocar el protector plástico del sensor
•Destapar el sistema de filtración. de pH.

•Retirar con las pinzas el filtro de fibra de vidrio. •Apagar el equipo.

146
[Link]. Determinación de la Demanda Química •Colocar 1 g de KOH.
de Oxígeno (DQO) por el método de reflujo
cerrado y oxidación con dicromato de potasio, •Colocar el sensor de DBO5 y cerrar
ácido sulfúrico y temperatura suavemente.

•Transferir 10 mL de agua residual a un •Programar el sensor para el rango de

tubo Falcon de 15 mL. altas (999 mg/L).

•Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm. •Colocar las botellas en el agitador
magnético para DBO5.
•Transferir el sobrenadante a un tubo
falcon limpio de 15 mL. •Incubar las botellas en agitación por 5 días.

•Tomar 0,2 o 2 mL del agua residual •Registrar la concentración de DBO5 al

centrifugada, transferir al tubo HACH®. quinto día y multiplicar por el inverso de la
dilución realizada.
•Seguir las instrucciones de la casa
comercial para el método No 8000 [Link]. Determinación de nitrógeno, amoniacal,
([Link] nitratos y nitritos

•Leer la concentración de la demanda [Link].1. Determinación de nitrógeno amoniacal

química de oxígeno (mg/L DQO) en el por el método del método de salicilato
espectrofotómetro HACH®.
•Transferir 10 mL de agua residual a un
[Link]. Determinación de la Demanda bioquímica tubo Falcon de 15 mL.
de oxígeno al quinto día (DBO5) por el método
respirométrico al quinto día •Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm.

•Transferir 10 mL de agua residual a un •Realizar una dilución con agua MilliQ

tubo Falcon de 15 mL. con un volumen final de 10.

•Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm. •Transferir 10 mL de sobrenadante a un

tubo falcon limpio de 15 mL.
•Transferir los 10 mL de agua a la botella
respirométrica. •Transferir los 10 mL de agua residual a un
tubo HACH® vacío.
•Adicionar 90 mL de agua destilada para
tener una dilución 1/10. •Seguir las instrucciones de la casa
comercial para el método No 8155
•Adicionar 0,1 mL de solución A. ([Link]

•Adicionar 0,1 mL de solución B. •Leer la concentración de nitrógeno

amoniacal (mg/L NH3-) en el
•Adicionar 0,1 mL de solución C. espectrofotómetro HACH®.

•Adicionar 0,1 mL de solución D. [Link].3. Determinación de nitratos por el

método de reducción de Cadmio
•Adicionar 0,1 mL de inóculo bacteriano
para DBO5. •Transferir 10 mL de agua residual a
un tubo Falcon de 15 mL –realizar este
•Colocar la barra magnética dentro de procedimiento por duplicado.
la botella respirométrica.
•Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm.
•Colocar el recipiente de caucho en la
boca de la botella.

147
 •Transferir los 10 mL de agua residual a un •Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm.
tubo HACH® vacío.
•Transferir los 10 mL de agua residual a un
•Seguir las instrucciones de la casa tubo HACH® vacío.
comercial para el método No 8039
([Link] •Seguir las instrucciones de la casa
comercial para el método No 8048
•Leer la concentración de nitratos (mg/L ([Link]
NO3-) en el espectrofotómetro HACH®.
•Leer la concentración de ortofosfatos (mg/L
[Link].4. Determinación de nitritos por el PO4-3) en el espectrofotómetro HACH®.
método del sulfato ferroso
8.5.5. Análisis microbiológico para los
•Transferir 10 mL de agua residual a un microorganismos responsables de la
tubo Falcon de 15 mL biotransformación o consorcio fúngico/
bacteriano
•Realizar este procedimiento por duplicado.
•Tomar 5 mL de muestra en un tubo
•Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm. 16x150 mm.

•Transferir los 10 mL de agua residual a un •Agitar la muestra en vortex por 10

tubo HACH® vacío. segundos y tomar 1 mL.

•Seguir las instrucciones de la casa •Transferir 1 mL de muestra a un tubo

comercial para el método No 8153 16x150 mm con 9 mL de solución salina
([Link] o agua peptonada. (0,80 % m/v).
Obteniendo un factor de dilución 1/10.
•Leer la concentración de nitritos (mg/L
NO2-) en el espectrofotómetro HACH®. •Realizar diluciones seriadas hasta la
dilución 10-12.
[Link].Determinación de sulfatos por el
método del sulfato de Bario •Transferir y sembrar por superficie en
agar salvado de trigo o agar rosa de
•Transferir 10 mL de agua residual a bengala 0,1 mL de las diluciones 10-2, 10-
un tubo Falcon de 15 mL –realizar este 4
, 10-6 y 10-8 para recuento de hongos de
procedimiento por duplicado. podredumbre blanca.

•Centrifugar por 10 minutos a 5000 o 1000 rpm. •Transferir y sembrar por superficie en
agar nutritivo 0,1 mL de las diluciones 10-2,
•Transferir los 10 mL de agua residual a un 10-4, 10-6 y 10-8 para recuento de bacterias.
tubo HACH® vacío.
•Transferir y sembrar por superficie en agar
•Seguir las instrucciones de la casa nutritivo 0,1 mL de las diluciones 10-2, 10-4,
comercial para el método No 8051 10-6 y 10-8 para recuento de microalgas.
([Link]
•Invertir las cajas de Petri y envolverlas
•Leer la concentración de sulfatos (mg/L en vinipel.
SO4-) en el espectrofotómetro HACH®
•Incubar las cajas de recuento de hongos
[Link]. Determinación de ortofosfatos por el por 7 días a 30 °C.
método del ácido ascórbico
•Incubar las cajas de recuento bacteriano
•Transferir 10 mL de agua residual a por 48 horas a 30 °C.
un tubo Falcon de 15 mL –realizar este
procedimiento por duplicado.

148
 •Realizar el conteo de unidades formadoras ●Diluciones seriadas salteadas pares:
de colonia utilizando la ecuación 24.
•Agitar muy bien la muestra. Realice
UFC X IFD el análisis de la muestra en Cabina de
UFC/mL =
0,1 mL Bioseguridad o en un área aséptica.
(Ecuación 24)
•Para preparar una dilución de 10-1,
tomar 10 mL de muestra y adicionarlos a
Donde: UFC: unidad formadora de colonia. 90 mL de agua destilada estéril (frasco de
IFD: inverso factor de dilución. dilución con 90) agitar muy bien.

8.5.6. Análisis microbiológico para coliformes •Si la dilución siguiente es seriada par,
termotolerantes por NMP: Técnica de es decir 10-2, tomar 10 mL de la dilución
Fermentación de tubos múltiples (Standard anterior, transfiéralos a otro frasco con 90 mL
Methods 9221 E) de agua destilada estéril, agitar muy bien.

•Retirar la muestra de la nevera y dejar a •Para dilución de 10-4, tome 1 mL de la

temperatura ambiente. dilución anterior y llevarlo a un frasco con
99 mL de agua destilada.
•Tomar la muestra y agitar vigorosamente
25 veces. •Para dilución de 10-6, tome 1 mL de la
dilución anterior y llévelo un frasco con 99
•Si es necesario realizar diluciones mL de agua destilada y así sucesivamente
seriadas, para ello tenga en cuenta el (Figura 21).
aspecto de la muestra: Color, turbiedad,
olor y sólidos. •Al realizar cada dilución cambiar de
punta la pipeta.
•Proceder a preparar las diluciones teniendo
en cuenta los siguientes procedimientos.

Figura 21.
Diluciones seriadas salteada pares

10 mL

10 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10-1 10-2 10 -4 10 -6 10 -8

Muestra de agua 90 mL 90 mL 99 mL 99 mL 99 mL
agua agua agua agua agua

149
●Diluciones seriadas salteadas impares:

•Para las diluciones saltadas impares tomar 10 mL de muestra, transfiéralos a 90 mL de agua

destilada estéril, obteniendo una dilución de 10-1, agitar muy bien.

•Tomar 1 mL de esa dilución (10-1) y adicionarlos a 99 mL de agua destilada estéril, obteniendo

una dilución de 10-3, agitar muy bien.

•Para la dilución 10-5 tomar 1 mL de la anterior y llevarlo a un frasco con 99 mL de agua

destilada estéril.

•Para la dilución 10-7 tomar 1 mL de la anterior y llevarlo a un frasco con 99 mL de agua

destilada estéril, y así sucesivamente (Figura 22).

•Al realizar cada dilución cambiar de punta la pipeta.

Figura 22.
Diluciones seriadas salteada impares.

10 mL

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10-1 10-3 10 -5 10 -7 10 -9

Muestra de agua 90 mL 99mL 99 mL 99 mL 99 mL

agua agua agua agua agua

•Inocular los volúmenes de muestra según se indica en la siguiente tabla:

Tabla 9.
Volumen de muestra por serie de tubos para análisis de coliformes termotolerantes

Volumen de muestra Concentración

Serie Nº de tubos por serie
en mL del medio
1 10 Doble 5
2 1 Simple 5
3 0,1 Simple 5

150
 •Incubar los tubos de caldo A-1 8.5.7. Análisis microbiológico para coliformes
inoculados a 35 ± 0,5 ºC por 3 horas (usar termotolerantes por NMP: por la técnica de
incubadora). multicelda (NMP/100 mL) utilizando el sustrato
definido Colilert®-18.
•Pasado el tiempo, transferir los tubos de
caldo A-1 al baño termostatado a 44,5 ± •Agitar muy bien la muestra, y proceder
0,2ºC por 21 ± 2 horas. a preparar las diluciones teniendo en
cuenta los siguientes procedimientos
•Interpretación de resultados. descritos anteriormente (Figuras 21 y 22).

•Verificar la producción de gas en los •A la dilución a sembrar adicionar el

tubos de caldo A-1, la reacción positiva contenido total de un vial (o sachet/
corresponde a presencia de Coliformes ampolleta/paquete) de Colilert®-18 y agitar
termotolerantes (fecales). hasta que el sustrato se disuelva totalmente.

•Para estimar la densidad de coliformes •Tomar las bolsas Quanti-tray, separar un

termotolerantes, calcular el valor de NMP poco el recubrimiento halando la pestaña
a partir del número de tubos positivos de de la parte superior y verter dentro de la
acuerdo con la tabla de Números Más bolsa todo el contenido del frasco de
Probable del Standard Methods for the dilución que contiene el sustrato (100 mL).
examination of water & wastewater, 23rd
Edition (SM) 9221 C: Tabla 9221: IV. (Anexo •Encender previamente el sellador
C, numeral 1). Quanti-tray Sealer PLUS, y dejarlo calentar
hasta que la luz verde se encienda.
•Realice la conversión de las unidades
con las ecuaciones 25 y 26: •Colocar la bolsa Quanti-tray que
contiene la muestra en la plantilla de
caucho correspondiente y pasarlo a través
Coliformes NMP 10 X NMP (Tabla 922:IV)
= del sellador, este distribuye la muestra
termotolerantes 100 mL Factor de dilución
homogéneamente en todas las celdas, y
(Ecuación 25) sella la bandeja automáticamente.

NMP •Incubar las bolsas de quanti-tray a 44,5 ±

Coliformes NMP 100 mL 0,2°C durante 18 ± 2 horas.
=
termotolerantes mL 100
•Pasado el tiempo de incubación realizar
(Ecuación 26) el conteo de las celdas en las que la
solución presenta color amarillo e informar
Donde: NMP: Número Más Probable. mL: mililitro Coliformes Termotolerantes.

•Leer los resultados de acuerdo con la

tabla 10 y la figura 23:

Tabla 10.
Interpretación de resultados para Colilert®

Aspecto Resultado

Menos amarillo que el comparador Negativo para coliformes termotolerantes

Amarillo igual o mayor que el comparador Positivo para coliformes termotolerantes

151
 Figura 23.
Cuantificación de Coliformes termotolerantes por el método sustrato enzimático Colilert® - 18,
formato multicelda (utilizando la cepa de Klebsiella variicola ATCC 31488).

Cortesía de: Fidson-Juarismy Vesga.

●Cálculos through carbon nanotubes. Journal of

Environmental Management. [Link]
•Calcular el NMP de Coliformes org/10.1016/[Link].2019.05.152.
termotolerantes a partir del número
de celdas positivas de acuerdo con la American Public Health Association A,
tabla de Número Más Probable (anexo American Water Works Association A, Water
C, numeral 2) o utilizando el Software Environment Federation W (2005). Standard
generador de NMP proporcionados por el Methods for the Examination of Water and
fabricante. Wastewater, 21st edn. Washington DC., USA.

•Si ha realizado dilución a la muestra Ardila, L., Hernández, V., Céspedes, D.,
tenga en cuenta el factor de dilución Mateus, F., Rivera, C., Pedroza, L., y Quevedo,
vertida en la bolsa. B. (2020) Tertiary treatment (Chlorella sp.) of a
mixed effluent from two secondary treatments
•Reporte los resultados obtenidos como (immobilized recombinant P. pastoris and
NMP/100 mL. rPOXA 1B concentrate) of coloured laboratory
wastewater (CLWW). Biotech. 10(5), 233-233.
[Link]
Banchón, C., Baquerizo, R., Muñoz, D., y
Aghalari, Z., Dahms, H., Sillanpaa, M., et al. Zambrano, L. (2016). Coagulación natural
(2020). Effectiveness of wastewater treatment para la descontaminación de efluentes
systems in removing microbial agents: industriales. Enfoque UTE. 7(4), 111-126.
asystematic review. Globalization and Health.
[Link] Blanco, A., Ramírez, C., Duarte, M., Beltrán,
M., Medina, L., Florido, A., y Pedroza, A. (2018).
Ahmad, J., Naeem, S., Ahmad, M., et al. (2019). A novel textile wastewater treatment using
A critical review on organic micropollutants ligninolytic co-culture and photocatalysis with
contamination in wastewater and removal TiO2. Universitas Scientiarum. 23(3), 437-464.

152
Campos, C., Saconi, A., (2014). Gestión del agua HACH (2022a) HACH 8051, Sulfate. Barium
en América del Sur: el estado de los recursos sulfate method. HACH Company.
hídricos en Argentina, Brasil y Colombia. Bogotá:
Editorial Pontificia Universidad Javeriana. HACH (2022b) HACH 8153, Nitrite. Sulphate
Ferrosous method. HACH Company.
Céspedes-Bernal, DN., Mateus-Maldonado,
JF., Rengel-Bustamante, JA., Quintero-Duque, HACH (2022c) HACH 8000, Chemical oxygen
MC., Rivera-Hoyos, CM., Poutou-Piñales, RA., demand. Reactor digestion method. HACH
Díaz-Ariza, LA., Castillo-Carvajal, LC., Páez- Company.
Morales, AI., Pedroza-Rodríguez, AM. (2021)
Non‑domestic wastewater treatment with HACH (2022d) HACH 8155, Ammonia (Nitrogen).
fungal/bacterial consortium followed by Salicylate method. HACH Company.
Chlorella sp., and thermal conversion of the
generated sludge. 3 Biotech. 11, 227. https:// HACH (2022e) HACH 8039, Nitrate. Cadmium
[Link]/10.1007/s13205-021-02780-1 reduction method. HACH Company.

Che, P., Zhao, W., Chen, D., et al. (2022). Research HACH (2022f) HACH 8048, Ortophosphate.
Progress on Integrated Treatment Technologies Ascorbic Acid method. HACH Company.
of Rural Domestic Sewage: A Review. Water.
[Link] Hachich, EM., Di-Bari, M., Christ, AP.,
Lamparelli, CC., Ramos, SS., Sato, MI. (2012).
EPA US. 2017. Clean Water Act Methods Comparison of thermotolerant coliforms and
Update Rule for the Analysis of Effluent. Rules Escherichia coli densities in freshwater bodies.
and Regulations; 40 CFR Part 136. Fed Regist Brazilian Journal of Microbiology. 675-681.
2017; 82:165).
Hernández-Sáenz, D., Puentes-Morales, CS.,
EPA. (2020). Title 40 of the Code of Federal Mateus-Maldonado, JF., Pedroza-Camacho,
Regulations. Protection of the Environment. 40 LD., Ramírez-Rodríguez, J., Rivera-Hoyos, CM.,
C.F.R. 141. Journal of Microbiology. 675-681. Pedroza-Rodríguez, AM. (2020). Evaluación
Recuperado de: [Link] de un consorcio entre Pleurotus ostreatus,
textidx?SID=1b93484e698f66515776074457ec1 Trametes versicolor y bacterias aeróbicas para
b&tpl=/ecfrbrowse/Title40/40tab_02.tp1 la remoción de colorantes sintéticos. Revista
Colombiana de Biotecnología. 22. (1), 45-59.
Fernández, J., Suan, A., Ramírez, J., Robles,
J., Salcedo, J., Pedroza, A., Daza, C. (2016). Livernoche, D., Jurasek, L., Desrochers, M.,
Treatment of real wastewater with TiO2-films Dorica, J. (1983) Removal of color from Kraft mill
sensitized by a natural-dye obtained from wastewater with cultures of white rot fungi and
Picramnia sellowii. Journal of environmental with immobilized mycelium of Coliorus versicolor.
chemical engineering. 4(3), 2848-2856. Biotechnology Bioengineering. 24(8), 2055–2065.

García, A., Pascual, J., Muñoz, M., y Capilla, Loarte, M., Castañeda, EM. (2018). Evaluación
J. (2018). Eliminación de fármacos en el agua del sistema de tratamiento de aguas
residual urbana mediante la combinación de residuales de las lagunas de oxidación de la
biorreactores de membranas con procesos de ciudad de casma-2017. UCV-Scientia. 57-57.
oxidación avanzada calidad del agua tratada
para su reutilización: mejora de la calidad del Martínez, M., Serrano, B., García, L., Miñana,
agua tratada para su reutilización. In Congreso G. (2019). Tratamiento coste-efectivo de
Nacional del Agua Orihuela: Innovación y activación medioambiental para disfunciones
Sostenibilidad. 937-948. Universitat d´ Alacant/ del sistema biológico de las EDAR. In XXXV
Universidad de Alicante. Jornadas Técnicas de AEAS (pp. 682-685).
Asociación Española de Abastecimientos de
Guo, T., Englehardt, J., Wu, T. (2014). Review Agua y Saneamiento.
of cost versus scale: water and wastewater
treatment and reuse processes. Water Ministerio de ambiente y desarrollo sostenible.
Science and Technology. 69(2), 223-234. 2018. resolución 0883 del 2018, Bogotá Colombia.

153
Ministerio de ambiente y desarrollo sostenible. Saravanan. A., Kumar, S., Jeevanantham, S., et
2018. resolución 0631 del 2016, Bogotá Colombia al. (2021). Effective water/wastewater treatment
methodologies for toxic pollutants removal:
Muñiz, R. (2019). Los fotobiorreactores de Processes and applications towards sustainable
microalgas: Un recurso para el tratamiento development. Chemosphere. [Link]
terciario de aguas residuales. Tekhné. 22(3). org/10.1016/[Link].2021.130595.

Organización Mundial de la Salud (oms). Some, S., Mondal, R., Mitra, D., et al. (2021).
(1989). Directrices sanitarias sobre el uso de Microbial pollution of water with special
aguas residuales en agricultura y acuicultura. reference to coliform bacteria and their nexus
Ginebra: Organización Mundial de la Salud. with environment. Energy Nexus. [Link]
Pedroza, A., Rodríguez, R., (2013). Optimization org/10.1016/[Link].2021.100008.
of C/N ratio and inducers for wastewater
paper industry treatment using Trametes Thanigaivel, S., Priya, A.K., Gnanasekaran,
versicolor immobilized in bubble column L., et al. (2022). Sustainable applicability
reactor. Journal of Micology. 1, 1-11. and environmental impact of wastewater
treatment by emerging nanobiotechnological
Pedroza, L., Lores, J., Rojas, J., Mateus, J., approach: Future strategy for efficient removal of
Puentes, C., Ramírez, J., Pedroza., A. (2018). contaminants and water purification. Sustainable
Effect of Domestic Wastewater as Co-Substrate Energy Technologies and Assessments. https://
on Biological Stain Wastewater Treatment Using [Link]/10.1016/[Link].2022.102484.
Fungal/Bacterial Consortia in Pilot Plant and
Greenhouse Reuse. Journal of Water Resource Toribio-Avedillo, D., Blanch, A., Muniesa, M., et
and Protection. 10(3), 369-393. al. (2021). Bacteriophages as Fecal Pollution
Indicators. [Link]
Puentes-Morales, C., Pedroza-Camacho, LD.,
Mateus-maldonado, JF., Lores-Acosta, JC., USEPA (2004), Guidelines for Water Reuse. US
Pedroza-Cubides, MC., Ramírez-Rodríguez, Environmental Protection Agency, Washington, DC.
J., Salcedo-Reyes, JC., Díaz-Ariza, LA.,
Pedroza-Rodríguez, AM. (2021) Biological and Valencia, CL., Pedroza-Rodríguez, AM.,
photocatalytic treatment at pilot plant scale Chamorro-Tobar, IC., Zambrano, DC., Carrascal-
of synthetic coloured wastewater produced Camacho, AK. (2020). Evaluation of photolysis,
in university teaching laboratories. Revista photolysis/H2O2 and H2O2 as treatments for
Mexicana de Ingeniería Química. 20(2), 521- the reduction of Salmonella spp in water of pig
539. [Link] farms. Revista de Investigaciones Veterinarias
del Perú. 31(4), e17205
Ramírez, A., Zoila, E., Rivera-Paima, C. (2019).
Remoción de Cr3+ en el tratamiento terciario de Véliz-Flores, RR., Aronés-Medina, EG.,
efluentes de curtiembre mediante nanofiltración. Palomino-Malpartida, YG., Huincho-
Rodríguez, R. (2018). Desinfección del efluente
Rivera, P., Chávez, R., y Salinas, R. (2018). secundario de la planta de agua residual de
Avances y limitantes en el tratamiento del Ayacucho con radiación ultravioleta para su
agua residual del estado de Zacatecas. reutilización en riego agrícola. Revista de la
Tecnología y ciencias del agua. 9(1), 113-123. Sociedad Química del Perú. 84(1), 41
Rossi, E., Luft, S., Moehle, J., et al. (2022).
Chlorine Efficiency in the Reducing Coliforms in Weber, B., Campos, C. (Eds.). (2016). Aportes
the Sanitary Effluent of Septic Tank Treatment técnicos y formativos para el uso sostenible
Systems with Anaerobic Filter. Journal of de los recursos hídricos en América Latina.
Advances in Microbiology. DOI: 10.9734/ Editorial Pontificia Universidad Javeriana.
JAMB/2022/v22i230433.
WHO (2006) Guidelines for the Safe Use of
Sánchez, MB., Uribe, C. (2018). Contaminación Wastewater, Excreta and Greywater. Volume
de los ambientes acuáticos generados por la 2: Wastewater Use in Agriculture. World Health
industria textil. Revista Campus. 23(26). Organization, Geneva).

154
155
156
Capítulo 9
BACTERIÓFAGOS COMO INDICADORES
DE CONTAMINACIÓN ACUÁTICA

157
158
Capítulo 9

BACTERIÓFAGOS COMO INDICADORES

DE CONTAMINACIÓN ACUÁTICA
Campos-Pinilla C.

9.1. Introducción riesgo más importante está asociado con la

exposición a agentes biológicos que incluyen
El riesgo de contaminación tanto a nivel bacterias, virus protozoos y helmintos (Asano
humano como ambiental hace necesario y Levine, 1998, García-Aljaro et al., 2018;
el control de la presencia, concentración y Toriribio et al., 2021).
viabilidad de microorganismos patógenos
en el agua. Dicho control proporciona Existe un consenso general sobre la dificultad
herramientas indispensables para conocer de determinar la presencia de todos los
la calidad del agua y para la toma de microorganismos patógenos implicados en
decisiones con relación al control de vertidos, los procesos de contaminación ambiental
tratamiento de aguas, conservación de los ya que implica varios días de análisis, costos
ecosistemas y salud pública (Campos, 1999, elevados y laboratorios especializados. Frente
Lucena et al., 2003; Toriribio et al., 2021). a estas dificultades y a la necesidad de hacer
una evaluación rápida y fiable de la presencia
El control de los parámetros fisicoquímicos de patógenos en el agua, se ha planteado la
y microbiológicos es muy importante tanto necesidad de trabajar con microorganismos
en los sistemas de potabilización como en indicadores (Campos, 1999, Savichtcheva y
los de depuración del agua. Sin embargo, Okabe, 2006; Toriribio et al., 2021).
en los lugares donde el agua es consumida
por el hombre o es reutilizada, el factor de

159
 La evaluación de los que requieren algunas veces de periodos
prolongados de tiempo e infraestructura y
patógenos presentes costos altos. De igual forma se sabe que algunos
virus son más resistentes a la desinfección
en agua, se ha realizado que el grupo de los coliformes, por lo que los
indicadores tradicionales de contaminación
tradicionalmente por bacteriana no evalúan de manera eficiente
la presencia o ausencia de virus en el
medio de indicadores agua. Frente a esta dificultad se presenta
bacterianos como la alternativa del uso de los bacteriófagos
como indicadores de la presencia de virus
coliformes totales patógenos de origen fecal. Se han estudiado
varios grupos de bacteriófagos que infectan
y E. coli. bacterias entéricas como son los colifagos
somáticos, F específicos y fagos que infectan
Los microorganismos indicadores son aquellos cepas de Bacteroides fragilis (IAWPRC, 1991,
que tienen un comportamiento similar a Jofre et al., 2016; Toriribio et al., 2021).
los patógenos (concentración y reacción
similar frente a factores ambientales y Existen varias aplicaciones de los bacteriófagos
barreras artificiales), pero son más rápidos como indicadores. Estas incluyen su uso
económicos y fáciles de identificar. Una vez como indicadores de contaminación por
se ha evidenciado la presencia de grupos patógenos en aguas residuales, eficiencia
indicadores, se puede inferir que los patógenos del tratamiento en plantas potabilizadoras
se encuentran presentes en concentraciones y depuradoras y supervivencia de virus y
parecidas y que su comportamiento frente a bacterias entéricas en el ambiente.
diferentes factores como pH, temperatura,
presencia de nutrientes, tiempo de retención Las condiciones que cumplen los bacteriófagos
hidráulica o sistemas de desinfección es para ser propuestos como indicadores virales
similar a la del indicador. de origen fecal son las siguientes:

La evaluación de los patógenos presentes •Los fagos se encuentran abundantemente

en agua, se ha realizado tradicionalmente en agua residual y agua contaminada.
por medio de indicadores bacterianos como
coliformes totales y E. coli. Sin embargo, se •Las poblaciones de fagos son mucho
ha determinado que los virus y parásitos son más grandes que las de los enterovirus y
más resistentes a las condiciones ambientales por consiguiente más fáciles de recuperar
y a sistemas de desinfección por lo que es a nivel ambiental.
necesario incluirlos dentro del seguimiento y
control de la calidad del agua. •Los fagos son incapaces de reproducirse
fuera del huésped bacteriano.
Más de 140 virus pueden ser transmitidos al
hombre a través del agua. Estos son los virus •Los fagos se pueden aislar y contar
entéricos eliminados a través de las heces de usando métodos sencillos.
las personas infectadas. Desde el punto de
vista de la salud pública, los virus entéricos •Se obtienen resultados más rápidos
son el grupo de microorganismos patógenos cuando se analizan los fagos que cuando
más críticos, debido a que la dosis mínima se trabaja con enterovirus.
infecciosa es muy baja, son muy resistentes
a los sistemas de desinfección y el control •Ciertos fagos son tan resistentes como los
a nivel de laboratorio es costoso (Campos, enterovirus a los procesos de desinfección
2019, Schwartzbrod, 1995; Wescot y Ayres, (Schwartzbrod, 1995).
1990; Toriribio et al., 2021).
Los bacteriófagos difieren de los organismos
En el caso de los virus se pueden detectar celulares en que son más pequeños (20-
enterovirus mediante el uso de técnicas 100 nm de diámetro) y presentan pocos

160
tipos de macromoléculas. Generalmente entre 32 y 40°C, lo que implica que este fago
contiene solo una capa proteica que rodea no puede replicarse en ambientes naturales y
un núcleo de DNA o RNA. Algunos fagos son específicos de contaminación de origen
también contienen lípidos y son parásitos fecal. Los fagos RNA específicos de la familia
intracelulares obligados por lo que requieren Leviviridae contiene dos géneros (Levivirus
de la presencia de una bacteria huésped y Allolevirus) y tres grupos no clasificados
viable para su replicación. En muchos casos (Muniesa et al., 1999, Jebri et al., 2017).
la replicación del fago lleva a la lisis o muerte
de la célula huésped. Los fagos que infectan varias cepas de
especies de Bacteroides, han sido detectados
Se ha encontrado que varios factores en heces y aguas contaminadas con heces.
pueden influir en el número y la actividad de La gran mayoría de estos fagos pertenecen
los bacteriófagos. Estos incluyen la densidad a la familia Siphoviridae, infectan la bacteria
tanto de la célula huésped como del fago por la pared y se consideran fagos somáticos.
correspondiente, la asociación de los fagos Las cepas de Bacteroides también difieren
y bacterias con los sólidos, la presencia de en su capacidad de detectar fagos
materia orgánica, especialmente aquella en las heces de diferentes especies de
que influye en la actividad metabólica del animales, incluyendo humanos y de aquí
huésped bacteriano; la luz ultravioleta y la su habilidad para determinar el origen de
visible; temperatura; pH y la concentración y la contaminación en una muestra dada.
el tipo de iones (Farrah, 1995, Grabow, 2001; Su concentración en ambientes acuáticos
Toriribio et al., 2021). naturales es generalmente más baja que
la de los fagos F RNA específicos y la de los
En la mayoría de los estudios acerca de somáticos ya que son excretados en bajas
la distribución de los fagos en ambientes concentraciones en alrededor del 15% de los
acuáticos, la cepa de E. coli, ha sido humanos. Teniendo en cuenta que la célula
usada como bacteria huésped. De ahí el huésped es anaerobia estricta y que se puede
uso generalizado de los colifagos como presentar interferencia por contaminación
indicadores de virus entéricos. Los colifagos con otras bacterias, el recuento de estos
han sido aislados de lagos, ríos y otros fagos puede ser un poco más complicado
ambientes acuáticos en varias partes del (Grabow et al., 1999; Jebri et al., 2017).
mundo, en concentraciones que superan 105
a 107/L.
Algunos fagos también
Los fagos somáticos tienen una cápside contienen lípidos y son
con DNA de cadena doble o sencilla en su
genoma. Se unen a los lipopolisacáridos o parásitos intracelulares
los receptores proteicos en la pared celular
bacteriana y pueden causar lisis en la cepa obligados por lo que
huésped en 20 - 30 minutos en condiciones
óptimas. Son conocidos más comúnmente requieren de
como colifagos somáticos y pertenecen a las
familias Myoviridae, Sipoviridae, Podoviridae la presencia de una
y Microviridae (Muniesa et al., 1999, Jebri et
al., 2017; Toriribio et al., 2021).
bacteria huésped viable
para su replicación.
Algunos estudios se han enfocado en los
fagos F RNA específicos en aguas residuales En muchos casos la
ya que se han propuesto como indicadores
de contaminación fecal. Se encuentran en replicación del fago lleva
concentraciones de 104 y 107 PFP/L, usando
como cepa huésped Escherichia coli o a la lisis o muerte de la
Salmonella typimurium (Bitton, 1995). El sitio
receptor de estos fagos para la infección es el célula huésped.
pili sexual que sólo se produce a temperaturas

161
Los fagos se evalúan generalmente sin realizar Los fagos se pueden detectar tanto en aguas
métodos de concentración directa con su contaminadas como en aquellas que no
respectiva bacteria huésped, por medio de deben presentar contaminación de origen
una doble capa en agar. Los métodos para fecal (aguas potables) o es muy baja (Figura
la detección y enumeración de colifagos 24). Para el caso de las aguas residuales se
somáticos han sido estandarizada por ISO realiza una previa filtración para eliminar
10705-2 (Anonymous, 2000), para fagos F las bacterias acompañantes y se procede
RNA específicos, ISO 10705-1 (Anonymus, a realizar diluciones para realizar la doble
1995) y para fagos que infectan cepas de capa en agar. En el caso de aguas con
Bacteroides fragilis, ISO 10705-4 (Anonymus, ausencia de fagos o baja concentración
2001). La técnica consiste en mezclar una y que tengan una baja turbidez, se realiza
cepa huésped conocida con una muestra una concentración a partir de 1 L de agua
de agua donde se presume están los fagos (Mendez et al., 2004) y si presentan alta
que infectan dicha cepa huésped. Si ocurre turbidez se realiza una floculación con
la infección se realizará la fase lítica y se hidróxido de magnesio (Schulze and Lenk,
observarán placas de lisis. Las diferencias en 1983, Sánchez-Alfonso, 2020).
los protocolos mencionados según el fago a
analizar se observan en la tabla 11.

