UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN

FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y

FARMACIA

Bacterias lácticas con capacidad de producir

folatos como estrategia para el diseño de
alimentos bio-enriquecidos

Bioquímico Jonathan Emiliano Laiño

2014
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN
FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA
Departamento Posgrado

HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO

Dra. Gabriela del Valle Perdigón
Dra. María Inés Gómez
Dra. María Eugenia Mónaco
Mag. Adriana Correa Zeballos
Máster María Regina Rintoul
Bioq. Cecilia Hebe Noemí Orphée
Bioq. Graciela Esther Borda
Sr. Mario Luis Rodríguez
Sr. Hugo Vaca
Sr. José María Sánchez
Srta. Anabel Noelí Garay Maguna

DECANA
Dra. Silvia Nelina González

VICE-DECANO
Dr. Edgardo Hugo Cutin

SECRETARIA DE ASUNTOS ACADEMICOS

Dra. Marta Elena Cecilia

JEFA DEL DEPARTAMENTO POSGRADO

Lic. Marta Quinteros
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN
FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA
Departamento Posgrado

DEPARTAMENTO DE POSGRADO

AUTORIDADES

DIRECTORA
Dra. Florencia Fagalde

CONSEJO TITULAR
Dra. Florencia Fagalde
Dra. María Inés Ybarra
Dra. Adriana María Sales
Dra. Nancy Roxana Vera
Dra. María Eugenia Bibas Bonet
Dra. Rosana Chehín

CONSEJO SUPLENTE
Dra. Sonia Beatriz Díaz
Dra. María Cristina Rubio de Recupero
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN
FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA
Departamento Posgrado

TRABAJO DE POSGRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO

ACADÉMICO SUPERIOR DE DOCTOR EN BIOQUÍMICA

CARRERA DE DOCTORADO EN BIOQUÍMICA

Acreditado y Categorizado A ante la
Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)
Resolución nº: 732/00

Acreditado y Categorizado A ante la

Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)
Resolución nº: 489-CONEAU-12

Director
Dr. Manuel Javier Aybar

Comité Académico
Dra. Gladis Susana Álvarez
Dr. Mario Domingo Baigorí
Dra. Sara Serafina Sánchez
Dra. Inés del Carmen Ramos
Dra. Roxana Beatriz Medina
Dr. Raúl Armando Salomón
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN
FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA
Departamento Posgrado

TRABAJO DE POSGRADO TITULADO

BACTERIAS LÁCTICAS CON CAPACIDAD DE PRODUCIR

FOLATOS COMO ESTRATEGIA PARA EL DISEÑO DE
ALIMENOS BIO-ENRIQUECIDOS

TESISTA
Bioq. Jonathan Emiliano Laiño

DIRECTORA DE TESIS
Dra. Graciela Savoy de Giori

DIRECTOR ASOCIADO DE TESIS

Dr. Jean Guy Joseph LeBlanc

COMISIÓN DE SUPERVISIÓN
Dra. María Eugenia Bibas Bonet
Dr. Fernando Juan Manuel Sesma†
Dra. María Pía Taranto
 Este trabajo fue realizado en el Centro de Referencia para Lactobacilos
(CERELA), dependiente del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y
Técnicas (CONICET), de la Fundación Miguel Lillo y de la Fundación para la
Educación, la Ciencia y la Cultura (FECIC)

Con el apoyo financiero del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y

Técnicas (CONICET), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica
(ANPCYT) y Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán
(CIUNT).
 Parte de los resultados de este trabajo de tesis doctoral fueron publicados en:

Artículos en revistas científicas con referato

-“Applicability of a Lactobacillus amylovorus strain as co-culture for obtaining a
novel naturally bio-enriched in folate fermented milk” (2014). Jonathan E Laiño,
Marianela Juarez del Valle, Graciela Savoy de Giori, and Jean Guy LeBlanc.
International Journal of Food Microbiology 191:10-16.
-“Development of a high folate concentration yogurt naturally bio-enriched using
selected lactic acid bacteria” (2013). Jonathan Emiliano Laiño, Marianela Juarez del
Valle, Graciela Savoy de Giori, and Jean Guy LeBlanc. LWT-Food Science Technology
54(1):1-5.
-“Production of natural folates by lactic acid bacteria starter cultures isolated from
artisanal Argentinean yogurts” (2012). Jonathan Emiliano Laiño, Jean Guy LeBlanc,
and Graciela Savoy de Giori. Canadian Journal of Microbiology 58(5):581-88.
-“B-Group vitamin production by lactic acid bacteria – current knowledge and
potential applications” (2011). LeBlanc J.G., Laiño J.E., del Valle M.J., Vannini V., van
Sinderen D., Taranto P., de Valdez G.F., de Giori G.S. and Sesma F. Journal of
Applied Microbiology 111(6):1297-1309.

Capítulos de libro
-“Folate production by lactic acid bacteria” (2013). Laiño J.E., de Giori G.S., and
LeBlanc J.G. En “Bioactive Foods as Dietary Interventions for Liver and
Gastrointestinal Disease” Watson RR and Preedy VR (eds.). Chapter 16 pp. 251-270.
San Diego: Academic Press.
 AGRADECIMIENTOS

A mi directora la Dra. Graciela Savoy de Giori por haberme dado la invaluable

oportunidad de realizar mi tesis doctoral. Por sus continuos consejos tanto a nivel
profesional como personal, su cálido trato y sobre todo paciencia para conmigo,
enseñándome siempre con una sonrisa, con palabras y su ejemplo, haciéndome sentir
como un hijo para ella. Por su confianza y continuo incentivo para mejorar y ser un
buen científico. Por haber puesto todo a mi disposición y haber hecho todo y más de lo
que estuvo a su alcance para realizar este trabajo de tesis, permitiéndome crecer
profesional y personalmente.
A mi co-director, el Dr. Jean Guy Joseph LeBlanc, por su continua ayuda tanto
en el laboratorio como en la parte personal desde el primer día de tesis. Por haberme
recibido y ayudado en todo cuanto estuvo a su alcance. Por permitirme mejorar y
superarme profesionalmente día a día a través de sus continuos consejos científicos y
personales, alentándome continuamente a seguir adelante, y por todas las oportunidades
brindadas.
A la Dra. María Eugenia Bibas Bonet y el Dr. Fernando Sesma, miembros de la
comisión de supervisión, por sus continuos consejos y aportes, por su dedicación y
compromiso en la tarea de supervisión.
A la Dra. María Pía Taranto, miembro de la comisión de supervisión, por sus
generosidad, total predisposición y compromiso, al reemplazar al Dr. Fernando Sesma,
en la tarea de supervisor de tesis. Por sus consejos y sugerencias, que me permitieron
mejorar profesionalmente.
A la Dra. Graciela Font de Valdez, directora del CERELA, por haberme abierto
las puertas de tan prestigiosa institución, y permitirme de esa manera desarrollar mi
trabajo de tesis.
A la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional
de Tucumán, por la excelentísima formación académica que me ha brindado tanto a
nivel de grado como Bioquímico, como de posgrado en esta tesis doctoral.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por
haberme otorgado las Becas Internas de Posgrado Tipo I y II, las cuales me han
permitido realizar esta tesis.
Al CONICET, la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica
(ANPCYT) y Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán
(CIUNT), por los subsidios brindados en el marco de proyectos, sin los cuales no podría
haber llevado a cabo este trabajo de tesis.
A la Lic. Marta Quinteros y Myriam González, del Departamento de Posgrado
de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de
Tucumán, por su paciencia, disposición, dedicación y asesoramiento en todos los
trámites administrativos.
A la Dra. María Graciela Agüero, Profesora Titular de la Cátedra de Bioquímica
Clínica I, por haberme permitido realizar trabajos experimentales en su cátedra.
Especialmente por sus consejos de gran valor científico y personales, quien me ha
transmitido sus conocimientos y ayudado con gran dedicación y compromiso. Por
haberme hecho sentir como un hijo, el tiempo que he estado en su cátedra bajo su
dirección el tiempo previo a la realización de esta tesis, y su posterior ayuda.
A Marianela Juárez del Valle, mi “hermana de vitaminas”, por haberme ayudado
en todas las tareas diarias en el laboratorio y sus consejos, con quien hemos ido
creciendo juntos profesionalmente, siendo siempre una gran amiga.
A mis compañeras del laboratorio de Tecnología y Desarrollo y Genética, María
Eugenia Ortiz, Silvina del Carmen, Lorena Carrizo, Luciana Ruiz Rodríguez, Nadia
Suarez, Juliana Bleckwedel, Julieta Bonacina, Lucrecia Terán, Antonieta Rodriguez de
Olmos, Alejandra Correa Deza, Lucía Brown, Carolina Torres, Eugenia Jimenez,
Micaela Pescuma, Yanina Bustos, Andrea Dallagnol y todos los chicos de CERELA
por su ayuda y paciencia durante todos estos años de tesis, con quienes he compartido
todos los días de tantos años buenos momentos como otros difíciles, y de quienes me
llevo los mejores recuerdos y una gran amistad.
A todo el personal de CERELA, por haberme recibido tan bien y haberme hecho
parte de esa gran familia. Por su disposición, amabilidad y paciencia.
A la Dra. Marta Medici y José Luis Alvarado por su paciencia y dedicación en el
cuidado y preparación de los animales de experimentación.
A Vicky Martos, por su asesoramiento, ayuda, predisposición y paciencia.
A la Bioq. María Azul Zorzoli, del citómetro de CERELA, por su colaboración,
asesoramiento y disposición.
A la Dra. Eleonora Rossi, del laboratorio de hemostasia del Banco de Sangre,
por su colaboración y asesoramiento.
 Al personal de la Cátedra de Nutrición de la Facultad de Bioquímica, Química y
Farmacia de la UNT, por su asesoramiento y ayuda en materia nutricional y con los
animales para la obtención del plasma de rata.
A la Dra. Ana María Caetano de Faria y todos los chicos del Laboratorio de
Inmunología del Instituto de Ciências Biológicas de la Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, Brasil, por haberme recibido con tanto cariño y hospitalidad,
haciendo de mi estadía una experiencia inolvidable.
A María Hortensia del Rosario Zelaya, mi amor, por su incondicional apoyo y
amor. Por su confianza, sus consejos, por ser mi compañera de vida y principal pilar de
mi persona. Por ser la luz y el motorcito que día a día me impulsa y da fuerzas para
seguir adelante y querer superarme y ser cada vez mejor persona y científico. Por estar
“al pie del cañón” cada día de mi vida desde que la conocí, en los buenos pero sobre
todo en los malos momentos. Por enseñarme que siendo honestos y leales se pueden
conseguir grandes cosas, lo cual me ha hecho crecer invaluablemente.
A mis padres, Alberto Laiño y Alicia Noemí Soria, por el amor y apoyo
incondicional que siempre me han dado. Por haberme brindado un hermoso hogar, la
mejor educación y crianza que he podido recibir. Por haberme incentivado siempre en
todos los aspectos de la vida y en cada una de las metas que me he propuesto. Por
haberme enseñado que lo más importante en la vida es la familia y aquellos valores que
se necesita para ser una persona completa y honesta. Por estar a mi lado siempre, en los
buenos y malos momentos. Por haber hecho de mí la persona que soy. Por ser las
personas más importantes en mi vida, por las que siento un profundo orgullo y enorme
agradecimiento y amor.
A mi hermano Christian Leonel Laiño, por ser además de mi hermano mi mejor
amigo, por su paciencia y compresión. Por su cariño y consejos, y por estar siempre a
mi lado. Que junto a mis padres, constituyen la principal razón de ser quien soy tanto
como persona como profesional.
A Dios por iluminar mi vida día a día, por sus bendiciones diarias, por darme
fuerzas en los momentos difíciles, y por darme la esperanza y la gracia para ser quien
soy.
Ín
Índicce
Índice

ÍNDICE
RESUMEN
Resumen ..............................................................................................................................................2
Resumen de divulgación ....................................................................................................................4
INTRODUCCIÓN
Folatos..................................................................................................................................................6
Biodisponibilidad y absorción de los folatos ...................................................................................9
Deficiencia de folatos y su relación con la salud ...........................................................................13
Defectos del tubo neural (DTN) ....................................................................................................14
Anemia megaloblástica .................................................................................................................14
Cáncer ............................................................................................................................................14
Fortificación de alimentos ...............................................................................................................16
Bacterias productoras de folatos y productos fermentados bio-enriquecidos ...........................19
Productos fermentados ..................................................................................................................23
OBJETIVOS
Objetivos generales...........................................................................................................................28
Objetivos específicos.........................................................................................................................28
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos y condiciones de almacenamiento ...................................................................30
Condiciones de cultivo .....................................................................................................................32
Medios de cultivo ..............................................................................................................................32
Caldo MRS ....................................................................................................................................32
Caldo MRS-SLC ............................................................................................................................32
Caldo LAPTg .................................................................................................................................32
Caldo LAPTg-SL ...........................................................................................................................32
Folic Acid Casei Medium (FACM)................................................................................................32
Medio químicamente definido (MQD)...........................................................................................33
Medio químicamente definido libre de ácido fólico (MQD-SF) ....................................................33
Medio químicamente definido libre de ácido fólico (MQD-SF) para L. bulgaricus ......................33
LBS agar.........................................................................................................................................33
M17 agar ........................................................................................................................................34
McConkey agar ..............................................................................................................................34
Cerebro Corazón Infusión (BHI) agar ............................................................................................34
Caldo LSM estandarizado ..............................................................................................................34
Estudios fisiológicos, bioquímicos y moleculares ...........................................................................34
Determinación del crecimiento celular ...........................................................................................34
Método turbidimétrico....................................................................................................................34
Índice

Medida de la viabilidad celular ......................................................................................................35

Determinación del pH ......................................................................................................................35
Determinación de folatos .................................................................................................................35
Preparación del inóculo de la cepa de referencia ...........................................................................35
Preparación de las muestras ...........................................................................................................35
Medida de la concentración de folatos ...........................................................................................36
Estudio de la capacidad de BAL para producir folatos ................................................................37
Selección de cepas..........................................................................................................................37
Identificación de los microorganismos seleccionados mediante taxonomía clásica y molecular ..37
Taxonomía clásica ......................................................................................................................37
Taxonomía molecular.................................................................................................................37
Relación entre capacidad de BAL para producir folatos y su crecimiento ....................................38
Optimización de la producción de folatos ......................................................................................38
Efecto del precursor pABA ............................................................................................................38
Influencia de la fuente de carbono .................................................................................................38
Influencia del pH y temperatura de incubación..............................................................................38
Caracterización de las poblaciones celulares por citometría de flujo.........................................39
Caracterización genética de la biosíntesis de folatos en las cepas seleccionadas ........................39
Extracción de ADN cromosómico de las cepas seleccionadas ......................................................39
Diseño de cebadores específicos ...................................................................................................40
Amplificación por PCR ..................................................................................................................41
Estudio de la expresión génica de la biosíntesis de folatos Real Time PCR ..................................41
Extracción de ARN total de las cepas seleccionadas .................................................................41
Evaluación de la expresión génica mediante qRT-PCR .............................................................42
Cálculo de la expresión relativa de los genes fol........................................................................42
Estudios tecnológicos y funcionales ................................................................................................48
Compatibilidad entre cepas .............................................................................................................48
Tolerancia de las bacterias al tracto gastrointestinal (TGI) ........................................................48
Sensibilidad de los microorganismos a sales biliares ....................................................................49
Resistencia a diferentes concentraciones de sales biliares .............................................................49
Sensibilidad de los microorganismos a antibióticos ......................................................................49
Preparación del inóculo y soluciones de antibióticos .....................................................................49
Procedimiento ................................................................................................................................50
Diseño de un producto lácteo fermentado bio-enriquecido en folatos usando las cepas
seleccionadas .....................................................................................................................................50
Preparación de los fermentos .........................................................................................................50
Capacidad acidificante ...................................................................................................................51
Índice

Acidez titulable ..........................................................................................................................51

Determinación de pH .................................................................................................................51
Determinación de la sinéresis .........................................................................................................51
Elaboración de la leche fermentada bio-enriquecida en folatos...................................................51
Evaluación de la funcionalidad de la leche fermentada bio-enriquecida en folatos en un
modelo animal de experimentación deficiente en folatos .............................................................52
Modelo Animal ..............................................................................................................................52
Animales de experimentación ....................................................................................................52
Puesta a punto protocolo de deficiencia .....................................................................................52
Protocolo de deficiencia seleccionado .......................................................................................53
Protocolos de repleción ..............................................................................................................53
Protocolos de prevención de deficiencia ....................................................................................54
Obtención de muestras y su procesamiento ...................................................................................56
Muestras de sangre periférica .....................................................................................................56
Muestras de sangre periférica para hemograma .....................................................................56
Muestras de sangre entera y plasma .......................................................................................56
Muestras de órganos (hígado, bazo y riñón) para dosaje de folatos ...........................................56
Procesamiento de sangre entera y plasma para la determinación de folatos ..............................56
Procesamiento de órganos para la determinación de folatos ......................................................57
Procesamiento de órganos para la evaluación de translocación bacteriana................................57
Peso corporal .................................................................................................................................57
Peso de órganos ..............................................................................................................................57
Determinación de la concentración de folatos en sangre entera, plasma y órganos .......................58
Dosaje de homocisteína en plasma.................................................................................................58
Análisis estadístico ............................................................................................................................58
RESULTADOS
Estudios fisiológicos, bioquímicos y moleculares ...........................................................................62
Selección de cepas de bacterias lácticas nativas capaces de producir folatos .............................62
Resultados ......................................................................................................................................62
Capacidad de BAL para producir folatos ...................................................................................62
Cinética de producción de folatos y crecimiento bacteriano ......................................................66
Discusión ........................................................................................................................................70
Conclusiones parciales ...................................................................................................................72
Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folatos en medio químicamente definido ........74
Resultados ......................................................................................................................................74
Efecto del pABA sobre la capacidad de S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415
para producir folatos.......................................................................................................................74
Índice

Efecto del pABA sobre la capacidad de L. bulgaricus CRL871 para producir folatos ..............77
Discusión ........................................................................................................................................80
Conclusiones parciales ...................................................................................................................82
Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos en medio químicamente definido ...83
Resultados ......................................................................................................................................83
Efecto de la fuente de carbono en la capacidad de S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus
CRL415 para producir folatos ........................................................................................................83
Efecto de la fuente de carbono en la capacidad de L. bulgaricus CRL871 para producir folatos
........................................................................................................................................................88
Discusión ........................................................................................................................................90
Conclusiones parciales ...................................................................................................................92
Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos en fermentadores ..............93
Resultados ......................................................................................................................................93
Efecto del pH y temperatura de incubación en la capacidad de S. thermophilus CRL803 y S.
macedonicus CRL415 para producir folatos ..................................................................................93
Determinación de la viabilidad en S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415
mediante citometría de flujo .........................................................................................................100
Influencia de las condiciones de cultivo (pH del medio y temperatura de incubación) sobre la
síntesis de folatos y crecimiento por L. bulgaricus CRL871 .......................................................104
Discusión ......................................................................................................................................107
Conclusiones parciales .................................................................................................................110
Identificación de los genes implicados en la biosíntesis de folatos y evaluación de su expresión
..........................................................................................................................................................112
Diseño de los cebadores específicos de los genes involucrados en la síntesis de folatos ............112
Resultados ................................................................................................................................112
Estudio de expresión de los genes implicados en la síntesis de folatos mediante qRT-PCR ......117
Resultados ................................................................................................................................117
Expresión génica en S. thermophilus CRL803 ....................................................................117
Expresión génica en S. macedonicus CRL415 ....................................................................119
Discusión ..................................................................................................................................122
Conclusiones parciales .............................................................................................................125

Estudios tecnológicos y funcionales ..............................................................................................128

Diseño de un producto fermentado bio-enriquecido en folatos ..................................................128
Diseño de un producto fermentado naturalmente bio-enriquecido en folatos ..............................128
Resultados ................................................................................................................................129
Evaluación de la síntesis de folatos en leche por cultivos simples......................................129
Índice

Evaluación de la síntesis de folatos en leche por cultivos polivalentes...............................130

Diseño de una leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en folatos .........................134
Síntesis de folatos y crecimiento en leches fermentadas ................................................134
Concentración de folatos y crecimiento en las leches fermentadas durante su
almacenamiento (Vida de estante) ...............................................................................................136
Etiquetado nutricional de la leche fermentada bio-enriquecida ..........................................139
Discusión ..................................................................................................................................140
Evaluación de la tolerancia al tracto gastrointestinal y a sales biliares en las cepas seleccionadas
......................................................................................................................................................145
Resultados ................................................................................................................................145
Tolerancia al tracto gastrointestinal ....................................................................................145
Tolerancia a sales biliares ...................................................................................................147
Evaluación de la sensibilidad a antibióticos ........................................................................149
Discusión ..................................................................................................................................150
Conclusiones Parciales .................................................................................................................152
Valoración de la biodisponibilidad de los folatos producidos por las bacterias lácticas
seleccionadas mediante ensayos in vivo ........................................................................................154
Desarrollo de un modelo de deficiencia de folatos ......................................................................154
Resultados ................................................................................................................................155
Peso corporal y consumo de alimento .................................................................................155
Peso de órganos y relación peso de órganos/peso corporal (PO/PC) .................................156
Translocación bacteriana a órganos ....................................................................................158
Hemograma .........................................................................................................................158
Dosaje de folatos en plasma y sangre entera .......................................................................162
Discusión ..................................................................................................................................164
Evaluación de la leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en folatos en el modelo de
deficiencia de folatos....................................................................................................................166
Resultados ................................................................................................................................167
Peso corporal y consumo de alimento .................................................................................167
Peso de órganos y relación PO/PC ......................................................................................168
Hemograma .........................................................................................................................171
Dosaje de folatos en plasma y sangre entera .......................................................................172
Dosaje de folatos en Hígado, Bazo y Riñón ........................................................................173
Dosaje de Homocisteína en plasma .....................................................................................174
Discusión ..................................................................................................................................176
Efecto de la leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en folatos en la prevención de la
deficiencia de folatos....................................................................................................................178
Índice

Resultados ................................................................................................................................179
Peso corporal y consumo de alimento .................................................................................179
Peso de órganos y relación PO/PC ......................................................................................180
Hemograma .........................................................................................................................181
Dosaje de folatos en plasma y sangre entera .......................................................................183
Dosaje de folatos en Hígado, Bazo y Riñón ........................................................................184
Dosaje de Homocisteína en plasma .....................................................................................185
Discusión ..................................................................................................................................186
Conclusiones parciales .................................................................................................................187
CONCLUSIONES GENERALES ....................................................................................................189
PROYECCIONES ..............................................................................................................................191
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................193
LISTA DE ABREVIATURAS ..........................................................................................................208
Reesum
men
Resumen

Resumen

El tetrahidrofolato (THF) y sus derivados (agrupados bajo el nombre de folatos,

vitamina perteneciente al grupo B) son considerados los principales transportadores de
unidades de un carbono (C1). Participan, como cofactores esenciales de enzimas metabólicas
involucradas en la síntesis, metilación y reparación del ácido desoxirribonucleico (ADN) y
síntesis del ácido ribonucleico (ARN), indispensables para la correcta división y duplicación
celular. Su deficiencia conduce a la etiología de enfermedades como defectos del tubo neural,
cardiovasculares, las relacionadas con la salud reproductiva y embarazo y anemia
megaloblástica, entre otras. Los humanos deben incorporarlos de la dieta aunque están en baja
concentración. A los efectos de reforzar los niveles de esta vitamina en los alimentos, se
implementaron normas para su incorporación usando ácido fólico. Esta forma sintética
(obtenida por síntesis química), a diferencia de los folatos naturales, ingerida en elevadas
cantidades puede enmascarar la deficiencia de B12 y alterar la actividad de enzimas hepáticas.
El uso de microorganismos, como bacterias lácticas (BAL), que sintetizan folatos constituye
una alternativa viable y segura. El objetivo de este trabajo de tesis fue profundizar los
conocimientos fisiológicos y moleculares de las BAL en relación a su capacidad de sintetizar
folatos a fin de determinar su contribución al diseño de productos bio-enriquecidos en folatos.
La evaluación de la capacidad de ciento cuarenta y seis cepas de BAL para producir folatos en
un medio químicamente definido libre de folatos posibilitó identificar sesenta con esta
propiedad funcional, que fue variable y cepa dependiente. Los estudios fisiológicos y
bioquímicos de la producción de folatos demostraron que Streptococcus (S.) thermophilus
CRL803, S. macedonicus CRL415 y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CRL871 (L.
bulgaricus) sintetizaron elevados niveles de folatos en medio de cultivo y en leche. El
agregado del precursor pABA, la fuente de carbono y las condiciones de cultivo afectaron la
producción de la vitamina. Se evaluó, por primera vez, la expresión génica de la síntesis de
folatos en S. thermophilus y S. macedonicus empleando Real Time PCR. Se determinó
aumento significativo de la expresión de genes involucrados en la síntesis de novo de folatos
así como los responsables de la elongación de la cadena poliglutámica y de la reducción de
los folatos, que fue coincidente con la máxima síntesis de la vitamina mientras que, en fase
estacionaria, se evidenció disminución de los niveles de expresión de los genes responsables
de la síntesis de novo. La combinación de las cepas seleccionadas (relación coco:bacilo 2:1),
usada como cultivo iniciador, permitió obtener una leche fermentada naturalmente

2
Resumen

enriquecida en folatos que aporta el 10% IDR (ingesta diaria recomendada). El producto,
evaluado en modelos animales, fue capaz de revertir la deficiencia de folatos en ratones,
restituyendo los niveles de folatos en plasma y órganos, y normalizando la homocisteína
plasmática; así como prevenir el desarrollo de la deficiencia de folatos, evidenciado por los
valores normales de homocisteína y de folatos en plasma y sangre entera. Este trabajo de tesis
muestra nuevas perspectivas de aplicación de BAL con capacidad de producir folatos para el
desarrollo de alimentos bio-enriquecidos con funcionalidad comprobada.

3
Resumen de divulgación

Resumen de divulgación

En este trabajo de tesis doctoral se evaluó la capacidad de ciento cuarenta y seis cepas
de bacterias lácticas para sintetizar folatos en un medio libre de folato y en una matriz láctea.
Se seleccionaron las cepas Streptococcus (S.) thermophilus CRL803 y S. macedonicus
CRL415 y Lactobacillus (L.) delbrueckii subsp. bulgaricus CRL871. Esta especie,
previamente fue considerada consumidora de folatos. En esta tesis se demostró, por primera
vez, la existencia de cepas de L. bulgaricus capaces de sintetizar folatos. Se determinaron las
condiciones óptimas de fermentación a fin lograr buen crecimiento microbiano y elevados
niveles de folatos. Posteriormente, a partir de las cepas seleccionadas se formuló un cultivo
iniciador que, inoculado en leche, permitió obtener una leche fermentada con elevadas
concentraciones de folatos, que significó un aporte del 10% a la ingesta diaria recomendada
para adultos. Este producto, con características reológicas y organolépticas adecuadas y con
elevados niveles de folatos, fue estable durante su almacenamiento a 4–6ºC durante 28 días.
La eficiencia de la leche fermentada bio-enriquecida en vitamina se evaluó en distintos
modelos animales, demostrándose que el producto fue capaz de revertir parcialmente la
deficiencia de folatos, con un efecto comparable a la repleción con ácido fólico (2 mg/kg).
Además, fue suficiente para evitar el desarrollo de la deficiencia de folatos cuando se
administró a los animales en forma conjunta con la dieta libre de folatos, desde el primer día
de alimentación.
Este trabajo de tesis muestra nuevas perspectivas de aplicación de BAL con capacidad
de producir folatos para el desarrollo de alimentos bio-enriquecidos con funcionalidad
comprobada. Esta estrategia es económica, segura y efectiva a la suplementación de los
alimentos con ácido fólico, evitando los efectos adversos asociados al consumo de elevadas
dosis de ácido fólico en personas sanas.

4
Introoduccción
n
Introducción Folatos

Folatos

Las vitaminas son micronutrientes esenciales para el metabolismo de los seres vivos,
junto con otros elementos nutricionales actúan directa e indirectamente como catalizadoras de
todos los procesos fisiológicos vitales para las células.
Actualmente, se reconocen 13 vitaminas esenciales para la salud humana y se clasifican
de acuerdo a su solubilidad en: i) liposolubles (A, D, E y K) e ii) hidrosolubles (vitamina C y
el grupo B). Las vitaminas del grupo B (o complejo B) incluyen: tiamina (B1), riboflavina (B2),
niacina (B3), piridoxina (B6), ácido pantoténico (B5), biotina (B7, H), folatos (B9) y cobalamina
(B12). Cada vitamina del grupo B es químicamente diferente y actúa sinérgicamente con otras
vitaminas para mantener la homeostasis corporal debido a sus funciones que son determinantes
en procesos metabólicos como la producción de energía y maduración de eritrocitos, entre otras
funciones.
El tetrahidrofolato (THF) y sus derivados (generalmente agrupados bajo el nombre de
folatos) son cofactores esenciales de enzimas metabólicas involucradas en reacciones de
transferencia de un carbono (C1). Además, poseen propiedades antioxidantes ya que protegen
al genoma por inhibición de radicales libres que atacan al ADN (Duthie et al., 2002). Los folatos
poseen numerosos nombres: vitamina B9, vitamina B11, vitamina M, y folacina, entre otros. El
folato es una molécula tripartita porque está formada por tres dominios que derivan de: i) un
anillo de pteridina, proveniente de la guanosina-5’-trifosfato (GTP), ii) una parte central,
proveniente del ácido p-aminobenzoico (pABA) formado a partir de la vía del corismato, y iii)
una cadena de glutamato cuya longitud varía según el número de unidades glutámicas (1-12)
(Basset et al., 2005) (Figura I1).
En los folatos el anillo de pteridina puede presentar distintos niveles de reducción. Los
folatos que presentan los anillos de pteridina completamente reducidos son denominados
“tetrahidrofolatos” y aquellos que están parcialmente reducidos son llamados “dihidrofolatos”
(DHF).
Las unidades de C1 transportadas por esta vitamina constituyen los sustituyentes
localizados en la posición N-5 y N-10 del anillo de pteridina, los cuales pueden ser el grupo
metilo (-CH3), grupo formilo (-HCO), grupo formimino (-CHNH), grupo metenilo (-CH=) y el
grupo metileno (-CH2-) (Figura I1).
La mayoría de los folatos naturales son pteroilpoliglutamatos, es decir que contienen 2
a 7 glutamatos unidos por enlaces amida (peptídico) al grupo γ-carboxilo del glutamato. Los

6
Introducción Folatos

principales folatos intracelulares son pteroilpentaglutamatos, mientras que los extracelulares

son pteroilmonoglutamatos (Andreassi Ii et al., 2002; McGuire et al., 1984). Aunque los folatos
son sintetizados por plantas y la mayoría de los microorganismos (Basset et al., 2005; Green et
al., 1996; Hanson et al., 2002; Hanson et al., 2001), el ácido fólico (AF) no se encuentra en la
naturaleza (Figura I1). Su existencia depende de la síntesis comercial y se usa en suplementos
y en alimentos enriquecidos (Quinlivan et al., 2006). El AF difiere de los folatos naturales en
diversos aspectos como ausencia de sustituciones en los dominios de pteridina y de pABA; y
puede causar efectos adversos, lo que pone en duda su empleo en los programas de fortificación
(Baggott et al., 2012; Bailey et al., 2009; Smith et al., 2008).
En este trabajo de tesis se utilizará el término folatos a los derivados del THF, como
folilglutamatos presentes en los alimentos, y el término ácido fólico a la forma sintética de
folato.

Figura I1. Estructuras químicas de: A) ácido fólico, B) representación en 3D del ácido fólico mediante
el modelo de varillas y esferas y C) folatos naturales y sus sustituyentes.

7
Introducción Folatos

Esta vitamina es fundamental en dos de los principales ciclos de metabolización dentro

de la célula, participando en la síntesis del ADN y suplementando a grupos metilos en las
reacciones de metilación. En estos ciclos, el folato o AF es sometido a una serie de cambios
metabólicos, en los que la forma tetrahidrofolato, actúa como aceptor y dador de unidades de
C1 (Figura I2). Estas reacciones son comúnmente conocidas como el ciclo de un carbono
dependiente de folato (Lucock, 2000; Smulders et al., 2005).
El primero de estos ciclos está asociado con la producción de purinas y timidinas que
son esenciales para la síntesis del ADN. En este ciclo el folato actúa como dador de una unidad
de C1. Durante periodos de rápida división y crecimiento celular tales como la infancia y el
embarazo, el folato o AF es crítico para el mantenimiento normal de la división celular.
El segundo ciclo se relaciona con el metabolismo de la homocisteína y la metionina.
Homocisteína es un producto intermedio del metabolismo de la metionina y ésta se metaboliza
por dos vías: la remetilación, regenerado metionina, y la transulfuración, que convierte la
homocisteína en cisteína. La vía de la metilación se compone a su vez de dos vías bioquímicas
de intersección, una en la que participa 5-metil-THF y vitamina B12 y otra en la que participa
la betaína. La metionina puede ser a su vez utilizada para la síntesis de S-adenosilmetionina
(SAM), que es el principal dador de grupos metilos, esenciales para procesos metabólicos
como: metilación del ADN, de proteínas, neurotransmisores y fosfolípidos. (Blakley et al.,
1984; Hanson et al., 2001; Quinlivan et al., 2006).

Figura I2. Ciclos de un carbono dependientes de folato. CBS: cistationina β sintetasa; DHF
dihidrofolato; DNMT: ADN metiltransferasa; MS: metionina sintetasa; MTHFR:
metilentetrahidrofolato reductasa; SAH: S-adenosilhomocisteína; SAM: S-adenosilmetionina; SHMT:
serina hidroximetiltransferasa; THF: tetrahidrofolato; TS: timidilato sintetasa.

8
Introducción Biodisponibilidad y absorción de folatos

Los folatos naturales presentes en los alimentos se encuentran en formas poliglutámicas,

con una cadena corta γ-unida de residuos de glutamato que se adicionan al primer glutamato,
las cuales deben ser hidrolizadas hasta monoglutámicas en el intestino, por acción de la enzima
γ-glutamil hidrolasa o conjugasa, previo a su absorción (Ball, 1998; Gregory, 1997) para luego
volver a ser convertidas en la forma poliglutámica (Appling, 1991) dentro de las células. Los
folatos naturales, en diferentes grados son muy inestables al clivaje oxidativo entre los dominios
pteridina y pABA, proceso causado por la luz (Scott et al., 2000).
Los seres vivos son incapaces de sintetizar de novo los folatos por lo que éstos deben
ser ingeridos de una fuente exógena, como i) alimentos de origen animal y vegetal: extractos
de levadura, hígado, riñón, vegetales de hoja verde, cítricos y frutas (como frutillas, melones)
(Ohio State University, 2005) que fueron descritos como las principales fuentes de folato y ii)
los provenientes de microorganismos comensales del intestino grueso que poseen la capacidad
de sintetizar folatos los cuales son absorbidos por el huésped (Said et al., 2000). Los productos
lácteos (yogur, queso), aceites, mermeladas y dulces contienen folatos en reducida
concentración (Ohio State University, 2005).
Aunque determinados alimentos contienen elevadas cantidades de folatos, esta vitamina
es termolábil y sensible a la luz (oxidación) (Bailey, 2009; Lewis et al., 1979; Maruyama et al.,
1978). De esta manera, una parte considerable de folatos se destruye (hasta un 80% de su
contenido) (Winkels et al., 2007) durante el procesamiento de los alimentos, o por el
tratamiento de cocción, factores que pueden afectar la biodisponibilidad de la vitamina
(McNulty et al., 2004).

Biodisponibilidad y absorción de los folatos

La biodisponibilidad de los folatos se define como la fracción de folatos ingeridos que

son absorbidos en el intestino delgado y que pueden ser usados por los procesos metabólicos o
almacenados en el cuerpo (Melse-Boonstra, 2003).
Existen estudios que demuestran que la biodisponibilidad de los folatos procedentes de
una dieta mixta y variada es de alrededor de 50% mientras que la biodisponibilidad de formas
monoglutámicas varía entre 70 y 120% en relación a la del AF (100%).
La biodisponibilidad de los folatos puede sufrir variaciones por diversos factores como:
i) forma química de los folatos: la biodisponibilidad de las formas reducidas de folatos
pueden diferir de la forma oxidada (AF). La eficacia de la oxidación y reducción de los folatos

9
Introducción Biodisponibilidad y absorción de folatos

con o sin varias unidades de C1 se ha evaluado en varios estudios de intervención con personas.
Así se determinó aumento de folatos en suero después de la ingestión de folatos reducidos
comparados con la ingesta de AF (Perry et al., 1970). Por el contrario, otros investigadores
(Bhandari et al., 1992; Tamura et al., 1973), no encontraron diferencias en la eficacia entre el
AF y las formas reducidas de folatos;
ii) tamaño de los folatos: los pteroilpoliglutamatos constituyen la forma predominante de
folatos presente en los alimentos, y tienen que sufrir una hidrólisis hasta monoglutamatos para
ser absorbidos en el intestino delgado. La conjugasa presente en el yeyuno, es la responsable
de la remoción de glutamato de los pteroilpoliglutamato (Reisenauer et al., 1987).
iii) unión molecular: el tamaño de las cadenas interfiere con los transportadores de folatos
impidiendo su correcta absorción. Por ello la cadena de poliglutamato de los folatos naturales
(McNulty et al., 2004) debe ser removida por la enzima conjugasa humana que está presente
en el borde en cepillo del intestino delgado con una actividad óptima a bajo pH. Esta enzima
está en cantidad suficiente y no constituye un factor limitante en la absorción de folato
(Reisenauer et al., 1987). Una vez que los folatos son deconjugados a su forma monoglutámica,
son absorbidos por el enterocito a través del transportador de folatos acoplado a protón PCFT
(Proton Coupled Folate Transporter) (Zhao et al., 2011; Zhao et al., 2009). Este transportador
es responsable de la absorción de los folatos a nivel intestinal debido a su elevada actividad a
pH bajo y alta afinidad por el AF y folatos (Qiu et al., 2006; Qiu et al., 2007). Los individuos
que no son capaces de absorber folatos, tienen una mutación en el transportador. Esta situación
lleva a una severa deficiencia de folatos con macrocitosis, alteraciones del sistema nervioso
central, neuropatías periféricas, entre otras (Diop-Bove et al., 1993). Datos bibliográficos
sugirieron que la forma poliglutámica es 20-40% menos biodisponible que la forma
monoglutámica (Gregory, 1995). Estos resultados fueron confirmados, posteriormente,
mediante ensayos clínicos (Melse-Boonstra et al., 2004). Contrariamente, en un modelo animal
con ratas alimentadas con distintos tipos de folatos, se determinó que la forma poliglutámica
(conteniendo en promedio 8 residuos glutámicos) tuvo mayor biodisponibilidad que la
monoglutámica (Sybesma et al., 2003a). Esto podría deberse a que la enzima glutámico
carboxipeptidasa II de rata, responsable de la conversión de folatos poliglutámicos a
monoglutámicos, no limita la absorción de aquellos con colas glutámicas más largas. Además,
la enzima podría tener mayor afinidad por los folatos poliglutámicos largos;
iv) matriz alimentaria: la complejidad de la matriz en el alimento o en general de la dieta
afecta a la biodisponibilidad. En el caso de dietas ricas en frutas y verduras, la biodisponibilidad
varía desde 60 a 98% dependiendo de los parámetros medidos (Riddell et al., 2000). En leche,

10
Introducción Biodisponibilidad y absorción de folatos

las proteínas se unen a los folatos, lo que incrementaría la eficiencia de su absorción

protegiéndolo de la captación por bacterias intestinales, aumentando la absorción de la vitamina
en el intestino delgado (Eitenmiller et al., 1999).
v) efectos modificadores: la actividad de la pteroilglutamato hidrolasa es dependiente del pH
(pH óptimo 6.5-7.0) y puede ser inhibida por tomate y zumo de naranja y también por citrato
(Bhandari et al., 1990). Otros modificadores sería la fibra dietética que parece reducir la
biodisponibilidad de los folatos, así como el alcohol que inhibe la absorción de los folatos en el
intestino (Halsted, 1995). Otras interacciones incluyen efectos de los alimentos en el pH
intestinal con una potencial modificación de la actividad deconjugasa, presencia de
antagonistas, cambios intestinales influenciados por factores dietarios, quelación, y factores que
influyen en la tasa de vaciamiento gástrico.
vi) estatus de nutrientes en el organismo: la deficiencia de folatos puede alterar la
distribución de folatos entre los tejidos corporales, pero todavía no se ha aclarado si esto afecta
a la eficacia de folatos (Varela-Moreiras et al., 1992). Un déficit de vitamina B12 afecta la
conversión de folato en el organismo, ya que esta vitamina es necesaria para la correcta
actividad de la metionina-sintetasa, que transfiere el grupo metilo de la forma 5-metilTHF hasta
la homocisteína para formar metionina. La metilcobalamina sirve como cofactor de la
metionina sintetasa, enzima responsable de la remetilación de la homocisteína a metionina. En
la misma reacción el 5-metilTHF es demetilado para dar THF (Savage et al., 1995). En la
deficiencia de cobalamina, el 5-metilTHF no puede convertirse en THF.
A pesar de los numerosos estudios sobre la biodisponibilidad de folatos, el conocimiento
de esta etapa del metabolismo del folato fue parcialmente descripta (Gregory, 1997; LeBlanc
et al., 2010a; McNulty et al., 2004; Selhub et al., 1996; Zhao et al., 2011).