Tabla 11.
Bacteriófagos utilizados para evaluar contaminación de origen fecal en aguas y las diferencias
en la técnica de doble capa en agar según ISO.

Fago de Expresión de
Indicador Cepa huésped Medio de cultivo
referencia resultados
PFP Partículas
Colifagos Escherichia coli Sholtens
øX174 Formadoras de
somáticos WG5 modificado
Placas/ volumen
Salmonella Agar Triptona, PFP. Partículas
Fagos F RNA
typhimurium MS2 extracto de Formadoras de
específicos
WG49 levadura glucosa Placas/ volumen
Fagos que
PFP. Partículas
infectan cepas Bacteroides
B56-3 BPRMB Formadoras de
de Bacteroides fragilis RYC2056
Placas/ volumen
fragilis

Figura 24.
SAgar Scholtens modificado (MSA) inoculado con la cepa E. coli WG5 y la muestra de agua
residual evaluada tras 24 h de incubación a 37 ºC. Se observan las placas de lisis por la acción
del bacteriófago.

A B

Cortesía de Claudia Campos.

162
9.2. Objetivos •Puntas estériles para las dos pipetas
automáticas.
Objetivo general
•Cajas de agar Scholtens modificado (MSA).
•Realizar análisis de colifagos somáticos
en aguas superficiales por medio de la •Tubos de 16x100 mm tapa rosca estériles
técnica de doble capa en agar. y vacíos.

Objetivos específicos •Frascos Schott de 250 mL de capacidad

con agar MSA semisólido (MSAss).
•Evaluar la presencia de colifagos
somáticos en aguas superficiales como •Filtros de cápsula (poliéster sulfona PES)
indicadores de contaminación viral de de 0,22 μm de poro X 33 mm de diámetro
origen fecal. por grupo.

•Conocer las alternativas existentes •Jeringa de 5 mL sin aguja.

para evaluar la contaminación por virus
patógenos en agua y su interpretación. •Gradillas plásticas.

9.3. Reactivos y medio de cultivo •Frasco de muestreo de polipropileno de

500 mL.
•Agar Scholtens Modificado (MSA),
(anexo A, numeral 37). •Recipientes plásticos con decol para
desechos.
•Agar semisólido Scholtens Modificado
(MSAss), (anexo A, numeral 38). 9.4. Equipos

•Caldo Scholtens Modificado (MSB), •Baño termostatado.

(anexo A, numeral 39).
•Vórtex.
•Agua peptona 0,1 % (m/v) (anexo B,
numeral 2). 9.5. Metodología

•Bicarbonato de sodio. 9.5.1. Inoculación de Escherichia coli WG5 para

su crecimiento exponencial en medio MSB
•Cloruro de magnesio.
Este procedimiento describe la inoculación
•Ácido nalidíxico. (anexo B, numeral 37) de la cepa huésped antes de la prueba
de colifagos somáticos, por tanto, se debe
•Cloruro de calcio. (anexo B, numeral 38). calcular el tiempo de incubación de esta
para que a la hora de comenzar a realizar
•Tubos 16x100 mm tapa rosca con 9 mL de el análisis se tenga la bacteria en una
agua peptonada al 0,1 % (m/v), (anexo B, concentración de 108 UFC/mL:
numeral 2).
•Tomar un tubo tapa rosca de 13x100
•Muestra de agua superficial presuntamente mm para lectura en espectrofotómetro y
contaminada con heces fecales, recolectada adicionar la cantidad necesaria de caldo
en frascos de polipropileno estériles. MSB (2-3 mL). Este servirá como blanco
para realizar su lectura en el equipo a una
•Frascos de vidrio Schott 100 mL. longitud de onda a 600 nm.

•Pipetas automáticas de 1 mL. •Tomar aparte un vial del cultivo de
trabajo de E. coli WG5 almacenada en
•Pipetas automáticas de 5 mL. el congelador a -70°C y descongelar a
temperatura ambiente (15 – 22ºC).

163
 •Tener 50 mL de caldo MSB en un frasco de •Medir absorbancia en el espectrofotómetro
vidrio tapa rosca con capacidad para 250 (λ:600 nm) hasta que la lectura este entre
mL que debe estar a temperatura ambiente. 0,200 -0,400, correspondiente a 108 UFC/
mL aprox. Utilizar MSB como blanco de la
•NOTA: Para que el crecimiento ocurra prueba.
más rápido caliente previamente el caldo
a 37 °C. •Mantener el inoculo a -15°C y usarlo
antes de las próximas horas.
•Utilizar el vortex para agitar el vial de
bacteria descongelado y adicionar todo 9.5.3. Preparación de la muestra
el contenido del vial de trabajo al caldo
MSB mezclando bien. •A partir de la muestra original transferir 50
mL de la misma a un frasco schott de 50
•Retirar de 2-3 mL de esta mezcla aparte mL de capacidad (agitar previamente).
en un tubo tapa rosca 13x100 mm para
posterior lectura en espectrofotómetro. •Tomar una alícuota de 5 mL con jeringa
desdechable de 5 mL.
•Incubar a 36 +/- 2°C los 2 tubos (blanco
y con bacteria inoculada), junto con •Adaptar la jeringa sin la aguja al filtro PES
el frasco de caldo MSB inoculado con de 0,22 µm y realizar la filtración completa
bacteria, mientras se agita suavemente de la alícuota de la muestra.
por espacio de 21⁄2h.
•Recuperar el filtrado en un tubo tapa
•Transcurrido el tiempo de incubación, rosca estéril de 16x100 mm.
ajustar el espectrofotómetro a cero.
•A partir del filtrado, realizar diluciones de 10-1
•Usar el tubo con caldo MSB (blanco), ajustar a 10-3 en agua peptonada al 0,1% (m/v).
el espectrofotómetro en cero nuevamente
con una longitud de onda a 600 nm. 9.5.4. Determinación y cuantificación de colifagos
somáticos en aguas residuales
•Introducir en la celda del
espectrofotómetro el tubo con la bacteria •A partir de la muestra original transferir 50
inoculada y medir la absorbancia que mL de la misma a un frasco schott de 50
debe estar en un rango de densidad mL de capacidad (agitar previamente).
óptica entre 0,200 – 0,400 nm. (lo cual
puede variar dependiendo de la curva de •A partir de las diluciones 10-1 a 10-3 de la
crecimiento de la cepa huésped). muestra filtrada, adicionar 1 mL de cada
solución a los tres tubos de 16x100mm
•Registrar la absorbancia obtenida y tapa rosca, usando la misma pipeta,
comparar con el rango de Densidad transfiriendo desde la más diluida hacia la
Óptica (DO) deseada. más concentrada.

•Usar inmediatamente el cultivo. Si no se •A cada tubo con diluciones transferidas,

va a utilizar de inmediato refrigerar a -15°C adicionar 1 mL de la cepa de E. coli
por espacio máximo de 2 horas, con el fin WG5 correspondiente a 108 UFC/mL,
de detener el crecimiento de la bacteria y determinada por DO.
mantener la concentración alcanzada.
•Adicionar a cada tubo 2,5 mL de MS
9.5.2. Preparación del inóculo de E. coli WG5 Ass derretido completamente y a 45 +°C
aproximadamente.
•Inocular un vial de E. coli GW5 en 50 mL
de caldo MSB. •Mezclar utilizando vortex y adicionar
todo el contenido de cada tubo en cada
•Incubar a 37± 2°C en agitación suave caja con agar MSA.
por 2 ½ horas.

164
 •Homogenizar bien el contenido del tubo doctoral. Facultad de Biología. Universidad
en las cajas antes de la mezcla se solidifique. de Barcelona, España.

•Incubar a 37 +°C por 18 horas. Grabow, W., Very, A., Uys, M. y Villiers, J.
(1999). Evaluation of the application of
•Realizar el respectivo conteo del número de bacteriophages as indicators or water quality.
calvas formadas o zonas de aclaramiento. Report to the water research commission by
the Department of Medical Virology. Faculty
•Calcular el número de PFP/ 100mL of Medicine. Grabow, W. (Ed). (pp 55).
mediante la ecuación 27. University of Pretoria. WRC Report N° 540/1/98.
NX100 Pretoria South Africa.
PFP de colifagos somáticos/100mL =
(VXF)
(Ecuación 27) IAWPRC. (1999). Bacteriophages as model
viruses in water quality control. Water
Donde: N= Número total de placas contadas Research. 25(5), 529-545.
en la caja. V= Volumen usado en la prueba con
dilución. F= Factor de dilución expresado en Jebri, S., Muniesa, M., Jofre, J. (2017). General
decimales. PFP= Partículas formadoras de placa. and host-associated bacteriophages
indicators of fecal pollution. In Global Water
9.6 Referencias Pathogens. J.B. Rose and B. Jiménez-Cisneros
(Ed). (pp 1-49). Michigan State University.
Anonymus. (2001). ISO 10705-4: Water UNESCO. Michigan, USA.
quality. Detection and enumeration of
bacteriophages- part 4: Enumeration of Mendez, J., Audicana, A., Isern, A., Llaneza,
bacteriophages infecting Bacteroides J., Moreno, B., Tarancón, B. Luisa, M. (2004).
fragilis. Geneva, Switzerland: International Standarised evaluation of the performance of
Standardization Organization. a simple membrane filtration-elution method
to concentrate bacteriophages from drinking
Anonymus (1995). ISO 10705-1: Water water. Journal of Virological Methods. 117, 19-25.
quality. Detection and enumeration of
bacteriophages- part 1: Enumeration of Muniesa, M., Lucena, F., Jofre, J. (1999). Study
F-specific RNA Bacteriophages. Geneva, of the potential relationship between the
Switzerland: International Standardization morphology of infectious somatic phages and
Organization. their persistence in the environment. Journal
of Applied Microbiology. 87, 402-409.
Anonymus (2000). ISO 10705-2: Water
quality. Detection and enumeration of Schwartzbrod, L. (1995). Effect of human
bacteriophages- part 2: Enumeration of viruses on public health associated with the
somatic coliphages. Geneva, Switzerland. use of wastewater and sludge in agriculture
International Standardization Organization. an aquaculture. Schwartzbrod, L (Ed).
(pp 178). WHO Collaboration Centre for
Asano, T., Levine, D. (1998). Wastewater Microorganisms in wastewater. Université de
reclamation, recycling and reuse: an Nancy. World Health Organization. Geneva,
introduction. In Wastewater, Reclamation Switzerland.
and Rreuse. Takashi Asano (Ed). (pp. 32).
Lancaster, England. Technomic Publishing. Schulze, E., Lenk, J. (1993). Concentration of
Bitton, G. (1995). Fate of bacteriophages in coliphages from drinking water by Mg(OH)2
water and wastewater treatment plants. In flocculation. Die Naturwissenchaften. 70, 612-3.
Phage ecology. Goyal, S., Gerba, C., and
Bitton, G. (Ed). (pp 181-195). Jhon Wiley & Wescott, D., Ayres, R. (1990). Criterios de
Sons. New York, USA. calidad de aguas de riego. En riego con
agua residual regenerada. Asano, T. (Ed). (pp
Campos, C. (1999). Indicadores de 33-66). Universidad Politécnica de Cataluña.
contaminación fecal en la reutilización de Barcelona, España.
aguas residuales para riego Agrícola. Tesis

165
166
Capítulo 10
MONTAJE PARA LA EVALUACIÓN DE TOXICIDAD
EN AGUAS CON LACTUCA SATIVA (MC INNIS, 1989)

167
168
Capítulo 10

MONTAJE PARA LA EVALUACIÓN DE TOXICIDAD

EN AGUAS CON LACTUCA SATIVA (MC INNIS, 1989)
Campos-Pinilla C.

10.1. Introducción para proteger la integridad de los medios

físicos y bióticos, así como los grupos sociales
Los vertidos de origen doméstico, industrial y de los cuales dependen), requiere de una
agrícola son las fuentes más representativas de serie de medidas y muchas de ellas están
contaminación a nivel ambiental. En el caso relacionadas con la ecotoxicología.
de la contaminación de origen doméstico
se evalúa la presencia de materia orgánica, La expresión de toxicidad de una sustancia
nutrientes y microorganismos de origen fecal. química, depende de las características de
Cuando la contaminación predominante es exposición y de su comportamiento en el
de origen químico, además de los parámetros ambiente y en el sistema biológico. Además
físicoquímicos es importante evaluar el de las propiedades físicoquímicas de las
potencial tóxico del agua tanto para el sustancias, se debe considerar la magnitud,
medio ambiente como para la salud humana duración y frecuencia de exposición, las vías
(Bayo et al., 2009, Movehedian, 2005). de introducción y la susceptibilidad de los
organismos. Esta última está directamente
La toma de decisiones para intervenciones ligada con los procesos toxicoxinéticos y
inmediatas o para la formulación de políticas toxicodinámicos. Se ha establecido que para
públicas con miras a la protección de la que se produzca un efecto nocivo se deben
salud humana y del ambiente, así como la presentar tres elementos:
gestión ambiental (estrategias y directrices

169
 •Un agente físico. •Su pertinencia como miembro de una
familia que pertenece a la cadena
•Un sistema biológico con el cual el alimentaria del hombre.
agente pueda interactuar para producir
un efecto. Los parámetros de evaluación ecotoxicológica
deben contemplar los diferentes niveles tróficos
•Un medio que permita la interacción de manera que las pruebas de ecotoxicidad
entre el agente y el organismo para acuática deben ser realizadas con:
producir efecto (Diaz et al., 2004).
•Productores (algas).
La intoxicación se define como un conjunto de Ejemplo:Pseudokirchneriella subcapitata
síntomas y signos que muestra un desequilibrio (antes Scenedesmus capricornutum).
orgánico promovido por la acción de una
sustancia tóxica y por lo tanto un estado •Consumidores primarios.
patológico de un organismo frente a la Ejemplo: Daphnia magna.
presencia y concentración del agente tóxico.
El organismo afectado puede ser el hombre o •Consumidores secundarios.
cualquier otro animal o vegetal (Azevedo y Ejemplo: Danio rerio.
Da Matta, 2004; Zagatto y Bertoletti, 2006).
•Descomponedores:
Los estudios de ecotoxicidad se realizan [Link] fischeri.
exponiendo a los organismos seleccionados
del ambiente a varías concentraciones Estos organismos son utilizados para evaluar
de una misma sustancia en un periodo toxicidad por medio de bioensayos, los
determinado. En principio se debe considerar cuales se realizan con diferentes organismos
que no existe ningún organismo ni biocenosis representantes de la cadena trófica, para
que puedan ser usados para evaluar todos prever efectos negativos en flora y fauna y en
los efectos posibles sobre el ecosistema, el hombre. Lo aconsejable en el caso de usar
bajo las diferentes condiciones bióticas y estos bioensayos es contar con una batería
abióticas presentes. En la práctica, solamente que incluya al menos un representante del
unas pocas especies (especies modelo), grupo de los vegetales, animales y bacterias
que representan funciones ecológicas (Diaz et al., 2004; Forget et al., 2000; Zagatto y
relevantes pueden ser ensayadas. Debido a Bertoletti, 2006).
la multiplicidad de especies existentes y de
las relaciones de dependencia entre ellas, Un bioensayo se define como el método
las pruebas son realizadas como mínimo con utilizado para evaluar la potencia relativa de
tres organismos pertenecientes a diferentes un agente tóxico sobre un organismo vivo.
niveles tróficos, de modo que, al obtener un Una prueba de toxicidad corresponderá al
resultado con un organismo más susceptible, método utilizado para detectar y evaluar
se evalúa con mayor seguridad la toxicidad la capacidad de un agente para producir
presente en el agua (Diaz et al., 2004, Pandard efectos tóxicos sobre los organismos vivos. Su
et al., 2006). objetivo primario además de la obtención de
datos para determinar los efectos sobre los
Los criterios para seleccionar un organismo sistemas biológicos, es caracterizar la relación
utilizado en este tipo de pruebas incluyen: dosis-respuesta del agente (Díaz et al., 2004,
Zagatto y Bertoletti, 2006).
•Su representatividad en relación a un
determinado grupo de importancia ecológica. En general, los bioensayos tienen las siguientes
características:
•La facilidad de mantenimiento en el
laboratorio. •Se realizan con grupos de organismos
pertenecientes a la misma población, en
•Su estabilidad genética (poblaciones buenas condiciones de salud y aclimatados
uniformes). previamente a las condiciones de ensayo.

170
 •Los organismos se mantienen bajo En relación a la expresión de resultados,
condiciones ambientales constantes para los ensayos de toxicidad aguda, se
y normalizadas (calidad del agua, puede calcular la concentración media que
temperatura, oxígeno disuelto, iluminación, causa un efecto adverso en el 50 % de los
fotoperiodo, pH, salinidad). organismos evaluados durante un periodo
de tiempo determinado (48, 72 o 96 horas).
•Se exponen a concentraciones graduales Para invertebrados generalmente se calcula
del tóxico. la CE50, entendida como la concentración
media efectiva que inmoviliza 50 % de los
•Se usan grupos control. organismos evaluados y para peces se
calcula la CL50 que es la concentración letal
•Es necesario observar los signos de media que afecta al 50 % de los organismos.
toxicidad durante y al final del ensayo. Se utiliza un nivel de efecto del 50% ya que es
la respuesta más reproducible y que puede
•Se realiza medición y registro detallado ser estimada con mayor confianza. La CL50
de los efectos biológicos, tanto en los y la CE50 se suelen expresar en términos de
grupos tratados como en los de control. concentración de la sustancia evaluada
en el tiempo de duración de la prueba y se
•Se realiza observación del efecto en los pueden determinar por diferentes métodos
grupos tratados y de control al final del estadísticos (Zagatto y Bertoletti, 2006).
ensayo.
El bioensayo con semillas de lechuga
•No son costosos, ni demasiados largos. (Lactuca sativa) es una prueba estática de
toxicidad aguda (120 horas de exposición)
•Debe ser un método lo suficientemente en el que se pueden evaluar los efectos
reproducible para poder comparar la fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas
toxicidad de los diferentes productos a complejas sobre el proceso de germinación
ensayar. de las semillas y el desarrollo de las plántulas
durante los primeros días de crecimiento.
•Se realiza un apropiado análisis estadístico Como puntos finales para la evaluación
de los datos obtenidos. de los efectos fitotóxicos, se determina la
inhibición de la germinación y elongación
Los resultados de un bioensayo se relacionan, de la radícula y el hipocótilo (Bohorquez y
en primer lugar, con los organismos usados en Campos, 2007, Diaz et al., 2004).
el ensayo bajo las condiciones estipuladas
en el procedimiento de prueba. El efecto Lactuca sativa es una planta comestible que
nocivo evaluado puede indicar niveles de pertenece a la familia de las compuestas,
peligrosidad trasladables y asimilables a es decir Asteraceae. Son organismos que
organismos que forman parte de los sistemas cuentan con ovarios internos, pétalos unidos
naturales y la biocenosis (Diaz et al., 2004, (fusionados), corolas irregulares; en ocasiones
Zagatto y Bertoletti, 2006). cuentan con flores incompletas y a veces
con flores imperfectas. Otra característica
Los efectos tóxicos de una muestra son particular es que pertenecen a la clase
evaluados por medio de variables biológicas dicotiledónea. Es importante destacar, que,
como letalidad, inmovilidad, alteraciones durante la germinación y los primeros días de
del desarrollo, crecimiento, reproducción, desarrollo de la plántula, ocurren numerosos
metabolismo, fisiología y comportamiento de procesos fisiológicos, en los que la presencia
los organismos evaluados. de una sustancia tóxica, puede interferir
alterando la supervivencia y desarrollo normal
Los efectos medidos se pueden expresar con de la planta.
criterios cuantificables, como número de
organismos muertos, número de crías producidas, El efecto tóxico es expresado como
reducción del crecimiento u otros parámetros porcentaje de inhibición del crecimiento
metabólicos y cualitativamente, por cambios en de la radícula, respecto al promedio de
el comportamiento de los organismos. elongación del control negativo de la

171
prueba. Posteriormente, se debe establecer Para evitar variabilidad en los resultados, las
la concentración a la cual se produce el semillas deben almacenarse máximo por 2
50% de inhibición (CI50) en el crecimiento años en oscuridad y a 4°C, al cabo de este
de la raíz (Bohorquez y Campos, 2007, Pica- tiempo, es recomendable cambiar de lote.
Granados et al., 2000).
Aunque existen y se mencionan muchas
Previo a la implementación de la prueba es aplicaciones de los ensayos de toxicidad
recomendable verificar que cada lote nuevo su uso como una herramienta de manejo
de semillas que se utilice tenga un porcentaje del medio ambiente se ha centrado en la
de germinación superior al 90% y baja obtención de información para:
variabilidad de la elongación de la radícula
(CV < 30 %). •Identificar y clasificar muestras
potencialmente tóxicas.
Con el fin de reducir la variabilidad en
los resultados para el caso de semillas •Definir el grado y extensión real de la
no seleccionadas y que presenten gran contaminación tóxica.
heterogeneidad en el tamaño, es conveniente
realizar una selección previa descartando •Identificar en residuos complejos las
las fracciones de mayor y menor tamaño fracciones que aportan la toxicidad.
y utilizando únicamente la fracción más
numerosa y de tamaño intermedio. Por lo anterior es claro que la principal
ventaja del uso de los bioensayos es obtener
Es importante establecer cuáles son los valores información sobre toxicidad, aunque no se
de elongación en el control negativo, así pueda identificar la sustancia o sustancias que
como la sensibilidad de las semillas frente al las causa. Los ensayos de toxicidad dan una
control positivo (Zn+2). La reducción del poder visión integrada del efecto tóxico generado
germinativo y el aumento en la variabilidad por diversos contaminantes presentes en una
de las medidas de elongación de la radícula muestra, y los resultados expresan el peligro
en el control negativo a lo largo del tiempo, potencial para los organismos, lo cual es un
son indicadores de la reducción de la resultado mucho más claro para un gestor
vitalidad y envejecimiento de las semillas. En ambiental (Cáceres et al., 2018, Diaz et al.,
este caso, se recomienda utilizar un nuevo 2004), (Figura 25).
lote de semillas.

Figura 25.
Resultados del ensayo de toxicidad aguda con Lactuca sativa.

A B

Cortesía de Campos-Pinilla

172
10.2. Objetivos •Semillas de Lactuca sativa.

Objetivo general 10.4. Equipos

•Evaluar la toxicidad de un agua residual •Balanza.

industrial sobre el desarrollo de Lactuca sativa.
•Incubadora a 19ºC.
Objetivos específicos
10.5. Metodología
•Realizar el montaje de un bioensayo
empleando semillas de Lactuca sativa. •Medir con probeta 25 mL, 50 mL y 75 mL
del agua residual.
•Interpretar los resultados del bioensayo
con Lactuca sativa como índice de •Depositar cada medida en balones
toxicidad en aguas. aforados de 100 mL diferentes y completar
hasta 100 mL con agua destilada.
10.3. Materiales, medios y reactivos
•Homogenizar la solución invirtiendo los
10.3.1. Preparación de las diferentes balones.
concentraciones del agua residual
•Sobre un papel limpio y seco, seleccione
•Balones aforados de 100 mL con tapa. semillas de tamaño, forma y color
homogéneas para mantener uniformidad
•Balón aforado de 100 mL con tóxico de entre ellas.
referencia: Sulfato de Zinc (ZnSO4).
•Separe solo la cantidad de semillas que
•Frasco Schott de 250 mL con 150 mL de se van a utilizar, ya que lo que se desea,
agua destilada. es que estas se encuentren en perfecto
estado para la realización del bioensayo.
•Frasco de muestreo de polipropileno de
500 mL. Para todo el grupo. •Marque correctamente cada caja de
Petri con la dilución correspondiente, asi
•Frasco Schott de 500 mL con 400 mL de como la fecha de inicio y terminación de
agua a analizar por lado de mesa. cada bioensayo.

10.3.2. Montaje del bioensayo •Coloque en cada caja de Petri sobre la
tapa, un papel tipo watman No. 3.
•Cajas de Petri grandes.
•Sature el papel tipo whatman No. 3 con 4
•Papel Whatman No. 3 de 90 mm de mL de cada dilución, teniendo en cuenta
diámetro: como soporte de germinación. que el papel debe quedar bien, húmedo.
Procure que las semillas no queden
•Pinzas o palillos: para manipular semillas flotando sobre el. Al adicionar la solución
de L. sativa con pinzas en acero inoxidable a cada filtro, evite la formación de bolsas
o palillos. de aire. Se debe adicionar el mismo
volumen de la muestra concentrada en
•Probetas de 50 mL por grupo. otra caja de Petri.

•Chupas plásticas. •Con una pinza coloque cuidadosamente
25 semillas (cinco hileras de 5 semillas)
•Papel aluminio. de manera simétrica, dejando el mismo
espacio entre semillas para que cada
•Toallas de papel. una tome la misma cantidad de agua y
permita el crecimiento radicular.
•Regla.

173
 •Tape las cajas de Petri con la base de la carta control elaborada con el análisis de
cada caja (teniendo precaución de no 20 muestras de diferentes concentraciones
voltearlas) cúbralas con toallas de papel del Zn.
humedecidas, sin que destiles agua y
luego envuélvalas en papel aluminio para Si al introducir los valores encontrados en
evitar la pérdida de humedad. el Probit no obtiene resultados de la CI50,
se puede informar con el valor encontrado
•Incube a una temperatura de 22± 2°C en la concentración más baja donde aún
por 120 horas (5 días), realice el mismo se observa inhibición de la elongación de
procedimiento con el control positivo la semilla. Esto es posible siempre y cuando
(solución de Zinc) y el control negativo su carta control y el valor del tóxico control
(agua destilada). estén dentro de los rangos esperados.

•Al cumplirse tiempo de incubación, con 10.6. Referencias
ayuda de la regla, mida cuidadosamente
la longitud de cada raíz en milímetros, de Azevedo, F., Da Matta, A. (2004). As bases
cada una de las diluciones y de los controles. toxicológicas da ecotoxicología. Sao Paulo,
Brasil: RIMA editores e Intertox.
Para determinar la CI50, inicialmente se deben
introducir los datos de las mediciones de cada Bayo, J., Angosto, J. Gómes-López, M. (2009).
semilla obtenidas en el bioensayo en la hoja de Ecotoxicological screening of reclaimed
cálculo en Excel; con los resultados obtenidos disinfected wastewater by Vibrio fischeri
en esta hoja, se calcula el porcentaje de bioassay after a chlorination-dechlorination
crecimiento y el porcentaje de inhibición de la process. Journal of Hazardous Materials. 172,
radícula, de la siguiente forma: 166-171.

La medida de elongación de la radícula Bohorquez, P., Campos, C. (2007).

se considera desde el nudo (región más Evaluación de Lactuca sativa y Selenastrum
engrosada de transición entre la raíz y el tallo) capricornutum como indicadores de
hacia el ápice radicular. Como puntos finales toxicidad en aguas. Universitas Scientarum.
para la evaluación de los efectos fitotóxicos, 12 (2), 83-98.
se debe calcular para cada dilución el
porcentaje de crecimiento de la radícula y Díaz, MC. (2004). Pruebas de toxicidad
el porcentaje de inhibición, con respecto al acuática: fundamentos y métodos. Bogotá,
control negativo. De los 25 valores obtenidos Colombia. Universidad Nacional de Colombia.
elimine 5 valores extremos y utilice solo el Cáceres-Campos, C., Oron, G. (2018).
promedio de la lectura de 20 semillas para Toxicity effects of selected heavy metals on
calcular el porcentaje de crecimiento Lactuca sativa and Hydra viridissima used for
empleando la ecuación 28. sustainable crop production.