En el enterocito, el transporte de los folatos se lleva a cabo a través de la membrana

basolateral de la célula, hacia la circulación portal mediante la proteína asociada a resistencia
multidroga 3 o MRP3 (Multidrug Resistance associated Protein-3), con consumo de ATP
(Figura I3). Posteriormente, estos folatos absorbidos son transportados por la vena porta hacia
los sinusoides hepáticos donde ingresan por la membrana basolateral al hepatocito por acción
del PCFT (Zhao et al., 2011). Dentro del hepatocito, los folatos son metilados, como es el caso
del THF o del AF (Wright et al., 2003) y transportados hacia la sangre uniéndose a la α2-
globulina alcanzando los diferentes tejidos, donde son internalizados por sus correspondientes
transportadores y/o receptores de folatos como el PCFT, RFC (Transportador de Folatos
Reducidos), MRP3, entre otros. Dentro de las células, los folatos son acumulados mediante la

11
Introducción Biodisponibilidad y absorción de folatos

acción de la enzima folilpoliglutamato sintetasa, convirtiéndose en folatos poliglutamilados

(Appling, 1991), sustratos preferidos de las enzimas fólico-dependientes (Cossins, 2000; Scott
et al., 2000) (Figura I4). Por el contrario, los transportadores de folatos (descriptos en animales)
generalmente prefieren los monoglutamatos (Scott et al., 2000) y pueden mediar la
internalización reversible de la vitamina (Suh et al., 2001). En esta situación, los folatos no
serían retenidos en el interior de la célula.

Figura I3. Representación esquemática de la absorción de los folatos a nivel intestinal, y su posterior
transporte a las células. A) en el intestino, los folatos poliglutamilados son convertidos en la forma
monoglutámica por acción de la conjugasa dependiente de Zn. Posteriormente son incorporados al
enterocito por el transportador PCFT. Dentro de la célula, son transportados a través de la membrana
basal a la circulación por acción de los transportadores MRP3 y/o MRP1/5 con consumo de ATP. B) A
través de la circulación llegan al hígado, donde el AF y el THF son metilados y el AF reducido para
luego ser trasportados en sangre hacia los tejidos. En los tejidos ingresan a la célula por diferentes
transportadores (PCFT, RFC) y receptores (Folbp1, FR) dependiendo del tipo de célula.
THF: tetrahidrofolatos; PCFT: transportador de folato acoplado a protones; RFC: transportador de
folatos reducido; MRP3 y MRP1/5: proteína asociada a resistencia de multidroga 3 y 1/5; FR: receptor
de folatos; Folbp1: proteína ligadora de folatos.

12
Introducción Deficiencia de folatos

Figura I4. Representación esquemática del metabolismo de folatos en eucariotas, posterior a la

absorción de los folatos y AF.
1: dihidrofolato reductasa (EC 1.5.1.3); 2: serina hidroximetiltransferasa (EC 2.1.2.1); 3: 5,10-
metilentetrahidrofolato deshidrogenasa (EC 1.5.1.5); 4: 5,10-meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa (EC
3.5.4.9); 5: 10-formiltetrahidrofolato sintetasa (EC 6.3.4.3); 6: 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa
(EC 1.5.1.20); 7: sistema de clivaje de glicina; 8: tetrahidrofolato 5-formimino transferasa (EC 2.1.2.5);
9: 5-formiminotetrahidrofolato ciclodesaminasa (EC 4.3.1.4); 10: timidilato sintetasa (EC 2.1.1.45); 11:
10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa (EC 1.5.1.6); 12: metionil-tARNformil transferasa (EC
2.1.2.9).

Deficiencia de folatos y su relación con la salud

A pesar que los folatos se encuentran ampliamente distribuidos en los alimentos, sus
deficiencias son muy comunes en el mundo.
Debido al importante rol que cumplen los folatos en el organismo (Figura I5), la baja
ingesta de ellos conduce a la etiología de varias enfermedades como cánceres (colon y mama,
entre otros) (Kim, 1999; Novakovic et al., 2006; Xu et al., 2009), enfermedades
cardiovasculares (Li et al., 2005), defectos del tubo neural (Basset et al., 2005; Scott et al.,
2000), las relacionadas con la salud reproductiva y embarazo (Goh et al., 2008; Scholl et al.,
2000; Tamura et al., 2006), alteraciones del sistema nervioso central y anemia megaloblástica,
entre otras.

13
Introducción Deficiencia de folatos

Defectos del tubo neural (DTN)

Son malformaciones congénitas del cerebro y la médula espinal causados por una falla
en el cierre del tubo neural entre los días 21 y 28 posteriores a la concepción. El rango de
defectos abarca desde la anencefalia a la espina bífida, la cual es más variable en efectos y
severidad (Blencowe et al., 2010).
Los DTN presentan una elevada tasa de morbilidad y mortalidad, con una incidencia
estimada >300.000 nuevos casos por año (Jegatheesan et al., 2006) lo que resulta en
aproximadamente 41.000 muertes, constituyendo la tercer condición congénita de mayor
incidencia después de las enfermedades cardíacas congénitas y el Síndrome de Down (WHO,
2008).

Anemia megaloblástica
Esta patología ocurre por una falla en la síntesis del ADN como consecuencia de una
insuficiente cantidad de folato plasmático. Esta falta de síntesis de ADN lleva a una menor
producción de hemoglobina y alteración de la maduración celular durante la eritropoyesis con
glóbulos rojos de gran tamaño (megalocitos), disminución de la concentración de hemoglobina,
incremento en el volumen corpuscular medio (VCM) y en la concentración de hemoglobina
corpuscular media (CHCM), hipersegmentación de los neutrófilos, entre otras alteraciones
hematológicas. También se produce disminución de la concentración de folatos en plasma y
glóbulos rojos, junto con aumento de los niveles plasmáticos de homocisteína y disminución
de la S-adenosilmetionina (SAM) (Mattson et al., 2003).
La anemia megaloblástica no sólo es causada por la deficiencia de folato sino también
por la falta de la vitamina B12, siendo ambas manifestaciones clínicas similares. El diagnóstico
diferencial entre ambas anemias se realiza mediante la determinación de los niveles de vitamina
B12 en suero y de folatos en plasma y glóbulos rojos (Herbert et al., 1960; Wickramasinghe,
2006).
De esta manera, los efectos causados por la deficiencia de folatos se relacionan con su
función en la síntesis de ácidos nucleicos.

Cáncer
El cáncer es una enfermedad multifactorial sobre un sustrato genético. Muchos son los
estudios epidemiológicos realizados sobre este tema; en relación con el folato, siendo definida
más claramente en el cáncer colorrectal y su situación precancerosa el adenoma colorrectal
(Bailey et al., 2003; Kim, 2004a; 2007). Es por ello que una ingesta elevada de folato dietario

14
Introducción Deficiencia de folatos

y altos niveles de folatos en sangre generalmente se asocian con disminución del riesgo de
ciertas malignidades debido a que los folatos participan en el mantenimiento de la estabilidad
del ADN a través de la donación de grupos C1. Varios estudios in vitro demostraron que la
deficiencia de folatos causada por disminución de la re-metilación de S-adenosilhomocisteína
(SAH) a SAM en el ciclo de la metionina, lleva a la demetilación de la citosina, hipometilación
global del ADN, activación de proto-oncogenes e inestabilidad cromosómica.
También la falta de grupos C1 disminuye la síntesis de timidilato (dTMP)
incrementando la relación dUMP/dTMP lo que lleva a incorporar elevadas cantidades de uracilo
al ADN (Melnyk et al., 1999), lesiones en el ADN provocando alteraciones en el cromosoma
induciendo transformaciones malignas. También, puede estar afectado el mecanismo de
reparación del ADN por inhibición de la biosíntesis de timidilato y de las purinas (Duthie,
2010). El rol protector del folato contra la carcinogénesis es todavía cuestionado (Kim, 2004b).
La evidencia disponible no avala, en su totalidad, la hipótesis que una incompleta metilación
del ADN, como consecuencia directa de un bajo nivel de folato, incrementa el riesgo de cáncer
de colon en humanos. Si bien, in vitro, se mostró que la deficiencia de folato i) genera
inestabilidad genómica por inducción de daño del ADN, ii) inhibe la reparación del mismo y
iii) incrementa las transformaciones malignas; en humanos y roedores, no existe evidencia que
demuestre una asociación causal entre esos biomarcadores de estabilidad genómica y el riesgo
de cáncer (Duthie, 2010).
Estudios epidemiológicos indicaron que existe una relación inversa entre la ingesta de
folatos y el riesgo de cáncer colorrectal. La evidencia experimental sugiere que la deficiencia
de folato promovería las etapas iniciales de la carcinogénesis, mientras que altas dosis de AF
podrían aumentar el crecimiento de células cancerosas.
Actualmente se propusieron algunas explicaciones para comprender el rol del AF en el
riesgo de desarrollar cáncer: i) posible presencia de lesiones pre-neoplásicas no identificadas
con potencialidad para desarrollar cáncer en esas poblaciones de riesgo; ii) efecto adverso del
AF sintético a diferencia de los folatos naturales y iii) deficiencia para metabolizar elevadas
dosis de suplementos vitamínicos, entre otras causas (Carroll et al., 2010).

Otro evento que también estaría relacionado en desarrollo de muchos tipos de cánceres
humanos es una sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico, el receptor
de transferrina y el receptor de folato (FR). Particularmente, el receptor de folato ha sido
ampliamente utilizado como ligando, por su elevada afinidad a agentes terapéuticos dirigidos a
células cancerosas. (Zhang et al., 2010). Estos antecedentes demuestran que es muy importante

15
Introducción Fortificación de alimentos

establecer la relación riesgo-beneficio del folato y AF y sus dosis sobre la promoción del cáncer
y efecto quimiopreventivo.

Figura I5. Representación esquemática de los efectos causados por la deficiencia de folatos.
1: 10-formiltetrahidrofolato sintetasa (EC 6.3.4.3); 2: 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa (EC
1.5.1.6); 3: 5,10-meteniltetrahidrofolato sintetasa (EC 6.3.3.2); 4: serina hidroximetiltransferasa (EC
2.1.2.1); 5: 5,10-metilentetrahidrofolato deshidrogenasa (EC 1.5.1.5); 6: metionina sintetasa (EC
2.1.1.13). THF: tetrahidrofolato; SAH: S-adenosilhomocisteína; SAM: S-adenosilmetionina.

Fortificación de alimentos

La elevada incidencia de que presenta la deficiencia de folatos a nivel mundial y la

gravedad de sus patologías asociadas, principalmente los DTN hizo necesaria la ingesta de
suplementos de AF para asegurar el aporte periconcepcional. Además, las autoridades
gubernamentales de numerosos países implementaron políticas de suplementación de harinas y
otros alimentos con AF.
Canadá y Estados Unidos establecieron programas obligatorios de fortificación de
harinas desde 1998. En nuestro país, en el año 2002, se sancionó la ley Nº 25.630 que dispone
de normas para la prevención de las anemias y las malformaciones del tubo neural. Para ello la
ley en su artículo 3º establece: “La harina de trigo destinada al consumo que se comercializa en
el mercado nacional, será adicionada con hierro, ácido fólico, tiamina, riboflavina y niacina en
las proporciones que a continuación se indican en mg/kg: hierro como sulfato ferroso (Fe
elemental) 30, ácido fólico 2,2; tiamina (B1) como mononitrato de tiamina 6,3; riboflavina (B2)
1,3 y niacina como nicotinamida 13,0” (ANMAT, 2002).

16
Introducción Fortificación de alimentos

La efectividad de la fortificación depende de los hábitos alimentarios, así por ejemplo

la fortificación de la harina podría ser inefectiva en algunos países del sur de Asia y África
donde muchas familias, especialmente de bajos recursos económicos, se encuentran en mayor
riesgo debido a la falta regular de la ingesta de productos de harina fortificada (Blencowe et al.,
2010).

Sin embargo, algunos países no han adoptado un programa nacional de fortificación con
AF a causa de los potenciales efectos adversos del mismo, como el enmascaramiento de la
deficiencia de vitamina B12 lo que demora su diagnóstico. En general, la suplementación con
AF asegura la ingesta diaria recomendada (IDR) en aquellos individuos que ingieren bajos
niveles de folatos dietarios y así prevenir los DTN y/o bajar los niveles plasmáticos de
homocisteína. Por otra parte, aquellos individuos con ingestas normales o elevadas estarían
expuestos a una excesiva ingesta de AF, aumentando los niveles de AF no metabolizado en
plasma, el cual sería el responsable del enmascaramiento de las manifestaciones hematológicas
características de la deficiencia de vitamina B12. En consecuencia, el diagnóstico de la
deficiencia se realizaría a través del deterioro neurológico asociado al déficit de B12 La vitamina
B12 actúa como cofactor en la metilación de la homocisteína a metionina, reacción en la que el
5-metiltetrahidrofolato (5-metilTHF) se convierte en THF. Herbert et al. (1962) postularon una
hipótesis para explicar el mecanismo mediante el cual el AF enmascara la deficiencia de
vitamina B12, la cual fue posteriormente demostrada por numerosos autores (Abe et al., 1975;
Cooper et al., 1976; DeGrazia et al., 1972; Ellegaard et al., 1973; Hoffbrand et al., 1993; Kass,
1976; Krebs et al., 1976; Lavoie et al., 1974; Sauer et al., 1977; Taylor et al., 1974; Tisman et
al., 1973). Esta hipótesis denominada “Trampa de los folatos” postula que, la deficiencia de
vitamina B12 produce un bloqueo en el metabolismo de los folatos mediante la retención del
folato como 5-metilTHF privando a las células de THF y de todas las demás formas de folatos
derivadas del THF (Herbert et al., 1962). En la deficiencia de vitamina B12, la actividad de la
enzima metionina sintetasa es muy baja o ausente. En consecuencia, el 5-metilTHF generado
no puede ser usado para la conversión de homocisteína en metionina con la consecuente
acumulación de homocisteína y disminución de las concentraciones de SAM. Las bajos niveles
de SAM estimulan la actividad de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR)
incrementando la reducción de 5,10-metilenTHF a 5-metilTHF en una reacción que es
irreversible (Kutzbach et al., 1967). De esta manera, las diferentes formas de folatos se emplean
para obtener 5-metilTHF necesarios para las reacciones de metilación, disminuyendo las

17
Introducción Fortificación de alimentos

concentraciones intracelulares de folatos poliglutámicos y generando así una “deficiencia de

folatos” intracelular.
Además del enmascaramiento de la deficiencia de B12, se demostró que elevadas
ingestas de AF producen alteraciones en la función de la enzima dihidrofolato reductasa
hepática (responsable de la reducción del 7,8-DHF a THF). Sin embargo, la enzima participa
en la conversión del AF en 7,8-DHF y consecuente formación de THF. Se reportó que el AF,
en elevadas concentraciones, puede saturar la enzima, una parte del exceso de AF se acumularía
en el organismo como AF no metabolizado (Bailey et al., 2009) y el resto sería excretado por
orina (Cooperman et al., 1970). El hígado humano contiene aprox. 0,75 µmol (331 µg) de
folatos. La enzima DHFR puede reducir el ácido fólico a THF en un rango entre 0,016 y 0,75
µmol AF/min a Vmáx. Así, 400 µg de AF [dosis diaria recomendada por la Organización
Mundial de la Salud (OMS)] serían convertidos a THF en aproximadamente 1 h, mientras que
dosis superiores (5 mg de AF) requerirían más tiempo (12 h) (Bailey et al., 2009). En estos
estudios, la enzima se encontró en condiciones de Vmáx. A diferencia de lo observado in vitro,
en el organismo, como consecuencia de los procesos fisiológicos en hígado, la transformación
de AF a THF necesitaría más tiempo. Otros estudios demostraron que luego de la
administración oral de 10 µg/kg, el AF no metabolizado fue detectado hasta 3 h después de su
ingesta (Perry et al., 1970). Teniendo en cuenta estos antecedentes, la fortificación de alimentos
listos para consumir así como de harinas, entre otros, llevan a la ingesta de AF en cantidades
superiores al límite máximo tolerable (1 mg), y en consecuencia a una acumulación de AF no
metabolizado en el organismo, causando diferentes efectos adversos (Bailey et al., 2009).
Otras consideraciones del exceso del consumo de AF, indicadas por la Administración
de Drogas y Alimentos (FDA) de Estados Unidos, incluyen los potenciales riesgos para las
mujeres embarazadas, y personas con tratamiento con fármacos anti-epilépticos y anti-folato.
Los folatos naturales (tales como el THF producido por las bacterias), a diferencia del
AF, no enmascaran la anemia producida por déficit de vitamina B12. Numerosas especies de
bacterias, incluyendo algunas presentes en el intestino grueso, son capaces de sintetizar folatos.
Los resultados indican que los niveles de folatos sintetizados en el intestino humano podrían
ser significativos. Existen evidencias in vivo que los folatos sintetizados por bacterias fueron
absorbidos a través del intestino grueso intacto e incorporados a los tejidos (Rong et al., 1991).
El AF absorbido, es transportado al hígado donde parte es reducido y otra porción es
metilada. (Wright et al., 2003). Contrariamente, los folatos bacterianos se reducen y la mayoría
son metilados antes de la absorción (Asrar et al., 2005).

18
Introducción Fortificación de alimentos

En el caso de la suplementación, se han estudiado muchas otras alternativas al AF, entre

ellas la administración de (6S)5-metilTHF el cual fue más efectivo en incrementar la
concentración de folato en eritrocitos de mujeres en edad reproductiva, (Lamers et al., 2006),
sin embargo la obtención química del (6S)5-metilTHF es mucho más costosa que la del AF.
Otras de las metas de la suplementación con AF es disminuir los niveles de homocisteína
plasmática que, combinado con piridoxina y cianocobalamina, contribuiría a reducir el riesgo
de enfermedades cardiovasculares.

Bacterias productoras de folatos y productos fermentados bio-enriquecidos

El uso de microorganismos que sintetizan folatos constituye una alternativa viable y

segura respecto al empleo del AF. En bacterias, la biosíntesis de folato proviene de la
conversión de GTP en 7 pasos constitutivos al cofactor biológicamente activo THF (Figura I6).
Dos reacciones de condensación ocurren en la vía de biosíntesis de THF. La primera es la
condensación de pABA con 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7,8-dihidropteridina para
producir dihidropteroato. La segunda es la reacción del glutamato con el dihidropteroato para
formar DHF (Green et al., 1996). El pABA por sí mismo se sintetiza a partir de la vía de la
pentosa fosfato; en esta vía, D-erytrosa-4-fosfato se condensa con fosfoenolpiruvato y formar
corismato. El corismato constituye un puente entre la síntesis de los aminoácidos aromáticos
(triptófano, fenilalanina, tirosina) y pABA (McConkey et al., 2004). En Escherichia coli, el
corismato se convierte, por los componentes I y II de la corismato sintetasa (PabB y PabA, EC
6.3.5.8), en 4-amino-4-deoxicorismato. Posteriormente, el piruvato es clivado por acción de la
4-amino-4-deoxicorismato liasa (PabC EC 4.1.3.38), para formar pABA (Green et al., 1991;
Parsons et al., 2002), cuya presencia es fundamental para que se forme el THF (Wegkamp et
al., 2007).

19
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

Figura I6. Representación esquemática de la biosíntesis de folatos por bacterias lácticas.

1: GTP ciclohidrolasa I (EC 3.5.4.16); 2: fosfatasa (EC 3.6.1.-); 3: fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1); 4:
Dihidroneopterina aldolasa (EC 4.1.2.25); 5: dihidropteridinhidroximetil pirofosfoquinasa (EC 2.7.6.3);
6: aminodeoxicorismato sintetasa (EC 2.6.1.85); 7: aminodeoxicorismato liasa (EC 4.1.3.38); 8:
dihidropteroato sintetasa (EC 2.5.1.15); 9: dihidrofolato sintetasa (EC 6.3.2.12); 10: dihidrofolato
reductasa (EC 1.5.1.3); 11: γ-glutamil hidrolasa (EC 3.4.19.9).

En lo que respecta a la producción de folatos por bacterias lácticas (BAL) (Figura I6),
se identificaron los genes para la biosíntesis de folato en Lactococcus (Lc.) lactis, Lactobacillus
(L.) plantarum, y L delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus) Estos resultados y el
desarrollo de diversas técnicas de ingeniería metabólica permitió comprender la compleja vía
metabólica de síntesis de folatos y de ese modo utilizar las BAL como agentes productores de
folatos. Así se determinó que la vía biosintética en este grupo de microorganismo incluye 7
pasos constitutivos, para convertir el precursor GTP en THF. Sin embargo, en el genoma de
determinadas BAL, como L. gasseri, L. salivarius, L. acidophilus y L. johnsonii, que no
sintetizan folatos, faltan algunos genes involucrados en la biosíntesis de folato.
Lc. lactis fue más extensamente estudiado desde el punto de vista genético debido a que
se dilucidó su genoma (Bolotin et al., 2001). En las últimas décadas, se desarrollaron numerosas
herramientas genéticas, para esta bacteria usada como modelo, que posteriormente fueron
aplicadas en otras especies bacterianas. Las mismas, aplicadas en estrategias de ingeniería
metabólica, permitieron la inactivación de genes y/o la sobreexpresión de genes nuevos o
existentes. La mayoría de las estrategias de ingeniería metabólica aplicadas a BAL se relacionan

20
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

con el metabolismo primario como re-direccionamiento del piruvato a productos finales como
diacetilo y alanina en elevadas concentraciones. La ingeniería metabólica aplicada en la síntesis
de folato es sumamente compleja. Esta biosíntesis incluye partes de glicólisis, vías de las
pentosas fosfato, y la vía del shikimato para la producción del pABA, constituyente central para
la síntesis de folatos, mientras que se requiere la síntesis de purinas para la producción del GTP
y numerosos pasos enzimáticos necesarios para el ensamblado final del folato y la síntesis de
derivados del folato (Sybesma et al., 2003b).
En los microorganismos, predominan los folatos poliglutámicos debido a que numerosas
enzimas tienen mayor afinidad por dichas formas que sus correspondientes monoglutámicas
(McGuire et al., 1984). La folilpoliglutamil sintetasa (EC 6.3.2.17), codificada por el gen folC,
es responsable de la síntesis de folatos poliglutámicos y la correspondiente elongación de la
cadena. Hasta el momento, todos los microorganismos cuyos genomas fueron secuenciados,
tienen un homólogo de folC. No obstante, en las diferentes especies, la longitud de la cadena
de folatos poligutámicos varía entre 1 y 10 residuos de glutamato. Se asume que los folatos
poliglutámicos quedan retenidos en el interior de las células. Esta presunción se basa en que la
longitud de las cadenas poliglutámicas de los folatos extracelulares son más cortas que las
encontradas intracelularmente.
Las formas poliglutamadas de folatos varían con las especies de BAL, así en Lc. lactis
más del 90% del total de folato producido permaneció en la célula y fue identificado como 5,10-
metenilTHF y presumiblemente 10-formilTHF, ambos con 4, 5 o 6 residuos de glutamato
(Sybesma, et al., 2003c). Por su parte, en S. thermophilus la mayor parte del folato producido
se liberó al medio extracelular y fue identificado como 5-formilTHF y 5,10-metenilTHF, ambos
con 3 residuos de glutamato. Esta diferencia en la distribución podría ser explicada
probablemente por la diferente longitud de las colas poliglutámicas de los 2 microorganismos.
Una de las principales funciones de la cola de poliglutamatos es la retención del folato dentro
de la célula. Se asume que la retención celular de los folatos es principalmente resultado de las
cargas negativas de los grupos carboxilos (poliglutamato) del folato (pKa 4,6). Más aún, en
Streptococcus (S.) thermophilus, la distribución intra y extracelular del folato estuvo
influenciada por el pH. Las células que crecieron a bajo pH tuvieron una mayor fracción de
folato extracelular que las células que fueron cultivadas a un pH alto (Sybesma, et al., 2003c).
Consecuentemente, a un pH intracelular bajo, una mayor proporción de moléculas de folato se
protona y neutraliza eléctricamente, mejorando el transporte a través de la membrana. En Lc.
lactis no se observó influencia en la distribución intra y extracelular del folato (Sybesma, et al.,
2003c).

21
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

Uno de los sistemas que se utilizó para inducir la sobreexpresión de los genes
involucrados en la síntesis de folato en Lc. lactis es el sistema de expresión controlado por
nisina (NICE). Mediante este sistema se pudo determinar la influencia de ciertos genes sobre la
producción de folato. Así la sobreexpresión de la forma controlada del gen folKE incrementó
(10 veces) la producción de folato extracelular y (3 veces) la producción de folato total;
mientras que la sobreexpresión del gen folA disminuyó (2 veces) la producción de folato total
(Sybesma, et al., 2003b). Otros resultados obtenidos, a través de este sistema, fue la
sobreexpresión combinada de folKE y folC que favoreció la acumulación intracelular de folato.
Por su parte, la sobreexpresión de la primera enzima de la vía biosintética (GTP ciclohidrolasa
I) tuvo gran potencial como estrategia para incrementar el flujo a través de la vía y así la
producción de la vitamina.
Si bien este sistema inducible es muy útil para estudios metabólicos, en fermentaciones
se prefiere el uso de promotores constitutivos. Así, el clonado de los genes folKE bajo el control
del promotor constitutivo pepN incrementó la producción de folatos de manera similar que la
obtenida mediante el sistema NICE, aunque los niveles de producción de enzima fueron
menores (Sybesma, et al., 2003b).
También se asume que el incremento de folatos extracelulares de cadena corta, como el
folato monoglutámico, resulta de la sobreexpresión de folKE (Sybesma, et al., 2003b).
La actividad de la conjugasa microbiana (folC) puede ser inhibida por constituyentes de
la dieta. Los folatos poliglutámicos intracelulares no estarían disponibles para la absorción a
nivel gastrointestinal del consumidor si los mismos no son liberados mediante lisis celular. El
uso de bacterias productoras de folato permite el desarrollo de productos fermentados con
niveles incrementados de folato, los cuales contribuirían a incrementar el aporte de folato
dietario (Sybesma, et al., 2003b).
Otros estudios de sobreexpresión fueron realizados combinando el promotor inducible
por nisina y uno constitutivo para incrementar la concentración de pABA, sin aumento de la
cantidad de folatos (Hugenholtz et al., 2002b), con cambios en la distribución de la vitamina en
ambos lados de la membrana citoplasmática (folato acumulado vs secretado) (Wegkamp et al.,
2007). Es decir que, la sobreproducción de pABA resultó en una disminución del pool
intracelular de folato y aumento de folatos secretados. Esto podría deberse a que elevadas
cantidades de pABA inhibirían la actividad de la enzima (folC).
Posteriormente, en relación a los resultados previos, se obtuvo una cepa que
sobreexpresó simultáneamente los clusters génicos de folato y pABA, la cual fue capaz de

22
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

incrementar los niveles de folatos, independientemente de la suplementación con pABA

(Wegkamp et al., 2007).
Estos estudios demostraron que existe una relación muy estrecha entre la biosíntesis de
folato y pABA, sugiriendo que: i) la deleción de los genes de pABA en Lc. lactis produjo
pérdida de la capacidad para producir folatos e incapacidad de crecer en ausencia de
nucleobases/nucleósidos de purinas; ii) el folato no es esencial para la biosíntesis de
pirimidinas; iii) la sobreexpresión combinada de los genes de folato y pABA es necesaria para
obtener una cepa productora de elevadas concentraciones de folato.
Las investigaciones también fueron realizadas en BAL incapaces de producir folato. Un
ejemplo fue la conversión de L. gasseri ATCC 33323, consumidor de folatos, en productor de
la vitamina. Esta cepa sólo posee los genes folA y folC involucrados en la regeneración y
retención de los folatos captados del ambiente. La transformación de L. gasseri se realizó
mediante la transferencia de un plásmido conteniendo el cluster completo de folato (folA, folB,
folKE, folP, ylgG y folC bajo el control del sistema NICE) proveniente de Lc. lactis MG1363
(Wegkamp et al., 2004).

Productos fermentados
Se estableció que la IDR de folato es 400 μg en adultos, 200 µg en niños, y 600 µg en
mujeres embarazadas y lactantes (FAO/WHO, 2002).
La leche tradicionalmente no se considera una buena fuente de folatos (20–50 µg/L)
comparada a otros productos (Achon et al., 2011). Estudios in vitro, usando un modelo
gastrointestinal dinámico, demostraron que el AF y el 5-metilTHF en leche fortificada
presentaron una mayor disponibilidad de absorción (60–70%) (Verwei et al., 2003).
La fermentación mediante microorganismos productores de folatos constituiría una
alternativa a la fortificación con AF.
En la actualidad, los consumidores advierten que la cantidad de algunos nutrientes está
por debajo de las ingestas recomendadas. Además, en determinadas franjas etarias hay riesgo
de deficiencia de vitamina, especialmente los mayores debido a que su ingesta de alimentos es
insuficiente y, en jóvenes, quienes consumen una variedad restringida de alimentos
(Papastoyiannidis et al., 2006). Las leches fermentadas constituyen una matriz potencial para
la fortificación con folatos porque las proteínas de la leche fijadoras de folatos mejoran la
estabilidad y biodisponibilidad de 5-metilTHF y AF (Aryana, 2003; Jones et al., 2002; Verwei
et al., 2003).

23
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

Los microorganismos productores de folatos pueden ser utilizados en otros alimentos.

Así, las levaduras en la fermentación de masa de centeno para la elaboración de pan aumentaron
los niveles de folatos (Kariluoto et al., 2006). Las BAL usadas como iniciadores en la
fermentación de harina de maíz incrementaron (3 veces) las concentraciones de folatos después
de 4 días de fermentación a 30ºC. Otro ejemplo es el “idli”, una masa fermentada al vapor o
mezcla de arroz y garbanzo negro elaborada con Leuconostoc (Leuc.) mesenteroides donde el
contenido de folato aumentó 60% (Jägerstad et al., 2004).
También, se informó que fermentos lácticos fueron capaces de producir cantidades
significativas de 5-metilTHF (2 veces) durante la fermentación de vegetales (Jägerstad et al.,
2004).

Las BAL son un grupo de microorganismos que se utilizan como cultivos iniciadores
en la elaboración de alimentos fermentados. Además de sus importantes capacidades
fermentativas, las BAL aumentan la seguridad, vida útil, valor nutricional, sabor, y sobre todo
la calidad de los productos fermentados. Por sus propiedades benéficas, algunas BAL se las
utiliza como microorganismos probióticos. De acuerdo a la definición actualmente adoptada
por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la
OMS, los probióticos son “microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades
adecuadas confieren un beneficio a la salud del huésped”. Estos microorganismos deben ser
capaces de sobrevivir a través del tracto gastrointestinal (GI), adherirse a las células intestinales
humanas, ser antagonista hacia microorganismos patógenos y ejercer efectos benéficos en la
salud del huésped, entre otros (Collins et al., 1998). Las potenciales bacterias probióticas
deberían ser capaces de sobrevivir a los bajos valores de pH del estómago y tolerar las sales
biliares en el duodeno. La supervivencia al tránsito intestinal y la colonización transitoria son
algunas de las principales pre-condiciones para que los microorganismos desarrollen algún
efecto benéfico posterior a su consumo (Collins et al., 1998).
Ciertas cepas de S. thermophilus fueron propuestas como potenciales probióticos debido
a que, no solo produjeron elevadas concentraciones de folatos extracelulares, sino que
mejoraron la microbiota intestinal y la digestión de la lactosa en individuos intolerantes,
estimularon el sistema inmune intestinal, disminuyendo el riesgo de ciertos cánceres, úlceras e
inflamación. Además, se determinaron otras propiedades como deconjugación de sales biliares,
hidrofobicidad, actividad β-galactosidasa, y resistencia a barreras biológicas (jugos gástricos y
sales biliares) (Iyer et al., 2009a).

24
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

Los nutracéuticos y los alimentos funcionales también contribuyen a la salud del

consumidor. Si bien la FDA no reconoce el término nutracéutico, que fue concebido por
DeFelipe en 1989, se define como un “suplemento dietario que entrega una forma concentrada
de un componente biológicamente activo del alimento en una matriz no alimentaria para
mejorar la salud”. Por su parte, los alimentos funcionales no son suplementos dietarios, pero
preferiblemente son consumidos como parte de una dieta normal y entregan uno o más
ingredientes bioactivos (poseen efectos fisiológicos y que pueden mejorar la salud) dentro de
la matriz del alimento (Halsted, 2003).
Algunas cepas de BAL tienen la capacidad de producir, liberar, y/o incrementar
compuestos benéficos específicos en los alimentos. Estos ingredientes pueden ser
macronutrientes (ácidos grasos insaturados presentes en algunos aceites), micronutrientes
(vitaminas), o compuestos no nutrientes (enzimas hidrolíticas y flavonoides) que están
naturalmente presentes en los alimentos (ácidos grasos omega 3 en pescado o vitamina C en
frutas cítricas) o adicionados (leches fortificadas con calcio y vitamina D, y cereales fortificados
con AF).
Recientemente, la comunidad científica ha centrado su interés en la producción de
vitaminas por BAL. Si bien la mayoría de estas bacterias son auxótrofas para varias vitaminas,
ciertas cepas tienen la capacidad de sintetizar cantidades significativas de vitaminas del grupo
B, las cuales pueden ser usadas para combatir la deficiencia de folatos (Gangadharan et al.,
2010).
Numerosos estudios han demostrado que Lc. lactis y S. thermophilus tienen la capacidad
de sintetizar folatos. Ello explica porque algunos productos fermentados, incluidos el yogur,
contienen mayores concentraciones de folatos que la leche no fermentada. Sin embargo,
diversos estudios indican que esta propiedad de producir o utilizar folatos depende de la cepa
utilizada. La mayoría de los lactobacilos son incapaces de sintetizar esta vitamina esencial, a
excepción de L. plantarum y L. acidophilus que sintetizaron folatos cuando crecieron en un
medio químicamente definido libre de folato (Sybesma, et al., 2003c). Otras BAL como Leuc.
lactis, Bifidobacterium (B.) longum fueron capaces de formar folatos. También se observó que
algunas cepas de Propionibacterium (P.), productoras de vitamina B12, pueden producir
grandes cantidades de folatos (Holasova et al., 2004).
Otras investigaciones demostraron que algunos microorganismos probióticos
(bifidobacterias) y propionibacterias fueron capaces de sintetizar folatos (Holasova et al., 2004;
Hugenholtz et al., 2002a; Pompei et al., 2007).

25
Introducción Síntesis de folatos por bacterias lácticas

Con respecto a los alimentos fermentados, la concentración de folato depende de las

cepas utilizadas. En yogur, el nivel de vitamina está determinado principalmente por S.
thermophilus debido a que L. delbrueckii subsp. bulgaricus consume folato durante su
crecimiento en leche (Kneifel et al., 1991; Rao et al., 1984). Por lo tanto, es importante
seleccionar la combinación adecuada de cepas a fin de incrementar la concentración de folatos
en el producto.
Se describieron combinaciones de S. thermophilus/B. animalis/Enterococcus (E.)
faecium y S. thermophilus y B. animalis que aumentaron los niveles de folato en leche
(Crittenden et al., 2003). Estos autores informaron que cepas de S. thermophilus y B. longum
sintetizaron principalmente 5-MTHF incrementando su contenido a las 12 h de fermentación
seguido de una disminución. Por el contrario, P. freundenreichii subsp. shermanii no modificó
los niveles de 5-MTHF durante la fermentación.
Entre los cultivos iniciadores utilizados en leches fermentadas, S. thermophilus, es la
BAL con mayor potencial para el enriquecimiento natural de folatos (Holasova et al., 2004,
Sybesma, et al., 2003c).

26
Obbjetivvos
Objetivos

Objetivo general

Profundizar los conocimientos fisiológicos y moleculares de las bacterias lácticas

(BAL) en relación a su capacidad de sintetizar biomoléculas funcionales como folatos,
importantes para el diseño de alimentos bio-enriquecidos.

Objetivos específicos

1.- Seleccionar cepas de BAL nativas capaces de producir folatos;

2.- Evaluar la influencia de los parámetros de cultivo en la producción de folatos;

3.- Identificar los genes involucrados en la biosíntesis de folatos y evaluar su expresión;

4.- Diseñar un producto lácteo fermentado bio-enriquecido en vitamina;

5.- Valorar la eficacia del alimento enriquecido con folatos, producidos por las BAL
seleccionadas, mediante ensayos in vivo (modelos animales).

28
Mateerialles y méto
odoss
Materiales y métodos

1. Microorganismos y condiciones de almacenamiento

Las bacterias lácticas (BAL) utilizadas en este trabajo de Tesis (Tabla M1) fueron
obtenidas de la Colección de Cultivos del Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA,
San Miguel de Tucumán, Argentina). Los cultivos fueron conservados a –20ºC en leche
extracto de levadura estéril.
Se utilizaron 146 cepas de BAL pertenecientes a las siguientes especies: Lactobacillus
(L.) acidophilus (8 cepas), L. casei (4 cepas), L. fermentum (12 cepas), L. paracasei subsp.
paracasei (12 cepas), L. plantarum (18 cepas), L. delbrueckii subsp. bulgaricus (L.
bulgaricus) (41 cepas) y Streptococcus (S.) thermophilus (51 cepas).