Promedio crecimiento Forget, G., Gagnon, P., Dutka, B. (2000).

Crecimiento de en la dilución Overview of methods and results of the eight-
X100
radícula (%) = Promedio country international development research
crecimiento center (IDRC) Watertox Project. Environmental
control negativo Toxicology. 15(4), 461-470.
(Ecuación 28)
McInnis, R. (1989). Short Term Elongation
Inhibición (%)=100-porcentaje de crecimiento Toxicity Bioassay. National Water Research
Institute (NWRI). Environment Canadá.

Una vez obtenidos estos valores, introdúzcalos Mitchell, J., Burgess, J., Stuetz, R. (2002).
en el programa estadístico Probit para Review’s developments in ecotoxicity testing.
obtener la CI50. Tenga en cuenta que el Environmental Science and Biotechnology. 1,
control de calidad interno de su prueba, es el 169-198.
valor del tóxico control obtenido a partir de

174
Movahedian, H., Bina, B., Asghary, G. (2005).
Toxicity evaluation of wastewater treatment
plant effluents using Daphnia magna. Journal
Environmental Heath Science Engineering. 2
(82), 1-4.

Pandard, P., Devillers, J., Charissou, A., Poulsen,

V., Jourdain, M., Férar, J., Grand, C., Bispo, A.
(2006). Selecting a battery of bioassays for
ecotoxicological characterization of wastes.
Science of the Total Environment. 363, 114-125.

Pica-Granados, Y., Trujillo, GD., Hernández, HS.,

(2000). Bioassay standarization for water quality
monitoring in Ciudad de México, México.
Environmental Toxicology. 15(4), 322-330.

Zagatto, P., Bertoletti, E. (2006). Ecotoxicología

Aquática. Principios e Aplicacoes. Sao Paulo, Brasil.

175
176
Capítulo 11
TRANSFORMACIÓN Y APROVECHAMIENTO DE
RESIDUOS ORGÁNICOS SÓLIDOS

177
178
Capítulo 11

TRANSFORMACIÓN Y APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS

ORGÁNICOS SÓLIDOS
Rodrigo Ortega Blu, María Mercedes Martínez, Viviana Gutiérrez Romero, Lucía Ana
Díaz, Natalia Sánchez Sánchez, Adriana Matiz Villamil, Aura Marina Pedroza Rodríguez

11.1. Introducción Durante la descomposición de los materiales

orgánicos el carbono, nitrógeno, fósforo, y
11.1.1. Valorización de residuos orgánicos a otros elementos se hacen disponible de las
través de un modelo de economía circular plantas, animales y microorganismos y se
incorporan en el suelo importantes cantidades
La vida en la tierra depende del ciclo de de materia orgánica. Además de la continua
carbono y otros nutrientes, como el nitrógeno, entrega de carbono y nutrientes, la materia
los cuales ocurren en el suelo, el agua y la orgánica representa enormes ventajas para
atmósfera. Todos los seres vivos requieren las diferentes propiedades físicas, químicas y
de carbono, en diferentes formas, como biológicas del suelo (Yong et al., 2016).
fuente de energía y de alimento, mientras los
ecosistemas dependen de la disponibilidad de En Latinoamérica, los residuos orgánicos
recursos orgánicos e inorgánicos como materia representan entre el 60-70% de los residuos
prima para mantener los organismos vivos. Los domiciliarios, y en algunos países el 100% de
materiales orgánicos se descomponen y se este material es vertido en rellenos sanitarios. La
humifican para acumular materia orgánica eliminación en vertederos o rellenos conduce
en los suelos, por lo que los procesos de a desviar el carbono y los nutrientes presentes
mineralización y humificación representan en todos estos materiales, ubicándolos lejos
los procesos más importantes en el ciclo del de los ecosistemas donde fueron producidos
carbono del suelo (Juul et al., 2013). y haciendo que su reutilización no sea posible.

179
Además, cuando se entierran los residuos empleados para la producción de alimentos,
orgánicos, se genera una descomposición piensos o fertilizantes, valorizando los “residuos”
anaeróbica incontrolada que lleva a la con un efecto positivo sobre la huella de
producción de gases de efecto invernadero carbono, ayudan a disminuir las emisiones
como metano (CH4) y óxido nitroso (N2O). Es gaseosas y favoreciendo el uso sostenible de
paradójico que en países donde día a día se los recursos naturales (Xiang & Zheng 2017;
pierden suelos por efecto de malas prácticas Chandra et al., 2018, Martínez, 2017).
agrícolas y erosión, sea también donde
menos se empleen los residuos orgánicos La transformación de los RSO se puede hacer
para generar abonos, haciendo circular el C por medio de procesos biológico, físicos y
que tanto se necesita para construir materia químicos (Figura 26). Dentro de los procesos
orgánica y mantener la producción agrícola biológicos se destacan las tecnologías
empresas (Juul et al., 2013; Stephen and como compostaje, vermicultura, digestión
Periyasamy, 2018 Elsayed et al., 2020 Lim et al anaeróbica y obtención de sustratos de
2016; Yong et al., 2016), (Figura 27). siembra (Lim et al 2016; Wainaina et al., 2020).
En relación con los procesos físico y químicos,
Para el aprovechamiento y transformación se destacan la conversión termoquímico o
de materiales orgánicos, dentro de un pirolisis, para la producción de diferentes clases
modelo de economía circular se pueden de bio carbón o también denominado biochar
emplear diferentes estrategías, con el fin de (Moreno et al., 2019; Blanco et al., 2021).
que los residuos de un proceso se aprovechan
convirtiéndose en bio productos que serán 11.1.2. Compostaje
materia prima o biomasa para procesos de
producción de bioenergía (electricidad, El compostaje es el proceso biológico que se
calor, biodiesel, bioetanol o biogás) o lleva a cabo en condiciones aeróbicas, en
materiales de base biológica “bio-based el cual la materia orgánica presente en los
materials” como biopinturas, bioplásticos residuos vegetales o animales se descompone
o biolubricantes. Adicionalmente, los produciendo CO2, agua, energía en forma
subproductos transformados pueden ser de calor, nutrientes mineralizados y biomasa

Figura 26.
Comparación entre transformación aeróbica y anaeróbica.

100% Residuo 50% Compost

Mineralización
Fresco 50% CO2

Degradación aeróbica

100% Residuo 50% Compost

Mineralización
Fresco 50% CO2

Degradación anaeróbica

Cortesía de María Mercedes Martínez.

180
microbiana. Luego de un tiempo, la temperatura está directamente relacionada con el origen
cae, entrando en la etapa mesofílica y el y composición de los residuos. Los tiempos
proceso de estabiliza, es decir los organismos prolongados en el proceso de compostaje
que producían enzimas ralentizan su actividad, pueden generar problemas por el mayor
dado que se empiezan a agotar nutrientes tiempo de uso del espacio en las plantas
esenciales como N y P. hasta que aun en de tratamiento de residuos sólidos (PTRS),
presencia de volteo y humedad la temperatura que afecta directamente en la eficiencia
no se incrementa. Este punto corresponde y rentabilidad del proceso, así como, en la
al compost estable y posteriormente inicia la disminución de la capacidad de transformar
madurez (Martínez, 2017). mayores cantidades de material por lo cual,
estos pueden acumularse en los lugares de
El material obtenido varia en calidad acopio y generar problemas ambientales
(compost tipo A y B según las normativas de (Fourti, 2013).
cada país) y puede ser empleado en suelo
con diferentes objetivos según sus contenidos Como solución a esta situación, es posible
de nutrientes o grado de madurez. Sin disminuir el tiempo de compostaje mediante
embargo, en relación a la toxicidad e el uso de inoculantes biológicos, también
inocuidad, en ningún caso (tipo de compost) conocidos como bioinoculantes, que
deberá presentar compuestos tóxicos son productos que contienen uno o más
(metales pesados, hidrocarburos o derivados) microorganismos, vivos o latentes los cuales
en altas concentraciones, o patógenos que permiten acelerar el proceso de producción
pongan en peligro la producción vegetal o la de compost debido a la capacidad
salud animal o humana (Martínez, 2017). enzimática de los mismos y adicionalmente,
aumentan la humificación final del producto,
En el proceso aeróbico, se genera más lo que a su vez contribuye a que éste pueda
biomasa que gas, estimándose del 100% del producirse de mejor calidad fisicoquímica
material original, una producción de 50% de y microbiológica (Camacho et al., 2014;
CO2 y 50% de compost en el balance final. Queiroz et al., 2017). Estos bioinoculantes
El CO2, la energía y el vapor de agua salen pueden estar conformados por bacterias,
del sistema en especial durante la etapa hongos o por consorcios microbianos que
termofílica, pero los nutrientes presentes contengan organismos como Aspergillus
en las proteínas, carbohidratos, lípidos, sp., Pseudomonas sp., Penicillium sp.,
resinas etc., que originalmente componían Streptomyces sp., Bacillus sp. entre otros (Xu
la materia orgánica, son degradados por et al., 2019; Stanley et al., 2017).
acción de enzimas microbianas y por efecto
mecánico del volteo, y son mineralizados a Uno de los sectores que ha adoptado
sus componentes originales como N-NH4, esta tecnología de compostaje y uso de
N-NO3, SO4, PO4, etc (Martínez 2017). bioinoculantes como alternativa para
el manejo de los residuos, es el sector
La transformación de estos residuos es posible porcícola, teniendo en cuenta que la
debido a que su componente orgánico se mortalidad producida en la industria
encuentra conformado por una fracción porcícola se dispone tradicionalmente en
biodegradable, la cual está constituida fosas, generando problemas ambientales
por azúcares simples, aminoácidos, grasas, por los lixiviados producidos en los procesos
aceites, ceras, proteínas, minerales y por una de descomposición no controlada o en
fracción cuya degradación es más compleja el peor de los casos, estos residuos son
constituida generalmente por celulosa, incinerados, lo cual, puede contribuir a la
hemicelulosa, almidón y lignina, polímeros, formación de gases de efecto invernadero
entre otros, que pueden ser transformados (GEI), (Medina-Lara et al., 2018; Matíz et al.,
mediante enzimas especificas las cuales 2020). Se consideró entonces el compostaje
son producidas por los microorganismos para el manejo de la mortalidad, por ser una
nativos presente en los residuos orgánicos estrategia segura y eficiente para disponer
(Viteri-Flórez et al., 2015). Aunque este y aprovechar esta materia orgánica. Con el
proceso natural de descomposición es uso de los bioinoculantes permite de manera
eficiente, su duración es variable, ya que más eficiente, eliminar materiales de difícil

181
degradación como la queratina, elastina y de varios sistemas de microcosmos para la co
colágeno presentes en pelo, huesos y piel de degradación de biomasa lignocelulósica y
cerdos (Valenzuela-Sánchez, 2017; Won et al., polietileno de baja densidad (Moreno et al.,
2016; Mohan et al., 2017; Ferraro et al., 2016). 2019; Castillo et al., 2021).

El estudio de los procesos de biotransformación 11.1.3. Biogas y biodigestatos

a través de procesos de compostaje se
puede realizar a escala de laboratorio, piloto Alternativamente al tratamiento aeróbico
e industrial. A nivel de laboratorio existen de compostaje para tratamiento de residuos
varias configuraciones de biorreactores que sólidos orgánicos, se cuenta con los sistemas
permiten simular y controlar el proceso de anaeróbicos, en los que la materia orgánica
transformación. Uno de los más utilizados presente en los residuos vegetales o animales
son los sistemas de microcosmos que son se descompone produciendo en su mayoría
un tipo de fermentadores sólidos estáticos gases (biogás), agua, nutrientes mineralizados
que pueden una configuración de columna y biomasa microbiana (biodigestato). El
o bandeja. Los biorreactores en forma proceso produce mínimo calor por lo que
de columna son sistemas cerrados que no se reconoce una fase termófila como sí
permiten evaluar el flujo de CO2 mediante ocurre en el compostaje. El balance general
respirometría y mantener el sistema libre de de la biodigestión establece como mayor
contaminantes; el suministro de aire no es producto es el biogás, el cual se estima
costoso y permite controlar diversos factores aproximadamente 70 %; este corresponde
del proceso. Los biorreactores tipo bandeja, a una mezcla de gases compuesta en su
se utilizan con mayor frecuencia en la mayoría por metano (CH4), seguido por CO2 y
producción de cuerpos fructíferos de hongos H2S entre otros gases; igualmente se produce
comestibles, posee las mismas ventajas del agua y un residuo solido o biodigestato
sistema de columnas y, adicionalmente, (30%), de alta humedad y con contenido de
facilita la transferencia de calor, aumenta la nutrientes y sólidos que lo convierten en un
superficie de contacto entre el oxígeno y la potencial producto de uso agrícola o forestal
biomasa (Castillo et al., 2021). En la figura 27 se (Martínez, 2017), (Figura 28).
presenta el montaje a escala de laboratorio

Figura 27.
Sistemas de microcosmos a escala de laboratorio. (A) Biomasa lignocelulósica inicial
y a los 60 días inoculadas con Pleurotus ostreatus. (B) Micelio de Pleurotus ostreatus colonizando
la biomasa lignocelulósica.

A B

Cortesía de Alejandra Moreno y Alejandra Castillo Toro.

182
 Figura 28.
Sistemas de microcosmos a escala de laboratorio. (A) Biomasa lignocelulósica inicial
y a los 60 días inoculadas con Pleurotus ostreatus. (B) Micelio de Pleurotus ostreatus colonizando
la biomasa lignocelulósica.

11.1.4. Sustratos de siembra relacionada con las tasas de descomposición

y afecta la proporción C/N (Barrett et al.,
Los sustratos de siembra son materiales 2016; Raviv, 2005; Pascual et al., 2018). Otras
distintos al suelo, minerales u orgánicos, consideraciones importantes al momento de
que se emplean para el cultivo de plantas, elegir un sustrato de siembra son los costos y
abarcando desde su germinación hasta los el impacto al medio ambiente.
siguientes estados fenológicos. Un sustrato
de siembra debe escogerse considerando La turba ha sido el sustrato más empleado
distintas características físicas, químicas y para cultivo, sin embargo, en los últimos años
biológicas que garanticen su calidad y el se han buscado otros sustratos de siembra que
crecimiento adecuado de las plantas. Es sean de bajo costo y generen poco impacto
necesario que las partículas del sustrato ambiental. Existen distintos insumos orgánicos
le proporcionen estructura, porosidad, que pueden ser empleados para este fin
densidad aparente y capacidad de retención (Schmilewski, 2008). Materiales lignocelulósicos
de agua apropiadas. En cuanto a las como cortezas, virutas, aserrines y fibra de
propiedades químicas, se deben considerar coco, presentan características físicas que les
principalmente la conductividad eléctrica, permiten constituir un insumo apropiado para
la capacidad de intercambio catiónico, la la siembra de plantas luego de un proceso de
disponibilidad de nutrientes y el pH que debe transformación u oxidación. Otros materiales
presentar valores entre 5,5 y 6,5. El sustrato que se pueden transformar a través de
también debe estar libre de patógenos que procesos de compostaje y ser empleados
puedan afectar el desarrollo vegetal y la como sustratos de siembra incluyen residuos
salud humana. Por otra parte, su madurez orgánicos provenientes de la industria y los
garantiza que no estén presentes compuestos estiércoles animales.
fitotóxicos mientras que su estabilidad está

183
 La evaluación de la calidad de los sustratos de siembra,
además del análisis de sus características físicas, químicas
y microbiológicas, debe incluir su efecto sobre diferentes
etapas del crecimiento vegetal. Para llevar a cabo estos
estudios, se puede comparar el crecimiento y desarrollo de
distintas plantas en el sustrato de interés, retándolo con un
sustrato utilizado convencionalmente para su cultivo.

•La turba es un sustrato que se obtiene a Para el cultivo de cada especie vegetal,
través de un proceso de descomposición es importante proporcionar los nutrientes y
anaeróbica. Es ampliamente usado condiciones adecuados para su crecimiento.
ya que presenta propiedades físicas, Por eso, luego de escoger un determinado
químicas y biológicas deseables, aunque sustrato de siembra, usualmente se aplican
estas varían de acuerdo con su origen y las aditivos como fertilizantes y controladores
condiciones bajo las cuales fue producido. de plagas de origen químico o biológico
Por ejemplo, entre más descompuesto, su (Schmilewski, 2008). En las etapas de vivero,
capacidad de retención de agua puede por ejemplo, dependiendo de la planta y
disminuir (Barrett et al., 2016). sus requerimientos nutricionales, se formula
fertilización con productos minerales como
•La fibra de coco es un residuo de la la roca fosfórica o con insumos orgánicos
industria de la planta Cocos nucifera. Es de origen vegetal o animal, tales como
un sustrato con un balance apropiado la harina de alfalfa, la harina de cáscara
de aireación y agua. A pesar de esto, de cacao, residuos de café y compost de
su alta conductividad eléctrica, baja estiércol animal. Los productos basados en
capacidad de intercambio catiónico y microorganismos promotores del crecimiento
alta proporción C/N pueden afectar su vegetal también pueden emplearse para
calidad (Stewart-Wade, 2020). Además, la enriquecer los sustratos generando beneficios
fibra de coco algunas veces debe pasar relacionados con la disponibilidad de
por tratamientos que la estabilicen, lo que nutrientes para las plantas y el control de
aumenta su costo (Barrett et al., 2016). enfermedades (Pascual et al., 2018).

•La corteza, el aserrín y la viruta se obtiene La evaluación de la calidad de los

de los residuos provenientes de la industria sustratos de siembra, además del análisis
de la madera. Sus variables propiedades de sus características físicas, químicas y
físicas, químicas y biológicas se han microbiológicas, debe incluir su efecto
estudiado para evaluar su potencial uso sobre diferentes etapas del crecimiento
como sustrato de siembra. La corteza es vegetal. Para llevar a cabo estos estudios,
sometida a almacenamiento por largos se puede comparar el crecimiento y
periodos de tiempo o a compostaje para desarrollo de distintas plantas en el sustrato
mejorar sus propiedades, que son distintas de interés, retándolo con un sustrato
dependiendo del origen del material y el utilizado convencionalmente para su cultivo.
tamaño de las partículas, así como del tipo Usualmente, además de determinar variables
y duración del proceso de transformación relacionadas con la germinación de las
(Pascual et al., 2018). semillas, se miden variables como la biomasa
vegetal (Barrett et al., 2016). En la figura 29
se presenta algunos de los ensayos que se
realizan para evaluar los sustratos de siembra
antes de emplearlos en campo.

184
 Figura 29.
Crecimiento de en diferentes sustratos de siembra: a y b. Semillas germinadas en papel de
germinación y turba; c y d. Plantas de tomate sembradas en dos sustratos orgánicos 20 días
después del trasplante.

A B

Cortesía de Lucía Ana Díaz Ariza.

185
11.1.5. Conversión termoquímica o pirolisis- biochar •Elaborar y caracterizar un biochar a
partir de la conversión térmica a bajas
El proceso de pirólisis, es un tratamiento de temperaturas de residuos sólidos
térmo-químico, que se le realiza a la biomasa orgánicos.
o residuos sólidos orgánicos, para obtener
un nuevo material o energía. Se basa en la •Evaluar un método rápido para
conversión de los materiales mediante un determinar la producción de metano en
proceso termoquímico en una atmósfera sistemas anaeróbicos.
deficiente de oxígeno en los tres estados de
la materia; sólido (char), líquido condensado 11.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo
(biocombustibles, biocrude y alquitrán) y no
condensado (gas) (Blanco et al., 2021). El 11.3.1. Sistemas de transformación de materiales
biochar es un producto sólido rico en carbono, orgánicos bajo fermentación sólida aeróbica en
extraído a partir de la descomposición de microcosmos
materia orgánica mediante un proceso
termoquímico (Cha et al., 2016). •Reactor para fermentación sólida de
0,75 L.
Varios autores han reportado que la
aplicación de biochar a el suelo presenta •Tapones de caucho con tres orificios.
enormes beneficios ambientales y
ecológicos, la fijación de carbono, aporta •Puertos de entrada y salida de vidrio.
a la capacidad de intercambio catiónico
y nutrientes, así como a la aireación y •Manguera siliconada.
estructura del suelo estimulando la actividad
biológica de diferentes comunidades •Frascos de vidrio de 10 mL.
microbianas en suelo, sin embargo, también
debe evaluarse el contenido de metales •Residuos de cosecha, hojarasca,
pesados que podría limitar su uso. Por otro residuos de cocina, estiércol o materiales
lado, el biochar sirve como soporte para orgánicos disponibles.
inmovilizar microorganismos benéficos
con aplicación agrícola, como bacterias •Agua destilada.
promotoras de crecimiento vegetal, fijadores
de nitrógeno, bacterias fosfato solubilizadoras •Solución de glucosa y extracto de levadura
y microorganismos bio controladores de al 0,1 % (m/v) (anexo B, numeral 6).
diferentes tipos de fitopatógenos (Moreno et
al., 2019; Blanco et al., 2021; Céspedes et al., •Pinzas.
2021).
•Espátula.
11.2. Objetivos
11.3.2. Evaluación del crecimiento vegetal en
Objetivo general sustratos de siembra

•Evaluar modelos a escala de laboratorio •Semillas de tomate (Solanum lycopersicum).

para transformar residuos orgánicos para
la obtención de bio productos de mayor •Sustratos: Fibra de coco, corteza o aserrín
valor agregado. y turba.

Objetivos específicos •Tubos de ensayo de vidrio de 30 x 120 mm.

•Evaluar la transformación de residuos •Frascos de vidrio de 160 mL de capacidad.
orgánicos sólidos empleando sistemas
de fermentación en sólido aeróbicos a •Calibrador.
escala de microcosmos.
•Bolsas de papel.

186
 • Cajas Petri. •Agua destilada.

•Papel absorbente. •Kit para la detección de lignina soluble HACH.

•Papel aluminio. 11.4. Equipos

•Pipeta. •Termo balanza.

•Pinzas. •Balanza de tres dígitos.

•Etanol (20% v/v), (anexo B, numeral 7). •Horno eléctrico (0 a 400ºC).

•Agua destilada estéril.
•pHmetro.
•Hipoclorito de sodio (2,5% v/v),(anexo B,
numeral 8). •Mufla de 0 a 800ºC.

11.3.3. Producción de biochar •Campana de anaerobiosis.

•Bandejas de aluminio •Espectrofotómetro UV/VIS.

•Biomasa lignocelulósica como residuos •Centrífuga que permita obtener hasta
de poda, residuos de madera, residuos 8000 rpm.
post-cosecha.
•Incubadora.
•Campanas de Anaerogen 3M® o
sistemas artesanales para disminuir la 11.5. Metodología
concentración de O2.
11.5.1. Sistemas de fermentación en sólido
•Sobres de Anaerogen 3M® aeróbicos a escala de microcosmos in vitro

•Pinzas. • •Colocar 50 g de biomasa lignocelulósica

picada en bandejas de aluminio y
•Espátula. esterilizar en autoclave por un ciclo a
120ºC/15 psi durante 1 hora.
11.3.4. Caracterización física y química de
residuos orgánicos y bio-productos •Colocar el sustrato en cada reactor
y esterilizar por un ciclo a 120ºC/15 psi
•Agua destilada. durante 1 hora.

•Cápsulas de porcelana. •Inocular 5 mL de biomasa peletizada
bajo condiciones de esterilidad producida
•Tubos Falcon de 50 mL. como se menciona en el capítulo 4 del
presente libro.
•Papel de filtro.
•Mezclar con el baja lenguas el sustrato y
•Embudos. la biomasa.

•Frasco Schott o similar de 250 mL. •Tapar el reactor con el tapón de caucho
que sirve como soporte para los puertos
•Espátulas. de entrada y salida (estas partes deben
ser previamente esterilizadas por un ciclo
•Vidrios de reloj. a 120ºC/15 psi durante 15 minutos).

•Hidróxido de potasio 0,5 M (anexo B,
numeral 5).

187
 •Conectar las mangueras de siliconada con ayuda de las pinzas y cubrir con
a cada uno de los 3 puertos del tapón y papel aluminio.
conectar el filtro de 0,22 micras.
•Llevar los tubos a incubación a temperatura
•Conectar la trampa de NaOH al puerto de 20-25°C y fotoperiodo de 12 horas.
de salida de CO2.
•Observar diariamente y eliminar el
•Realizar aireación conectando la material que presente contaminación
manguera del puerto de aireación al con hongos.
motor de pecera.
[Link]. Medición del crecimiento vegetal
11.5.2. Evaluación del crecimiento vegetal en
sustratos de siembra •Luego de 20 días, registrar la
supervivencia y medir el crecimiento de
[Link]. Preparación del material vegetal las plantas diligenciando el formato al
final de esta sección. Luego de medir
•Lavar las semillas con agua durante 15 la altura y la longitud radical con el
minutos. calibrador, disponer las plantas en las
bolsas de papel (1 planta/bolsa) y llevar
•Adicionar etanol (70 %) durante 30 segundos. a secado en horno durante 72 horas a
70ºC. Finalmente, determinar el peso
•Lavar tres veces con agua destilada estéril. del material vegetal seco. Las plantas
pueden alcanzar alturas superiores a la
•Adicionar hipoclorito de sodio (2.5%) del tubo de ensayo (Figuras 29c). Destape
durante 5 minutos. el tubo y continúe con la incubación.

•Lavar tres veces con agua destilada 11.5.3. Producción de biochar
estéril durante 5 minutos para un tiempo
total de lavado de 15 minutos. •Tamizar la biomasa a transformar usando
tamices No 10, 12 y 20, para obtener un
•Para el ensayo se utilizarán 15 plántulas, tamaño de partícula de 4-5±1 mm.
suponiendo un porcentaje de germinación
del 60%, disponer 25 semillas en una caja •Se secó 24 horas a 70ºC y se preservó en
Petri de manera equidistante sobre papel bolsa plástica sello pack para controlar la
absorbente humedecido con agua humedad.
destilada estéril o en la turba que utilizará
como control (Figuras 30a y 30b). •Colocar 100 ± 5 g del material crudo en
recipiente de aluminio de 250 g.
•Envolver las cajas Petri con papel
aluminio e incubar 5 días a 20-25°C. •Colocar el recipiente en una campana
de anaerobiosis de 2,5 L (3M® u otra).
[Link]. Preparación de los sustratos de siembra
•Colocar dentro de la campana con un
•Añadir el sustrato de siembra a los sobre de Anaerogen 3M®.
tubos de ensayo hasta llenar ¼ del tubo.
Preparar cinco repeticiones por sustrato. •Tapar la campana y realizar el
desplazamiento del O2 por el catalizador
•Adicionar agua con la pipeta del sobre por 12 horas a 19±2 ºC.
cuidadosamente hasta que el sustrato
esté húmedo. •Transferir el recipiente a una mufla del
20L y cerrar la tapa de la mufla.
[Link]. Siembra del material vegetal
•Ajustar las condiciones de proceso a
•Cuando las semillas hayan germinado, razón de 300±5 ºC por 1 hora con una
disponer una en cada uno de los 15 tubos velocidad de calentamiento de 10ºC min.

188
 •Dejar enfriar la mufla y retirar el recipiente 11.5.6. Determinación de materia orgánica y
de aluminio. carbono orgánico total (COT) para materiales
sólidos
•Colocarlo nuevamente dentro de la
campana de anaerobiosis o dentro de un •Pesar 10 g de biomasa lignocelulósica
desecador para que no adquiera humedad. y secar por 24 horas a 70ºC. También se
puede secar en termobalanza.
•Realizar la caracterización física y química
del material inicial y el biochar producido. •Colocar 2 g del material seco en una
cápsula de porcelana previamente pesada.
11.5.4. Determinación del porcentaje de humedad
•Introducir la cápsula con el material a la
•Pesar la cápsula de porcelana y registrar mufla y ajustar la temperatura a 400ºC.
el peso.
•Realizar la ignición de material por 3
•Adicionar a la cápsula de porcelana 5 g horas y dejar enfriar la mufla una vez
de biomasa inicial o biochar. cumplido el tiempo.

•Registrar el peso inicial húmedo. •Pesar nuevamente la capsula y registrar
el peso pos ignición.
•Secar la muestra en termobalanza hasta
peso constante. •Determine el porcentaje de materia
orgánica y carbono orgánico total
•Dejar enfriar la muestra, pesar empleando la ecuación 30 y 31.
nuevamente y registrar el porcentaje de
humedad. Materia
orgánica(%) = (Peso inicial-Peso final) X100
•Calcular el porcentaje de humedad
(Ecuación 30)
empleando la siguiente ecuación 29.

(Peso inicial-Peso final) X100

(Peso inicial-Peso final) COT(%) =
Humedad(%) = X100 1,724
Peso inicial
(Ecuación 31)
(Ecuación 29)

11.5.5. Determinación de pH 11.5.7. Determinación del grado de condensación

E4/E6
•Pesar 10 g de biomasa lignocelulósica.
•Pesar 4 g de material.
•Colocarlos en 40 mL de agua destilada.
•Disponerlos en un tubo Falcon de 50 mL
•Agitar la mezcla en shaker por 20 minutos. con 40 mL de KOH 0,5 M.

•Filtrar la muestra empleando papel filtro •Incubar a temperatura ambiente
Whatman No 3 y embudo. durante 24 h a 150 rpm.

•Recuperar el filtrado en un vaso de •Centrifugar a 8000 rpm por 15 min y
precipitado de 100 mL. Si quedan recuperar el sobrenadante en un tubo limpio.
sedimentos volver a filtrar.
•Guardar en refrigeración a 4ºC.
•Determina el pH de la muestra.
•En espectrofotómetro visible leer la
longitud de onda a 465 nm y 665 nm,
empleando como blanco agua destilada.