Tabla M1. Cepas de diferentes especies Lactobacillus y Streptococcus

Cepa (Código Cepa (Código

Especie Especie
CRL) CRL)
L. acidophilus 43 L. paracasei subsp. paracasei 75
44 76
45 84
258 206
730 207
924 208
1014 678
1064 997
L. casei 431 1004
238 L. plantarum 41
239 51
1100 103
L. fermentum 141 140
220 219
251 363
345 428
573 651
574 681
646 691
661 725
722 759
944 769
955 778
973 785
L. paracasei subsp. paracasei 59 794
66 936
72 1081

30
Materiales y métodos

Tabla M1. Cepas de diferentes especies Lactobacillus y Streptococcus (continuación)

Especie Cepa (Código CRL) Especie Cepa (Código CRL)

L. delbrueckii subsp. bulgaricus 142 S. thermophilus 418
401 419
407 630
420 638
421 723
423 728
426 729
427 734
447 737
449 738
466 801
468 802
487 803
494 804
495 805
537 806
538 807
540 808
541 809
543 810
544 811
551 812
555 813
559 814
565 815
631 816
656 817
657 818
850 819
854 820
859 821
861 986
862 1184
863 1185
864 1186
865 1187
866 1188
868 1190
869 1191
871 1192
872 1193
Streptococus (S.) thermophilus 395 1764
396 1765
412 1766
414 1767
417 S. macedonicus 415

31
Materiales y métodos

2. Condiciones de cultivo
En todos los casos, los lactobacilos fueron activados en caldo MRS mientras que los
estreptococos en caldo LAPTg. Las cepas fueron crecidas dos veces en el mismo medio antes
de su inoculación (2% v/v) en el medio en estudio. La temperatura de incubación fue 37 y
42°C para las cepas de lactobacilos y estreptococos, respectivamente.

3. Medios de cultivo
Se utilizaron los siguientes medios de cultivo (en g/L).

3.1. Caldo MRS (De Man et al., 1960)

Peptona, 10; extracto de carne, 10; extracto de levadura, 5; glucosa, 20; Tween 80, 1,0;
fosfato dipotásico, 2; acetato de sodio, 5,0; citrato triamónico, 2; sulfato de magnesio
heptahidratado, 0,25; agua destilada c.s.p. 1L. El MRS agar se preparó agregando al medio
caldo 15 g/L de agar y el MRS agar blando se preparó agregando 6 g/L de agar. El pH final
del medio de cultivo fue 6,5–6,8.

3.2. Caldo MRS-SLC (MRS con menor concentración de vitaminas del grupo B)
Caldo MRS sin extracto de levadura y con menor concentración de extracto de carne
(2,5 g/L).

3.3. Caldo LAPTg (Raibaud et al., 1961)

Peptona de carne, 15; tripteína, 10; extracto de levadura, 10; glucosa, 10; Tween 80,
1,0; agua destilada c.s.p. 1L. El LAPTg agar se preparó agregando al medio caldo 15 g/L de
agar y el LAPTg agar blando se preparó agregando 6 g/L de agar. El pH final del medio de
cultivo fue 6,5–6,8.

3.4. Caldo LAPTg-SL (LAPTg con menor concentración de vitaminas del grupo B)
Caldo LAPTg sin extracto de levadura.

3.5. Folic Acid Casei Medium (FACM) (Jukes, 1955; Waters et al., 1961)
Digesto pancreático de caseína tratado con carbón, 10; dextrosa, 40; acetato de sodio,
40; Tween 80, 1; fosfato monopotásico, 1; fosfato dipotásico, 1; DL-triptófano, 0,2; L-
arginina, 0,6; L-cisteína (HCl), 0,5; adenina sulfato, 0,010; guanina (HCl), 0,010; uracilo,

32
Materiales y métodos

0,010; xantina, 0,020; polisorbato 80 0,010 glutatión (reducido), 0,005; sulfato de magnesio
(anhidro) 0,20; cloruro de sodio, 0,020; sulfato ferroso, 0,020; sulfato de manganeso, 0,015;
riboflavina, 0,001; ácido p-aminobenzoico (pABA), 0,002; piridoxina (HCl), 0,004; tiamina
(HCl), 0,004; pantotenato de calcio, 0,008; ácido nicotínico, 0,008; biotina,0,0002; agua
destilada c.s.p. 1L. El pH final del medio de cultivo fue 6,6–6,8. Cat Nº. 282210 (Difco,
Becton, Dickinson, and Co., Sparks, Maryland, USA)

3.6. Medio químicamente definido (MQD) (Hébert et al., 2004)

Acetato de sodio, 5; citrato de amonio, 1; sulfato de magnesio 0,2; sulfato de
manganeso, 0,038; fosfato monopotásico,3; fosfato dipotásico, 3; sulfato ferroso, 0,02; Tween
80, 1; glucosa, 20; arginina, 0,1; alanina,0,1; glicina, 0,1; histidina, 0,1; isoleucina, 0,1;
leucina, 0,1; valina, 0,1; treonina, 0,1; prolina, 0,1; serina, 0,1; lisina, 0,1; metionina,0,1;
aspartato,0,2; asparagina,0,2; fenilalanina,0,1; tirosina, 0,1; ácido glutámico, 0,2; glutamina,
,0,2; triptófano, 0,1; cisteína, 0,2; uracilo, 0,01; guanosina, 0,01; adenina, 0,01; xantina, 0,01;
ácido orótico, 0,005; biotina, 0,01; ácido p-aminobenzoico (pABA), 0,01; ácido pantoténico,
0,001; ácido nicotínico, 0,001;tiamina, 0,001; vitamina B12, 0,001; piridoxal, 0,002;
riboflavina, 0,001; ácido fólico, 0,001; agua bidestilada c.s.p. 1L. Todos los componentes
fueron esterilizados (121ºC, 15 min) o filtrados (membranas de 0,2 µm Sartorius AG,
Göttingen, Alemania) separadamente antes de ser utilizados. Los componentes fotolábiles
fueron conservados en oscuridad. El pH final del medio de cultivo fue 6,5–6,8

3.7. Medio químicamente definido libre de ácido fólico (MQD-SF) (MQD modificado sin
ácido fólico)
MQD libre de ácido fólico. El pH final del medio de cultivo fue 6,5–6,8.

3.8. Medio químicamente definido libre de ácido fólico (MQD-SF) para L. bulgaricus
MQD libre de ácido fólico con casaminoácidos, 10; aspartato, 0,6; asparagina, 0,6;
triptófano, 0,4; guanina, 0,01. Se empleó casaminácidos en lugar de los siguientes
aminoácidos: arginina, alanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, valina, treonina, prolina,
serina, lisina y metionina. El pH final del medio de cultivo fue 6,5–6,8.

3.9. LBS agar (Rogosa et al., 1951)

Digesto pancreático de caseína, 10; extracto de levadura, 5; glucosa, 20; Tween 80,
1,0; fosfato monopotásico, 6; citrato de amonio, 2; acetato de sodio, 25; sulfato de magnesio,

33
Materiales y métodos

0,575; sulfato de manganeso, 0,12; sulfato ferroso, 0,034; ácido acético, 1,3 mL; agar, 12;
agua destilada c.s.p. 1L. El pH final del medio de cultivo fue 5,3–5,7.

3.10. M17 agar (Terzaghi et al., 1975)

Tripteína, 25; digesto péptico de carne, 25; digesto papaínico de harina de soja, 5;
extracto de carne, 5; extracto de levadura, 25; lactosa, 5; β-glicerofosfato de sodio, 19; ácido
ascórbico, 0,5; sulfato de magnesio, 0,25; agar, 12; agua destilada c.s.p. 1L. El pH final del
medio de cultivo fue 6,7–7,1.

3.11. McConkey agar (MacConkey, 1905)

Digesto pancreático de gelatina, 17; digesto pancreático de caseína 1,5; digesto
péptico de tejido animal, 1,5; lactosa, 10; sales biliares, 1,5; cloruro de sodio, 5; rojo neutro,
0,03; cristal violeta, 0,001; agar, 12; agua destilada c.s.p. 1L. El pH final del medio de cultivo
fue 6,9–7,3.

3.12. Cerebro Corazón Infusión (BHI) agar (Nash et al., 1991)

Infusión de cerebro-corazón vacuno, 8; digesto péptico de tejido animal, 5; digesto
pancreático de caseína, 16; cloruro de sodio, 5; glucosa, 2; fosfato disódico, 2,5; agar 12; agua
destilada c.s.p. 1L. El pH final del medio de cultivo fue 7,2–7,6.

3.13. Caldo LSM estandarizado (Klare et al., 2007)

El caldo LSM estandarizado consiste en una mezcla de caldo iso-Sensitest (ITS) (90%
p/v; Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) y el caldo MRS (10% p/v). El pH final del medio fue
ajustado a pH 6,7.

ESTUDIOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES

4. Determinación del crecimiento celular

4.1. Método turbidimétrico
Las características de crecimiento de los cultivos se evaluaron midiendo la
absorbancia a 580 nm con un espectrofotómetro (Spectronic 20, Bausch y Lomb, NuevaYork,
EE.UU.). El inoculo se preparó a partir de cultivos activos en caldo MRS (lactobacilos) o

34
Materiales y métodos

LAPTg (estreptococos), incubados a 37ºC o 42ºC durante 16 h. Las células, cosechadas por
centrifugación a 5000 × g durante 15 min, fueron lavadas y resuspendidas en solución
fisiológica al volumen original.
Diluciones apropiadas de la suspensión celular se inocularon en los diferentes medios,
a una DO de 0,10.

4.2. Medida de la viabilidad celular

El número de células viables se determinó por el método de dilución en placa.
Diluciones apropiadas se sembraron en cajas de Petri conteniendo MRS agar o LAPTg agar y
se incubaron durante 48 h a la temperatura óptima de cada microorganismo. Los resultados se
expresaron como logaritmo de unidades formadoras de colonias por mL (log UFC/mL).

5. Determinación del pH
El cambio en el pH se midió con un pHmetro digital (Altronix TPX 1, Nueva York,
EE.UU.).

6. Determinación de folatos
La determinación de folatos se realizó usando el método microbiológico (Horne et al.,
1988) modificado usando L. casei subsp. rhamnosus NCIMB10463 como cepa de referencia
(O'Broin et al., 1992), la cual es naturalmente resistente a cloranfenicol (>500 µg/mL).

6.1. Preparación del inóculo de la cepa de referencia

La cepa, almacenada a -70ºC, fue activada en caldo MRS incubándose a 37ºC, 24 h.
Un mililitro del cultivo fue lavado 3 veces con solución salina estéril y resuspendido al
volumen original. Esta suspensión fue inoculada al 2% (v/v) en el caldo FACM e incubada a
37ºC, 24 h. Este paso se repitió otra vez (para disminuir el contenido de folatos en la cepa).
Para la determinación de folatos, se usó la cepa inoculada al 4% (v/v) en 10 mL de FACM 2x
conteniendo 20 µg/mL de cloranfenicol (disminución del riesgo de contaminación
microbiana).

6.2. Preparación de las muestras

Un alícuota de cultivo fue mezclada con el mismo volumen de buffer protector [buffer
fosfato 0,1M (pH 6,8), con la adición de ácido ascórbico 1,5 % (p/v) para evitar la oxidación

35
Materiales y métodos

de los folatos], y se centrifugó (5000 x g, 5 min). Se colectó el sobrenadante (muestra de

folato extracelular, FE) y el pellet se resuspendió al volumen original con buffer protector
(muestra de folato intracelular, FI).
Las muestras de FE y FI fueron calentadas a 100ºC, 5 min, centrifugadas (10000 x g, 6
min) y almacenadas a -80ºC hasta la determinación de folatos.

En el caso de las muestras de leche fermentada, una alícuota fue mezclada con el
mismo volumen de buffer protector y sometida a un tratamiento tri-enzimático descripto por
Iyer et al. (2009b). Brevemente, las enzimas [α-amilasa de Aspergilus oryzae (Cat. Nº 10065)
y proteasa de Streptomyces griseus (Cat. Nº P5147) obtenidas de Sigma Chemical, St. Louis,
MO, USA] fueron disueltas en agua destilada a una concentración de 4 mg/mL y esterilizadas
por filtración (0,22 mm). La enzima deconjugasa de folatos se obtuvo de plasma de ratas
(INSIBIO-CONICET-UNT) de acuerdo a lo descripto por Aiso et al. (1998). El contenido de
folatos endógenos en las enzimas fue medido por el método microbiológico, determinándose
que la proteasa no contiene la vitamina, a diferencia de lo encontrado en la deconjugasa y α-
amilasa (1,2 mg/L y 1,54 ng/mg de folatos, respectivamente).

Luego del tratamiento enzimático, la mezcla resultante (1 mL) fue calentada a 100ºC,
5 min y centrifugada a 10000 x g, 6 min. El sobrenadante fue recolectado y almacenado a –
80ºC hasta la determinación de folatos totales (FT). En todos los casos, muestras no
inoculadas, se usaron como controles y se analizaron simultáneamente.
Todas las muestras fueron procesadas en oscuridad.

6.3. Medida de la concentración de folatos

Las muestras, provenientes de medio de cultivo y de leche, fueron diluidas con buffer
protector (1/40 y 1/80). Luego, en cada pocillo de una microplaca estéril de 96 pocillos
(Deltalab, Argentina), se colocaron 100 µL de cada muestra diluida y 100 µL de la cepa de
referencia (ver apartado 6.1) (volumen final de reacción= 200 µL). Las placas se incubaron a
37ºC, 48 h sin agitación, midiéndose la densidad óptica (DO580) usando un lector de
microplaca VERSAmaxTM (Sunnyvale, CA, EEUU).
En cada microplaca, se realizó una curva estándar usando ácido fólico, grado HPLC
(Fluka Biochemica, Sigma-Aldrich, Switzerland) como estándar. La concentración de folatos
se expresó como microgramos por litro (µg/L), a partir del valor de folato obtenido de la

36
Materiales y métodos

curva estándar, corregido por el factor de dilución y sustracción de los valores de folato
endógeno correspondiente a cada enzima.

7. Estudio de la capacidad de BAL para producir folatos

7.1. Selección de cepas
Se evaluó la capacidad de producir folatos en 146 cepas de BAL, listadas en la Tabla
M1. Las cepas activadas en las condiciones previamente descriptas (ver apartado 2), fueron
lavadas 3 veces con solución salina 0,85% (p/v) y resuspendidas a su volumen original. Esta
suspensión se inoculó al 4% (v/v) en el caldo FACM y se incubó a 37ºC, 18 h sin agitación.
Luego del crecimiento, se repitió el procedimiento anterior, y la suspensión celular se inoculó
al 2% en caldo FACM. Los cultivos que desarrollaron bien (visualizado por incremento de la
DO) fueron lavados e inoculados al 2% en caldo fresco. Este procedimiento fue repetido 7
veces. Posteriormente, se tomaron 2 muestras (500 µL c/u) de cada cultivo para determinar la
concentración de folatos totales diferenciándose los retenidos y los liberados al medio
extracelular. Se procedió como se describió en el apartado 6.2. Se seleccionaron aquellas
cepas de BAL que produjeron elevadas concentraciones de folatos extracelulares.

7.2. Identificación de los microorganismos seleccionados mediante taxonomía clásica y

molecular
7.2.1. Taxonomía clásica
Las cepas fueron identificadas mediante el estudio de las propiedades bioquímicas que
incluyeron: coloración de Gram, reacción de oxidasa, reducción de nitrato, crecimiento a 15,
37 y 45ºC, producción de gas a partir de glucosa, hidrólisis de arginina y producción de
amonio. Se completó la identificación bioquímica evaluando el perfil de fermentación de
azúcares utilizando el kit comercial API50 CHL (bioMérieux, Marcy l’Etolie, France)
siguiendo las instrucciones del fabricante.

7.2.2. Taxonomía molecular

Se extrajo el ADN a partir de cada uno de los cultivos (apartado 9.1). Se emplearon los
siguientes cebadores (PLB16, 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; and MLB16, 5′-
GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3′) para amplificar la zona de la región variable (V1) del
gen del ARN ribosomal 16S, como fue descripto previamente (Hébert et al., 2000). Los
amplicones, obtenidos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), fueron secuenciados

37
Materiales y métodos

en CERELA. La búsqueda de homólogos se realizó in silico usando los algoritmos BLAST

del NCBI (National Center of Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

7.3. Relación entre capacidad de BAL para producir folatos y su crecimiento

Las bacterias seleccionadas (apartado 7.1.) fueron inoculadas individualmente en
FACM a una DO580 inicial de 0,1 e incubadas a 37ºC, 24 h. A intervalos, se tomaron alícuotas
(2 mL) para determinar crecimiento (apartado 4, 5) y concentración de folatos (apartado 6).

8. Optimización de la producción de folatos

Las fermentaciones se llevaron a cabo en frascos conteniendo 500 mL de medio
MQD-SF (glucosa 2 % y pABA 1,5 mM). El microorganismo se inoculó a una DO580 de 0,1
(4,8-5,7 x 105 UFC/mL).

8.1. Efecto del precursor pABA

La concentración de pABA del medio MQD-SF fue modificada entre 0 y 1,5 mM. El
microorganismo inoculado fue incubado a la temperatura óptima del microorganismo (37 o
42ºC para lactobacilos y estreptococos termófilos, respectivamente) durante 24 h. A
intervalos, se tomaron muestras (2 mL) para realizar las siguientes determinaciones:
crecimiento (apartados 4 y 5) y concentración de folatos (apartado 6).

8.2. Influencia de la fuente de carbono

Se evaluó el agregado individual de los siguientes azúcares: glucosa, lactosa y
sacarosa a distintas concentraciones (1-3%) manteniendo la concentración de pABA en un
valor de 1,5 mM. La especie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus no fermenta
sacarosa como única fuente de carbono. Por lo tanto, se analizó la acción de glucosa y lactosa
en la producción de folatos. Las condiciones de cultivo, toma de muestras y determinaciones
(crecimiento y folatos) fueron descriptas previamente (apartados 4, 5 y 6)

8.3. Influencia del pH y temperatura de incubación

Se trabajó en un fermentador New Brunswick BIOFLO C32, utilizándose 1,5 L de
medio MRS-SLC (L. bulgaricus) o LAPTg-SL (estreptococos). El microorganismo inoculado
fue incubado a 37 y 42ºC con agitación constante de 100 rpm. El pH del medio se ajustó y
mantuvo controlado a 5,0 y 6,0 con NaOH 3N según corresponda. Las fermentaciones se

38
Materiales y métodos

mantuvieron 24 h y se tomaron muestras periódicas para evaluar crecimiento del

microorganismo (apartados 4 y 5) y concentración de folatos (apartado 6).