189
 •Determine la relación de condensación orgánico para viveros. Trabajo de grado en
E4/E6, dividiendo el valor de la absorbancia Microbiología Industrial. Pontificia Universidad
a 465 nm sobre el valor de absorbancia a Javeriana. 1-76.
665 nm.
Ferraro, V., Anton, M., Santa, V. (2016). The
11.6. Referencias “sisters” α-helices of collagen, elastin and
keratin recovered from animal by-products:
Blanco, A., Chacon, M., Quintero, M., Poutou, Functionality, bioactivity and trends of
R., Diaz, L., Devia, C., Castillo, L., Toledo, application. Trends in Food Science &
D., Pedroza, A. (2020). Co-inoculation of Technology. 51, 65-75.
phosphate solubilizing bacteria in biochar
their effects in Allium cepa L. Sometido 2020. Instituto Colombiano de Normas Técnicas
Camacho, A., Martínez, L., Ramírez, H., y certificación ICONTEC. Norma técnica
Valenzuela, R., Valdés, M. (2014). Potencial de colombiana 5167. Productos para la industrial
algunos microorganismos en el compostaje agrícola, productos orgánicos usados
de residuos sólidos. Terra Latinoamericana. como abonos o fertilizantes y enmiednas
32(4), 291-300. o acondicionadores de suelos. Segunda
edición. 2011. 1-51.
Cha, JS., Park, SH., Jung, SC., Ryu, C., Jeon,
JK., Shin, MC., Park, YK. (2016). Production Juul, N., Münster, M., Ravn, H., Söderman,
and utilization of biochar: A review. Journal of M.L. (2013). Challenges when performing
Industrial and Engineering Chemistry. 40, 1-15. economic optimization of waste treatment:
Chandra, R., Castillo, C., Delgado, P., Parra, A review. Waste management. 33(9), 1918-
R. (2018). A biorefinery approach for dairy 1925.
wastewater treatment and product recovery
towards establishing a biorefinery complexity Lim, SL., Lee, LH., Wu, TY. (2016). Sustainability
index. Journal of Cleaner Production. 183, of using composting and vermicomposting
1184-1196. technologies for organic solid waste
biotransformation: recent overview,
Alejandra Castillo-Toro, Juan F. Mateus- greenhouse gases emissions and economic
Maldonado, Diana N. Céspedes-Bernal, analysis. Journal of Cleaner Production. 111,
Leonardo Peña-Carranza, Adriana I. Páez- 262-278.
Morales, Raúl A. Poutou-Piñales, Juan C.
Salcedo-Reyes, Lucía A. Díaz-Ariza, Laura C. Queiroz, N., Pereira, T., Martinez, L., De Castro.
Castillo-Carvajaf, Aura M. Pedroza-Rodríguez, C., Souza, E. (2017). Microbial additives
Luis D. Gómez-Méndez. (2021). Evaluation of in the composting process. Cîencia e
two microcosm systems for co-treatment of Agrotecnologia. 41(2), 159-168.
PEBDoxo-lignocellulosic biomass and Biochar
production. 3 Biotech. Martínez, M., Aprovechamiento de Residuos
y Biomasa para producción de Bioenergía y
Elsayed, M., Ran, Y., Ai, P., Azab, M., Mansour, fertilizantes orgánicos: economía circular de
A., Jin, K., Abomohra, AEF. (2020). Innovative los residuos. Mundoagro 2017. Chile.
integrated approach of biofuel production
from agricultural wastes by anaerobic Medina-Lara, M., Quintero-Lizaola, R.,
digestion and black soldier fly larvae. Journal Espinoza-Victoria, D., Alarcón, A., Etchevers-
of Cleaner Production. 121495. Barra, J., Trinidad-Santos, A., Conde-Martínez,
F. (2018). Generación de un inoculante
Fourti, O. (2013). The maturity test during acelerador del compostaje. Revista Argentina
the composting of municipal solid wastes. de Microbiología. 50(2), 206-210.
Resources, Conservation and Recycling. 72,
43-49. Moreno, D., Gómez, L., Blanco, A., Castillo,
A., Herrera, L., Poutou, R., Salcedo, J., Díaz,
García, MF. (2018). Efecto de condiciones L., Castillo, L., Rojas, S., Pedroza, A. (2019).
de almacenamiento sobre la estabilidad Simultaneous bioconversion of lignocellulosic
química, física y microbiológica de un sustrato residues and oxodegradable polyethylene

190
by Pleurotus ostreatus to biochar production, Huisingh, D. (2016). Cleaner energy for
enriched with phosphate solubilizing bacteria cleaner production: modelling, simulation,
for agricultural use. PLOS ONE. optimisation and waste management. Journal
of Cleaner Production. 111, 1-16.
Mohan, N., Ammayappan, L., Sarma, D.,
Debnath, S., Tamuli, M. (2017). Characterization
of thermal properties of pig hair fiber. Journal
of Natural Fibers. 14(4), 459-465.

Stanley, H., Onwukwe, C. (2017). Microbial and

physicochemical properties of a regulated
compost. Journal of Advances in Biology &
Biotechnology. 16(1), 1-6.

Stephen, JL., Periyasamy, B. (2018). Innovative

developments in biofuels production from
organic waste materials: a review. Fuel. 214,
623-633.

Valenzuela-Sánchez, M. Manejo y disposición

de la mortalidad en granjas porcícolas.
Columna Porcicultura y Medio Ambiente.
2017.

Viteri-Flórez, P., Castillo-Guerra, D., Viteri-

Rosero, S. (2015). Desarrollo y evaluación de
un inóculo de bacterias celulolíticas. Revista
U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica.
18(1), 207-215.

Wainaina, S., Awasthi, MK., Sarsaiya, S., Chen,

H., Singh, E., Kumar, A., Kumar, S. (2020).
Resource Recovery and Circular Economy
from Organic Solid Waste using Aerobic
and Anaerobic Digestion Technologies.
Bioresource Technology. 122778.

Won, S., Park, J., Rahman, M., Park, K., Ra, C.

(2016). Co-composting of swine mortalities
with swine manure and sawdust. Journal
Compost Science & Utilization. 24(1), 42-53.

Xiang, L., Yi, Z. (2017). Lignin-enzyme interaction:

Mechanism, mitigation approach, modeling,
and research prospects. Biotechnology
Advances. 35, 466–489.

Xu, J., Jiang, Z., Li, M., Li, Q. (2019). A compost-

derived thermophilic microbial consortium
enhance the humification process and alters
the microbial diversity during composting.
Journal of Environmental Management. 243,
240-249.

Yong, JY., Klemeš, JJ., Varbanov, PS.,

191
192
Capítulo 12
INOCUIDAD MICROBIOLÓGICA E INDICADORES
DE MADUREZ EN ENMIENDAS ORGÁNICAS

193
194
Capítulo 12

INOCUIDAD MICROBIOLÓGICA E INDICADORES

DE MADUREZ EN ENMIENDAS ORGÁNICAS
Ana Karina Carrascal, Irina Barrientos, Viviana Gutiérrez Romero,
María Mercedes Martínez

12.1. Introducción tratados ya sea mediante compostaje o

vermicompostaje u otros tratamientos que
Se entiende por inocuidad la garantía de que permitan eliminar el riesgo microbiológico.
un alimento no causar enfermedad bajo las Los productores agrícolas, en especial los que
condiciones de uso previsto. En el campo son se acogen a la norma FSMA deberán llevar
numerosos los factores que pueden aportar los registros de producción deben incluir la
contaminación a los alimentos, y de especial fuente de todos los materiales utilizados en
cuidado cuando se trata de cultivos de el compost. Si los materiales animales (como
consumo directo como es el caso de hortalizas se utilizan harina de pescado y guano de
y frutas. Agua de riego contaminada, murciélago), se deben mantener registros
abonos y enmiendas orgánicas crudas, mal precisos de monitoreo de temperatura
procesados o sin tratamiento térmico, té de para demostrar que el compost alcanza las
compost procedente de estiércoles frescos, temperaturas óptimas según las pautas y
son fuentes de contaminación microbiana manejar el proceso y el producto de manera
por lo que para garantizar la inocuidad de que garantice no aporte de excesos de
los alimentos deben ser tratados antes de la nutrientes, organismos patógenos, metales
aplicación (Martinez 2020). pesados o residuos de sustancias prohibidas
que representen riesgo para la salud del
Por ello, en especial los estiércoles animales consumidor (Martinez 2020).
o mezclas con estos materiales, deben ser

195
El uso de estiércol crudo está restringido y el frutas y vegetales van en incremento. Esta
compost que contenga materiales animales preocupación ha generado mayores controles
debe producirse bajo ciertas condiciones y en los diferentes países sobre la calidad y los
alcanzar la madurez para garantizar la inocuidad. criterios que deben cumplir las EO.

12.1.1. Indicadores de madurez Los análisis microbiológicos constituyen un

aspecto importante para determinar la
La calidad de las enmiendas es usualmente calidad sanitaria de las enmiendas orgánicas.
definida en función de su estabilidad y Para ello, se utilizan grupos indicadores,
madurez. Sin embargo, el concepto de así como la detección de patógenos
calidad es más amplio. La mayoría de los bacterianos y parasitarios (Román et al., 2013).
parámetros que determinan la calidad de A continuación, se describe la importancia
los compost o vermicompuestos no son de estos grupos.
aplicables a todos los materiales y procesos
de estabilización-maduración (compostaje Coliformes termotolerantes (denominados
y/o vermicompostaje). El concepto de también fecales): Se denominan coliformes
madurez es utilizado haciendo referencia al termotolerantes a un grupo de bacterias Gram
grado de descomposición de las sustancias negativas perteneciente a la familia de las
orgánicas fitotóxicas producidas durante la Enterobacteriaceae capaces de fermentar
etapa de compostaje activa y se ha evaluado lactosa y producir indol a 44,5 °C, es un grupo
generalmente a través de bioensayos con de bacterias Gram negativas, esporuladas
plantas o semillas (Emino y Warman, 2004). que se encuentran en el intestino (EPA, 2006).
De acuerdo a la Agencia Ambiental de
Compost, sustratos orgánicos y estiércoles Estados Unidos (EPA por sus siglas en inglés)
tienen una alta proporción de su nitrógeno total la presencia de este grupo en un alto número
en la forma de amonio (NH4+) inmediatamente es un posible indicador de la presencia de
disponible para la planta. Esta proporción es bacterias patógenas como Salmonella,
superior en purines – (residuos líquidos: materia Shigella y E. coli productoras de toxina shiga.
fecal, orín y agua, residuos de industria de cerdo, También su presencia en concentraciones
pollos, vacuno, otros) y digestatos provenientes altas en una enmienda orgánica que se ha
de una digestión anaeróbica (producción sometido a un proceso térmico indica que
de biogás) en comparación a tratamientos este falló (no se alcanzaron las temperaturas
aeróbicos o parcialmente aeróbicos. Conocer requeridas o el tiempo de exposición fue
las concentraciones de N-NH4 es importante muy corto) (Wichuk & McCartney, 2007) o
para determinar las dosis de aplicación y estimar se presentó una contaminación posterior
con mayor exactitud las dosis de inhibidor de con agua contaminada durante las etapas
nitrificación (Martinez 2020). de enfriamiento o presencia de utensilios
contaminados. Se ha establecido que
12.1.2. Inocuidad microbiana en enmiendas recuentos por debajo de 1,000 UFC/g
orgánica (Unidades Formadoras de Colonia por gramo
de peso seco), se asocia con la destrucción
Las enmiendas orgánicas (EO) se definen como de los patógenos entéricos.
cualquier material adicionado al suelo para
mejorar sus propiedades físicas o químicas [Link]. Bacterias patógenas
(Reynells, 2016), dentro de estas enmiendas
se incluyen estiércoles estabilizados, compost En materias primas como los estiércoles
maduros y té de compost estables. Sin pueden encontrarse bacterias patógenas
embargo, las EO se han reconocido como para humanos y animales, siendo de especial
reservorio de bacterias patógenas como interés la presencia de Salmonella spp. Este
Escherichia coli productoras de toxina shiga microorganismo es uno de los principales
(STEC) y Salmonella, siendo un riesgo en los agentes de enfermedades transmitidas
cultivos de frutas y vegetales (Islam, 2005), por alimentos (ETA) y puede ser habitante
que impactan en el sistema de salud pública, normal del tracto digestivo de animales que
pues los datos recientes muestran que el incluyen aves (siendo el pollo un importante
número de brotes alimentarios asociados a reservorio), bovinos, porcinos entre otros

196
(INS, 2011). Igualmente es de interés E. coli Otros patógenos que se han encontrado en
productoras de toxina shiga (STEC), que se compost y que podrían llegar al hombre por el
ha asociado a enfermedades causadas por consumo de alimentos contaminados incluyen:
consumo de frutas y vegetales crudos o sus Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes,
productos no pasteurizados (Islam, 2005). Bacillus cereus y Cryptosporidium parvum
Estas bacterias tienen como reservorios (Beuchat, 2006). Recientemente una de las
diversos animales incluidos bovinos, ovinos grandes preocupaciones en salud pública
y ciervos, y pueden sobrevivir hasta 70 es la presencia de bacterias con genes de
días en el estiércol, dependiendo de la resistencia a antibióticos que se han reportado
concentración y la temperatura. Con relación en estiércoles, se ha demostrado la presencia
a este microorganismo existe evidencia de de coliformes con marcadores de resistencia a
un brote alimentario asociado al consumo macrólidos en cultivos de vegetales que fueron
de lechuga donde se estableció que la abonados con estiércoles que contenían estos
fuente de contaminación fue con escorrentía antibióticos (Marti, 2013). Por tanto, el uso de
de estiércol proveniente de una granja estiércol puede alterar la población general del
ganadera adyacente (caIFERT (California microbioma del suelo al aumentar la proporción
Food Emergency Response Team), 2008). de bacterias resistentes a los antibióticos en los
Adicionalmente, se ha logrado establecer cultivos (Reynells, 2016).
que el viento puede ser una fuente de
diseminación de patógenos provenientes Teniendo en cuenta lo anterior los
de estiércoles que se producen en granjas microorganismos que se buscan en EO para
pecuarias y se encuentran cercanas a granjas evaluar la inocuidad de estos insumos es
productoras de frutas y vegetales, por tanto, la detección de Salmonella y coliformes
existen recomendaciones que señalan que termotolerantes, existen diferentes métodos
la distancia mínima entre explotaciones referenciados para la detección de estos
ganaderas y cultivos de frutas y vegetales microorganismos, siendo ampliamente
debe ser al menos de 120 metros (LGMA, 2013). reconocidos los métodos establecidos por
la EPA.

Tabla 12.
Normas sobre los requisitos que deben cumplir las enmiendas orgánicas para cultivos.

Microorganismo Límite de tolerancia

México
Colombia NTC
Chile NCh 2880/04 Unión Europea NTEA-006-
5164/2004
SMA-RS-2006
A B
Coliformes
<1000 <2000
fecales <1000 UFC/g <1000 UFC/g <1000 UFC/g
NMP/g NMP/g
(termotolerantes)
Ausente Ausente
en 25g en 25g Ausente en 25 g Ausente en 25 g <3 NMP/g
Salmonella spp
del del del producto del producto base seca
producto producto
Enterococcus
ND ND 1000 NMP/g ND ND
faecalis
Huevos viales de Ausente Ausente
Ausente en 1g ND Menor a 10
helminto/Ascaris en 1g en 1g
Algunos países
Hongos Ausente según
ND ND incluyen Ausente
fitopatógenos especie vegetal
Plamodiosphora
Tomado de: Román et al., 2013 (FAO, 2013)

197
12.2. Objetivo •Agar infusión cerebro corazón BHI (anexo
A, numeral, 45).
Objetivo general
•Caldo Urea.
•Evaluar la calidad química y microbiológica
para enmiendas orgánicas. •Antisuero polivantente “0”.

Objetivos específicos 12.3.2. Método 1680. Número más probable

usando caldo lauril sulfato y medio EC para
•Establecer la calidad microbiológica de coliformes fecales. (U.S. EPA, 2004)
enmiendas orgánicas.
•Caldo Lauril Sulfato (anexo A, numeral, 46).
•Determinar la calidad química de
enmiendas orgánicas. •Caldo EC (anexo A, numeral, 47).

12.3. Materiales, reactivos y medios de cultivo •Tubos de 16x150 mm para rosca.

12.3.1. Método 1682 para Salmonella (U.S. •Frasco Schott de 250 mL.
EPA, 2006)
•Pipeta automática de 100-100 µL.
•Balanza digital con sensibilidad de 0,1 g.
12.3.3. Ensayos de fitotoxicidad de los
•Cubiertos estériles. biomateriales obtenidos con uso en fertilización

•Pipeta automática de 0.1-1 mL. •Semillas de rábano (Raphanus sativus),
lechuga (Lactuca sativa), pepino
•Pipeta automática de 5-10 mL. cohombro (Cucumis sativus).

•Puntas estériles (20-200 µL). •Cajas de Petri o recipientes plásticos o
de vidrio.
•Puntas estériles (5-10 mL).
•Papel filtro o toallas absorbentes.
•Asa desechable de 1 µL.
•Compost fresco, compost maduro,
•Tubos de vidrio 16 x 150 Tapa rosca. biochar, estiércol, o materiales orgánicos
transformados y a emplear en fertilización.
•Cajas de Petri 15 mm x 90 mm.
•Agua preferiblemente destilada o aireada.
•Agua bufferada peptonada (anexo B,
numeral 2). •Incubadora a 25°C.

•Caldo Tripticasa de Soya (TBS), (anexo A, •Bolsas plásticas negras o lugar oscuro.
numeral 40).
12.3.4. Actividades enzimáticas en enmiendas
•Medio Rapapport semisólido (anexo A, orgánicas
numeral 41).
[Link]. Actividad fosfatasa
•Agar xilosa, lisina y desoxiolato X.L.D.
(anexo A, numeral 42). •Material orgánico o enmienda orgánica.

•Agar tripe azucar hierro TSI (anexo A. •Un frasco Schott de 25 mL con
numeral 43). 4-p-nitrofenil fosfato (0,1 M) preparado en
una solución buffer universal MUB a pH 7,0
•Agar lisina hierro LIA (anexo A, numeral 44). (anexo B, numeral 17).

198
 •Un frasco Schott de 25 mL con NaOH •Espectrofotómetro.
(0,5M) (anexo B, numeral 18).
•Shaker.
•Un frasco Schott de 25 mL con CaCl2
(0,5M) (anexo B, numeral 19). 12.5. Metodología

•Un frasco Schott de 25 mL p-nitrofenol 12.5.1. NMP para Salmonella de acuerdo al

(0,01-0,06 µmol/L) (anexo B, numeral 20). método 1682 (EPA, 2006)

•Erlenmeyer de 250 mL. •Bajo condiciones de esterilidad a partir

de la muestra, se pesan 30 g con cubiertos.
•Papel filtro Whatman No 42.
•Se agregan a 270 mL de agua peptonada
•Embudo. bufferada y se agita para homogenizar la
muestra.
•Pipeta automática de 100-1000 µL.
Para realizar las diluciones:
•Puntas azules.
•A partir de la muestra homogenizada
[Link]. Actividad amonio monoxigensa agregar 20 mL en cada uno de los tubos
de la serie (5 tubos) que contienen 10 mL
•Material orgánico o enmienda orgánica. de Caldo TSB 3x (triple concentración).

•Un frasco Schott con buffer MUB pH 6,0 • A partir de la de la muestra homogenizada
(anexo B, numeral 17). agregar 10 mL en cada uno de los tubos
de la serie (5 tubos) que contienen 5 mL
•Frasco Schott de 25 mL con buffer Tris- de Caldo TSB 3x (triple concentración).
HCL buffer (0,05 M, pH 8,0) (Anexo B,
numeral 40). •A partir de la muestra homogenizada
agregar 1 mL en cada uno de los tubos
•Erlenmeyer de 250 mL. de la serie (5 tubos) que contienen 10 mL
de Caldo TSB 1x.
•Un frasco Schott de 25 mL con sulfato de
amonio 200 mM (anexo B, numeral 41). •Mezclar los tubos con movimientos de inversión.

•Papel filtro Whatman No 42. •Incubar los tubos por 24 ± 2 horas a 36°C
± 1,5°C.
•Frascho Schott de 25 mL con reactivo de
Griess-Illosvay (anexo B, numeral 15). •Después del tiempo de incubación, se
colocan 30 μL 5 veces de cada uno de
•Pipeta automática de 100-1000 µL. los tubos de caldo TSB en una caja de
Petri con medio Rappaport Vassiliadis
•Puntas azules. Semisólido (MSRV). No invertir las cajas.
Dejar que las gotas se absorban en el
12.4. Equipos medio durante aproximadamente 1 hora
a temperatura ambiente y llevar a incubar
•Balanza. a 42°C ± 0,5°C durante 16 a 18 horas.

•Incubadora. •Después del tiempo de incubación,
se revisan las cajas para observar la
•Horno a 100°C. motilidad que rodea las gotas; para
una motilidad positiva se debe observar
•Baño de agua termostadado. un “halo blanquecino” de crecimiento
aproximadamente de 2 cm desde el
• Vortex. centro de la mancha.

199
 •Usando un asa, tomar muestra en un [Link]. Análisis de datos y cálculos
halo desde el borde exterior de una
colonia del medio MSRV y aislar en una La densidad estimada de Salmonella se
caja de Petri con medio selectivo para calcula como el número más probable
Salmonella (XLD). (NMP) en base a peso seco. Los resultados
de Salmonella de muestras de biosólidos se
•Incubar las cajas del agar selectivo informan como NMP/4 g de sólidos totales
durante 24 horas a 36°C ± 1,5°C. (base de peso seco), que se calcula de
acuerdo con los siguientes pasos:
•Seleccionar las colonias que presentan
morfología característica de Salmonella •Selección de NMP/g (peso húmedo)
e inocular en los tubos de las bioquímicas
TSI (agar hierro triple azúcar), LIA (agar Obtenga el valor del índice NMP en la
lisina hierro) y caldo Urea. Utilizar la misma tabla del anexo C usando la cantidad
colonia para inocular los tres medios. de tubos positivos en las tres series
Inocular cada medio con los controles de diluciones significativas. Como las
positivo y negativo. muestras sólidas se diluyeron en la etapa
de homogeneización, la dilución debe
•Incubar durante 24 ± 2 horas a 36°C ± tenerse en cuenta al calcular el NMP/
1,5°C. mL (peso húmedo). Como resultado,
el valor del índice NMP de la Tabla 5 se
•Para confirmación mediante antisuero divide por 0,1 para tener en cuenta la
polivalente O: dilución de la muestra durante la etapa
de homogeneización. Para estos datos
Emulsionar el crecimiento en la porción use la tabla de NMP que se encuentra
inclinada de TSI (independientemente en el siguiente enlace [Link]
de si TSI es positivo o negativo) usando [Link]/sites/production/files/2015-07/
solución salina estéril. Colocar dos gotas documents/[Link].
del crecimiento emulsionado en el
portaobjetos. A la primera gota, agregar •Conversión a NMP/ g (peso seco) y
una gota de antisuero polivalente O. A cálculo de MPN/4 g de sólidos totales
la segunda gota, agregar una gota de (peso seco)
solución salina estéril (como comparación
visual). Observe bajo aumento para una Para la conversión a NMP/g de sólidos
reacción de aglutinación que indica un totales (peso seco), suponemos que,
resultado positivo. Se deben analizar los NMP/mL de peso húmedo = NMP/g de
controles positivos y negativos apropiados peso húmedo. Por lo tanto, podemos
de TSI para cada una de las muestras. calcular NMP/4 g de sólidos totales (peso
seco) para muestras líquidas utilizando
[Link]. Determinación de sólidos totales la siguiente ecuación 33. En la tabla 13
se presenta un ejemplo para realizar el
Determinación del porcentaje de peso en cálculo de NMP/g de Salmonella sp.
seco: Inmediatamente después de pesar la
muestra para el examen microbiológico, se NMP
pesan 4 g de muestra en un crisol o plato NMP (mL peso húmedo)x4
=
de evaporación de aluminio. Seque esta 4g (peso seco) Porcentaje solidos
alícuota durante la noche a 103°C a 105°C. totales (decimales)
Deje que se enfríe en un desecador antes de
pesar. Calcule el porcentaje de peso seco (Ecuación 33)
empleando la ecuación 32.

g de la muestra seca
% Peso seco = X100
g de la muestra inical
(Ecuación 32)

200
 Tabla 13.
Ejemplo para el cálculo para NMP/g de Salmonella sp

Volumen de la muestra
homogenizada Porcentaje
utilizado para inocular NMP/mL de sólidos NMP/4g
Ejemplo
tubos con TSB (peso húmedo) totales (peso seco)
(peso seco)
20 mL 10 mL 1 mL
(0,067) x (4)/(0,96)=0.28
D (solido) 0/5 1/5 0/5 0,0067/0,1=0,067 96%
MPN/4g
(1,181) x (4)/(0,18)=26
E (solido) 4/5 4/5 4/5 0,1181/0,1=1,181 18%
MPN/4g
(5,422) x (4)/(0,43)=50
F (solido) 5/5 2/5 2/5 0,5422/0,1=5,422 43%
MPN/4g

12.5.2. Método 1680. Número más probable •Mezcle los tubos con las diluciones y lleve
usando caldo lauril sulfato y medio EC para a incubar a 35°C +/- 0,5°C durante 24 horas.
coliformes fecales. (U.S. EPA, 2004) Terminado este tiempo, revise cada tubo
en busca de crecimiento y producción
•Diluciones: Pese 11 gramos de las de gas. Si presenta crecimiento, pero no
muestras y páselos a un recipiente con hay formación de gas, reincube durante
99 mL de agua buferada peptonada 24 horas más.
(dilución 10-1). A partir de esta dilución
tome 11 mL y páselos a 99 mL de agua •Confirmación: Cada uno de los tubos
buferada peptonada (dilución 10-2). que dieron positivos se pasa con asa
Continúe realizando diluciones hasta 10-5. redonda a caldo EC. Incubar en baño de
agua a 44,5°C durante 24 h. Después de la
•Inoculación: Marque 5 tubos de caldo LB incubación revise los tubos que produzcan
con campana de Durham con la dilución gas y presente crecimiento. Los tubos que
10-1, en cada tubo transferir con una cumplan con estas dos reacciones son
pipeta estéril un mL de la dilución 10-1. considerados coliformes fecales.

•Marque 5 tubos de caldo LB con campana •Calcule el NMP en peso seco revisando
de Durham con la dilución 10-2, en cada la tabla de NMP.
tubo transferir con una pipeta estéril un mL
de la dilución 10-2. •Selección de NMP/g (peso húmedo)
Obtenga el valor del índice NMP en la tabla
•Marque 5 tubos de caldo LB con de NMP. (Use la tabla del siguiente enlace
campana con la dilución 10-3 en cada [Link]
tubo transferir con una pipeta estéril un files/2015-07/documents/[Link])
mL de la dilución 10-3. usando la cantidad de tubos positivos en
las tres series de diluciones significativas.
•Marque 5 tubos de caldo LB con campana Como las muestras sólidas se diluyeron en
de Durham con la dilución 10-4, en cada la etapa de homogeneización, la dilución
tubo transferir con una pipeta estéril un mL debe tenerse en cuenta al calcular el
de la dilución 10-4. NMP/mL (peso húmedo). Como resultado,
el valor del índice NMP del anexo C se
•Marque 5 tubos de caldo LB con campana divide por 0,1 para tener en cuenta la
de Durham con la dilución 10-5, en cada dilución de la muestra durante la etapa
tubo transferir con una pipeta estéril un mL de homogeneización.
de la dilución 10-5.

201
 •Conversión a NMP/g (peso seco) y Realizar el conteo del
cálculo de MPN/4 g de sólidos totales
(peso seco). número de semillas
•Para la conversión a NMP/g de sólidos germinadas en cada
totales (peso seco), suponemos que,
NMP/mL de peso húmedo = NMP/g de caja incluyendo el
peso húmedo. Por lo tanto, podemos
calcular NMP/4 g de sólidos totales (peso testigo y estimar el % de
seco) para muestras líquidas utilizando la
ecuación 34:
germinación, teniendo en
cuenta que la germinación
NMP
NMP
=
(ml peso húmedo)x4 del blanco, será nuestra
4g (peso seco) Porcentaje solidos
totales (decimales) referencia (100 %) en la
(Ecuación 34) prueba del producto.
Tabla 14.
Ejemplo para el cálculo para NMP/g de E. coli

Volumen de la muestra
homogenizada Porcentaje
utilizado para inocular NMP/ml de sólidos NMP/4g
Ejemplo
tubos con TSB (peso húmedo) totales (peso seco)
(peso seco)
20 mL 10 mL 1 mL
(0,067) x (4)/(0,96)=0.28
D (solido) 0/5 1/5 0/5 0,0067/0,1=0,067 96%
MPN/4g
(1,181) x (4)/(0,18)=26
E (solido) 4/5 4/5 4/5 0,1181/0,1=1,181 18%
MPN/4g
(5,422) x (4)/(0,43)=50
F (solido) 5/5 2/5 2/5 0,5422/0,1=5,422 43%
MPN/4g

12.5.3. Fitotoxicidad (Basado en el método •Colocar 20 semillas/ caja de cualquiera

propuesto por Zucconi, 1981) de las especies vegetales mencionadas
en tantas cajas como materiales orgánicos
•Emplear semillas de Rábano rojo o considere para evaluar.
lechuga por ser altamente sensibles a
la presencia de sales u otros elementos •Caja 1, corresponderá al tratamiento 1
tóxicos en el material orgánico o sustrato. (material orgánico 1) y caja 2 al material
orgánico 2, etc. Incluir una caja como testigo.
•Realizar una mezcla 1:1 del material a
analizar con agua destilada. •Prepara las diluciones de los materiales 1:20
en agua (1 g de material en 20 mL de agua
•Preparar el blanco con solo agua destilada. preferiblemente destilada y desionizada).

•Recortar el papel absorbente al tamaño • Humedecer con 9 mL de la solución (agua
del recipiente en el que se hará la + material) teniendo en cuenta que la
prueba (cajas plásticas o cajas de Petri) y caja marcada como testigo solo llevará
colocarlo en el fondo del recipiente. 1 mL de agua (la misma empleada para
hacer la dilución). El método original
sugiere 10 repeticiones/ material.