8.3.1. Caracterización de las poblaciones celulares por citometría de flujo

Los estudios por medio de citometría de flujo tienen como finalidad caracterizar
poblaciones celulares que no pudieron ser determinadas por el método usado anteriormente
(apartado 4.2). Permite detectar y discriminar microorganismos cultivables, además de otros
que son viables pero no cultivables con la posibilidad de obtener células individuales de
características fisiológicas o morfológicas especiales.
En nuestros estudios, las diferencias en la integridad de la membrana celular
permitieron determinar la viabilidad celular. Para la preparación de las muestras se usó un kit
comercial (BD Cell Viability, Cat. Nº 349483, Difco, Becton, Dickinson, and Co., Sparks,
Maryland, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, que contiene una solución de
naranja de tiazol (NT) y una de ioduro de propidio (IP). El NT es un colorante permeable a las
células vivas y muertas en grados variables. La señal de fluorescencia del NT en las células
viables permite su recuento aun cuando detritus en la preparación celular podrían interferir en
el scatter gate alrededor de las células. El IP sólo se incorpora a las células muertas porque la
integridad de la membrana celular está comprometida. Por lo tanto, la combinación de los 2
colorantes provee un método rápido y confiable para la discriminación de células vivas y
muertas.
Brevemente, se estandarizó la cantidad de células (106 UFC/mL) en las muestras de
los cultivos, extraídas periódicamente. Se tomaron 100 µL de cada muestra y se adicionaron 1
µL de IP y 1 µL de NT. La mezcla resultante se agitó 30 s y la adquisición de las muestras
(200000 eventos) se realizó en un citómetro FACScan (Becton, Dickinson, and Co., Sparks,
Maryland, USA) equipado con un láser de excitación de ion argón (488 nm). Los datos fueron
analizados usando el software Flow Jo (Tree Star) (Zuniga et al., 2005) determinándose los %
de las poblaciones bien diferenciadas: i) células viables (sólo marcación con NT), ii) células
viables parcialmente dañadas (marcación con IP y NT) y iii) células muertas (sólo marcación
con IP).

9. Caracterización genética de la biosíntesis de folatos en las cepas seleccionadas

9.1. Extracción de ADN cromosómico de las cepas seleccionadas
Se realizó la extracción ADN total de las cepas L. bulgaricus CRL871, S.
thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 de acuerdo al protocolo descripto por
39
Materiales y métodos

Pospiech et al. (1995). Las células, provenientes de 10 mL de un cultivo en fase estacionaria

de crecimiento, se centrifugaron, se lavaron con buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 10
mM pH 8) y se resuspendieron en 1,7 mL de buffer SET (NaCl 75 mM, EDTA 25 mM, Tris-
HCl 20 mM pH 7,5) conteniendo 20 mg/mL de lisozima. Luego de mantener 4 h a 37°C, se
agregaron 100 µL de SDS 10% y 20 µL de proteinasa K (20 mg/mL) incubando a 55°C
durante 2 h. A continuación se adicionaron 335 µL (1/3 vol) de NaCl 5M y 2,6 mL (1 vol)
(1,3 mL) de la mezcla cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) dejando la mezcla a temperatura
ambiente por 30 min. Después de centrifugar a 10000 x g durante 10 min, se transfirió la capa
acuosa (fase superior) a otro tubo de centrífuga empleando una pipeta plástica. De esta etapa,
depende el grado de pureza con que se obtendrá el ADN (procurar no transferir detritos de la
interfase). Se recuperó el ADN mediante precipitación con 600 µL (0,6 vol) de alcohol
isopropílico a temperatura ambiente (o 2,5 vol de etanol absoluto en freezer), invirtiendo
suavemente hasta observar la formación del filamento de ADN. Se extrajo el ADN con una
varilla de vidrio o punta de plástico (también puede recuperarse por centrifugación). El
precipitado se lavó con etanol 70%, el ADN se secó y se resuspendió en un volumen
adecuado (50 a 500 µL) de buffer TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM). Se realizó
una electroforesis en gel de agarosa (0,8–1%) a 75-80 V para visualizar la calidad del ADN.

9.2. Diseño de cebadores específicos

Con el objeto de estudiar la expresión de los genes involucrados en la síntesis de
folatos o genes fol, se obtuvieron las secuencias de cada uno de ellos así como los genes de
referencia o housekeeping. En S. thermophilus CRL803, los genes fol evaluados fueron folE,
folQ, folK, folP, folC y folA, mientras que para S. macedonicus CRL415, los genes folE, folB,
folK, folP, folC y drfR. En ambas cepas, los genes de referencia fueron gyrB y recA.
Los cebadores utilizados para amplificar los genes fueron diseñados utilizando
distintos programas en línea [Primer3 (http://primer3.ut.ee), IDT Primer Quest
(https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index), Primer BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) e in silico PCR (http://insilico.ehu.es/PCR)],
de acuerdo a secuencias de nucleótidos de cada gen obtenidas de la Kyoto Encyclopedia of
Genes and Genomes (KEGG) (http://www.genome.jp/kegg) y del GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).
Se emplearon para S. thermophilus CRL803 las cepas de referencia S. thermophilus
LMD9, CNRZ1066 y LMG18311 y para S. macedonicus CRL415, la cepa S. macedonicus

40
Materiales y métodos

ACA-DC198. Los cebadores diseñados (Tabla M2 y M3) fueron sintetizados por Genbiotech
S.R.L (Genbiotech, Buenos Aires, Argentina).
Las secuencias de los genes fol y housekeeping, obtenidas de los cebadores
previamente diseñados, fueron usadas como molde para el diseño de cebadores específicos
(Tabla M4 y M5) utilizados en los ensayos de Real Time PCR (qRT-PCR). Para el diseño de
estos cebadores se consideraron los siguientes requisitos: i) tamaño del cebardor: 18-20 bp; ii)
temperatura de melting: 60-62ºC; iii) tamaño del amplicón: 150-200 bp; iv) contenido de GC:
45-50%.

9.3. Amplificación por PCR

Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron empleando la GoTaq Green
Master Mix (Promega, Madison, USA) y el termociclador MyCycler Bio-Rad (Bio-Rad,
California, USA), según el siguiente protocolo: Volumen de Reacción= 12,5 µL, Molde= 1 µl
de ADN total, Ciclos de amplificación: 94ºC 5 min (x1); 94ºC 1 min, 60ºC 30 s 72ºC 30 s
(x35); 72ºC 2 min (x1). Posteriormente se corrió un gel de agarosa 2% (UltraPure Agarose,
Invitrogen, USA) a 90 V durante 45–60 min. Los geles fueron revelados con GelRed Nucleic
Acid Gel Stain (Biotium Inc., California, USA) empleando un transiluminador UV.
Se emplearon marcadores de peso molecular: i) 1Kb Plus ladder (Invitrogen, Life
Technologies, New York, USA) y ii) 100bp (Promega, Madison, USA).
Los productos de amplificación fueron secuenciados empleando un secuenciador
automático 3130 Genetic Analyzer Hitachi AB (Applied Biosystems, Life Technologies, New
York, USA).
Las secuencias fueron analizadas on line utilizando el programa BLAST y
posteriormente el DNAman 5.5.2 (Lynnon BioSoft, Vaudreuil, Quebec, Canada).

9.4. Estudio de la expresión génica de la biosíntesis de folatos Real Time PCR

9.4.1. Extracción de ARN total de las cepas seleccionadas
Una vez diseñados los cebadores específicos de los genes fol y housekeeping para
qRT-PCR, se procedió a realizar la extracción del ARN total de las muestras obtenidas a
diferentes tiempos en condiciones óptimas y no óptimas en fermentadores (Resultados 2.3).
La extracción de ARN total se realizó mediante columnas de afinidad de acuerdo al kit
comercial NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Alemania)
siguiendo las instrucciones del fabricante para extracción de ARN total a partir de bacterias.

41
Materiales y métodos

Una vez obtenido el ARN se procedió a verificar ausencia de ADN. Para ello se
realizó una reacción de PCR empleando los cebadores específicos para el gen gyrB de
acuerdo al protocolo descripto en el apartado 3.3. En este caso, los moldes fueron: ADN total
(control positivo), agua de reacción (control negativo) y eluído tratado con ADNasa
(muestra).
Posteriormente se corrió un gel de agarosa 2% a 90V durante 45–60 min, y se reveló
con Gel Red. La ausencia de banda en la calle que se sembró la muestra verifica la ausencia
de ADN.
El ARN total fue cuantificado empleando el fluorómetro QubitTM 2.0 (Invitrogen,
USA) y el kit comercial de cuantificación de ARN QubitTM RNA Assay Kit (Cat. Nº Q32852
Invitrogen, USA).

9.4.2. Evaluación de la expresión génica mediante qRT-PCR

Se evaluó el grado de expresión relativa de los genes fol en condiciones óptimas
respecto a otras condiciones mediante qRT-PCR.
Una vez confirmada la ausencia de ADN en las muestras de ARN total extraído se
procedió a realizar la reacción cuantitativa de RT-PCR. Las muestras de ARN almacenadas a
-70ºC fueron descongeladas a temperatura ambiente. Se empleó el kit comercial para qRT-
PCR SensiFastTM SYBR & Fluorescein One-Step Kit (Bioline, Tauton, Massachusetts, USA).
La reacción de amplificación se realizó, usando el termociclador Bio-Rad iQ5 Multicolor Real
Time-PCR Detection System (Bio-Rad, California, USA), de acuerdo al siguiente protocolo:
volumen de Reacción: 20 µL; molde: 4 µL de ARN (10 pg).Las condiciones de qRT-PCR
fueron :45ºC 10 min (1x); 95ºC 2 min (1x); 95ºC 5 s, 60ºC 10 s, 72ºC 5 s (40x); 95ºC 1 min
(1x); 55ºC 1 min (1x); 55ºC 10 s (70x).
Finalizada la reacción de qRT-PCR se evaluaron las gráficas de Tm a fin de descartar
la presencia de dímeros de cebadores, amplificación inespecífica, etc. Los resultados fueron
analizados empleando el programa Bio-Rad iQ5 Optical System Software, Standard Edition
versión 2.0.148.60623 (Bio-Rad, California, USA).
Posteriormente se analizaron las gráficas de Intensidad de fluorescencia vs Ciclos de
amplificación (CT).

9.4.3. Cálculo de la expresión relativa de los genes fol

Esta técnica permite evaluar la expresión relativa de determinado gen en una
condición respecto a otra de referencia.

42
Materiales y métodos

Para ello se evaluó la expresión de los genes en condiciones óptimas respecto a la de

referencia, se emplearon los valores de CT de los genes fol y referencia para el cálculo. En
este caso se empleó el método 2-∆∆CT (Livak et al., 2001) para determinar el grado de
expresión relativa entre 2 condiciones. Se consideró significativo aquellos valores de 2-∆∆CT
superiores a 2 (Livak et al., 2001).
La ecuación empleada para el cálculo fue la siguiente:

(1) ∆CTóptimo = CTfol – CTreferencia

∆CTno óptimo = CTfol - CTreferencia

(2) N = 2-(∆CTóptimo – ∆CTreferencia)

N = 2-∆∆CT

donde: CThousekeeping = CT del gen de referencia o housekeeping (gyrB y recA) en

condición óptima y de referencia.
CTfol = CT del gen fol evaluado en condición óptima y de referencia

43
Materiales y métodos

Tabla M2. Cebadores de genes fol de S. thermophilus

Gen Función / Enzima Cebador F Cebador R Tamaño (pB)

folE GTP Ciclohidrolasa I 5’-CACTTGGTTCCTTTTTATGG-3’ 5’-ATTTCCTTACGTTCTTCACG-3’ 305

folQ Dihidroneopterin aldolasa 5’-TTGCCGTTTTTATGGCTATC-3’ 5’-ATCGACTACGCTCCAATTCA-3’ 335

2-amino-4-hidroxi-6-
folK hidroximetildihidropteridin 5’-AGTCATTGGATCGCTTGCT-3’ 5’-TTCTCGGCAATTTCTAGCAG-3’ 331
difosfokinasa

folP Dihidropteroato sintetasa 5’-TCTTGAATGTTACCCCAGAC-3’ 5’-TAAGGCTAGCATCTGACCAT-3’ 329

folC1 Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TCGAATTGGTCACCTTACTC-3’ 5’-GATTGTCTGTGGAAAGAAGC-3’ 339

folC2 Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TTAGTCCTCTAGCGGTCATC-3’ 5’-AAACTAGCATTTGCCACCT-3’ 319

folA Dihidrofolato reductasa 5’-CAAATCATTGCTATTTGGGC-3’ 5’-CCATCAAAAGCCTTGTAGAC-3’ 323

44
Materiales y métodos

Tabla M2. Cebadores de genes fol de S. thermophilus

Gen Función / Enzima Cebador F Cebador R Tamaño (pB)

folE GTP Ciclohidrolasa I 5’-CACTTGGTTCCTTTTTATGG-3’ 5’-ATTTCCTTACGTTCTTCACG-3’ 305

folQ Dihidroneopterin aldolasa 5’-TTGCCGTTTTTATGGCTATC-3’ 5’-ATCGACTACGCTCCAATTCA-3’ 335

2-amino-4-hidroxi-6-
folK hidroximetildihidropteridin 5’-AGTCATTGGATCGCTTGCT-3’ 5’-TTCTCGGCAATTTCTAGCAG-3’ 331
difosfokinasa

folP Dihidropteroato sintetasa 5’-TCTTGAATGTTACCCCAGAC-3’ 5’-TAAGGCTAGCATCTGACCAT-3’ 329

folC1 Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TCGAATTGGTCACCTTACTC-3’ 5’-GATTGTCTGTGGAAAGAAGC-3’ 339

folC2 Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TTAGTCCTCTAGCGGTCATC-3’ 5’-AAACTAGCATTTGCCACCT-3’ 319

folA Dihidrofolato reductasa 5’-CAAATCATTGCTATTTGGGC-3’ 5’-CCATCAAAAGCCTTGTAGAC-3’ 323

44
Materiales y métodos

Tabla M3. Cebadores de genes fol de S. macedonicus

Gen Función / Enzima Cebador F Cebador R Tamaño (pb)

folE GTP Ciclohidrolasa I 5’-GAGAAAATCCTAAGCGTGAA-3’ 5’-AGCAACTTGGTCAGTCAAAC-3’ 323

folB Dihidroneopterin aldolasa 5’-TAAAAGGTTGCCGTTTTTAT-3’ 5’-GCTCCCGTTCTAACTCAATA-3’ 339

2-amino-4-hidroxi-6-
folK hidroximetildihidropteridin 5’-TTATTTGAGCTTAGGAAGCAA-3’ 5’-ACGCTCAAATTTTCAGTAGC-3’ 327
difosfokinasa

folP Dihidropteroato sintetasa 5’-CAGAGCGCTTAAAGAACG-3’ 5’-AGCAATTCGATATTTTGTGC-3’ 339

folCA Folilpoliglutamato sintetasa 5’-AGCTATCAGCTGTCCATGTT-3’ 5’-CATACCTGCCTCGATAAAAG-3’ 329

folCB Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TCATTCTCATAAAGCCAACG-3’ 5’-GTCTTGAAATTCTGCGCTAT-3’ 310

dfrR Dihidrofolato reductasa 5’-GTGTCACCTTTGACGGAAT-3’ 5’-CGTTGAAGGTTTCAGACACT-3’ 303

45
Materiales y métodos

Tabla M4. Cebadores de genes fol y de referencia o housekeeping (recA y gyrB) de S. thermophilus para qRT-PCR

Gen Función / Enzima Cebador F Cebador R Tamaño (pB)

folE GTP Ciclohidrolasa I 5’-TGGGGATAAGGTGACAGGAC-3’ 5’-CCTCGAGGATTAAGGGCTTC-3’ 129

folQ Dihidroneopterin aldolasa 5’-CAGGGCTTCACAAAGTGACA-3’ 5’-TAGCACCAGCTAAACGCTCA-3’ 119

2-amino-4-hidroxi-6-
folK hidroximetildihidropteridin 5’-GCTTGCTTGAGACGGAAGTT-3’ 5’-CCTGACAAGCACTCAGCAAG-3’ 144
difosfokinasa

folP Dihidropteroato sintetasa 5’-CGGAATTTGTAACCGAGGAA-3’ 5’-CTGGCAGTGGCTGTCTTGTA-3’ 115

folC1 Folilpoliglutamato sintetasa 5’-ATCATTGAAGCAGGGATTGG-3’ 5’-GCTATCGCCCAAAGTTTCAG-3’ 111

folC2 Folilpoliglutamato sintetasa 5’—3’CGGTCTTGGGCAATACTCAT 5’-CCTTCTTCATTCGCCTTCTG-3’ 133

folA Dihidrofolato reductasa 5’-ATTGCTATTTGGGCGGAAG-3’ 5’-CATGCCATCAAAGGTCACAC-3’ 144

recA Recombinasa A 5’-TGTAGGACTTCAAGCGCGTA-3’ 5’-TCCACCTGGGGTAGTCTCTG-3’ 148

gyrB Subunidad β de ADN girasa 5’-CTCCAAAGAAGGCTTGCATC-3’ 5’-CCACGACCATCATCAACAAC-3’ 138

46
Materiales y métodos

Tabla M5. Cebadores de genes fol y de referencia o housekeeping (recA y gyrB) de S. macedonicus para qRT-PCR

Gen Función / Enzima Cebador F Cebador R Tamaño (pb)

folE GTP Ciclohidrolasa I 5’-GGGTTATTGGATACGCCAAA-3’ 5’-CAGTCACACGACCGTCACTT-3’ 223

folB Dihidroneopterin aldolasa 5’-TTGCCGTTTTTATGGCTACC-3’ 5’-ACAAATTGCTCCTGCCAAAC-3’ 217

2-amino-4-hidroxi-6-
folK hidroximetildihidropteridin 5’-CTGTGACGTCGGTCTCTTCA-3’ 5’-TCATGCCTAACACGCTTCAG-3’ 163
difosfokinasa

folP Dihidropteroato sintetasa 5’-GACGTTTGGGCTGGTCTTTA-3’ 5’-ATTTTGTGCCTCGTTTTTGG-3’ 228

folCA Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TGACTTGGTTGAGCGTGTTC-3’ 5’-CCCATACCTGCCTCGATAAA-3’ 156

folCB Folilpoliglutamato sintetasa 5’-TGGCACTTACGATTCAACCA-3’ 5’-TGCTGGACATTGTCTCTTCG-3’ 215

dfrR Dihidrofolato reductasa 5’-ACCTTTGACGGAATGAATCG-3’ 5’-GATACTAGCCCCACCAACGA-3’ 171

recA Recombinasa A 5’-TCAACCAGTTGCGTGAAAAA-3’ 5’-TACCACGGACATCAAGACGA-3’ 108

gyrB Subunidad β de ADN girasa 5’-CAAGAAGCTATGGCACGTCA-3’ 5’-TCTCGCCATTAAGCGATTCT-3’ 132

47
Materiales y métodos

ESTUDIOS TECNOLÓGICOS Y FUNCIONALES

10. Compatibilidad entre cepas

Se realizó mediante el método de difusión en agar de acuerdo a Parente et al. (1995),
para detectar la presencia de sustancias antimicrobianas en el sobrenadante de cultivo. Esta
técnica tiene como fundamento, que las sustancias producidas por los microorganismos
difunden a través del agar estableciendo un gradiente de concentración. Un resultado positivo
se revela por la presencia de un halo de inhibición de la cepa testigo.
En una caja de Petri se agregaron 15 mL de MRS agar (lactobacilos) o LAPTg agar
(estreptococos) (1,5% agar) y se dejó solidificar. Posteriormente se adicionó una segunda
capa (5 mL) de MRS agar blando o LAPTg agar blando (0,6%) fundido y enfriado a 45ºC
conteniendo 0,1 mL de un cultivo activo de la cepa “indicadora”. Una vez solidificada la
segunda capa, se efectuaron orificios de 5 mm de diámetro en los cuales se colocaron 20 µl de
los sobrenadantes del resto de las cepas de interés con el objeto de detectar la producción de
alguna sustancia que actúe como inhibidora del crecimiento de la cepa utilizada como
indicadora. Las placas fueron finalmente incubadas a 37ºC durante 24 h y se evaluó la
presencia de zonas de inhibición. Todos los microorganismos se utilizaron como posibles
productores e indicadores.

11. Tolerancia de las bacterias al tracto gastrointestinal (TGI)

Para este estudio, 20 mL de las suspensiones celulares (concentradas 2x) de cada cepa,
previamente activada en caldo MRS (lactobacilos) o caldo LAPTg (estreptococos), en la
matriz a ensayar (medio de cultivo, solución salina estéril, leche descremada 10%, etc.) se
mezclaron con el mismo volumen de solución “saliva–gástrica” (pepsina 0,6% en PBS, pH
2,0). El ajuste a ese valor de pH 2,0 se realizó con HCl 5 M (Bao et al., 2010). Se recolectaron
muestras (1 mL), inmediatamente después de mezclar, y a los 30, 60 y 90 min de incubación a
37ºC para el recuento de lactobacilos (MRS, 37°C) o estreptococos (LAPTg, 42ºC).
Adicionalmente, se tomó una muestra después de 90 min, se centrifugó (6000 × g, 15 min,
5°C) y se resuspendió en 1,5 mL de bilis (BD) 1% (pH 8,0), se recolectó una alícuota (100
µL) para determinar el número de células viables (UFC/mL). Las suspensiones celulares se
incubaron a 37ºC, 10 min (shock biliar) y luego se realizaron los recuentos celulares.
Posteriormente, las suspensiones celulares se lavaron 2 veces con solución salina estéril, se
centrifugaron a 6000 x g, 5 min y se resuspendieron en 1,5 mL de solución intestinal (bilis

48
Materiales y métodos

0,3% y pancreatina 0,1%, pH 8), se tomó una alícuota (100 µL) para la determinación de
UFC/mL. Se incubó a 37ºC durante 90 min. A intervalos, se tomaron alícuotas (100 µL) para
la evaluación de la viabilidad (UFC/mL).

12. Sensibilidad de los microorganismos a sales biliares

La sensibilidad de las cepas a sales biliares se determinó de acuerdo a Bao et al.
(2010). Cada cepa, se activó en caldo MRS (lactobacilos) o LAPTg (estreptococos). Luego el
cultivo se centrifugó, se lavó 2 veces con solución salina estéril y se centrifugó (6000 x g, 5
min). El pellet se resuspendió en 5 mL de MRS-THIO (lactobacilos, MRS suplementado con
0,2% p/v de tioglicolato de sodio) o LAPTg-THIO (estreptococos, LAPTg suplementado con
0,2% p/v de tioglicolato de sodio). Cada suspensión celular se inoculó al 2% (v/v) con 0,3%
(p/v) de Oxgall (Sigma, St. Louis, MO, USA). Los cultivos se incubaron durante 9 h a 37ºC,
midiéndose la DO600 a cada hora y se comparó con la DO de los cultivos controles en caldo
MRS sin sales biliares (lactobacilos) o LAPTg sin sales biliares (estreptococos). Los
resultados se expresaron como el tiempo requerido para crecer (tiempo lag) considerado como
la diferencia entre el tiempo de crecimiento en medio con oxgall respecto al medio control sin
oxgall cuando se presentó una diferencia de 0,3 unidades entre las DO en 2 tiempos
consecutivos en un mismo medio.

12.1. Resistencia a diferentes concentraciones de sales biliares

Se procedió como en el apartado 12, usando distintas concentraciones (0,2-2%) de
Oxgall incubando las cepas a 37ºC durante 24 h. Se midió la DO a distintos tiempos. La
resistencia de cada microorganismo fue considerada como la mayor concentración de sales
biliares donde las fueron capaces de crecer.

13. Sensibilidad de los microorganismos a antibióticos

Se determinó la sensibilidad de las cepas seleccionadas a diferentes antibióticos (ATB)
siguiendo el protocolo sugerido por la EFSA (EFSA/FEEDAP, 2012).

13.1. Preparación del inóculo y soluciones de antibióticos

Brevemente, los inóculos se prepararon mediante la suspensión de colonias
individuales aisladas (MRS agar o LAPTg agar de acuerdo al microorganismo, 24-48 h, 37ºC)
en 3 mL de solución salina estéril. La turbidez de la suspensión de células fue ajustada a una

49
Materiales y métodos

DO625 de 0,16-0,20 (1 equivalente estándar McFarland, aproximadamente 3 x 108 UFC/mL),

luego se diluyó 500 veces en caldo LSM. El caldo LSM estandarizado se utilizó para todos
los microorganismos. Los antibióticos evaluados se obtuvieron de Sigma en forma de
potencia. Se prepararon soluciones stock de cloranfenicol, clindamicina, tetraciclina,
eritromicina en etanol al 95% y de los demás antibióticos (ampicilina, gentamicina,
kanamicina, estreptomicina, vancomicina) en agua MiliQ estéril. Alícuotas de 1 mL de las
soluciones madre se almacenaron a -20ºC.

13.2. Procedimiento
En microplacas, de 96 pocillos estériles con tapa, se colocaron 50 µL de la solución
stock y de cada dilución (1/2-1/256) del antibiótico en cada pocillo., colocándose luego 50 µL
de la suspensión celular del microorganismo en estudio. Se incubó en condiciones anaerobias
a 37ºC durante 48 h. La sensibilidad de las bacterias a los ATB se determinó comparando su
DO625 respecto a la DO del control positivo de crecimiento (inóculo sin ATB).

14. Diseño de un producto lácteo fermentado bio-enriquecido en folatos usando las

cepas seleccionadas

14.1. Preparación de los fermentos

Cada cultivo láctico, previamente seleccionado, fue activado de acuerdo a lo descripto
en el apartado 1.1. Estas suspensiones celulares fueron inoculadas al 2% (v/v) en leche
descremada (Svelty Calcio Plus, Nestle, Argentina, reconstituída al 10% (p/v) previamente
tratada con calor a 87ºC, 30 min) e incubadas a 37ºC y 42ºC. A intervalos, se tomaron
alícuotas para determinar capacidad acidificante [pH (apartado 4, 5) y acidez titulable], y
concentración de folatos (apartado 6).
Los fermentos polivalentes se prepararon a partir de las cepas de S. thermophilus
CRL803, S. macedonicus CRL415 y L. bulgaricus (CRL863, CRL871 y CRL872) inoculando
el mismo volumen de cada una y en distintas relaciones coco:bacilo (1:1; 1:2; 2:1). El
comportamiento de los distintos fermentos fue evaluado en leche descremada reconstituída al
10% (p/v) usando un inóculo al 2% (v/v) en leche.

50
Materiales y métodos

14.2. Capacidad acidificante

14.2.1. Acidez titulable
Se pusieron 5 mL de cada muestra en un Erlenmeyer. Se adicionaron 3 gotas de
fenolftaleína (solución al 1 % en etanol 96º). Luego se tituló con una solución de NaOH 0,11
N (solución Dornic), bajo agitación hasta aparición de color rosa estable. Los resultados se
expresaron en gramos de ácido láctico por 100 mililitros de muestra, considerando que 1 mL
de solución Dornic equivale a 0,1 g % de dicho ácido.

14.2.2. Determinación de pH
Se procedió de acuerdo a lo descripto previamente (apartado 4 y 5).

14.3. Determinación de la sinéresis

A fin de determinar el porcentaje de sinéresis, se pesó la leche fermentada (200 mL) y
posteriormente se centrifugo a 2000 rpm 5 min. Posteriormente se separó el sobrenadante
(suero) y se determinó su peso. El cálculo del % de sinéresis se realizó empleando la siguiente
ecuación:
% (sinéresis) = Ps x 100
Pm
donde: Ps: peso en g del Suero
Pm: peso en g de la muestra

15. Elaboración de la leche fermentada bio-enriquecida en folatos

Las cepas seleccionadas (apartado 10.2) se inocularon al 2% en 200 mL de leche
descremada [Svelty Calcio Plus, Nestle, Argentina, reconstituída al 10% (p/v) previamente
tratada con calor a 87ºC, 30 min] y se incubaron a la temperatura óptima durante 16 h.
Los cultivos en leche inoculados al 2% (v/v) fueron usados para preparar distintas
combinaciones (6) denominadas: A, B, C (relación coco:bacilo 2:1); D, E y F (relación 1:1)
(Sección Resultados, apartado 4.1.1.3).
Los fermentos recientemente preparados fueron inoculados al 2% (v/v) en leche
descremada 10% (p/v) en la relación correspondiente e incubados a 42ºC, 6 h. La
fermentación se detuvo por enfriamiento rápido de la leche fermentada en baño de hielo,
luego en baño de agua y mantenimiento a 4–6ºC, 24 h. Los productos fueron conservados
durante 30 días a temperatura de refrigeración. Se determinó concentración de folatos totales
(apartado 6), viabilidad (apartado 4) y acidez desarrollada (ver apartado 5) inmediatamente
51
Materiales y métodos

luego de la inoculación (tiempo 0) y final de la fermentación (6 h) y durante los 30 días de

almacenamiento a 4ºC.
La viabilidad de L. bulgaricus fue determinada en placas de LBS agar (Difco, Becton,
Dickinson, and Co., Sparks, Maryland), incubadas a 37ºC, 48 h; mientras que S. thermophilus
en M17 agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) luego de la incubación a 42ºC, 48 h.

16. Evaluación de la funcionalidad de la leche fermentada bio-enriquecida en

folatos en un modelo animal de experimentación deficiente en folatos

16.1. Modelo Animal

16.1.1. Animales de experimentación
Se emplearon ratones BALB/c, criados en colonia cerrada en el bioterio de CERELA
(Chacabuco 145, San Miguel de Tucumán, Argentina). Los animales permanecieron en
condiciones ambientales controladas (temperatura 22 ± 2°C; humedad 55% ± 2%) con ciclos
de luz-oscuridad de 12 h.

16.1.2. Puesta a punto protocolo de deficiencia

Ratones destetados (3 semanas de edad) y adultos (6 semanas de edad) fueron
depletados mediante la alimentación con una dieta de composición definida libre de folatos
(Tabla M2) con o sin la suplementación con el antibiótico (ATB) succinilsulfatiazol 1% (p/p)
durante 28 días (d). Los ratones controles bien nutridos consumieron una dieta de
composición definida (DCD) conteniendo 2 mg/kg de alimento (Tabla M6) con o sin la
suplementación con ATB. Ambas dietas fueron consumidas ad libitum. De esta manera se
obtuvieron 8 grupos experimentales:
a. Grupo Control 3 semanas infantes con ATB (Ci+ATB): ratones normales de 3 semanas
alimentados con DCD suplementada con ATB.
b. Grupo Deficiente 3 semanas infantes con ATB (Di+ATB): ratones normales de 3 semanas
alimentados con dieta libre de ácido fólico suplementada con ATB.
c. Grupo Control 6 semanas adultos con ATB (Ca+ATB): ratones normales de 6 semanas
alimentados con DCD suplementada con ATB.
d. Grupo Deficiente 6 semanas adultos con ATB (Da+ATB): ratones normales de 6 semanas
alimentados con dieta libre de ácido fólico suplementada con ATB.

52
Materiales y métodos

e. Grupo Control 3 semanas infantes (Ci): ratones normales de 3 semanas alimentados con
DCD.
f. Grupo Deficiente 3 semanas infantes (Di): ratones normales de 3 semanas alimentados con
dieta libre de ácido fólico.
g. Grupo Control 6 semanas adultos (Ca): ratones normales de 6 semanas alimentados con
DCD.
h. Grupo Deficiente 6 semanas adultos (Da): ratones normales de 6 semanas alimentados con
dieta libre de ácido fólico.
Las muestras se tomaron al inicio del período de alimentación (tiempo 0) y a los 7, 14,
21, 28, 35 y 42 d de alimentación. Durante todo el periodo evaluado, todos los grupos de
ratones tuvieron libre acceso al agua de bebida y al alimento correspondiente.
Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética para el Cuidado
Animal de CERELA

16.1.3. Protocolo de deficiencia seleccionado

Ratones destetados (3 semanas de edad) fueron depletados mediante alimentación con
una dieta libre de folatos (Tabla M6). Los ratones controles bien nutridos, consumieron la
dieta DCD (Tabla M6) durante 14 d. Ambas dietas fueron consumidas ad libitum. Las
muestras se tomaron al inicio (tiempo 0) y al final (14 d) del período de depleción.
Durante todo el periodo evaluado, los grupos de ratones tuvieron libre acceso al agua
de bebida y al alimento correspondiente.

16.1.4. Protocolos de repleción

A fin de evaluar la eficiencia de la leche fermentada bio-enriquecida en la
recuperación de los ratones deficientes en folatos respecto a la fortificación con ácido fólico,
los ratones deficientes fueron divididos en 4 grupos alimentados, durante 21 días
consecutivos, con:
a. Dieta libre de folato DCD-SF (grupo control deficiente, grupo D);
b. Dieta control DCD (grupo repletado, grupo R);
c. Dieta deficiente DCD-SF junto con leche fermentada bio-enriquecida (grupo suplementado
con el producto bio-enriquecido, grupo LF-B);
d. Dieta deficiente DCD-SF junto con leche fermentada no enriquecida (grupo control de
leche fermentada, grupo LF).

53
Materiales y métodos

Los ratones del grupo control bien nutrido (grupo N) fueron alimentados durante todo
el ensayo con dieta DCD.
Las muestras se tomaron durante el período de depleción (0, 7 y 14 d) y de repleción
(21, 28 y 35 d). Durante el periodo evaluado, todos los grupos de ratones tuvieron libre acceso
al agua de bebida y al alimento correspondiente.

16.1.5. Protocolos de prevención de deficiencia

Con el objeto de evaluar la eficiencia de la leche fermentada bio-enriquecida en folatos
en la prevención del desarrollo de la deficiencia, los ratones destetados fueron divididos en 4
grupos alimentados, durante 35 días consecutivos, con:
a. Dieta DCD (grupo control bien nutrido, grupo N)
b. Dieta DCD-SF (grupo control deficiente, grupo D)
c. Dieta DCD-SF junto con leche fermentada bio-enriquecida (grupo suplementado con el
producto bio-enriquecido, grupo LF-B)
d. Dieta DCD-SF junto con leche fermentada no enriquecida (grupo control de leche
fermentada, grupo LF)
Las muestras se tomaron a distintos tiempos de alimentación (0, 7, 14, 21, 28 y 35 d).
Durante el periodo evaluado, todos los grupos de ratones tuvieron libre acceso al agua de
bebida y al alimento correspondiente.

54
Materiales y métodos

Tabla M6. Composición de las dietas control y libre de ácido fólico

Dieta deficiente* Dieta control**

Ingredientes
Cantidad g/kg
L-alanina 3,5 3,5
L-arginina (base libre) 11,2 11,2
L-asparagina.H2O 6,82 6,82
L-ácido aspártico 3,5 3,5
L-cisteína 3,5 3,5
L-ácido glutámico 35 35
Glicina 23,3 23,3
L-histidina (base libre) 3,3 3,3
L-isoleucina 8,2 8,2
L-leucina 11,1 11,1
L-lisina (HCl) 18 18
L-metionina 8,2 8,2
L-fenilalanina 11,6 11,6
L-prolina 3,5 3,5
L-serina 3,5 3,5
L-treonina 8,2 8,2
L-triptófano 1,74 1,74
L-tirosina 3,5 3,5
L-valina 8,2 8,2
Dextrina 397 397
Sucrosa 196,64 196,64
Celulosa 50 50
Aceite de maíz 100 100
Mix de sales #210020 50 50
Mix de vitaminas #317759 (libre de ácido fólico) 10 10
Cloridrato de Colina 2 2
Acetato de Sodio 8,1 8,1
Premezcla Ácido Fólico/Sucrosa - 0,4

*,** Dieta basada en la “Dieta para roedores L-amino ácido definina, deficiente en folatos
Clifford/Koury con 2 mg/kg de ácido fólico agregado”. *Cat. Nº 517812 (Dyets, Bethlehem, USA).
**Cat. Nº 517802 (Dyets, Bethlehem, USA).

55
Materiales y métodos

16.2. Obtención de muestras y su procesamiento

16.2.1. Muestras de sangre periférica
Las muestras de sangre fueron obtenidas por punción cardíaca de animales
previamente anestesiados con pentobarbital sódico.

16.2.1.1. Muestras de sangre periférica para hemograma

Las muestras se obtuvieron empleando EDTA como anticoagulante en la
concentración de 1,5 mg/mL de sangre, manteniendo la relación sangre:anticoagulante (9:1)
recomendada por el Comité Internacional para la Estandarización en Hematología (ICSH)
(ICSH, 1977).

16.2.1.2. Muestras de sangre entera y plasma

Las muestras se obtuvieron en tubos plásticos empleando EDTA como anticoagulante
en la concentración de 1,5 mg/mL de sangre, manteniendo la relación sangre:anticoagulante
(9:1) recomendada por el ICSH (ICSH, 1977).
Se tomó una alícuota (100 µL) de la sangre entera y se almacenó a -70ºC. El resto de
sangre entera se centrifugó (3000 x g, 10 min) y se trasvasó el plasma a otro tubo. Las
muestras de plasma fueron fraccionadas en alícuotas y almacenadas a -70ºC (Dacie et al.,
2008).

16.2.2. Muestras de órganos (hígado, bazo y riñón) para dosaje de folatos

Los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. El hígado, bazo y
riñones fueron extraídos asépticamente, colocados en tubos Eppendorf y pesados.

16.2.3. Procesamiento de sangre entera y plasma para la determinación de folatos

Las muestras de sangre entera se procesaron de acuerdo al siguiente protocolo: se
descongeló la alícuota de sangre entera, rápidamente a 37ºC y se colocó en 900 µL de agua
destilada estéril (dilución 1/10), a fin de lisar los glóbulos rojos y liberar el folato. Se incubó a
37ºC, 2 h. Luego, la muestra de sangre lisada se calentó a 100ºC, 5 min. Se centrifugó a
13000 x g, 10 min. Se separó el sobrenadante, se fraccionó en alícuotas y se conservó a -70ºC
hasta su uso.

Las muestras de plasma se procesaron de acuerdo al siguiente protocolo: una alícuota

(100 µL) de plasma se colocó en 900 µL de buffer protector estéril (dilución 1/10), a fin de
56
Materiales y métodos

lisar los glóbulos rojos y liberar el folato. Se incubó a 37ºC, 2 h. Luego, la muestra de plasma
se calentó a 100ºC, 5 min; se centrifugó 13000 x g, 10 min. Se separó el sobrenadante y se
fraccionó en alícuotas las cuales fueron conservadas a -70ºC hasta su uso.

16.2.4. Procesamiento de órganos para la determinación de folatos

Las muestras de órganos se procesaron siguiendo este protocolo: se colocó cada
órgano, previamente pesado, en 5 mL de buffer protector y se disgregó empleando un
homogeneizador. Se calentó el homogenato a 100ºC 5 min, se centrifugó a 13000 g, 10 min,
se trasvasó el sobrenadante y se fraccionó en alícuotas y se almacenó a -70ºC hasta su uso.

16.2.5. Procesamiento de órganos para la evaluación de translocación bacteriana

Las muestras de órganos frescos se procesan según el protocolo: se colocó cada
órgano, inmediatamente después de extraídos y pesados, en 5 mL de agua peptona estéril
0,1% (p/v) y se disgregó mediante un homogeneizador. Una alícuota (100 µL) del
homogenato se colocó en 900 µL de agua peptona realizándose diluciones seriadas 1/10. Se
sembró 100 µL de cada dilución seriada y el homogenato puro por duplicado en 20 mL de
McConkey agar (enterobacterias), MRS agar (lactobacilos) y BHI agar (recuento total de
bacterias) incubándose a 37ºC (24-48 h). Se contaron aquellas diluciones que tuvieran 30-300
colonias.
Se calculó el número de UFC/mL con la siguiente ecuación:
UFC/mL = (Colonias contadas x dilución) / 0,1

16.3. Peso corporal

El peso corporal fue determinado cada 2 días durante todo el periodo de alimentación,
y el día de toma de muestra. Se utilizó una balanza electrónica (ACCULAB, USA) con una
sensibilidad de 0,01 g y el peso final resultó del promedio de los valores obtenidos en tres
pesadas diferentes realizadas en forma alternada. Los resultados fueron expresados en g.