202
 •Incubar a 25 +/-2°C en oscuridad (cubrir •Cuantificar el largo de la raíz luego
las cajas con papel aluminio o llevarlas a de 5 días de incubación y expresar los
incubadora) / 48 horas. resultados como Índice de germinación
(IG) empleando la ecuación 36:
•Realizar el conteo del número de semillas
germinadas en cada caja incluyendo (%G - %L)
el testigo y estimar el % de germinación, Indice de germinación (IG) =
100
teniendo en cuenta que la germinación
del blanco, será nuestra referencia (100 (Ecuación 36)
%) en la prueba del producto. Emplear
la ecuación 35 para determinar el Dónde: (%G): porcentaje de germinación
porcentaje de germinación. (% L) porcentaje de crecimiento de las raíces,
ambos respecto al control hecho con agua
Compost destilada, y dividir por cien.
% germinación = X100
Control
•Luego se reporta el porcentaje de
(Ecuación 35) germinación y se indica si el material es
fitotóxico o no (Figura 30). Para indicar si
Dónde: Compost: Número de semillas germinadas un material es No fitotóxico el porcentaje
en la caja con el extracto de compost de germinación debe ser superior al
85%. Cuando el material presenta
Control: Número de semillas germinadas en el características fertilizantes el índice de
control germinación es superior a 100%.

Figura 30.
Ensayos de fitotoxicidad para materiales orgánicos frescos y transformados.

A B

C D

203
12.5.4. Actividades enzimáticas •En un tubo limpio colocar 1 mL de
sobrenandante con 4 mL de buffer MUB a
[Link]. Actividad fosfatasa pH 6.0 o buffer fosfato y 1 mL de sulfato de
amonio 200 mM.
•Pesar 10 g de material a investigar.
•Incubar en agitación por 1 h a 35ºC y 120
•Extraer la enzima con buffer MUB, pH 6,0. rpm.

•Filtrar con el papel filtro No 42. •Frenar la reacción por refrigeración a

4ºC por 5 minutos.
•Recuperar la sobrenandante.
•Filtrar con papel filtro No 42.
•En un tubo limpio colocar 250 µL del
sustrato 4-p-nitrofenil fosfato (0,1 M) •Transferir 1 mL del sobrenadane y adicionar
preparado en una solución buffer 100 uL de Griess-Illosvay. Se forma un color
universal MUB a pH 7.0. rojo o rosado.

•Incubar por 1 hora a 37ºC en baño •Leer la absorbancia a 520 nm.

serológico.
•Transformar la concentración de amonio
•Adicionar añadieron 360 µL de NaOH (0,5 empleando la curva patrón (0,01 - 0,06
M) y 86 μL de CaCl2 (0,5 M) para detener µmol/L).
la reacción enzimática.
•Calcular la actividad enzimática que
•Centrifugar a 3578 x g por 10 min a 19ºC. se define como: una unidad amonio
monoxigenasa (1UP) es igual a una µmoL
•Leer la absorbancia de la muestra a una min/L de para nitrofenol liberado, bajo las
longitud de onda de 400 λ400 nm. condiciones de reacción.

•Transformar a concentración de p-nitrofenol •Relacionar con el peso de la muestra

empleando la curva patrón (0,01 - 0,06 analizada para expresar en UP/g.
µmol/L).
12.6. Referencias
•Calcular la actividad enzimática que
se define como: una unidad fosfatasa Agriservice SPA, (2019). Procedimiento operativo
(1UP) es igual a una µmoL min/L de estandarizado ASP009. Determinación de
p-nitrofenol liberado, bajo las condiciones N-NH4 soluble en Purines y biodigestatos.
de reacción. Versión digital. 3 p. Santiago, Chile

•Relacionar con el peso de la muestra Blanco-Vargas, A., Rodríguez-Gacha, LM.,

analizada para expresar en UP/g. Sánchez-Castro, N., Garzón-Jaramillo, R.,
Pedroza-Camacho, LD., Poutou-Piñales, RA.,
[Link]. Amonio monoxigenasa Rivera-Hoyos, CM., Díaz-Ariza, LA., Pedroza-
Rodríguez, AM. (2020). Phosphate-solubilizing
•Pesar 1 g de material a investigar. Pseudomonas sp. and Serratia sp., co-culture
for Allium cepa L. growth promotion. Heliyon.
•Colocarlos en erlemeyer de 100 mL que Beuchat. (2006). Vectors and conditions
contiene 5 mL de Tris-HCL buffer (0.05M, for preharvest contamination of fruits and
pH 8.0). vegetables with pathogens capable of causing
enteric diseases. British Food Journal. 38-53.
•Agitar por 5 h a 30ºC
caIFERT (California Food Emergency Response
•Filtrar con el papel filtro No 42. Team). (2008). Investigation of the Taco John´s
Escherichia coli O157:H7 outbreak associated
•Recuperar la sobrenandante. with iceberg lettuce. Sacramento.

204
Emino, ER., Warman, PR. (2004). Biological U.S. EPA. (2006). “Method 1682: Salmonella in
assay for compost quality. Compost Science Sewage Sludge (Biosolids) by Modified Semisolid
and Utilization. 12, 342-348. Rappaport-Vassiliadis (MSRV) Medium.”.

Islam, MD. (2005). Survival of Escherichia coli Wichuk, & McCartney. (2007). A review of the
O157: h7 in Soil and on Carrots and Onions effectiveness of current time-temperatura
Grown in Fields Trreated with Contaminated regulation on pathogen inactivation during
Manure Compost or Irrigation Water. Food composting. Journal Enviromental Enginering
Microbiology. 22, 63-70. Science, 572-586.

INS. (2011). Perfil de riesgo de Salmonella spp Reithner, B., Ibarra-Laclette, E., Mach, R.L,
en pollo entero y en piezas. (C. R. Carrascal Herrera-Esttrella, A. (2011). Identification of
AK, Ed.) Bogotá: Imprenta Nacional de mycoparasitism-related genes in Trichoderma
Colombia. atroviride. Applied Environmental
Microbiology. 77, 4361-4370.
LGMA. (2013). Commodity specific food safety
guidelines for the production and harvest of XRomán, P., Martinez, M., Pantoja, A. (2013).
lettuce and leafy greens. California, USA. Manual del Compostaje del Agricultor.
Experiencias en America de Chile.
Martinez, M. (2020). Compost y materiales Organización de las Naciones Unidas para la
orgánicos efectos en la calidad de suelos Alimentación y la Agricultura- FAO Santiago
y cultivos. Proceedings XII Congreso de Chile.
Internacional de Compostaje. Colombia
Agosto 2020.

Ospina, PA., Romero-Perdomo, FA., Infante-

González, NG., Paredes-Céspedes, DM.,
Pedroza-Rodríguez, AM., Quevedo-Hidalgo,
B., Gutiérrez-Romero, V. (2020). Growth
conditions and determination of Ammonia
Monooxygenase (AMO) activity by cellular
lysis in autotrophic and heterotrophic nitrifying
strains. Revista Colombiana de Agronomía.

Marti, ST. (2013). Impact of manure fertilization

on the abundande of antibiotic-resistant
bacteria and frequency of detection of
antibiotic resistance genes in soil and
on vegetables at harvest. . Applied and
Environmental Microbiology. 5701-5709.

Reynells, S. (2016). Importance of Soil

Amendments: Survival of Bacterial Pathogen
in Manure and Compost Used as Organic
Fertilizers. Microbiol Spectr, 1-13.

U.S. EPA. 2006. “Method 1682: Salmonella

in Sewage Sludge (Biosolids) by Modified
Semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV)
Medium.” EPA-821-R-06-14.

U.S. EPA. (September de 2004). Method 1680

Fecal Coliforms in Sewage Sludge (Biosolids)
by Multiple-Tube Fermentation using Lauryl
Tryptose Broth (LTB) and EC Medium.

205
206
Capítulo 13
Aplicación ambiental de herramientas moleculares,
ómicas y biología sintética

207
208
Capítulo 13

Aplicación ambiental de herramientas moleculares,

ómicas y biología sintética
Claudia M. Rivera-Hoyos, Raúl A. Poutou-Piñales, Edwin D. Morales-Álvarez

13.1. Introducción ADN, han hecho posible el hallazgo de genes y

genomas de microorganismos que antes no era
La mayor diversidad biológica entre posible estudiar, llevando al descubrimiento de
los organismos vivos se encuentra en nuevos genes de extremófilos, genomas enteros,
los microorganismos, que debido a su operones de microorganismos no cultivables,
extraordinaria capacidad de adaptación nuevas enzimas o productos naturales con
genética y a las variaciones ambientales, posibles aplicaciones biotecnológicas (Rashid
han colonizado todos los ecosistemas. Sin & Stingl, 2015).
embargo, cerca del 70-80% de la diversidad
microbiana no es cultivable; situación que Las herramientas genómicas básicas que se
convierte a las técnicas moleculares y a los han aplicado para estudiar las poblaciones
nuevos métodos de estudio en ecología y comunidades microbianas naturales,
microbiana en valiosas herramientas para incluyen la secuenciación del ADN (Wang
comprender la función de los microorganismos et al., 2020), la reacción en cadena de la
en el medio ambiente y su posible utilidad polimerasa (PCR) y sus variantes (Wideman et
con fines biotecnológicos (Bodor et al., 2020; al., 2021), los sistemas de clonación de ADN
Maertens et al., 2021). en diferentes organismos (Caparco et al.,
2020; Díaz-Rincón et al., 2017; Rivera-Hoyos
Los desarrollos en las técnicas de separación et al., 2015; Santana-Pereira et al., 2020), las
celular, amplificación de ADN y plataformas técnicas de hibridización como la hibridación
de alto rendimiento para la secuenciación de fluorescente in situ (FISH) (Aistleitner et al.,

209
2020; Kuo et al., 2020; Morono et al., 2020), así o sintetizar organismos completos. Este
como las técnicas y programas para análisis nuevo campo se basa la concepción
bioinformáticos (Chen et al., 2020; Kherwa transformadora de que todos estos enfoques
& Bansal, 2018). Recientemente, se han pueden utilizarse tanto para estudiar
utilizado métodos novedosos que incluyen sistemas celulares como para facilitar su
técnicas basadas en ARNr, metagenómica manipulación con interés productivo (Meng
y metatranscriptómica (Knapik et al., 2020; & Ellis, 2020). Si bien la capacidad de diseñar
Lott et al., 2020; Mukherjee & Reddy, 2020), así microorganismos racionalmente ha existido
como el uso de microarreglos filogenéticos y desde hace más de medio siglo, con la
funcionales (Lekang et al., 2020) con el fin de revolución de la genómica y posteriormente
analizar muestras ambientales complejas. con la biología de sistemas en la década de
1990, la biología sintética surgió como una
Por otra parte, el estudio tradicional de disciplina rigurosa de ingeniería para diseñar,
los microorganismos se ha enfocado en el controlar y programar el comportamiento
análisis de las rutas metabólicas individuales celular (Cameron et al., 2014).
o de las respuestas moleculares individuales
bajo condiciones específicas. Este enfoque En este orden de ideas, la biología
ha sido de gran utilidad, pero, aunque sintética es considerada una extensión de
ofrece información muy relevante, resulta la tecnología del ADN recombinante o
en una aproximación reduccionista cuyo ingeniería genética, reconocida desde la
único objetivo podría ser un gen específico, década de 1970. Tecnología que ha sido el
un conjunto de genes o productos génicos, motor del desarrollo biotecnológico y que
quedándose corto al no considerar la continua en ascenso; lo que es evidente si se
dinámica natural de los organismos, su tienen en cuenta las reducciones drásticas
comportamiento en comunidades y cómo en los costos en secuenciación y síntesis de
una red de moléculas puede controlar el ADN, cebadores y sondas, así como por el
comportamiento ecológico de los mismos. desarrollo de herramientas de punta para
En contraste, la ventaja de la Biología de la edición del genoma, como el sistema
Sistemas es que ofrece distintas metodologías CRISPR/Cas9 (Montecillo et al., 2020; Tyagi
para describir de forma integral la respuesta et al., 2020; Zhang et al., 2021; Zhao et al.,
de un organismo a su entorno. Este nuevo 2020). Los enfoques de la biología sintética ya
campo de estudio reune otras ramas de las se han aplicado a la ingeniería metabólica
ciencias biológicas y ha sido potenciado por la de microorganismos para la producción
revolución de las ciencias “Ómicas”; las cuales de moléculas de importancia industrial y
permiten caracterizar y cuantificar grandes se muestran prometedores para acelerar
grupos de moléculas. Dicha caracterización, el descubrimiento y desarrollo de nuevos
también implica la necesidad de una elevada metabolitos secundarios de interés, por
capacidad de almacenamiento y análisis ejemplo, para abordar problemas actuales
de cantidades masivas de información en en salud humana, el suministro mundial
computadores, por lo que la comprensión de alimentos, la producción de energías
de sistemas biológicos completos también renovables y de enzimas con relevancia
ha evolucionado a la par con el poder de ambiental, entre otros (Katz et al., 2018).
cómputo y las herramientas bioinformáticas
(Madigan et al., 2019). Uno de los mayores retos en microbiología
ambiental consiste en entender el impacto
El desarrollo alcanzado en distintos campos los ambientes perturbados sobre la actividad
de la biología y la bioinformática ha llevado al de las comunidades microbianas nativas y
uso y diseño de herramientas que involucran en el vínculo con la diversidad genética y
también la ingeniería, dando como resultado funcional integrado al funcionamiento de los
a la hoy llamada Biología Sintética, que ecosistemas, lo que implica análisis a distintas
integra la biología molecular y la ingeniería escalas y de distintos componentes (densidad,
para diseñar y construir nuevos componentes diversidad, función, actividad, interacciones).
biomoleculares, redes y rutas metabólicas
(Benner & Sismour, 2005; Ren et al., 2020); lo En este capítulo, se resumen algunos de los
que hace con el objetivo de reprogramar aspectos fundamentales para el estudio

210
de las comunidades microbianas basado Estudiar los genomas microbianos
en el uso de herramientas moleculares, ha permitido avances en numerosos
ciencias ómicas, biología de sistemas y campos, desde el descubrimiento de
biología sintética. Herramientas y áreas genes que codifican enzimas resistentes a
que, en conjunto con las técnicas clásicas ambientes extremos como las presentes en
de estudio en microbiología, favorecen la microorganismos termofílicos, hasta genes
comprensión de la función que desempeñan que codifican para factores de virulencia
los microorganismos en el medio ambiente y en numerosos patógenos (Bouchez et al.,
su posible utilidad con fines biotecnológicos. 2016). Ha contribuído también al desarrollo o
perfeccionamiento de técnicas, por ejemplo,
13.2. Investigación del genoma en el diseño de microarreglos para el estudio
de la expresión génica, la detección de
El genoma corresponde a la totalidad de la eventos de transferencia horizontal de genes,
información genética, incluyendo los genes el descubrimiento de CRISPR, el entendimiento
codificantes, ARNs y secuencias reguladoras, de rutas metabólicas o al diseño de medios
así como las secuencias no codificantes. La de cultivo basados en los requerimientos
genómica, se refiere a la disciplina encargada específicos de los microorganismos (Li et al.,
de mapear, secuenciar, analizar y comparar 2020; Liu & Li, 2020; Lujan et al., 2020; Zhao et
los genomas (Madigan et al., 2019). Se han al., 2021).
secuenciado varios miles de genomas y el
número continúa en aumento ya que con El estudio del genoma inicia con la
frecuencia aparecen nuevos avances en las secuenciación de ADN, que se refiere a la
técnicas de secuenciación. Hoy en día se determinación del orden preciso (secuencia)
cuenta con las secuencias de ADN de más en el que están alineados los nucleótidos. La
de 50.000 Bacterias, Arqueas y Virus, muchas secuenciación se considera el corazón de la
de ellas consignadas en bases de datos de revolución de las ómicas y su tecnología avanza
proyectos metagenómicos a las cuales se con rapidez, ya que cada año aparecen
puede acceder de forma gratuita como nuevos métodos y los costos continúan
“Genomes OnLine Database” ([Link] disminuyendo, lo que ha facilitado el acceso a
[Link]) que es un recurso en línea para estas tecnologías. En la Tabla 15 se resumen los
el acceso integral a la información sobre principales métodos de secuenciación.
proyectos de secuenciación genómica,
metagenómica y los metadatos asociados,
en todo el mundo.
Tabla 15
Métodos de secuenciación del ADN.

Generación Método Características Referencias

Método desoxi de
Sanger (radioactividad o Tamaño de lectura: (Sanger & Coolson,
Primera generación
fluorescencia; amplificación 700-900 bases 1977)
del ADN)
Pirosecuenciación
454 (fluorescencia; Tamaño de lectura:
(Bibi & Azhar, 2021)
amplificación del ADN; 400-500 bases
masiva en paralelo)
Método Ilúmina/
Segunda Solexa (fluorescencia; Tamaño de lectura: (Argenta et al.,
generación amplificación del ADN; 50-100 bases 2021)
masiva en paralelo)
Método SOLiD
(fluorescencia; Tamaño de lectura: (Pandey et al.,
amplificación del ADN; 50-100 bases 2021)
masiva en paralelo)

211
 Tabla 15
Métodos de secuenciación del ADN.

Generación Método Características Referencias

Secuenciación de una Tamaño de lectura:
sola molécula, HeliScope hasta 55 bases
(Shi et al., 2021)
(fluorescencia; única (mejora la exactitud
molécula de ADN) para ADN fósil)
Tercera generación Secuenciación SMRT, Pacific
Biosciences (fluorescencia;
Tamaño de lectura: (Gallardo-Escarate
única molécula de ADN;
2500-3000 bases et al., 2021)
guíade onda de “modo
cero” o ZMW)
Scuenciación por Ion
Tamaño de lectura:
Torrent (cambios iónicos por (Fujita et al., 2021)
100-200 bases
pH; amplificación de ADN)
Cuarta generación Secuenciación por
nanoporos, Oxford
Tamaño de lectura:
Nanopore (corriente (Liem et al., 2021)
miles de bases
eléctrica; única molécula
de ADN; tiempo real)
Tomado y modificado de (Madigan et al., 2019; Rashid & Stingl, 2015)

Independientemente del método de Finalmente, pese al gran esfuerzo necesario

secuenciación utilizado, el paso siguiente en para generar la secuencia registrada de un
el estudio de los genomas corresponde al genoma, el resultado es un “listado de piezas”,
ensamblaje y anotación del genoma, que y para entender cómo funcionan las células, es
consiste en poner los fragmentos obtenidos en necesario conocer mucho más que los genes
el orden correcto, basados en el solapamiento presentes. Se requiere entonces, entender la
de algunas regiones para después eliminar expresión de genes, la función de los productos
los solapamientos (Boivin et al., 2020; Chen génicos, la función de las proteínas obtenidas,
et al., 2020; Necsulea, 2020). A continuación, intermediarios metabólicos y metabolitos que
la secuencia genómica ensamblada será se producen durante el crecimiento celular,
útil siempre y cuando sea anotada con el fin entre otros, lo que dió lugar al campo de la
de identificar genes y regiones funcionales, genómica funcional (Cordier et al., 2020;
donde el uso de herramientas bioinformáticas Goldberg & Parsley, 2020).
resulta fundamental para almacenar y
analizar las secuencias y estructuras de los 13.3. Genómica funcional
ácidos nucléicos y de las proteínas. Debido
al avance en los métodos de secuenciación, La genómica funcional utiliza los datos
se están generando datos más rápido de lo genómicos para estudiar la expresión y función
que pueden ser analizados adecuadamente; de genes y proteínas a escala global (en todo
por lo tanto, la anotación continúa siendo el el genoma o en todo el sistema), centrándose
cuello de botella de la genómica. Con esta en la transcripción génica, la traducción y
información, pueden obtenerse los Open las interacciones proteína-proteína, para lo
Reading Frames (ORFs) o marcos de lectura cual se utilizan métodos de alto rendimiento
abiertos, que consisten en las regiones que (Boolchandani et al., 2019). Por analogía
codifican para una proteína y que pueden con el término “genoma”, el complemento
ser identificados realizando búsquedas entero de ARN producido bajo determinadas
computarizadas para encontrar los codones condiciones ambientales se conoce como
de inicio y de parada en los ORFs (Boivin et “transcriptoma”. Una terminología similar
al., 2020; Chen et al., 2020; Necsulea, 2020). se aplica a los productos de la traducción,
el metabolismo y otras áreas relacionadas,
añadiendo el sufijo “ómica” (Figura 31).

212
 Figura 31.
Diferentes niveles de integración (ADN, ARN, proteínas y metabolitos) en las técnicas
de microbiología molecular para el estudio de un solo tipo de microorganismo
o comunidades microbianas.

ADN ARN PROTEÍNAS METABOLITOS

GENOMA TRANSCRIPTOMA PROTEOMA METABOLOMA

Información Mensajero/ Función

genética Ribosoma Celular

Análisis aplicados a un solo tipo de organismo

Transcriptómica Proteómica
Genómica Metabolómica

Análisis aplicados a comunidad de organismos

Metatranscriptómica Metaproteómica
Metagenómica Metabolómica

La metagenómica corresponde al estudio acuáticos son un reto para la metagenómica

de las secuencias genómicas de la totalidad precisamente por la alta diversidad de
de los organismos presentes en una muestra especies presentes, haciendo difícil el
o en un ambiente particular, donde se ensamblaje y manejo de gran cantidad
encuentran microorganismos cultivables de información. Al final de este capítulo, se
y no cultivables. Algunos ejemplos de propone una metodología para la aplicación
estudios metagenómicos enfocados en la de técnicas de análisis metagenómico para el
microbiología ambiental involucran el análisis estudio de la distribución temporal y espacial
de ambientes extremos como los drenajes de comunidades microbianas presentes
ácidos de minas, que pueden tener una en columnas de Winogradsky (Capítulo 7 –
poca diversidad de especies y de difícil Ciclo del Azufre). El estudio metagenómico,
cultivo y que debido a la metagenómica ha puede combinarse con la búsqueda de
sido posible aislar el ADN de las comunidades grupos funcionales específicos que brinden
allí presentes (Breitwieser & Salzberg, 2020; orientación con respecto a procesos
Fadiji & Babalola, 2020; Luan et al., 2020; microbianos importantes en la microbiología
Ribeiro Duarte et al., 2020; Rodriguez et al., ambiental. En la Tabla 16 se presentan
2020). En contraste, el estudio de ambientes algunos de los genes de uso frecuente para la
complejos como los suelos fértiles o ambientes evaluación de procesos microbianos.

213
 Tabla 16
Genes de uso frecuente para la evaluación de grupos funcionales microbianos específicos en
una muestra ambiental.

Proceso Enzima
Gen E.C. Referencias
metabólico codificada
Nitrato
narG [Link] (Unda-Calvo et al., 2019)
reductasa
nirK, nirS Nitrito reductasa [Link] (Wise et al., 2020)
Desnitrificación Óxido nítrico
norB [Link] (Torregrosa-Crespo et al., 2017)
reductasa
Óxido nitroso
nosZ [Link] (Carreira et al., 2020)
reductasa
Fijación
nifH Nitrogenasa [Link] (Luxem et al., 2020)
de nitrógeno
Amoniaco
Nitrificación amoA [Link] (Li et al., 2021)
monooxigenasa
Oxidación Metano
pmoA [Link] (Wallenius et al., 2021)
de metano monooxigenasa
Adenosina
Reducción aprA 5-fosfosulfato [Link] (Meyer & Kuever, 2007)
de sulfato reductasa
dsraB Sulfito reductasa [Link] (Pineau et al., 2008)
Producción Metilcoenzima
mcrA [Link] (Hua et al., 2019)
de metano M-reductasa
Degradación
Naftaleno
de compuestos nahA [Link] (Yang et al., 2014)
dioxigenasa
de petróleo
Alcano
alkB [Link] (Van Beilen et al., 2006)
hidroxilasa
Subunidad
Fotosíntesis M del centro
pufM (Código UniProtp0C0y9)
anoxigénica de reacción
fotosintético

Tomado y modificado de (Madigan et al., 2019)

La transcriptómica, por otra parte, se refiere y se disponen espacialmente según un patrón

al estudio global de la transcripción y se lleva conocido, genes o porciones de genes. Esta
a cabo mediante el análisis de todo el ARN tecnología requiere de la hibridación entre
generado en condiciones de crecimiento el ADN y el ARN. Los fragmentos de ácidos
diferentes. En los estudios transcriptómicos se nucléicos de cadena simple y cuya identidad
pueden usar micromatrices, que dependen se conoce se denominan “sondas” y suelen
de la hibridación entre el ADN y el ARN, o ser radioactivas o fluorescentes. Estos chips
mediante la secuenciación de ARN (ARN-Seq) génicos son de utilidad en distintos campos,
que depende de métodos de secuenciación dependiendo de los genes que se encuentren
de segunda generación o posteriores fijados al chip. La expresión génica global se
(Bouchez et al., 2016). Las micromatrices son controla mediante el ensamblado de una
pequeños soportes sólidos sobre los que se fijan matriz de oligonucleótidos complementarios

214
a cada gen en el genoma y usando luego la se generan (Knight et al., 2018). Finalmente,
población completa de ARNm como muestra la proteómica comparativa derivada de
(Madigan et al., 2019). El análisis por ARN- la proteómica estructural, permite modelar
seq, es un método donde se tienen todas la estructura de una proteína desconocida
las moléculas de ARN de una célula (para lo si está disponible la estructura 3D de una
cual se requiere que la secuencia genómica proteína cuya secuencia de aminoácidos
esté disponible); este método no sólo indicará coincida con ella al menos en el 30 % de sus
qué genes se transcriben sino cuántas secuencias. Para ello, es indispensable el uso
copias de ARN se obtienen. Es un método de herramientas bioinformáticas y el punto de
dispendioso ya que el ARN más abundante partida sería la base de datos de estructuras
en la célula es es ARN ribosomal, por lo que de proteínas, para la cual el acceso es libre
debe eliminarse dicho ARN o aumentar la (Protein Data Bank: [Link]
cantidad de ARNm en la mezcla inicial de
ARN total. Sin embargo, debido al progreso en La integración entre la proteómica y la
los métodos de secuenciación, el ARN-seq se genómica ofrece pistas importantes sobre
está convirtiendo en el métodos de elección la relación entre la expresión génica y la
para estudios globales de expresión de genes influencia de los estímulos ambientales
(Chazarra-Gil et al., 2021; Franzen & Bjorkegren, sobre los organismos y las comunidades
2020; Su et al., 2020; Yang et al., 2020). microbianas. Información fundamental
para la investigación básica que puede
Avanzando en los niveles de integración de tener efecto en la medicina, la agricultura
los estudios moleculares, la proteómica se (Bakshi et al., 2020), la biotecnología y la
refiere al estudio a nivel de todo el genoma protección del medio ambiente. Áreas en las
de la estructura, la función y la regulación que el conocimiento de la conexión entre el
de las proteínas de un organismo. Y su genoma y el proteoma y de cómo se regula
estudio en relación con el transcriptoma es esta conexión puede ayudar a solucionar
señalar las enzimas realmente responsables problemas ambientales, así como aportar
de la actividad de la comunidad en beneficios en la productividad agrícola.
condiciones específicas. El primer enfoque Finalmente, la metabolómica estudia los
de la proteómica inició con el uso de la metabolitos sintetizados por los organismos y
electroforesis bidimensional (2D) en gel de las comunidades microbianas y puede ser de
poliacrilamida. Esta técnica permite separar, utilidad para identificar los productos finales
identificar y estimar la abundancia de todas o intermediarios derivados de su actividad
las proteínas presentes en una muestra celular. metabólica (Knight et al., 2018). Una de
Alternativamente, en la versión preparativa las técnicas más usadas para el análisis
de la técnica, las proteínas pueden eluirse metabolómico corresponde a una variante
e identificarse por espectrometría de masas de la espectrometría de masas, que combina
para obtener un espectro característico de la espectrometría de masas y el tiempo de
cada organismo (Bouchez et al., 2016). Sin vuelo de los iones generados durante el
embargo, en la actualidad se usa cada vez análisis: MALDI-TOF (del inglés matrix-assisted
más la cromatografía líquida para separar laser desorption/ionization y time of flight)
mezclas de proteínas, siendo la cromatografía (Kim et al., 2021; Weis et al., 2020).
líquida de alta resolución o alta presión (HPLC,
High Pressure Liquid Chromatography) la más 13.4. Biología de sistemas
usada. En esta técnica, la muestra se disuelve
en el solvente adecuado y se pasa mediante La biología de sistemas consiste en la
presión por una columna empaquetada integración de los datos de la genómica
que constituye la fase estacionaria, que y otras ómicas para construir una visión
separa las proteínas por las variaciones en general de un sistema biológico (Bouchez
sus propiedades químicas como el tamaño, et al., 2016). Poder almacenar y analizar una
la carga iónica o la hidrofobicidad. Las gran cantidad de datos es indispensable
fracciones se recuperan a la salida de la y la bioinformática es esencial para este
columna y las proteínas de cada fracción se propósito, para la comprensión de sistemas
digieren con proteasas para identificar por biológicos completos, razón por la que está
espectrometría de masas los péptidos que evolucionando en paralelo y adquiriendo la

215
potencia y la capacidad de almacenamiento a partir de organismos modificados hasta
y manejo de datos en los ordenadores. La el diseño de microrganismos como E. coli
estrategia básica de la biología de sistemas con la capacidad de proteger a las abejas
es reunir un conjunto de datos ómicos y a de los parásitos (International Genetically
partir de ellos construir modelos informáticos Engineered Machine – iGEM: [Link]
del sistema de estudio. Estas observaciones Recientemente, los avances en la edición de
permiten predecir el comportamiento o las genomas como el uso de herramientas de
propiedades de un organismo o comunidad CRISPR/Cas9 han permitido editar el ADN de
que no eran observables con los estudios animales, plantas y microorganismos con una
preliminares. Una base de datos útil para tal precisión extremadamente alta; impactando
fin es la Enciclopedia de genes y genomas de forma revolucionaria la velocidad para
de Kyoto (KEGG: [Link] generar nuevo conocimiento ya que las
kegg/), que es una base de datos para técnicas tradicionales para la modificación
comprender las funciones y utilidades de de genomas solían ser dispendiosas y
alto nivel de los sistemas biológicos, como la demoradas. Ahora, debido a la disponibilidad
célula, el organismo y el ecosistema, a partir de nuevas técnicas de edición genética es
de información molecular, especialmente posible cambiar el código de una vida en
conjuntos de datos moleculares a gran el transcurso de unas pocas semanas. Este
escala, generados por la secuenciación descubrimiento significó el Premio Nobel de
del genoma y otras tecnologías de alto química en el año 2020 (Uyhazi & Bennett,
rendimiento, donde incluso se encuentran 2021) y no ha parado de evolucionar
módulos de los mapas y rutas metabólicas de revolucionar los campos de la ingeniería
una gran cantidad de organismos. genética y la biología sintética.

13.5. Ingeniería genética y biología sintética 13.6. Protocolo básico para el análisis de
la distribución temporal y espacial de
La ingeniería genética o tecnología del ADN comunidades microbianas en un modelo de
recombinante comprende múltiples técnicas ecosistema como las columnas de Winogradsky
para la manipulación del material genético
con el fin de alterar, reparar o mejorar la Las columnas de Winogradsky representan un
función de los organismos o para la producción ecosistema microbiano modelo, preparados
de moléculas de interés biotecnológico (Yan & mediante la adición de sedimentos a un
Fong, 2017). El término biología sintética hace cilindro transparente con suplementos
referencia al uso de la ingeniería genética adicionales e incubados en presencia
para crear nuevos sistemas biológicos a partir de luz (Capítulo 7 – Ciclo del Azufre). Los
de partes biológicas disponibles, obtenidas a gradientes ambientales se desarrollan dentro
partir de uno o varios organismos. Estas partes de la columna, creando diversos nichos que
biológicas (promotores, enhancers, operadores, permiten el enriquecimiento de bacterias
riboswitches, proteínas reguladoras, señales de específicas, simulando un ecosistema natural
secreción, terminadores de la transcripción, (Céspedes-Bernal et al., 2021). El cultivo
dominios enzimáticos, etc.) se denominan enriquecido poblacionalmente se puede
biobloques (del inglés biobricks) como usar par estudiar la estructura y función de
analogía a los bloques de construcción para las comunidades bacterianas. Para ello, se
construir un edificio (Meng & Ellis, 2020). La puede llevar a cabo el estudio del gen 16S
biología sintética se encarga de unir estos que codifica para ARN ribosomal 16S y así
bloques en varias combinaciones para formar caracterizar la dinámica de la comunidad
módulos funcionales, capaces de generar microbiana durante la evolución de la
comportamientos más complejos. columna y determinar la tasa de cambio
de la comunidad en el tiempo, por ejemplo,
Anualmente, se lleva a cabo una competencia entre 60 y 90 días.
mundial para incentivar ideas basadas en la
biología sintética que puedan resolver problemas Esteban et al., (2015) estudiaron columnas de
biotecnológicos, ambientales y en distintas Winogradsky durante 60 días y encontraron
áreas del conocimiento. Estas iniciativas van que la comunidad microbiana cambió en
desde el diseño de productos biodegradables comparación con la muestra inicial. Donde la

216
población de las cianobacterias, Chloroflexi, sedimento utilizando el kit de purificación de
Nitrospirae y Planctomycetes se incrementó ADN MoBio PowerSoil (MoBio, CA) siguiendo
relativamente con el tiempo, mientras que la las instrucciones del fabricante.
mayoría de las Proteobacterias disminuyeron
su población relativa. Entre el 67 y 72 % de la La región V4 del gen 16S rADN se puede
comunidad de superficie estaba compuesta amplificar por PCR usando una polimerasa
por taxones altamente enriquecidos que eran de alta fidelidad y cebadores con código
raros y escasos en la muestra inicial, incluidas de barras 515F (5´-GTG CCA GCM GCC
la cianobacteria Anabaena, un miembro GCG GTA A-3´) y 806R (5´-GGA CTA CHV
del filo Gemmatimonadetes y un miembro GGG TWT CTA AT-3´) con secuencias de
del grupo Chloroflexi clase Anaerolinea. adaptadores de células de flujo al sistema
Concluyendo que los taxones raros pueden Illumina. Según Esteban et al., (2015) cada
llegar a ser abundantes en condiciones reacción de 25 μl debe contener 2 μl del ADN
ambientales apropiadas y apoyando la genómico extraído, solución potenciadora
hipótesis de que los taxones raros pueden a una concentración final del 2X, 0,8 μM de
incrementar su población en estos modelos cada cebador, 1 mM MgSO4, 0,3 mM dNTPs
ecológicos controlados. Lo que, a futuro, y tampón de PCR a concentración final
podría ser una fuente para estudios 1X. Para la PCR se proponen las siguientes
prospectivos que permitan el descubrimiento condiciones: una partida en caliente de 94
de microorganismos, genes o moléculas °C durante 5 minutos, luego 32 ciclos (94°C
de interés biotecnológico. La metodología durante 15 s, 50 °C durante 45 s, 6 °C durante
general para el estudio de la distribución 30 s). La secuenciación se puede realizar
temporal y espacial de comunidades usando MiSeq de Illumina para generar
microbianas en columnas de Winogradsky se lecturas de extremo emparejado (Esteban et
describe en la Figura 32. al., 2015). Finalmente, con los datos obtenidos
se debe continuar con el ensamblaje y
En detalle, el protocolo para el análisis anotación de las secuencias para poder
genómico de la comunidad bacteriana realizar los cálculos de diversidad alfa usando
presente en las columnas debe incluir la índices como el de Shannon, la riqueza de
extracción, amplificación y secuenciación del unidades taxonómicas experimentales (OTUs)
ADN para luego proceder con el análisis de la y otros índices de diversidad de poblaciones
diversidad microbiana. La extracción de ADN (Gauthier & Derome, 2021).
se puede realizar usando entre 40-100 mg de

Figura 32.
Esquema general para el estudio de la distribución temporal y espacial de las comunidades
microbianas en Columnas de Winogradsky.

1 2 3
IMAGEN
ORIGINAL
EN BAJA
RESOLUCIÓN

Montaje de Extracción Amplificación

la columna ADN por PCR

4 5 6

Análisis de diversidad Análisis de datos Secuenciación

microbiana (Nanoporo, Ilumina, etc.)

217
13.7. Referencias Boolchandani, M., D’Souza, A. W., & Dantas, G.
(2019, Jun). Sequencing-based methods and
Aistleitner, K., Sieper, T., Sturz, I., Jeske, R., resources to study antimicrobial resistance.
Tritscheller, S., Mantel, S., Tscherne, A., Nature Review in Genetics, 20(6), 356-370.
Zange, S., Stoecker, K., & Wolfel, R. (2020). [Link]
NOTIFy (non-toxic lyophilized field)-FISH for 019-0108-4
the identification of biological agents by
Fluorescence in situ Hybridization. Plos One, Bouchez, T., Blieux, A. L., Dequiedt, S.,
15(3), e0230057. [Link] Domaizon, I., Dufresne, A., Ferreira, S., Godon,
org/10.1371/[Link].0230057 J. J., Hellal, J., Joulian, C., Quaiser, A., Martin-
Laurent, F., Mauffret, A., Monier, J. M., Peyret,
Argenta, T. S., Barros, A. R. M., de Carvalho, P., Schmitt-Koplin, P., Sibourg, O., D’oiron, E.,
C. A., Dos Santos, A. B., & Firmino, P. I. M. Bispo, A., Deportes, I., Grand, C., Cuny, P.,
(2021, Jan 20). Parabens in aerobic granular Maron, P. A., & Ranjard, L. (2016). Molecular
sludge systems: Impacts on granulation microbiology methods for environmental
and insights into removal mechanisms. diagnosis. Environmental Chemistry Letters,
Science of Total Environment, 753, 142105. 14(4), 423-441. [Link]
[Link] org/10.1007/s10311-016-0581-3
scitotenv.2020.142105
Breitwieser, F. P., & Salzberg, S. L. (2020, Feb 15).
Bakshi , A., Moin, M., & Madhav, M. S. (2020). Pavian: interactive analysis of metagenomics
Metagenomics in Agriculture: State-of- data for microbiome studies and pathogen
the-Art. In R. S. Chopra, C. Chopra, & N. R. identification. Bioinformatics, 36(4), 1303-
Sharma (Eds.), Metagenomics: Techniques, 1304. [Link]
Applications, Challenges and Opportunities bioinformatics/btz715
(pp. 167-187). Springer. [Link]
[Link]/10.1007/978-981-15-6529-8_11 Cameron, D. E., Bashor, C. J., & Collins, J. J.
(2014, May). A brief history of synthetic biology.
Benner, S. A., & Sismour, A. M. (2005, Jul). Nature Review in Microbiology, 12(5), 381-
Synthetic biology. Nature Review in Genetics, 390. [Link]
6(7), 533-543. [Link] nrmicro3239
org/10.1038/nrg1637
Caparco, A. A., Pelletier, E., Petit, J. L., Jouenne,
Bibi, F., & Azhar, E. I. (2021, Jan). Analysis of A., Bommarius, B. R., Berardinis, V., Zaparucha,
bacterial communities in sponges and coral A., Champion, J. A., Bommarius, A. S., &
inhabiting Red Sea, using barcoded 454 Vergne-Vaxelaire, C. (2020). Metagenomic
pyrosequencing. Saudi Journal of Biological Mining for Amine Dehydrogenase Discovery.
Sciences, 28(1), 847-854. [Link] Advanced Synthesis & Catalysis, 362(12), 2427-
[Link] 2436. [Link]
adsc.202000094
Bodor, A., Bounedjoum, N., Vincze, G. E., Erdeiné
Kis, Á., Laczi, K., Bende, G., Szilágyi, Á., Kovács, Carreira, C., Nunes, R. F., Mestre, O., Moura,
T., Perei, K., & Rákhely, G. (2020). Challenges I., & Pauleta, S. R. (2020, Oct). The effect of
of unculturable bacteria: environmental pH on Marinobacter hydrocarbonoclasticus
perspectives. Reviews in Environmental Science denitrification pathway and nitrous oxide
and Bio/Technology, 19(1), 1-22. [Link] reductase. Journal of Biology and Inorganic
[Link] Chemistry, 25(7), 927-940. [Link]
[Link]
Boivin, V., Reulet, G., Boisvert, O., Couture,
S., Elela, S. A., & Scott, M. S. (2020, Mar 18). Céspedes-Bernal, D. N., Mateus-Madonado, J.
Reducing the structure bias of RNA-Seq F., Rengel-Bustamante, J. A., Quintero-Duque,
reveals a large number of non-annotated M. C., Rivera-Hoyos, C. M., Poutou-Piñales, R.
non-coding RNA. Nucleic Acids Research, A., Díaz-Ariza, L. A., Castillo-Carvajal, L. C.,
48(5), 2271-2286. [Link] Páez Morales, A. I., & Pedroza-Rodríguez, A. M.
org/10.1093/nar/gkaa028 (2021). Non-domestic wastewater treatment

218
with fungal/bacterial consortium followed by seq analysis. Bioinformatics, 36(12), 3910-
Chlorella sp., and thermal conversion of the 3912. [Link]
generated sludge. 3Biotech, 11(5), Article: bioinformatics/btaa269
227. [Link]
s13205-021-02780-1 Fujita, S., Masago, K., Sasaki, E., Tsukushi, S.,
Horio, Y., Kuroda, H., & Hida, T. (2021, Mar-Apr).
Chazarra-Gil, R., van Dongen, S., Kiselev, V. Weak-evidence Fusion Candidates Detected
Y., & Hemberg, M. (2021, Apr 19). Flexible by a FusionPlex Assay Using the Ion Torrent
comparison of batch correction methods for System. In Vivo, 35(2), 993-998. [Link]
single-cell RNA-seq using BatchBench. Nucleic [Link]
Acids Research, 49(7), e42. [Link]
[Link] Gallardo-Escarate, C., Valenzuela-Munoz,
V., Nunez-Acuna, G., Valenzuela-Miranda,
Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., & Cheng, J. D., Goncalves, A. T., Escobar-Sepulveda, H.,
(2020, Apr 20). Bioinformatics Methods for Liachko, I., Nelson, B., Roberts, S., & Warren, W.
Mass Spectrometry-Based Proteomics Data (2021, Feb 11). Chromosome-scale genome
Analysis. International Journal of Molecular assembly of the sea louse Caligus rogercresseyi
Science, 21(8), 2873. [Link] by SMRT sequencing and Hi-C analysis.
[Link]/10.3390/ijms21082873 Science Data, 8(1), 60. [Link]
[Link]/10.1038/s41597-021-00842-w
Cordier, T., Alonso-Saez, L., Apotheloz-Perret-
Gentil, L., Aylagas, E., Bohan, D. A., Bouchez, Gauthier, J., & Derome, N. (2021, Apr 7).
A., Chariton, A., Creer, S., Fruhe, L., Keck, F., Evenness-Richness Scatter Plots: a Visual
Keeley, N., Laroche, O., Leese, F., Pochon, X., and Insightful Representation of Shannon
Stoeck, T., Pawlowski, J., & Lanzen, A. (2020, Entropy Measurements for Ecological
May 16). Ecosystems monitoring powered by Community Analysis. mSphere, 6(2), e01019-
environmental genomics: A review of current 01020. [Link]
strategies with an implementation roadmap. mSphere.01019-20.
Molecular Ecology, IN PRESS. [Link]
[Link] Goldberg, C. S., & Parsley, M. B. (2020).
Environmental Population Genomics:
Díaz-Rincón, D. J., Duque, I., Osorio, E., Challenges and Opportunities. In P.
Rodríguez-López, A., Espejo-Mojica, A., Parra- A. Hohenlohe & O. P. Rajora (Eds.),
Giraldo, C. M., Poutou-Piñales, R. A., Alméciga- Population Genomics: Wildlife (pp. 101-
Díaz, C. J., & Quevedo-Hidalgo, B. (2017). 113). Springer. [Link]
Production of Recombinant Trichoderma reesei org/10.1007/13836_2020_75
Cellobiohydrolase II in a New Expression System
Based on Wickerhamomyces anomalus. Hua, Z. S., Wang, Y. L., Evans, P. N., Qu, Y. N.,
Enzyme Research, 2017, Article ID 6980565. Goh, K. M., Rao, Y. Z., Qi, Y. L., Li, Y. X., Huang,
M. J., Jiao, J. Y., Chen, Y. T., Mao, Y. P., Shu,
Esteban, D. J., Hysa, B., & Bartow-McKenney, W. S., Hozzein, W., Hedlund, B. P., Tyson, G. W.,
C. (2015). Temporal and spatial distribution Zhang, T., & Li, W. J. (2019, Oct 8). Insights into
of the microbial community of winogradsky the ecological roles and evolution of methyl-
columns. PLoS One 10(8), e0134588. https:// coenzyme M reductase-containing hot spring
[Link]/[Link] Archaea. Nature Communication, 10(1), 4574.
pone.0134588 [Link]
s41467-019-12574-y
Fadiji, A. E., & Babalola, O. O. (2020, Mar).
Metagenomics methods for the study of plant- Katz, L., Chen, Y. Y., Gonzalez, R., Peterson, T.
associated microbial communities: A review. C., Zhao, H., & Baltz, R. H. (2018, Jul). Synthetic
Journal of Microbiology Methods, 170, 105860. biology advances and applications in the
[Link] biotechnology industry: a perspective. Journal
mimet.2020.105860 of Indistrial Microbiology and Biotechnology,
Franzen, O., & Bjorkegren, J. L. M. (2020, Jun 45(7), 449-461. [Link]
1). alona: a web server for single-cell RNA- org/10.1007/s10295-018-2056-y

219
Kherwa, P., & Bansal, P. (2018). Topic Modeling: Enhance the Pollutant Degradation Capacity
A Comprehensive Review. ICST Transactions of Shewanella oneidensis. Environmental
on Scalable Information Systems, 0(0), 159623. Science Technology, 54(6), 3599-3608.
[Link] [Link]
7-2018.159623 est.9b06378

Kim, E., Cho, E. J., Yang, S. M., Kim, M. J., & Li, M., Zhang, J., Yang, X., Zhou, Y., Zhang,
Kim, H. Y. (2021, Apr). Novel approaches for L., Yang, Y., Luo, L., & Yan, Q. (2021,
the identification of microbial communities Apr). Responses of ammonia-oxidizing
in kimchi: MALDI-TOF MS analysis and high- microorganisms to biochar and compost
throughput sequencing. Food Microbiology, amendments of heavy metals-polluted soil.
94, 103641. [Link] Journal of Environmental Science, 102, 263-
org/10.1016/[Link].2020.103641 272. [Link]
jes.2020.09.029
Knapik, K., Bagi, A., Krolicka, A., & Baussant,
T. (2020, May 15). Metatranscriptomic Liem, M., Regensburg-Tuink, T., Henkel, C.,
Analysis of Oil-Exposed Seawater Bacterial Jansen, H., & Spaink, H. (2021, Feb 2). Microbial
Communities Archived by an Environmental diversity characterization of seawater in a pilot
Sample Processor (ESP). Microorganisms, 8(5), study using Oxford Nanopore Technologies
744. [Link] long-read sequencing. BMC Research
microorganisms8050744 Notes, 14(1), 42. [Link]
org/10.1186/s13104-021-05457-3
Knight, R., Vrbanac, A., Taylor, B. C., Aksenov,
A., Callewaert, C., Debelius, J., Gonzalez, Liu, D.-F., & Li, W.-W. (2020). Genome Editing
A., Kosciolek, T., McCall, L. I., McDonald, D., Techniques Promise New Breakthroughs
Melnik, A. V., Morton, J. T., Navas, J., Quinn, R. in Water Environmental Microbial
A., Sanders, J. G., Swafford, A. D., Thompson, Biotechnologies. ACS ES&T Water, 1(4), 745-
L. R., Tripathi, A., Xu, Z. Z., Zaneveld, J. R., Zhu, 747. [Link]
Q., Caporaso, J. G., & Dorrestein, P. C. (2018, acsestwater.0c00276
Jul). Best practices for analysing microbiomes.
Nature Review in Microbiology, 16(7), 410-422. Lott, S. C., Voigt, K., Lambrecht, S. J., Hess, W.
[Link] R., & Steglich, C. (2020, Aug). A framework for
018-0029-9 the computational prediction and analysis of
non-coding RNAs in microbial environmental
Kuo, J. T., Chang, L. L., Yen, C. Y., Tsai, T. H., populations and their experimental validation.
Chang, Y. C., Huang, Y. T., & Chung, Y. C. (2020, ISME J, 14(8), 1955-1965. [Link]
Dec 24). Development of Fluorescence In Situ [Link]/10.1038/s41396-020-0658-7
Hybridization as a Rapid, Accurate Method
for Detecting Coliforms in Water Samples. Luan, Z., Sun, G., Huang, Y., Yang, Y., Yang,
Biosensors (Basel), 11(1), 8. [Link] R., Li, C., Wang, T., Tan, D., Qi, S., Jun, C.,
[Link] Wang, C., Wang, S., Zhao, Y., & Jing, Y. (2020).
Metagenomics Study Reveals Changes in
Lekang, K., Lanzen, A., Jonassen, I., Gut Microbiota in Centenarians: A Cohort
Thompson, E., & Troedsson, C. (2020, May). Study of Hainan Centenarians. Frontiers in
Evaluation of a eukaryote phylogenetic Microbiology, 11, 1474. [Link]
microarray for environmental monitoring of [Link]/10.3389/fmicb.2020.01474
marine sediments. Marine Pollution Bulletin,
154, 111102. [Link] Lujan, H., Romer, E., Salisbury, R., Hussain,
org/10.1016/[Link].2020.111102 S., & Sayes, C. (2020, May 1). Determining
the Biological Mechanisms of Action for
Environmental Exposures: Applying CRISPR/
Li, J., Tang, Q., Li, Y., Fan, Y. Y., Li, F. H., Wu, J. Cas9 to Toxicological Assessments. Toxicology
H., Min, D., Li, W. W., Lam, P. K. S., & Yu, H. Q. Science, 175(1), 5-18. [Link]
(2020, Mar 17). Rediverting Electron Flux with [Link]/10.1093/toxsci/kfaa028
an Engineered CRISPR-ddAsCpf1 System to

220
Luxem, K. E., Leavitt, W. D., & Zhang, X. Biotech, 10(2), 71. [Link]
(2020). Large Hydrogen Isotope Fractionation org/10.1007/s13205-020-2057-1
Distinguishes Nitrogenase-Derived Methane
from Other Methane Sources. Applied and Necsulea, A. (2020). Phylogenomics and
Environment Microbiology, 86(19), e00849- Genome Annotation (C. Scornavacca, F. d. r.
00820. [Link] Delsuc, & N. Galtier, Eds.).
AEM.00849-20.
Pandey, J., Debnath, A., Tripathi, R. M.,
Madigan, M. T., Bender, K. S., Buckley, D. H., Verma, O. P., & Yaduvanshi, N. (2021). DNA
Sattley, W. M., Stahl, D. A., & Brock, T. D. (2019). Sequencing and Its Types. Biotica Research
Brock biology of microorganisms. Pearson Today, 3(2), 119-121.
Education.
Pineau, S., Sabot, R., Quillet, L., Jeannin, M.,
Maertens, L., Matroule, J. Y., & Van Houdt, R. Caplat, C., Dupont-Morral, I., & Refait, P. (2008).
(2021, Feb 5). Characteristics of the copper- Formation of the Fe(II–III) hydroxysulphate
induced viable-but-non-culturable state in green rust during marine corrosion of steel
bacteria. World Journal of Microbiology and associated to molecular detection of
Biotechnology, 37(3), 37. [Link] dissimilatory sulphite-reductase. Corrosion
[Link] Science, 50(4), 1099-1111. [Link]
[Link]
Meng, F., & Ellis, T. (2020, Oct 14). The second
decade of synthetic biology: 2010-2020. Rashid, M., & Stingl, U. (2015, Dec).
Nature Communication, 11(1), 5174. https:// Contemporary molecular tools in microbial
[Link]/[Link] ecology and their application to advancing
19092-2 biotechnology. Biotechnology Advances,
33(8), 1755-1773. [Link]
Meyer, B., & Kuever, J. (2007, Oct). org/10.1016/[Link].2015.09.005
Molecular analysis of the distribution and
phylogeny of dissimilatory adenosine-5’- Ren, J., Lee, J., & Na, D. (2020, Jan). Recent
phosphosulfate reductase-encoding genes advances in genetic engineering tools based
(aprBA) among sulfur-oxidizing prokaryotes. on synthetic biology. Journal of Microbiology,
Microbiology (Reading), 153(Pt 10), 3478- 58(1), 1-10. [Link]
3498. [Link] org/10.1007/s12275-020-9334-x
mic.0.2007/008250-0
Ribeiro Duarte, A. S., Stark, K. D. C., Munk, P.,
Montecillo, J. A. V., Chu, L. L., & Bae, Leekitcharoenphon, P., Bossers, A., Luiken,
H. (2020). CRISPR-Cas9 System for Plant R., Sarrazin, S., Lukjancenko, O., Pamp, S. J.,
Genome Editing: Current Approaches and Bortolaia, V., Nissen, J. N., Kirstahler, P., Van
Emerging Developments. Agronomy, 10(7), Gompel, L., Poulsen, C. S., Kaas, R. S., Hellmer,
1033. [Link] M., Hansen, R. B., Gomez, V. M., & Hald, T.
agronomy10071033 (2020). Addressing Learning Needs on the Use
of Metagenomics in Antimicrobial Resistance
Morono, Y., Kubota, K., Tsukagoshi, D., & Surveillance. Frontiers in Public Health, 8,
Terada, T. (2020). EDTA-FISH: A Simple and 38. [Link]
Effective Approach to Reduce Non-specific fpubh.2020.00038
Adsorption of Probes in Fluorescence in situ
Hybridization (FISH) for Environmental Samples. Rivera-Hoyos, C. M., Morales-Álvarez, E. D.,
Microbes Environment, 35(3), ME20062. Poveda-Cuevas, S. A., Reyes-Guzmán, E.
[Link] A., Poutou-Piñales, R. A., Reyes-Montaño,
ME20062 E. A., Pedroza-Rodríguez, A. M., Rodríguez-
Vázquez, R., & Cardozo-Bernal, Á. M. (2015).
Mukherjee, A., & Reddy, M. S. (2020, Feb). Computational analysis and low-scale
Metatranscriptomics: an approach for constitutive expression of laccases synthetic
retrieving novel eukaryotic genes from genes GlLCC1 from Ganoderma lucidum and
polluted and related environments. 3 POXA 1B from Pleurotus ostreatus in Pichia

221
pastoris. Plos One, 10(1), e0116524. https:// Tyagi, S., Kumar, R., Das, A., Won, S. Y.,
[Link]/[Link] & Shukla, P. (2020, Aug 10). CRISPR-Cas9
pone.0116524.g002 system: A genome-editing tool with endless
possibilities. Journal of Biotechnology, 319, 36-
Rodriguez, C., Jary, A., Hua, C., Woerther, 53. [Link]
P. L., Bosc, R., Desroches, M., Sitterle, E., jbiotec.2020.05.008
Gricourt, G., De Prost, N., Pawlotsky, J. M.,
Chosidow, O., Sbidian, E., Decousser, J. W., & Unda-Calvo, J., Martínez-Santos, M., Ruiz-
Multidisciplinary Necrotizing Fasciitis Study, G. Romera, E., & Lechuga-Crespo, J. L. (2019).
(2020, Jul). Pathogen identification by shotgun Implications of denitrification in the ecological
metagenomics of patients with necrotizing status of an urban river using enzymatic
soft-tissue infections. The British Journal of activities in sediments as an indicator.
Dermatology, 183(1), 105-113. [Link] Journal of Environmental Sciences, 75, 255-
[Link] 268. [Link]
jes.2018.03.037
Sanger, S. N., & Coolson, A. R. (1977). DNA
Sequencing with chain-terminating Inhibitors. Uyhazi, K. E., & Bennett, J. (2021, Jan 4).
Proceedings of National Academy of Science, A CRISPR view of the 2020 Nobel Prize in
USA, 74(12), 54-63. Chemistry. Journal of Clinical Investigation,
131(1), e145214. [Link]
Santana-Pereira, A. L. R., Sandoval-Powers, org/10.1172/JCI145214
M., Monsma, S., Zhou, J., Santos, S. R.,
Mead, D. A., & Liles, M. R. (2020). Discovery Van Beilen, J. B., Li, Z., Duetz, W. A., Smits, T.
of Novel Biosynthetic Gene Cluster Diversity H. M., & Witholt, B. (2006). Diversity of Alkane
From a Soil Metagenomic Library. Frontiers Hydroxylase Systems in the Environment. Oil &
in Microbiology, 11, 585398. [Link] Gas Science and Technology, 58(4), 427-440.
[Link] [Link]
ogst:2003026
Shi, H., Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Bai, Y., Ge,
Q., & Raju, N. (2021). Bias in RNA-seq Library Wallenius, A. J., Dalcin Martins, P., Slomp, C. P.,
Preparation: Current Challenges and & Jetten, M. S. M. (2021). Anthropogenic and
Solutions. BioMed Research International, Environmental Constraints on the Microbial
2021, 1-11. [Link] Methane Cycle in Coastal Sediments. Frontiers
org/10.1155/2021/6647597 in Microbiology, 12, 631621. [Link]
[Link]
Su, S., Tian, L., Dong, X., Hickey, P. F., Freytag,
S., & Ritchie, M. E. (2020, Apr 1). CellBench: R/ Wang, M., Noor, S., Huan, R., Liu, C., Li, J.,
Bioconductor software for comparing single- Shi, Q., Zhang, Y. J., Wu, C., & He, H. (2020).
cell RNA-seq analysis methods. Bioinformatics, Comparison of the diversity of cultured and
36(7), 2288-2290. [Link] total bacterial communities in marine sediment
org/10.1093/bioinformatics/btz889 using culture-dependent and sequencing
methods. PeerJ, 8, e10060. [Link]
Torregrosa-Crespo, J., González-Torres, P., [Link]
Bautista, V., Esclapez, J. M., Pire, C., Camacho,
M., Bonete, M. J., Richardson, D. J., Watmough, Weis, C. V., Jutzeler, C. R., & Borgwardt, K.
N. J., & Martínez-Espinosa, R. M. (2017). Analysis (2020, Oct). Machine learning for microbial
of multiple haloarchaeal genomes suggests identification and antimicrobial susceptibility
that the quinone-dependent respiratory testing on MALDI-TOF mass spectra: a
nitric oxide reductase is an important source systematic review. Clinical and Microbiology
of nitrous oxide in hypersaline environments. Infections, 26(10), 1310-1317. [Link]
Environmental Microbiology Reports, [Link]
9(6), 788-796. [Link] [Link]
org/10.1111/1758-2229.12596 Wideman, N. E., Oliver, J. D., Crandall, P.
G., & Jarvis, N. A. (2021, Jan 19). Detection
and Potential Virulence of Viable but Non-

222
Culturable (VBNC) Listeria monocytogenes:
A Review. Microorganisms, 9(1), 194.
[Link]
microorganisms9010194

Wise, B. R., Roane, T. M., & Mosier, A. C. (2020).

Community Composition of Nitrite Reductase
Gene Sequences in an Acid Mine Drainage
Environment. Microbial Ecology, 79, 562-575.
[Link]
019-01420-9

Yan, Q., & Fong, S. S. (2017). Challenges and

Advances for Genetic Engineering of Non-
model Bacteria and Uses in Consolidated
Bioprocessing. Frontiers in Microbiology, 8,
2060. [Link]
fmicb.2017.02060

Yang, S., Corbett, S. E., Koga, Y., Wang, Z.,

Johnson, W. E., Yajima, M., & Campbell, J. D.
(2020, Mar 5). Decontamination of ambient
RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.
Genome Biology, 21(1), 57. [Link]
[Link]

Yang, Y., Wang, J., Liao, J., Xie, S., & Huang,
Y. (2014, Nov). Distribution of naphthalene
dioxygenase genes in crude oil-contaminated
soils. Microbial Ecology, 68(4), 785-793. https://
[Link]/[Link]

Zhang, S., Shen, J., Li, D., & Cheng, Y.

(2021). Strategies in the delivery of Cas9
ribonucleoprotein for CRISPR/Cas9 genome
editing. Theranostics, 11(2), 614-648. https://
[Link]/[Link]

Zhao, J., Fang, H., & Zhang, D. (2020, Dec).

Expanding application of CRISPR-Cas9 system
in microorganisms. Synth Syst Biotechnol,
5(4), 269-276. [Link]
org/10.1016/[Link].2020.08.001

Zhao, Y., Wei, L., Tagmount, A., Loguinov,

A., Sobh, A., Hubbard, A., McHale, C. M.,
Chang, C. J., Vulpe, C. D., & Zhang, L.
(2021, Apr). Applying genome-wide CRISPR
to identify known and novel genes and
pathways that modulate formaldehyde
toxicity. Chemosphere, 269, 128701.
[Link]
chemosphere.2020.128701

223
224
Capítulo 14
ANEXOS

225
226
Capítulo 14

Anexos

Anexos A el agua al recipiente de vidrio, homogenizar

Preparación de medios de cultivo y medir el pH con potenciómetro ajustando
a 5,5 con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B,
1. Agar PDA: Por componentes: Infusión papa numeral 43 y 44). Posteriormente, adicionar
(200 g de papa) (4 g/L), Glucosa (2 g/L), Agar el agar y calentar lentamente en plancha de
(20 g/L), agua destilada (1000 mL) y pH final calentamiento repitiendo la operación como
(5,5). Por casa comercial: Base 39,9 g/L agua si fuera el producto comercial.
destilada (1000 mL) y pH final (5,5).
2. Agar nutritivo: Peptona de carne (5 g/L),
Preparación: Pesar cada uno de los extracto de carne (30 g/L), agar-agar (20
componentes o el producto comercial y g/L), agua destilada (1000 mL) y pH final (7,0).
depositar en un recipiente de vidrio que
soporte el proceso de esterilización. Adicionar Preparación: Pesar cada uno de los
1000 mL de agua destilada y calentar componentes y depositar en un recipiente de
lentamente en plancha de calentamiento, vidrio que soporte el proceso de esterilización.
homogenizar o mezclar regularmente hasta Adicionar 1000 mL de agua destilada
que comience a hervir. Esterilizar en autoclave y calentar lentamente en plancha de
a 116,9°C, 18 psi por 15 minutos. Si el agar se calentamiento, homogenizar regularmente
elabora por componentes adicionar cada hasta que se observe la completa disolución
uno de ellos a excepción del agar. Adicionar y comience a hervir. Esterilizar en autoclave

227
a 116,9 °C, 15 psi por 15 minutos. Si el agar se 5. Agar tributirina: Por componentes: Peptona
elabora por componentes adicionar cada universal (5,5 g/L), extracto de levadura (3,5
uno de ellos a excepción del agar. Adicionar g/L), agar‑agar (15 g/L), 10 mL de glicerol
el agua al recipiente de vidrio, homogenizar al 99,5% (v/v), agua destilada (1000 mL) y
y medir el pH con potenciómetro ajustando a pH final (7,0). Por casa comercial: Pesar los
7,2 con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral gramos que indique la casa comercial, agua
43 y 44). Posteriormente, adicionar el agar y destilada (1000 mL), 10 mL de glicerol al 99,5%
calentar lentamente en mechero repitiendo la (v/v) y pH final (5,5).
operación como si fuera el producto comercial.
Preparación: Pesar cada uno de los
3. Agar avena al 5 % (m/v) con nistatina al componentes y depositar en un recipiente de
0,01 % (m/v): Por componentes: Avena en vidrio que soporte el proceso de esterilización.
polvo (50 g/L), agar (20 g/L), nistatina (0,1 Adicionar 990 mL de agua destilada y calentar
g/L), agua destilada (1000 mL) y pH final lentamente en plancha de calentamiento,
(7,2). Casa comercial: Medio base (72,5 g/L), homogenizar regularmente hasta que se
nistatina (0,1 g/L), agua destilada (1000 mL) y observe la completa disolución y comience
pH final (7,0). a hervir. Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15
psi por 15 minutos. Si el agar se elabora por
Preparación: Pesar cada uno de los componentes adicionar cada uno de ellos
componentes o el producto comercial y a excepción del agar y el agua al recipiente
depositar en un recipiente de vidrio que soporte de vidrio, homogenizar y medir el pH con
el proceso de esterilización. Adicionar 1000 potenciómetro ajustando a 7,2 con NaOH 1N o
mL de agua destilada y calentar lentamente HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 44). Posteriormente,
en plancha de calentamiento, homogenizar adicionar el agar y calentar lentamente en
regularmente hasta que comience a hervir. mechero repitiendo la operación como si fuera
Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15 el producto comercial.
minutos. Si el agar se elabora por componentes
adicionar cada uno de ellos a excepción 6. Agar almidón: Fosfato dibásico de potasio
del agar y el agua al recipiente de vidrio, (K2HPO4), (0,1 g/L), fosfato monobásico de
homogenizar y medir el pH con potenciómetro potasio (KH2PO4), (0,1 g/L), cloruro de calcio
ajustando a 7,2 con NaOH 1N o HCl 1N (anexo (CaCl2), (0,5 g/L), peptona universal (2,5 g/L),
B, numeral 43 y 44). Posteriormente, adicionar extracto de levadura (2,5 g/L), maizena (10
el agar y calentar lentamente en mechero g/L), agua destilada 1000 mL) y pH final (7,0).
repitiendo la operación como si fuera el
producto comercial. Preparación: Pesar cada componente
a excepción del agar y depositar en un
4. Agar leche: Fosfato dibásico de potasio recipiente de vidrio que soporte el proceso de
(K2HPO4), (0,1 g/L), fosfato monobásico de esterilización. Posteriormente, adicionar 1000
potasio (KH2PO4), (0,1 g/L), cloruro de calcio mL de agua destilada homogenizar y medir
(CaCl2), (0,5 g/L), peptona universal (2,5 el pH con potenciómetro ajustando a 7,0 con
g/L), extracto de levadura (2,5 g/L), leche hi NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y
calcium (10 g/L), agua destilada 1000 mL) y 44). Finalmente, adicionar el agar y calentar
pH final (7,0). lentamente en plancha de calentamiento
hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave
Preparación: Pesar cada componente por 7 minutos a 7,5 psi de presión por 121º C.
a excepción del agar y depositar en un
recipiente de vidrio que soporte el proceso de 7. Agar pectina: Fosfato dibásico de potasio
esterilización. Posteriormente, adicionar 1000 (K2HPO4), (0,1 g/L), fosfato monobásico de
mL de agua destilada homogenizar y medir potasio (KH2PO4), (0,1 g/L), cloruro de calcio
el pH con potenciómetro ajustando a 7,0 con (CaCl2), (0,5 g/L), peptona universal (2,5
NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y g/L), extracto de levadura (2,5 g/L), pectina
44). Finalmente, adicionar el agar y calentar alimentaria (10 g/L), agua destilada 1000 mL)
lentamente en plancha de calentamiento y pH final (7,0).
hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave
por 7 minutos a 7,5 psi de presión por 121ºC.

228
Preparación: Pesar cada componente suave. Esterilizar en autoclave por 15 minutos
a excepción del agar y depositar en un a 15 psi de presión por 121º C. El ABTS se
recipiente de vidrio que soporte el proceso de adiciona después de esterilizar. Para preparar
esterilización. Posteriormente, adicionar 1000 caldo salvado de trigo, se utilizan los mismos
mL de agua destilada homogenizar y medir componentes, pero no se adiciona agar.
el pH con potenciómetro ajustando a 7,0 con
NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 10. Agar salvado con MnCl2: Salvado de
44). Finalmente, adicionar el agar y calentar trigo (175 g/L), glucosa (10 g/L), extracto de
lentamente en plancha de calentamiento levadura (2 g/L), peptona (5 g/L), MgSO4·7H2O
hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave (0,05 g/L), MnSO4·H2O (0,076 g/L), K2HPO4 (0,1
por 7 minutos a 7,5 psi de presión por 121ºC. g/L), cloranfenicol (0,1 g/L), agar (20 g/L),
agua destilada (1000 mL), pH final (6,5) y
8. Agar celulosa: Fosfato dibásico de potasio MnCl2 0,5 mM. Adicionar 62,9 mg de MnCl2
(K2HPO4), (0,1 g/L), fosfato monobásico de para un litro de medio.
potasio (KH2PO4), (0,1 g/L), cloruro de calcio
(CaCl2), (0,5 g/L), peptona universal (2,5 g/L), Preparación: Para preparar el extracto
extracto de levadura (2,5 g/L), celulosa de líquido de salvado de trigo se debe pesar
baja densidad (10 g/L), agua destilada 1000 175 g de salvado y adiconar a un recipiente
mL) y pH final (7,0). que contenga un 1 litro de agua. Mezclar y
dejar reposar por 1 hora. Posteriormente filtrar
Preparación: Pesar cada componente empleando un colador y recuperar el líquido o
a excepción del agar y depositar en un también llamado extracto de salvado. Medir
recipiente de vidrio que soporte el proceso de el volumen de extracto y se adicionar agua
esterilización. Posteriormente, adicionar 1000 destilada hasta completar un litro. Adicionar
mL de agua destilada homogenizar y medir los demás compoenten del medio a esta
el pH con potenciómetro ajustando a 7,0 con solución y ajustar a pH de 6,5. Agregar 20 g
NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y de agar y calentar lentamente en plancha
44). Finalmente, adicionar el agar y calentar de calentamiento hasta ebullición suave.
lentamente en plancha de calentamiento Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15
hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave psi de presión por 121º C. El MnCl2 0,5 [Link]
por 7 minutos a 7,5 psi de presión por 121ºC. adiciona después de esterilizar. Para preparar
caldo salvado de trigo, se utilizan los mismos
9. Agar salvado de trigo con 2,2´-Azino-bis componentes, pero no se adiciona agar.
(3-ethylbenzotiasolina-6-ácido sulfónico (ABTS):
Salvado de trigo (175 g/L), glucosa (10 g/L), 11. Agar lignina I: Extracto líquido de aserrín
extracto de levadura (2 g/L), peptona (5 g/L), (100 mL), agar- agar (20 g/L), agua destilada
MgSO4·7H2O (0,05 g/L), MnSO4·H2O (0,076 (900 mL) y pH final (6,5).
g/L), K2HPO4 (0,1 g/L), cloranfenicol (0,1 g/L),
agar (20 g/L), agua destilada (1000 mL), pH Preparación: Para la obtención de extracto
final (6,5) y ABTS 0,5 mM (adicionar 277,3 mg líquido de aserrín, pesar 300 g de aserrín y
de ABTS para un litro de medio). adicionar 1000 mL de NaOH 2 N. Autocalvar
por 1 hora a 115ºC y 15 psi (extracción térmica
Preparación: Para preparar el extracto y química de la lignina soluble). Enfriar y
líquido de salvado de trigo se debe pesar filtrar en embudo plástico el extracto líquido
175 g de salvado y adicionar a un recipiente concentrado. Diluir el extracto concentrado
que contenga un 1 litro de agua. Mezclar y 1/10 con agua destilada y ajustar el pH a 6,5
dejar reposar por 1 hora. Posteriormente filtrar con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y
empleando un colador y recuperar el líquido 44). Adicionar el agar y calentar lentamente
o también llamado extracto de salvado. en plancha de calentamiento hasta ebullición
Medir el volumen de extracto y adicionar suave. Esterilizar en autoclave por 15 minutos
agua destilada hasta completar un litro. a 15 psi de presión por 121ºC.
Adicionar los demás compoenten del medio
a esta solución y ajustar a pH de 6,5. Agregar 12. Agar lignina II: Extracto líquido de aserrín
20 g de agar y calentar lentamente en (100 mL), agar- agar (20 g/L), glucosa (10
plancha de calentamiento hasta ebullición g/L), agua destilada (900 mL) y pH final (6,5).

229
Preparación: Para la obtención de extracto (FeSO4 *7H2O), (0,01 g/L), cloruro de sodio
líquido de aserrín, pesar 300 g de aserrín y (NaCl), (0,05 g/L), cloruro de calcio (CaCl2),
adicionar 1000 mL de NaOH 2 N. Autocalvar (0,02 g/L), extracto de levadura (0,02 g/L),
por 1 hora a 115ºC y 15 psi (extracción térmica nitrato de amonio (NH4NO3), (1 g/L), glicerol
y química de la lignina soluble). Enfriar y (2 % v/v), solución de elementos traza (1 mL).
filtrar en embudo plástico el extracto líquido pH final (7,2).
concentrado. Diluir el extracto concentrado
1/10 con agua destilada y ajustar el pH a 6,5 Solución de micronutrientes: Sulfato de Zinc
con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 (ZnSO4), (2,32 g/L), sulfato de manganeso
y 44). Adicionar el agar, la glucosa y calentar tetrahidratado (MnSO4*4H2O), (1,78 g/L),
lentamente en plancha de calentamiento ácido bórico (H3BO3), (0,56 g/L), sulfito de
hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave cobre tetrahidratado (CuSO3*4H2O), (1
por 15 minutos a 15 psi de presión por 121ºC. g/L), permanganato de sodio dihidratado
(NaMnO4*2H2O), (0,3 g/L), cloruro de calcio
13. Agar lignina III: Extracto líquido de aserrín hexahidratado (CaCl2*6H2O), (0,42 g/L),
(100 mL), agar- agar (20 g/L), glucosa (10 g/L), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), (1 g),
slfato de manganeso (MnSO4), (100 mg/L), cloruro de níquel hexahidratado (NiCl2*6H2O),
sulfato de cobre (CuSO4), (100 mg/L), agua (0,004 g/L), yoduro de potasio (KI), (0,66 g/L),
destilada (900 mL) y pH final (6,5). agua destilada (1000 mL).

Preparación: Para la obtención de extracto Preparación: Pesar o medir cada componente

líquido de aserrín, pesar 300 g de aserrín y y depositar en un recipiente de vidrio
adicionar 1000 mL de NaOH 2 N. Autocalvar que soporte el proceso de esterilización.
por 1 hora a 115ºC y 15 psi (extracción térmica Posteriormente adicionar 999 mL de agua
y química de la lignina soluble). Enfriar y destilada homogenizar y medir el pH con
filtrar en embudo plástico el extracto líquido potenciómetro ajustando a 7,2 con NaOH 1N
concentrado. Diluir el extracto concentrado o HCl. Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi
1/10 con agua destilada y ajustar el pH a 6,5 por 15 minutos.
con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43
y 44). Adicionar el agar, la glucosa, el sulfato 16. Agar Siegmund and Wagner (SW): Nitrato
de manganeso, sulfato de cobre y calentar de sodio (Na2NO3), (1 g/L), fosfato monobásico
lentamente en plancha de calentamiento de potasio (KH2PO4), (0,1 g/L), sulfato de
hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave magnesio heptrahidratado (MgSO4*7H2O),
por 15 minutos a 15 psi de presión por 121ºC. (0,1 g/L), cloruro de calcio (CaCl2), (0,1 g/L),
glicerol (2% v/v), azul metileno (0,005 g/L),
14. Agar agua suplementado con glucosa extracto levadura (0,2 g/L), bromuro de
y extracto de levadura: Glucosa (1,0 g/L), cetiltrimetil amonio (CTAB), (0,2 g/L), agar (20
extracto de levadura (0,1 g/L), agua destilada g/L), agua (1000 mL) y pH final (6,5).
(1000 mL), agar agar (20 g/L) y pH final 6,5
Preparación: Pesar o medir cada componente
Preparación: Pesar cada uno de los a excepción del agar y depositar en un
componentes, depositar en un recipiente de recipiente de vidrio que soporte el proceso
vidrio que soporte el proceso de esterilización. de esterilización. Posteriormente adicionar
Adicionar 1000 mL de agua destilada 980 mL de agua destilada homogenizar y
homogenizar y calentar lentamente en medir el pH con potenciómetro ajustando
plancha de calentamiento hasta ebullición a 6,5 con NaOH 1N o HCl 1N. Finalmente,
suave. Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 adicionar el agar y calentar lentamente en
psi por 15 minutos. plancha de calentamiento hasta ebullición
suave. Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15
15. Medio líquido mineral más inductores psi por 15 minutos.
para producción de biosurfactante: Fosfato
dibásico de sodio (Na2HPO4), (2,2 g/L), fosfato 17. Agar King B: Por componentes: Peptona
dibásico de potasio (K2HPO4), (1,4 g/L), sulfato proteosa (20 g/L), sulfato de magnesio
de magnesio heptahidratado (MgSO4*7H2O), monohidratado (MgSO4·H2O), (1,5 g/L),
(0,6 g/L), sulfato de hierro heptahidratado fosfato dibásico de potasio dihidratado

230
(K2HPO4·2H2O), (1,8 g/L), glicerol (10 mL/L) (K2HPO4), (0,2 g/L), fosfato monobásico de
y agua destilada (990 mL/L) y pH final (7,2). potasio (KH2PO4), (0,1 g/L), cloruro de calcio
Casa comercial: medio basal (33,3 g/L), dihidratado (CaCl2·2H2O), (0,1 g/L), sulfato de
glicerol (10 mL/L), agua destilada (990 mL/L) magnesio heptahidratado (MgSO4·7H2O), (0,2
y pH final (7,2). g/L), clorudo de sodio (NaCl), (0,1 g/L), agar
(20 g/L), 7 mL de rojo congo 0, % (m/v), agua
Preparación: Pesar cada uno de los destilada (993 mL) y pH final (7,2).
componentes o el producto comercial y
depositar en un recipiente de vidrio que soporte Preparación: Pesar o medir en volumen
el proceso de esterilización. Adicionar 990 mL cada componente a excepción del agar
de agua destilada y calentar lentamente en y depositar en un recipiente de vidrio
plancha de calentamiento, homogenizando que soporte el proceso de esterilización.
regularmente hasta que comience a hervir. Posteriormente adicionar 993 mL de agua
Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15 destilada homogenizar y medir el pH con
minutos. Si el agar se elabora por componentes potenciómetro ajustando a 7,2 con NaOH
adicionar cada uno de ellos a excepción 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 44).
del agar y el agua al recipiente de vidrio, Finalmente adicionar el agar y calentar
homogenizar y medir el pH con potenciómetro lentamente en plancha de calentamiento.
ajustando a 7,2 con NaOH 1N o HCl 1N (anexo Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi por
B, numeral 43 y 44). Posteriormente, adicionar 15 minutos.
el agar y calentar lentamente en mechero
repitiendo la operación como si fuera el 20. Agar Ashby: Manitol (20 g/L), fosfato
producto comercial. monobásico de potasio (KH2PO4), (1 g/L), sulfato
de magnesio heptrahidratado (MgSO4*7H2O),
18. Agar Rhada: Fosfato monobásico de (0,2 g/L), sulfato de hierro heptahidratado
postasio (KH2PO4), (2 g/L), cloruro de amonio (FeSO4*7H2O), (0,0005 g/L), cloruro de sodio
(NH4Cl), (0,05 g/L), sulfato de magnesio (NaCl), (0,2 g/L), cloruro de calcio dihidratado
monohidratado (MgSO4 H2O), (0,5 g/L), (CaCl2*2H2O), (0,2 g/L), agar (20 g/L), agua
cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 2H2O), destilada (1000 mL) y pH final (7,0).
(0,1 g/L), agar agar (7 g/L), 0,1 mL de solución
de elementos traza y pH final 6,5. Preparación: Pesar cada componente
a excepción del agar y depositar en un
Solución de elementos traza: sulfato de recipiente de vidrio que soporte el proceso de
manganeso (MnSO4), (0,5 g/L), sulfato de esterilización. Posteriormente adicionar 1000
hierro heptahidratdo (FeSO4 7H2O), (0,1 g/L) y mL de agua destilada homogenizar y medir
sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 7H2O), el pH con potenciómetro ajustando a 7,0 con
(0,1 g/L). NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y
44). Finalmente adicionar el agar y calentar
Preparación: Pesar cada uno de los lentamente en plancha de calentamiento.
componentes o el producto comercial y Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi por
depositar en un recipiente de vidrio que 15 minutos.
soporte el proceso de esterilización. Adicionar
999,9 mL de agua destilada y calentar 21. Agar NFB. Agar semisólido para el
lentamente en plancha de calentamiento, aislamiento de diazotrófos microaerofílicos:
homogenizando regularmente hasta que Acido D-málico (5 g/L), solución al 10 % (m/v)
comience a hervir. Esterilizar en autoclave a de fosfato dibásico de potasio (K2HPO4),
116,9°C, 15 psi por 15 minutos. Si el agar se (5 mL), solución al 10 % (m/v) de sulfato de
elabora por componentes adicionar cada magnesio (MgSO4), (2 mL), solución al 10%
uno de ellos a excepción del agar y el agua (m/v) de cloruro de sodio (NaCl), (1 mL),
al recipiente de vidrio, homogenizar y medir solución al 1% (m/v) de cloruro de calcio
el pH con potenciómetro ajustando a 7,2 con dihidratado (CaCl2 *2H2O) (2 mL), solución al
NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 44). 0,5% (m/v) de azul de bromotimol en 0,2 N, de
hidróxido de potasio (KOH), (2 mL), solución de
19. Agar YMA: Manitol (10 g/L), extracto de micronutrientes (semisólido) (2 mL), solución
levadura (0,8 g/L), fosfato dibásico de potasio al 1,64% (m/v) de EDTA preparado en agua

231
ajustar pH 7,2 para disolverlo completamente Posteriormente, adicionar el agua destilada
(4 mL), hidróxido de potasio (KOH), (4,5 g/L), para completar 1000 mL, homogenizar y
solución de vitaminas (1 mL), pH (6,8) y agar medir el pH con potenciómetro ajustando
agar (10 g/L). Para el medio sólido se pesan a 6,8 con KOH 1N o ácido málico (anexo
20 g/L de agar. B, numeral 8 y 9). Finalmente, adicionar el
agar y calentar lentamente en plancha
Solución de micronutrientes para NFB: Molibdato de calentamiento hasta ebullición suave.
de sodio dihidratado (Na2MoO4*2H2O), (0,2 g/ Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15
200 mL), sulfato de magnesio (MgSO4), (0,235 minutos. Para preparar agar NFB se adicionan
g/ 200 mL), ácido bórico (H3BO3), (0,280 g/ 200 los mismos componentes y se incremente la
mL), sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 concentración de agar a 20 g por cada 1000
·5H2O), (0,008 g/ 200 mL), sulfato de zinc mL de medio.
heptahidratado (ZnSO4 ·7H2O), (0,024 g/200
mL) y agua destilada (200 mL). 23. Agar Rojo Congo: Acido D-málico (5 g/L),
fosfato dibásico de potasio (K2HPO4), (0,5
Solución de vitaminas para NFB: Biotina 10 g/L), sulfato de magnesio (MgSO4), (0,2 g/L),
mg/100 mL, Piridoxina HCl 20 mg/100 m y H2O cloruro de sodio (NaCl), (0,1 g/L), cloruro de
destilada. 100 mL. hierro hexahidratado (FeCl3.6H2O), (0,015 g/L),
hidróxido de potasio (KOH), (4.8 g/L), agar agar
Preparación: Pesar o medir en volumen (15 g/L), extracto de levadura (1 g/L), solución
cada componente a excepción del agar 1:400 Rojo Congo (15 mL) y pH final (7,0).
y depositar en un recipiente de vidrio
que soporte el proceso de esterilización. Preparación: Pesar o medir en volumen
Posteriormente, adicionar 982 mL de agua cada componente a excepción del agar
destilada homogenizar y medir el pH con y depositar en un recipiente de vidrio
potenciómetro ajustando a 6,8 con KOH que soporte el proceso de esterilización.
1N o ácido málico (anexo B, numeral 8 y Posteriormente, adicionar 985 mL de agua
9). Finalmente, adicionar el agar y calentar destilada homogenizar y medir el pH con
lentamente en plancha de calentamiento potenciómetro ajustando a 6,8 con KOH
hasta ebullición suave. Esterilizar en 1N o ácido málico (anexo B, numeral 8 y
autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos. 9). Finalmente, adicionar el agar y calentar
Para preparar agar NFB se adicionan los lentamente en plancha de calentamiento
mismos componentes y se incremente la hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave
concentración de agar a 20 g por cada 1000 a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.
mL de medio.
24. Caldo amonio: Sulfato de amonio
22. Agar LGI: Sacarosa (5 g/L), solución al 10% ((NH4)2SO4), (500 mg/L), sulfato de magnesio
(m/v) de fosfato dibásico de potasio (K2HPO4), heptahidratado (MgSO4·7H2O), (40 mg/L),
(2 mL), solución al 10 % (m/v) de fosfato cloruro de calcio dihidratado (CaCl2·2H2O),
monobásico de potasio (KH2PO4), (6 mL), (40 mg/L), fosfato monobásico de potasio
solución al 10% (m/v) de sulfato de magnesio (KH2PO4), (200 mg/L), carbonato de calcio
(MgSO4), (2 mL), solución al 1 % (m/v) de (CaCO3), (2 mg/L) y pH final (7,0).
cloruro de calcio dihidratado (CaCl2 *H2O),(2
mL), solución al 0,1% (m/v) de molibdato de Preparación: Mezclar los componentes, calentar
sodio dihidratado (NaMoO4.2H2O), (2 mL), hasta ebullición con agitación constante y
solución al 0,5 % (m/v) de azul de bromotimol autoclavar a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.
en 0,2 N KOH (5 mL), solución al 1% (m/v) de El agar amonio se prepara con los mismos
cloruro de hierro hexahidratado (FeCl3.6H2O), componentes y se adicionan 20 g/L de agar.
(1 mL), pH (6,2) y agar agar (1,8 g/L). Para el
medio sólido se pesan 20 g/L de agar. 25. Caldo nitrato: Nitrato de potasio (KNO3),
(500 mg/L), sulfato de magnesio (MgSO4),
Preparación: Pesar o medir en volumen (18 mg/L), cloruro de calcio dihidratado
cada componente a excepción del agar (CaCl2*2H2O), (12,5 mg/L), fosfato
y depositar en un recipiente de vidrio monobásico de potasio (KH2PO4), (500 mg/L),
que soporte el proceso de esterilización. fosfato dibásico de potasio (K2HPO4), (500

232
mg/L), sulfato de hierro heptahidratado lentamente en plancha de calentamiento
(FeSO4*7H2O), (10 mg/L), carbonato de calcio hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave
(CaCO3), (1500 mg/L) y pH final (7,0). a 116,9 °C, 15 psi por 15 minutos. El fosfato
tricálcico se esteriliza en seco por aparte
Preparación: Mezclar los componentes, calentar para adicionarlo al medio una vez esté estéril.
hasta ebullición con agitación constante y
autoclavar a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos. El agar 28. Agar Picovskaya: Por componentes:
nitrato se prepara con los mismos componentes Glucosa (10 g/L), cloruro de sodio (NaCl),
y se adicionan 20 g/L de agar. (0,2 g/L), sulfato de amonio ((NH4)2SO4), (0,5
g/L), sulfato de magnesio monohidratado
26. Caldo SRMS1 sin indicador de pH: Sulfato (MgSO4*H2O), (0,1 g/L), sulfato de manganeso
de amonio ((NH4)2SO4), (0,5 g/L), cloruro de monohidratado (MnSO4*H2O), (0,1 g/L),
potasio (KCl), (0,2 g/L), sulfato de magnesio extracto de levadura (0,5 g/L), fosfato
monihidratado (MgSO4*H2O), (0,3 g/L), sulfato tricálcico (Ca3(PO4)2), (5 g/L), agar (20 g/L),
de manganeso monihidratado (MnSO4*H2O), agua destilada (1000 mL) y pH final (7,2).
(0,004 g/L), cloruro de sodio (NaCl), (0,2
g/L), sulfato de hierro heptahidratado Preparación: Pesar cada componente
(FeSO4*7H2O), (0,0004 g/L), glucosa (10 a excepción del agar y depositar en un
g/L), extracto de levadura (0,1 g/L), fosfato recipiente de vidrio que soporte el proceso de
tricálcico (Ca3(PO4)2), (5 g/L), agua destilada esterilización. Posteriormente adicionar 1000
(1000 mL) y pH final (7,2). mL de agua destilada homogenizar y medir
el pH con potenciómetro ajustando a 7,2 con
Preparación: Pesar cada componente NaOH 1N o HCl 1N (Anexo B, numeral 43 y
y depositar en un recipiente de vidrio 44). Finalmente, adicionar el agar y calentar
que soporte el proceso de esterilización. lentamente en plancha de calentamiento
Posteriormente adicionar 1000 mL de agua hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave
destilada homogenizar y medir el pH con por 15 minutos a 15 psi por 121º C. El fosfato
potenciómetro ajustando a 7,2 con NaOH 1N tricálcico se esteriliza en seco por aparte para
o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 447). Esterilizar adicionarlo al medio una vez esté estéril.
en autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.
El fosfato tricálcico se esteriliza en seco por 29. Caldo API: Por componentes: Lactato de
aparte para adicionarlo al medio una vez sodio (NaC3H5O3), (4 g/L), extracto de levadura
esté estéril. (1 g/L), ácido ascórbico o vitamina C (0,1 g/L),
sulfato de magnesio (MgSO4), (0,2 g/L), fosfato
27. Agar SRMS1 con indicador de pH: por dibásico de potasio (K2HPO4), (0,01 g/L), sulfato
componentes: Sulfato de amonio ((NH4)2SO4), ferroso de amonio (Fe(NH4)2(SO4)2*6H2O),
(0,5 g/L), cloruro de potasio (KCl), (0,2 (0,2 g/L), cloruro de sodio (NaCl), (10 g/L),
g/L), sulfato de magnesio monihidratado resazurina de sodio (0,001 g/L), agua destilada
(MgSO4*H2O), (0,3 g/L), sulfato de manganeso (1000 mL) y pH final (7,0).
monihidratado (MnSO4*H2O), (0,004 g/L),
cloruro de sodio (NaCl), (0,2 g/L), sulfato de Preparación: Pesar o medir cada componente
hierro heptahidratado (FeSO4*7H2O), (0,0004 a excepción del agar y depositar en un
g/L), glucosa (10 g/L), extracto de levadura recipiente de vidrio que soporte el proceso de
(0,1 g/L), fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2), (5 g/L), esterilización. Posteriormente adicionar 1000
púrpura de bromocresol (0,1 g/L), agar (20 mL de agua destilada homogenizar y medir
g/L), agua destilada (1000 mL) y pH final (7,2). el pH con potenciómetro ajustando a 6,5 con
NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y
Preparación: Pesar cada componente 44). Finalmente, adicionar el agar y calentar
a excepción del agar y depositar en un lentamente en plancha de calentamiento
recipiente de vidrio que soporte el proceso de hasta ebullición suave. Esterilizar en autoclave
esterilización. Posteriormente adicionar 1000 a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.
mL de agua destilada homogenizar y medir
el pH con potenciómetro ajustando a 7,2 con
NaOH 1N o HCl 1N (Anexo B, numeral 43 y
44). Finalmente, adicionar el agar y calentar

233
30. Caldo para Thiobacillus acidófilos: por (1,1 g/L), sulfato de cobre heptahidratado
componentes: Fosfato dibásico de potasio (CuSO4 * 7H2O), (1,57 g/L) y cloruro de calcio
(K2HPO4), (0,5 g/700 mL), carbonato de calcio hexahidratado (CaCl2 * 6 H2O), (1,61 g/L).
(CaCO3), (2 g/700 mL), sulfato de amonio
((NH4)2SO4), (2 g/700 mL), sulfato de magnesio Preparación: Pesar o medir cada componente
heptahidratado (MgSO4*7 H2O), (0,2 g/700 mL), y depositar en un recipiente de vidrio
sulfato de hierro heptahidratado (FeSO4 * 7 que soporte el proceso de esterilización.
H2O) al 14% (300 mL), ácido sulfúrico (H2SO4),10 Posteriormente adicionar 1000 mL de agua
N (1 mL), nitrato de calcio Ca(NO3)2, (0,01 destilada homogenizar y medir el pH con
g/700 mL), cloruro de potasio (KCl), (0,1 g/700 potenciómetro ajustando a 7,0 con NaOH 1N
mL), elementos traza (1 mL) y agua destilada o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 44). Esterilizar
(700 mL). en autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.

Solución de elementos traza: EDTA (50 g/L), 32. Caldo nutritivo: Pesar 8 gramos del
Sulfato de zinc (ZnSO4), (2,2 g/L), cloruro producto comercial y depositar en un
de calcio dihidratado (CaCl2 **2H2O), (5,5 recipiente de vidrio que soporte el proceso
g/L), cloruro de manganeso tetrahidratado de esterilización. Posteriormente adicionar
(Mn2Cl *4H2O), (5,06 g/L), ortomolibdato de 1000 mL de agua destilada homogenizar y
amonio tetrahidratado ((NH4)2MoO4 * 4 H2O), medir el pH con potenciómetro ajustando a
(1,1 g/L), sulfato de cobre heptahidratado 7,0 con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral
(CuSO4 * 5H2O), (1,57 g/L) y cloruro de calcio 43 y 44). Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15
hezhidratado (CaCl2 * 6 H2O), (1,61 g/L). psi por 15 minutos.

Preparación: Pesar o medir cada componente 33. Medio mínimo mineral Bold suplementado
a excepción del FeSO4 y depositar en un con 1 g/L de glucosa: Cloruro de calcio
recipiente de vidrio que soporte el proceso dihidratado (CaCl2*H2O), (25 mg/L), cloruro
de esterilización. Posteriormente adicionar de sodio (NaCl), (25 mg/L), nitrato de sodio
700 mL de agua destilada homogenizar y (NaNO3), (250 mg/ L), sulfato de magnesio
medir el pH con potenciómetro ajustando (MgSO4), (75 mg/ L), fosfato monobásico de
a 2,0 con H2SO4 10 N (anexo B, numeral 16). potasio (KH2PO4), (105 mg/L), fosfato dibásico
Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi por de potasio (K2HPO4), (75 mg/L), glucosa (a
15 minutos. Autoclavar el FeSO4 en seco a g/L). Adicionalmente, se añaden 3 mg/L de
116,9°C, 15 psi por 15 minutos, adicionar agua solución de elementos traza. El pH final del
estéril hasta el volumen requerido (300 mL) medio es 7,0.
para que tenga una concentración final en
el medio del 14% (v/v). Mezclar el medio con Solución de elementos traza: cloruo de hierro
la solución de FeSO4 (FeCl3), (0,194 g/L), cloruo de manganeso
(MnCl2), (0,082 g/L), cloruro de cobalto
31. Caldo para Thiobacillus neutrófilos por (CoCl2), (0,16 g/L), molibdato de sodio
componentes: fosfato dibásico de potasio dihidratado (Na2MoO4H2O), (0,008 g/L), cloriro
(K2HPO4), (3 g/L), carbonato de calcio (CaCO3), de zinc (ZnCl2), (0,005 g/L) y pH (7.0).
(2 g/L), sulfato de amonio ((NH4)2SO4), (0,3 g/L),
sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 * 7 Preparación: Pesar o medir cada
H2O), (0,3 g/L), cloruro de hierro hexahidratado componente y depositar en un recipiente de
(FeCl3 * 6 H2O), (0,02 g/L), tiosulfato de sodio vidrio que soporte el proceso de esterilización.
(Na2S2O3), (10 g/L), cloruro de calcio dihidratado Posteriormente adicionar 997 mL de agua
(CaCl2 * 2 H2O), (0,2 g/L), elementos traza (1 mL) destilada homogenizar y medir el pH con
y agua destilada (1000 mL). potenciómetro ajustando a 7,0 con NaOH 1N
o HCl 1N (anexo B, numeral 43 y 44). Esterilizar
Solución de elementos traza: EDTA (50 g/L), en autoclave a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.
Sulfato de zinc (ZnSO4), (2,2 g/L), cloruro Para preparar el agar Bold se adicionar 20 g/L
de calcio dihidratado (CaCl2 **2 H2O), (5,5 de agar agar después de ajustar el pH, calentar
g/L), cloruro de manganeso tetrahidratado lentamente en plancha de calentamiento
(Mn2Cl * 4H2O), (5,06 g/L), ortomolibdato de hasta ebullición suave y esterilizar en autoclave
amonio tetrahidratado ((NH4)2MoO4 * 4 H2O), a 116,9°C, 15 psi por 15 minutos.

234
34. Agar Rosa de Bengala: Por componentes: g/L), extracto de carne (12 g/L), cloruro de
Glucosa (10 g/L), peptona bacteriológica (5 sodio (NaCl), (3 g/L), solución de carbonato
g/L), fosfato dibásico de potasio (K2HPO4), (1 de sodio (Na2CO3), (150 g/L) (5 mL), Solución
g/L), sulfato de magnesio (MgSO4), (0,5 g/L), de cloruo de magnesio (100 g de MgCl2.6H2O
cloranfenicol (0,1 g/L), colorante rosa de en 50 mL de H2O (0,3 mL), Solución de cloruro
bengala (0,05 g/L), agar (20 g/L) y pH 5,5. Por casa de calcio (CaCl2)1 mol/L. Ver la forma de
comercial: Pesar 31, 6 g del producto comercial y preparación abajo y este reactivo se adiciona
depositar en un recipiente de vidrio que soporte después de autoclavar a una temperatura
el proceso de esterilización. Posteriormente de 45ºC. (6 mL), agar agar (16 g) y agua
adicionar 1000 mL de agua destilada, disolver destilada (1000 mL).
en plancha de calentamiento hasta ebullición
suve y medir el pH con potenciómetro ajustando Medio completo: Son los mismos componentes
a 7,0 con NaOH 1N o HCl 1N (anexo B, numeral y cantidades del caldo MSB solo que se debe
43 y 44). Esterilizar en autoclave a 116,9°C, 15 psi adicionar agar-agar en una proporción de 16
por 15 minutos. g/L de medio preparado, autoclavar el medio
completo y finalmente dejar enfriar hasta +/-
35. Composición del medio Caldo A-1: 45°C para agregar asépticamente una solución
Lactosa (5,0 g/L), triptona (20 g/L), cloruro de de cloruro de calcio estéril (1 mol/L) en una
sodio (NaCl), (5,0 g/L), Salicina (0,5 g/L), Triton proporción de 0,6 mL por cada 100 mL (6 mL
X-100 (Polyethylene glycol p-isooctylphenyl para un litro) de medio preparado. Mezclar
ether (1,0 mL), agua destilada 1 L. bien y servir en cajas de Petri, así: Dejar solidificar
y almacenar en oscuridad a 5 +/- 3°C inferior
Preparación: Suspender 31,5 gramos de medio a 1 mes, si hay buena protección contra la
en un litro de agua destilada. Mezclar bien desecación. Solución de cloruro de calcio 1 M
y disolver con calor y agitación frecuente. (anexo B, numeral 38).
Hervir durante un minuto hasta disolver por
completo. Dispensar en tubos con campanas Para la preparación del caldo MSB se debe
Durham para la detección de gas, y esterilizar tener precaución de no adicionar la solución
en autoclave a 121ºC durante 10 minutos. de CaCl2 porque puede precipitarse e
Nota: para 10 mL de muestra de agua, interferir en la lectura por densidad óptica del
preparar el medio con doble concentración. inoculo, y por consiguiente en los resultados
de la práctica. Por otro lado, las soluciones
36. Composición del Colilert®- 18 (sustrato de Na2CO3 y Mg, se deben autoclavar
definido):o-nitrofeil-β-D-galactopiranósido por separado y adicionar posteriormente
(ONPG) (50 mg/100 mL), MUG (7,5 mg/100 mL), al resto de componentes en los medios
KH2PO4 (620 mg/100 mL), Anfoterecina (0,1 correspondientes.
mg/100 mL), Solanium (50 mg/100 mL), sulfato
de amonio ((NH4)2SO4), (500 mg / 100 mL), 38. Agar Semisólido Scholtens Modificado
sulfato de manganeso (MnSO4), (5 mg /100 mL), (MSAss): Agar semisólido para determinación
sulfato de zinc (ZnSO4), (5 mg /100 mL), sulfato de fagos somáticos, corresponde a la segunda
de magnesio (MgSO4), (10 mg /100 mL), cloruro capa de agar. Por componentes: peptona (10
de calcio (CaCl2), (5 mg /100 mL), fosfato g/L), extracto de levadura (3 g/L), extracto de
dibásico de sodio (Na2HPO4), (90 mg /100 mL), carne (12 g/L), cloruro de sodio (NaCl), (3 g/L),
sulfito de sodio (Na2SO3), (4 mg / 100 mL), cloruro solución de carbonato de sodio (Na2CO3),
de sodio (NaCl), (1000 mg / 100 mL). Este medio (150 g/L) (5 mL), solución de Mg (100 g de
de cultivo viene pre-dispensado en viales (o MgCl2.6H2O en 50 mL de H2O) (0,3 mL).
“sachet”) estéril y listo para utilizar. NO requiere
autoclavado ni preparación. Medio completo: Son los mismos
componentes y cantidades del caldo MSB
37. Agar Scholtens Modificado (MSA): Agar solo que se debe adicionar agar-agar en una
para cuantificación de fagos somáticos, proporción de 16 g/L de medio preparado,
corresponde a la primera capa de agar la autoclavar el medio completo y finalmente
que se sirve en la caja y se deja solidificar dejar enfriar hasta +/- 45°C para agregar
previamente a la prueba. Por componentes: asépticamente una solución de cloruro de
peptona (10 g/L), extracto de levadura (3 calcio estéril (1 mol/L) en una proporción

235
de 0,6 mL por cada 100 mL (6 mL para un papáico de soya (5,0 g/L), cloruro de sodio
litro) de medio preparado. Mezclar bien y (5,0 g/L), factores de crecimiento (1,5 g/L) y
servir en cajas de Petri, así: Dejar solidificar y agar (14, 5 g/L).
almacenar en oscuridad a 5 +/- 3°C inferior
a 1 mes, si hay buena protección contra la Preparación: Suspender cada uno de los
desecación. Solución de cloruro de calcio 1 componentes en un litro de agua destilada.
M (anexo B, numeral 38). Mezclar bien y disolver con calor y agitación
frecuente. Hervir durante un minuto hasta
Disuelva el cloruro de calcio en agua mientras disolver por completo en plancha de
se calienta suavemente, enfríe a temperatura calentamiento. Esterilizar en autoclave a
ambiente y esterilice por filtración a través 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50ºC.
de una membrana con poros de 0,2 µm,
almacene en oscuridad a 5 +/- 3°C por no 41. Medio Rappaport semosólido: Triptosa
más de 6 meses. Solución de ácido nalidíxico (4,59 g/L), hidrolizado de caseína (ácido)
(anexo B, numeral 37). (4,59 g/L), cloruro de sodio (NaCl), (7,34 g/L),
fosfato monobásico de potasio (KH2PO4),
39. Caldo Scholtens Modificado (MSB): Caldo (1,47 g/L), Cloruro de magnesio, anhidro
para cultivo de la cepa huésped de fagos (MgCl2) (10,93 g/L), oxalato de verde de
somáticos. malaquita 0,037 g (37 mg/L), agar (2,7 g/L),
agua de grado reactivo (1000 mL) y solución
Por componentes: peptona (10 g/L), Extracto de novobiocina (2%).
de levadura (3 g/L), extracto de carne (12
g/L), cloruro de sodio (NaCl), (3 g/L), Solución Preparacion: Después de mezclar bien los
de Na2CO3 (150 g/L) (5 mL), Solución de componentes, calentar hasta que hierva
MgCl2.6H2O (100 g de MgCl2.6H2O en 50 mL para disolverlos completamente (no
de H2O), (0,3 mL), Agua destilada (1000 mL), esterilizar en autoclave). Dejar enfriar a 50°C
disuelva los ingredientes en agua caliente. aproximadamente y agregar la solución de
Ajuste el pH a 7,2 +/- 0,2 a 45 +/- 3°C, así novobiocina al 2% por litro de medio. Mezclar
después de esterilizar, éste será de 7,2 +/- 0,5, bien girando el medio. Inmediatamente
distribuya el medio en botellas en volúmenes vertir en cajas de Petri. No invierta las placas
de 100 mL. esterilice en autoclave a 121 +/- para almacenar. Nota: Si usa un suplemento
1°C por 15 min, almacene en oscuridad a 5 antimicrobiano de novobiocina preparado
+/- 3°C por no más de 6 meses. comercialmente, agregue un volumen
suficiente para lograr una concentración de
Preparación de la solución de MgCl2: 0,002% por litro.
El MgCl2.6H2O es muy higroscópico y no debe
ser almacenado en forma cristalina una vez 42. Agar X. L. D. (Xilosa, lisina, desoxicolato):
que el contenedor ha sido abierto, por eso, Xilosa (3,75 g/L), Lisina (5,0 g/L), Lactosa (7,5
use el contenido total de un contenedor y g/L), Sacarosa (7,5 g/L), Cloruro de sodio
disolver en la cantidad de agua apropiada, (NaCl), (5,0 g/L), extracto de levadura (3,0
añadir 100 g de MgCl2.6H2O en 50 mL de agua g/L), Rojo Fenol (0,08 g/L), Desoxicolato de
destilada, la concentración final de Mg2+ en Sodio (2,5 g/L), Tiosulfato de Sodio (Na2S2O2),
esta solución será de 4,14 mol/L, esterilizar (6,8 g/L), Citrato Férrico de Amonio (0,8 g/L),
en autoclave y almacene a temperatura Agar (15,0 g/L), Agua destilada c.s.p. (1000
ambiente en oscuridad. mL), pH final 7.4 +/0.2.

Preparación de la solución de Na2CO3: Preparación: Suspender 57 g de medio

El Na2CO3 corrosivo por tanto debe manipularse en un litro de agua destilada. Mezclar
con guantes, gafas y batas apropiados, añadir vigorosamente. Calentar con agitación
15 g a 100 mL de agua destilada, esterilizare suave hasta que el medio llegue a ebullición.
en autoclave y almacenar a temperatura Evitar el sobrecalentamiento ya que puede
ambiente en oscuridad. provocar la precipitación del medio. Este
medio NO se puede esterilizar por autoclave.
40. Caldo tripticasa de soya: Digerido
pancreático de caseína (14,5 g/L), digerido

236
43. Agar TSI (triple azúcar-hierro). Digerido 46. Caldo Lauril sulfato: Triptosa (20 g/L),
pancreático de caseína (10,0 g/L), Digerido lactosa (5,0 g/L), cloruro de sodio (5,0 g/L),
péptico de tejido animal (10,0 g/L), Cloruro fosfato dibásico de potasio (2,75 g/L), fosfato
sódico (5,0 g/L), Lactosa (10,0 g/L), sacarosa monobásico de potasico (2,75 g/L), luril sulfato
(10,0 g/L), Dextrosa (1,0 g/L), Sulfato ferroso de sódico (0,10 g/L) y pH 6,8.
amonio (0,2 g/L), Tiosulfato sódico (0,2 g/L), Rojo
fenol (0,025 g/L), Agar (13,0 g/L) pH: (7,3 +7- 0,2). Preparación: Disolver 35,7 g en un litro de
agua destilasa. Autoclavar a 121º C durante
Preparacion: Pese 62,5 g del medio agar hierro 15 minutos.
triple azúcar (TSI) deshidratado y disuelva en
un litro de agua destilada. Caliente hasta 47. Caldo EC: Triptosa (20 g/L), lactosa (5,0
disolver completamente el agar. Hervir por un g/L), fofato monobásico de potasio (5,5 g/L),
minuto agitando frecuentemente. Distribuir cloruro de sodio (5,0 g/L), sales biliares (1,5
4 mL del medio en tubos de ensayo 13/100. g/L) y pH 6,9.
Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.
Sacar de la autoclave y dejar reposar de Preparación: Disolver 35,7 g en un litro de
forma inclinada. Se debe cuidar que tanto la agua destilasa. Autoclavar a 121º C durante
base como el bisel tengan la misma distancia. 15 minutos
Almacenar en nevera 2-8°C. Dejar atemperar
antes de sembrar la cepa bacteriana. ANEXO B
Preparación de reactivos
44. Agar LIA (agar lisina-hierro): Agar
bacteriológico (13,5 g/L), púrpura de 1. Solución salina al 0,85 % (m/v): Pesar 0,85
bromocresol (0,02 g/L), glucosa p(1 g/L), g de cloruro de sodio (NaCl) y disolver en
citrato de amonio férrico (0,5 g/L), eptona de 100 mL de agua destilada. Depositar en
gelatina (5 g/L), L-Lisina (10 g/L), tiosulfato de un frasco de vidrio previamente rotulado y
sodio (0,04 g/L), extracto de levadura (3 g/L), guardar refrigerado.
pH: (6,7 +/- 0,2).
2. Agua peptona al 0,1 % (m/v): Pesar 0,1 g
Preparacion: Suspender 33 gramos de medio de peptona universal y disolver en 1000 mL de
en un litro de agua destilada. Mezclar bien y agua destilada, ajustar el pH a 7,0 con NaOH
disolver calentando con agitación frecuente. 1N o HCl 1N; depositar el volumen requerido
Hervir durante un minuto hasta disolver por en los recipientes de vidrio y esterilizar por 15
completo. Dispensar en tubos y esterilizar en minutos a 15 psi.
autoclave a 121° C durante 12 minutos. Dejar
enfriar en posición inclinada. 3. Rojo congo al 1 % (m/v): Pesar 1 g de rojo
congo y disolver en 100 mL de agua destilada.
45. Agar BHI (infusión cerebro corazón): Depositar en un frasco de vidrio previamente
Glucosa (2 g/L), Fosfato dibásico de sodio (2,5 rotulado y guardar refrigerado a 4ºC.
g/L), peptona de gelatina (10 g/L), cloruro
sódico (5 g/L), infusión de corazón (10 g/L), 4. Cloruro de sodio 2 M: Pesar 116,8 g de
infusión de cerebro (7,5 g/L), pH (7,3 +7- 0,2). cloruro de sodio (NaCl) y disolverlos en 1000
mL de agua destilada. Depositar en un frasco
Preparación: Suspender 37 gramos del medio de vidrio previamente rotulado y guardar
en un litro de agua destilada. Mezclar bien y refrigerado a 4ºC.
disolver calentando con agitación frecuente.
Hervir durante un minuto hasta disolver 5. Hidróxido de potasio 0,5 M: Pesar 28,05
por completo. Dispensar en recipientes g de KOH y disolverlos en 1000 mL de agua
apropiados y esterilizar a 121ºC durante destilada. Depositar en un frasco de vidrio
15 minutos. El medio preparado debe previamente rotulado y guardar refrigerado.
almacenarse a 2-8ºC. Para obtener mejores
resultados el medio debe usarse el mismo 6. Solución de glucosa y cloruro de amonio:
día, de no ser así, debe calentarse en agua Pesar por separado 0,625 g de glucosa y 0,050
hirviendo para expulsar el oxígeno disuelto y g de cloruro de amonio. Disolver en 1000 mL
dejar enfriar antes de usar. de agua destilada. Esterilizar en autoclave a

237
116,9°C, 15 psi por 15 minutos. Preservar en un Solución B: Disolver 70 g de IK anhidro en
recipiente cerrado a 4ºC. un pequeño volumen de agua destilada
y añadir 100 g de I2Hg. Disolver y diluir con
7. Alochol eteílico al 20% (v/v): Medir 2,85 mL agua destilada hasta 500 mL. Conservar
de alcohol al 70% (v/v) y mezclar con 97,15 mL ámbar debidamente sellado. Finalmente,
de agua destilada. Preservar en un recipiente para obtener el reactivo de Nessler, mezclar
cerrado a 4ºC. en partes iguales las dos soluciones.

8. Hipoclorito de Sodio al 2,5 % (v/v): Medir 15. Reactivo de Gries:

con pipeta 2,5 mL de hipoclorito comercial Solución A: Disolver 0,5 g de ácido sulfanílico
al 5% (v/v) y mezclar con 200 mL de agua en 30 mL de ácido acético glacial y 120 mL
destilada. Depositar en un frasco de vidrio de agua destilada. Filtrar si es necesario.
previamente rotulado y guardar refrigerado
a 4ºC. Solución B: Disolver 0,1 g de alfanaftil amina en
120 mL de agua destilada calentando, enfriar,
9. Ácido salicílico 5 % (m/v), disuelto en H2SO4 agregar 30 mL de ácido acético glacial.
al 98% (v/v): Pesar 5 g de ácido salicílico y Utilizar cámara de extracción y máscara de
disolverlos en 100 mL de H2SO4 al 98 % (v/v). protección, los reactivos son cancerígenos. Si
Guardar en frasco oscuro. cualquiera de las dos soluciones toma color,
agitar con 0,5 g de zinc en polvo y filtrar. Para
10. Hidroxido de sodio 2 N: Pesar 80 g de obtener el reactivo de Griess, mezclar las
NaOH y mezclar lentamente con 1000 mL de dos soluciones y almacenar en frasco ámbar
agua destilada. La reacción es exotérmica debidamente sellado.
se recomienda realizar una homogenización
suave hasta que observar una disolución 15. Solución stock de KNO3 de 1000 ppm:
completa de las perlas de hidróxido. Depositar Pesar 1 g de nitrato de potasio y disolver en
en un frasco de color ámbar previamente 1000 mL de agua destilada empelando un
rotulado y guardar refrigerado a 4ºC. balón aforado de 1000 mL.

[Link]ón stock de (NH4)2SO4 de 1000 ppm: 16. p-nitrofenol 0,025 mM: Pesar 5,47 mg de
Pesar 1 g de nitrato de potasio y disolver en 4-p-nitrofenol fosfato y disolver en 1000 mL de
1000 mL de agua destilada empelando un agua destilada. Preservar en un frasco ambar
balón aforado de 1000 mL. y refrigerado a 4ºC.

12. Solución A compuesta por la “Mezcla” + [Link] universal MUB: Pesar 3,025 de Tris-
“Reactivo de color- CDR: compuesta por la (hidroximetil)-aminometano, 2,9 g de ácido
“Mezcla” + “Reactivo de color- CDR” – Mezcla maleíco, 3,5 g de ácido cítrico, 1,57 g de ácido
para 100 mL: 2,8 g KNaC4H4O6.4H2O – Tartrato bórico, 1 M de hidróxido de sodio, disolver
de sodio y potasio, 2,9 g Na3C6H5O7 – Citrato en 122 mL de agua estilada. Posteriormente,
de sodio, 8 g NaOH. CDR para 100 mL: 100 agregar más agua destilada hasta completar
mL de “Mezcla”, 8 g C7H5NaO3 – Salicilato de 250 mL. La solución se almacena a 4°C en
Sodio, 0,1 g Na2[Fe(CN)5NO] – Nitroprusiato oscuridad.
de Sodio.
18. Hidróxido de sodio 0,5 M: Disolver 20 g
13. Solución de hipoclorito de sodio al 0,2% de hidróxido de sodio en 500 mL de agua
(v/v): Medir con pipeta automática 4 mL de destilada, Utilizar cámara de extracción y
hipoclorito de sodio al 5 % (v/v) o comercial y máscara de protección
disolver en 100 mL de agua destilada.
19. Cloruro de calcio 0,5 M: Disolver 55, 49
14. Reactivo de Nesler: g de CaCl2 en 1000 mL de agua destilada.
Solución A: Disolver 160 g de NaOH en 500 Preservar en un frasco hermético y refrigerado.
mL de agua destilada. Conservar en frasco
ámbar bien sellado. 20. p-nitrofenol (0,01 – 0,06 µmol/L): Pesar
0,001 mg de p-nitrofenol y disolver en 1000
mL de aguas destilada si se va utilizar la

238
concentración 0,01 µmol/L. Pesar 0,008 mg se disuelven y se aforan con agua destilada.
de p-nitrofenoly disolver en 1000 mL de agua Finalmente, en un balón aforado de 2000 mL
destiladasiseva a utilizar la concentración de se adicionan las dos soluciones y se adiciona 1
0,06 µmol/L. L de ácido sulfúrico a 5N y finalmente se afora
a un volumen de 2 L con agua destilada.
[Link] acetato de Sodio 200 mM: Pesar 16,4
mg de acetato de sodio y dislver en 1000 mL 32. Reactivo B fosforo: Pesar 1,056 g de ácido
de agua destilada. Preserva en un frasco ascórbico a un balón a forado de 200 mL y
tapado y a 4°C. aforar hasta el volumen final con el reactivo
A. Esta solución debe prepararse el mismo día
22. Solución de ácido fítico: Pesar 1 g de ácido en el que se utiliza (útil para 66 muestras).
fítico y disover en 1000 mL de agua destilada.
33. Solucion de fofatos o solución A para la
23. Solución reveladora de fitasas determinación de DBO5: Disolver 8,5 g de KH2PO4,
21,75 g de K2HPO4, 33,4 g de Na2HPO4.7H2O, y
24. Acido cítrico 1 M: Disolver 192,1 g de 1,7 g de NH4Cl en aproximadamente 500 mL de
ácido cítrico en 1000 mL de agua destilada, agua destilada y diluir a 1 L. El pH debe ser 7,2
Preservar en un frasco hermético y refrigerado.
34. Solución de sulfato de magnesio
25. KOH (10 % m/v): Pesar 10 g de KOH y heptahidratado o solución B para la
disolverlos en 100 mL de agua destilada. determinación de DBO5: Disolver 22,5 g de
MgSO4.7H2O en agua destilada y diluir a 1 L.
26. H2O2 10 % o 30 % (v/v): Medir 10 mL de
H2O2 al 30 % (v/v) y mezclarlos con 90 mL 35. Solución de cloruro de calcio o solución C
de agua destilada. Preservar en un frasco para la determinación de DBO5: Disolver 27,5 g
hermético y refrigerado. de CaCl2 en agua destilada y diluir a 1 L.

27. HCl (1 % v/v): Mezclar 2,63 mL de HCl al 36. Solución de cloruro férrico hexahidratado
38% (v/v) con 97,37 mL de agua destilada. o solución D para la determinación de
Preservar en un frasco hermético y refrigerado. DBO5: Disolver 0,25 g de FeCl3.6H2O en agua
destilada, diluir a 1 L.
28. Azul de tripano (0,05% m/v): Pesar 0,05
g de azul de tripán y disolverlos en 100 mL 37. Inoculo para DBO5: Mezclar 10 mL de una
de agua destilada. Preservar en un frasco suspensión de Pseudomonas sp, 10 mL de
hermético y refrigerado. Bacillus sp. y 10 mL de Escherichia coli en un
frasco Schott de 100 mL y completar con 70 mL
29. NaHCO3 0,5 M: Pesar 42 g de NaHCO3 de solución salina al 0,85 % (m/v). Preparar cada
y disolver en 1000 mL de agua destilada. vez que se vaya a realizar una determinación
Preservar en frasco con tapa y en refrigeración de la demanda química de oxígeno.
de 4ºC.
38. Ácido nalidíxico: Mezclar 250 mg de
30. Solución patrón de KH2PO4: Se pesan 0.23g ácido nadilíxico con 2 mL de NaOH 1M y 8 mL
KH2PO4 y se afora con agua destilada hasta de agua destilada, se esteriliza por filtración
un volumen final de 1L. Esta solución madre con filtros de membrana de 0,22 µm. de la
corresponde a la concentración de 50 ppm. solución anterior se adiciona 1 mL para cada
A partir de ella se obtiene soluciones estándar 100 mL de medio (10 mL para un litro).
de 0, 0,5,1,1,5,2 y 2,5 ppm en agua destilada y
se mantienen en refrigeración. 39. Cloruro de calcio 1 M: Pesar 14,6 g de
CaCl2 disuelva el cloruro de calcio en agua
31. Reactivo A para fosforo: 12 gramos de mientras se calienta suavemente, Enfríe
Molibdato de potasio, son puestos en un a temperatura ambiente y esterilice por
balón aforado de 250 mL, aforando a 250 filtración a través de una membrana con
mL con agua destilada. Simultáneamente, poros de 0,2 µm, almacene en oscuridad a 5
en un balón aforado de 200 mL se agregan +/- 3 °C por no más de 6 meses.
0.2743 g de tartrato de potasio y antimonio

239
40.p-nitrofenol 0,1 M: Pesar 21,9 mg de 4-p-n
itrofenol fosfato y disolver en 1000 mL de agua
destilada. Preservar en un frasco ambar y
refrigerado a 4ºC.

41. buffer Tris-HCL buffer (0,05 M, pH 8,0).

42. Hidróxido de sodio 1 N: Pesar 40 g de

NaOH y mezclar lentamente con 1000 mL de
agua destilada. La reacción es exotérmica
se recomienda realizar una homogenización
suave hasta que observar una disolución
completa de las perlas de hidróxido. Depositar
en un frasco de color ámbar previamente
rotulado y guardar refrigerado a 4ºC.

43. Ácido clorhídrico al 1 N: Medir con pipeta

de vidrio de 10 mL o probeta de 20 mL la
cantidad necesaria para preparar 1000 mL
de solución en agua destilada. La reacción
es exotérmica se recomienda realizar una
homogenización suave hasta que observar
una disolución completa. Depositar en un
frasco de color ámbar previamente rotulado
y guardar refrigerado a 4ºC.

240