16.4. Peso de órganos

Los órganos hígado, bazo y riñones se pesaron inmediatamente después de ser
obtenidos empleando una balanza electrónica. El peso final del órgano se obtuvo a partir del
peso del tubo eppendorf con el órgano sustrayendo el peso del tubo eppendorf vacío. El peso

57
Materiales y métodos

final resultó del promedio de los valores obtenidos en tres pesadas diferentes realizadas en
forma alternada. Los resultados fueron expresados en g.

16.5. Determinación de la concentración de folatos en sangre entera, plasma y

órganos
La determinación de folatos fue realizada siguiendo el protocolo previamente
descripto (apartado 6). Las muestras fueron diluidas en buffer protector en la siguiente
relación: a) Sangre entera = dilución 1/100, b) Plasma de animales deficientes = dilución 1/10
y Plasma de los demás grupos = dilución 1/20, y c) Órganos = dilución 1/500.
Para el cálculo final de la concentración de folatos en sangre entera y plasma se
consideró la dilución 1/10 inicial, realizada durante el procesamiento de la muestra, mientras
que en el caso de los órganos, el peso de los órganos y el volumen de buffer empleado en la
disgregación de los mismos.

16.6. Dosaje de homocisteína en plasma

Se determinó la concentración de homocisteína en plasma mediante un kit comercial
Axis Homocysteine EIA–EF FHCY100 (AXIS-SHIELD, Escocia, Reino Unido). El
Inmunoensayo enzimático (EIA) Axis-Shield Homocysteine es un inmunoensayo enzimático
para la determinación de homocisteína (Hcy) en suero o plasma. La Hcy unida a proteínas es
reducida a Hcy libre y convertida enzimáticamente a S-adenosilhomocisteína (SAH) en una
etapa previa al inmunoensayo.

17. Análisis estadístico

Los resultados fueron obtenidos de 3 experimentos independientes y cada punto fue
medido en triplicado. Todos los valores fueron expresados como la media ± desvío estándar
(DE). Los análisis estadísticos fueron realizados con el paquete de Software SigmaPlot para
Windows versión 12.0 (Systat Software Inc., Chicago Illinois, USA) empleando el análisis
ANOVA GLM seguido de test poshoc Tukey. Los datos se consideraron estadísticamente
diferente con p<0,05.

58
Ressulta
ados
Esstudioos fissiológgicoss, bio
oquím
micoss y
molleculaares
Seleccción de cepass de BA
AL nativvas cappaces
de prooducir folatos
f
Resultados Selección de cepas productoras de folato

1.1. Resultados

1.1.1. Capacidad de BAL para producir folatos

Se evaluó la capacidad de 146 cepas [Lactobacillus (L.) acidophilus (8), L. casei (4), L.
fermentum (12), L. paracasei subsp. paracasei (12), L. plantarum (18), L. bulgaricus (41) y S.
thermophilus (51), (Materiales y métodos Tabla M1)] para producir folatos en un medio de
cultivo químicamente definido libre de folatos (FACM). En la Tabla 1.1 y 1.2 se muestran
aquellos microorganismos [n=60, L. acidophilus (2), L. bulgaricus (4), L. casei (1), L.
fermentum (2), L. paracasei subsp. paracasei (4), L. plantarum (15), y Streptococcus (S.)
thermophilus (32)] que crecieron en el mencionado medio (medido después de siete pasajes
sucesivos) y que sintetizaron folatos liberándolos al medio extracelular (FE, evaluado en el
sobrenadante del cultivo) y/o fueron retenidos en la célula (FI, estimado en la célula bacteriana).

Tabla 1.1. Crecimiento y síntesis de folatos por cepas de diferentes especies del género
Lactobacillus en FACM

Cepa (Código Folatos (µg/L)

Especie
CRL)a Extracelular (DE) b
Intracelular (DE)b Total (DE)b
L. acidophilus 43 5,1 (0,8) 2,3 (0,6) 7,4 (0,8)
1064 21,9 (2,3) 15,3 (1,4) 37,2 (3,1)
L. bulgaricus 863 86,2 (0,3) 8,6 (0,1) 94,8 (0,9)
866 3,6 (0,3) 16,2 (0,8) 19,8 (0,8)
871 14,7 (0,4) 11,4 (0,1) 26,1 (1,2)
872 16,5 (0,3) 11,6 (0,6) 28,1 (1,3)
L. casei 431 1,5 (0,3) 1,1 (0,3) 1,5 (0,4)
L. fermentum 251 1,2 (0,3) 1,1 (0,1) 2,3 (0,4)
973 4,3 (0,6) 2,6 (0,4) 6,9 (0,9)

a
Números de referencia de las cepas asignados por la Colección de Cultivos de CERELA.
b
Los valores se expresan como la media (desvío estándar, DE).

62
Resultados Selección de cepas productoras de folato

Tabla 1.1. Crecimiento y síntesis de folatos por cepas de diferentes especies del género
Lactobacillus en FACM (continuación)

Cepa (Código Folatos (µg/L)

Especie
CRL)a Extracelular (DE)b Intracelular (DE)b Total (DE)b
L. paracasei subsp. paracasei 75 3,4 (0,9) 26,6 (2,7) 30,1 (3,2)
76 7,5 (0,9) 15,6 (2,5) 23,1 (2,8)
208 21,6 (2,8) 17,1 (2,1) 38,7 (4,2)
678 8,2 (1,2) 1,1 (0,3) 9,2 (1,3)
L. plantarum 41 3,8 (0,8) 15,4 (1,2) 19,2 (2,3)
51 1,8 (0,4) 9,6 (1,1) 11,4 (2,3)
103 16,7 (3,4) 40,5 (4,2) 57,2 (5,2)
140 1,8 (0,4) 6,4 (0,9) 8,2 (1,2)
219 1,5 (0,3) 12,2 (1,7) 13,7 (1,9)
363 4,1 (0,8) 15,8 (1,3) 19,9 (1,8)
428 22,9 (2,7) 18,5 (1,6) 41,4 (3,6)
681 14,4 (1,2) 7,7 (1,3) 22,1 (2,4)
725 3,8 (0,9) 10,1 (1,2) 13,8 (1,7)
759 14,7 (1,3) 12,1 (1,1) 26,8 (3,2)
769 3,5 (0,8) 13,6 (1,8) 17,2 (1,9)
778 2,9 (0,5) 8,1 (1,7) 11,1 (1,2)
785 2,8 (0,3) 20,6 (2,8) 23,4 (2,1)
794 1,3 (0,2) 1,1 (0,2) 2,5 (0,6)
936 16,3 (1,6) 10,5 (0,9) 26,8 (3,2)

a
Números de referencia de las cepas asignados por la Colección de Cultivos de CERELA.
b
Los valores se expresan como la media (DE).

63
Resultados Selección de cepas productoras de folato

Tabla 1.2. Crecimiento y síntesis de folatos por cepas de S. thermophilus en FACM

Cepa (Código Folatos (µg/L)

Especie
CRL)a Extracelular (DE) b
Intracelular (DE)b Total (DE)b
S. thermophilus 412 22,9 (1,1) 28,6 (0,9) 51,5 (1,6)
414 21,1 (1,1) 16,2 (0,4) 37,3 (1,3)
415 76,6 (7,0) 15,9 (0,2) 92,5 (6,5)
417 72,7 (0,3) 8,8 (0,3) 81,5 (0,9)
418 19,1 (1,0) 14,6 (0,3) 33,7 (1,6)
419 17,1 (0,9) 19,6 (0,9) 36,7 (1,6)
638 20,2 (1,0) 17,2 (0,9) 37,4 (1,4)
723 8,8 (0,4) 22,5 (0,5) 31,3 (2,3)
734 11,7 (0,3) 7,6 (0,2) 19,3 (1,2)
737 27,5 (0,4) 13,3 (0,1) 40,8 (2,5)
738 4,3 (0,2) 1,4 (0,5) 5,7 (0,8)
802 14,0 (0,7) 17,6 (0,5) 31,6 (1,4)
803 22,4 (0,4) 12,2 (0,1) 34,6 (1,1)
806 20,0 (0,8) 7,6 (0,4) 27,6 (0,9)
807 23,0 (0,3) 1,8 (0,3) 24,8 (1,1)
808 25,7 (0,7) 54,7 (1,2) 80,4 (2,6)
809 19,2 (0,4) 7,5 (0,2) 26,7 (0,9)
810 14,5 (0,8) 11,9 (0,9) 26,4 (0,7)
811 14,7 (0,3) 16,4 (0,1) 31,1 (0,9)
812 11,1 (0,2) 10,7 (0,2) 21,8 (0,7)
813 32,3 (0,4) 8,8 (0,1) 41,1 (0,8)
814 5,4 (0,3) 9,7 (0,3) 15,1 (0,9)
816 11,2 (0,2) 10,3 (0,3) 21,5 (0,7)
817 11,0 (0,6) 1,6 (0,5) 12,6 (1,2)
818 10,8 (0,5) 11,8 (0,4) 22,6 (0,5)
819 7,3 (0,4) 12,3 (0,5) 19,6 (1,3)
820 13,2 (0,4) 11,0 (0,2) 24,2 (1,1)
821 16,6 (0,7) 10,6 (0,5) 27,2 (2,6)
986 30,4 (1,5) 15,3 (0,5) 45,7 (2,8)
1187 19,7 (0,8) 16,5 (0,4) 36,2 (1,5)
1190 6,8 (0,3) 10,1 (0,5) 16,9 (0,9)
1192 13,5 (0,3) 10,8 (0,3) 24,3 (0,8)

a
Números de referencia de las cepas asignados por la Colección de Cultivos de CERELA.
b
Los valores se expresan como la media (DE).

64
Resultados Selección de cepas productoras de folato

S. thermophilus CRL415 y CRL417, y L. bulgaricus CRL863 produjeron elevados

niveles de FE, siendo mayor (86,2 ± 0,3 µg/L) para la última cepa. Contrariamente, L.
plantarum CRL103 y S. thermophilus CRL808 sintetizaron la mayor concentración de FI (40,5
± 4,2 y 54,7 ± 1,2 µg/L, respectivamente) mientras que L. bulgaricus CRL871, entre otras cepas,
presentaron niveles similares tanto de FE (14,7 ± 0,4 µg/L) como FI (11,4 ± 0,1 µg/L) (Tabla
1.1 y 1.2).
De acuerdo a los resultados obtenidos, se seleccionaron 2 cepas de L. bulgaricus
[CRL863 (elevada conc. de FE) y CRL871 (conc. de FE = FI)], y 2 cepas de S. thermophilus
[CRL415 (elevada conc. de FE) y CRL803 (conc. de FE = FI)] para estudiar la cinética de
producción de folatos en FACM. El criterio de selección fue, además de la capacidad de
sintetizar folatos, la fácil adaptación al medio sintético. Las cepas seleccionadas, en el segundo
repique en FACM, presentaron una fase de latencia breve (2 h) alcanzando la fase estacionaria
temprana de crecimiento antes de las 8 h de incubación.
Previamente, se confirmó la identidad de los microorganismos seleccionados
evaluándose las propiedades bioquímicas, perfil de fermentación de azúcares mediante API
CH50 y secuenciación de la región variable V1 del gen ribosomal 16S ARN a partir del ADN
ribosomal 16S (ADNr 16S).
La identificación molecular (ADNr 16S) junto con los métodos fenotípicos permitieron
confirmar la identidad de las cepas CRL863 y CRL871 como L. delbrueckii subsp. bulgaricus,
presentando una similitud del 99% con L. bulgaricus ATCC11842, BAA365, ND02 y L.
bulgaricus 2038. En el caso de S. thermophilus CRL803 se obtuvo un grado de similitud del
99% con S. thermophilus CNRZ1066, LMG18311 y LMD9, mientras que la cepa CRL415
mostró una similitud del 99% con S. macedonicus ACA-DC 198. La confirmación de la
identidad se realizó de acuerdo al criterio de identificación que establece que se considera una
misma especie bacteriana cuando dos microorganismos tienen una identidad mayor al 97%
(Rodicio et al., 2004).

65
Resultados Selección de cepas productoras de folato

1.1.2 Cinética de producción de folatos y crecimiento bacteriano

A fin de determinar la relación entre la producción de folatos y el crecimiento bacteriano

en las cepas seleccionadas, esta propiedad se evaluó en función del tiempo, junto con el
crecimiento bacteriano [log (UFC/mL) y turbidez (DO580nm)] y la acidificación (pH). Los
resultados se muestran en la Figura 1.1.

L. bulgaricus CRL863 L. bulgaricus CRL871

A B
120 120
Folatos (µg/L)

100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 2 4 6 8 10 24 0 2 4 6 8 10 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Folatos totales Folatos extracelulares Folatos intracelulares

C D

Figura 1.1. Producción de folatos (A, B) (µg/L) y crecimiento (C, D) [DO580nm, log (UFC/mL) y pH],
en FACM, por cepas de L. bulgaricus CRL863 (A, C) y CRL871 (B, D). Los resultados se expresan
como la media ± DE.

L. bulgaricus CRL863 (Figura 1.1A) incrementó progresivamente la producción de

folatos hasta las 6 h de incubación, con una máxima concentración de folatos, tanto de FI (50,3
± 5,1 µg/L) como FE (51,2 ± 5,2 µg/L). La síntesis de la vitamina fue paralela con la fase
exponencial de crecimiento (7,3 log) (Figura 1.1C) y disminuyó gradualmente con el tiempo de
incubación (24 h), aunque la fase estacionaria se alcanzó a las 8 h [1,43 log (UFC/mL) y µmáx=
0,978 h-1] manteniéndose el número de células viables hasta el final de la fermentación. En el

66
Resultados Selección de cepas productoras de folato

caso de L. bulgaricus CRL871, la producción de folatos (Figura 1.1B) fue similar a la de

CRL863 (Figura 1.1A), pero con valores menores y diferentes entre el FE (34,2 ± 3,4 µg/L) y
FI (24,2 ± 2,4 µg/L); los mismos se mantuvieron sin variaciones hasta el final de la incubación
(Figura 1.1B). Este microorganismo creció rápidamente (µmáx= 0,691 h-1) alcanzando la fase
estacionaria a las 6 h de incubación [0,9 log (UFC/mL)] a pesar que su µmáx fue menor respecto
a CRL863 (Figura 1.1D).
Ambas cepas (CRL863 y CRL871) fueron acidificantes (pH= 1,2 y 1,9,
respectivamente) alcanzando CRL871 un pH de 4,6 ± 0,2 a las 24 h (Figura 1.1D).
La Figura 1.2 muestra la producción de folatos y el crecimiento de los estreptococos en
FACM.

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

A 180
B 180
160 160
Folatos (µg/L)

140 140
120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 2 4 6 8 10 24 0 2 4 6 8 10 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

Folatos totales Folatos extracelulares Folatos intracelulares

C D

Figura 1.2. Producción de folatos (A, B) (µg/L) y crecimiento (C, D) [DO580, log UFC/mL y pH], en
FACM, por cepas de S. thermophilus CRL803 (A, C) y S. macedonicus CRL415 (B, D). Los resultados
se expresan como la media ± DE.

67
Resultados Selección de cepas productoras de folato

S. thermophilus CRL803 produjo los niveles más elevados de FI (40,6 ± 4,1 µg/L) y FE
(39,8 ± 3,9 µg/L) (Figura 1.2A) a las 6 h, coincidente con la fase exponencial de crecimiento
(Figura 1.2C), disminuyendo levemente hasta las 24 h de incubación. Contrariamente S.
macedonicus CRL415 mostró una cinética de producción de folatos (Figura 1.2B) diferente a
la determinada para las otras BAL analizadas. La síntesis de vitamina incrementó
progresivamente con el tiempo de incubación, alcanzando los mayores niveles de FE (78,46 ±
7,8 µg/L) a las 10 h, mientras que para los FI (93,26 ± 9,3 µg/L) fue al final del período (24 h).
La cinética de producción de la vitamina fue concomitante con el crecimiento de los
estreptococos (Figura 1.2C y 1.2D). La cepa CRL803 (Figura 1.2C) creció fácilmente en el
medio (µmáx= 0,668 h-1) con un número de células viables significativamente superior [2 log
(UFC/mL)] al de CRL415 [µmáx= 0,449 h-1; 1,7 log (UFC/mL)] (Figura 1.2D). También, el
crecimiento microbiano fue medido indirectamente a través del pH del medio siendo CRL803
más acidificante que CRL415 (pH= 1,6 y 1,1, respectivamente).
Con el fin de confirmar si la producción de folatos era dependiente del crecimiento
bacteriano se graficó la concentración de folatos totales en función del recuento de células
viables, consideradas hasta el inicio de la fase estacionaria (Figura 1.3).

120
Folatos totales (µg/L)

100
80
60
40
20
0
6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5
log (UFC/mL)

CRL863 CRL871 CRL803

CRL415 Lineal (CRL871) Lineal (CRL415)

Figura 1.3. Producción de folatos (µg/L) en función del crecimiento [log (UFC/mL)].

El análisis de la variación de la producción de la vitamina frente a diferentes números

de células viables (log UFC/mL) permitió asociar ambos parámetros con distintos tipos de
modelos de respuesta. Los resultados indicaron dos tipos de relaciones: i) lineal, donde la
vitamina se produce paralelamente al crecimiento bacteriano, como se observa para L.
bulgaricus CRL871 (y = 41,98 x – 282,77; r2=0,96) y S. macedonicus CRL415 (y = 52,28 x –
324,54; r2=0,97); ii) relación sigmoidea (dos fases), donde durante la fase exponencial, el folato
se produce linealmente con el crecimiento celular mientras en fase estacionaria, la producción
68
Resultados Selección de cepas productoras de folato

de la vitamina aumenta mientras el crecimiento bacteriano no varía. Este comportamiento fue

observado en L. bulgaricus CRL863 y S. thermophilus CRL803 donde la relación entre la
síntesis de folatos y crecimiento, depende de la fase de crecimiento del microorganismo y su
estado metabólico.

69
Resultados Selección de cepas productoras de folato

1.2. Discusión

Las BAL generalmente se usan como cultivos iniciadores para la elaboración de una
amplia gama de productos fermentados. Algunas BAL son capaces de producir, liberar y/o
incrementar compuestos en los alimentos los cuales ejercen efectos benéficos en el huésped. La
mayoría de las BAL son auxótrofas en ciertas vitaminas, como los folatos, sin embargo, algunas
cepas pueden sintetizar vitaminas del grupo B.
En nuestros estudios, la adaptación y crecimiento de las BAL en un medio de cultivo
definido carente de vitamina fue la condición para evaluar si las cepas producían folatos. Los
resultados mostraron que la capacidad de las mismas para sintetizar folatos fue variable entre
las especies de Lactobacillus y S. thermophilus y aún entre cepas. Similares observaciones
fueron realizadas por otros investigadores (LeBlanc et al., 2010a; Lin et al., 2000; Nor et al.,
2010). Posteriormente Capozzi et al. (2012) también encontraron que, en numerosas cepas de
BAL de relevancia industrial, la producción de folatos fue dependiente de la especificidad de
cepas. Así L. acidophilus NCFM, microorganismo secuenciado, es incapaz de sintetizar folatos
mientras que otras cepas de la misma especie incrementaron los niveles de vitamina en leches
fermentadas (Lin et al., 2000).
El tamaño y carga de los folatos permite separar el folato extracelular (liberado al medio
de cultivo) del intracelular (retenido por la célula). En bacterias, durante la síntesis de la
vitamina, actúa la enzima folil-poliglutamato sintetasa cuya función es adicionar unidades
glutámicas al grupo glutamato de la molécula de folatos generando la denominada “cadena
glutámica”. Su longitud puede variar desde un residuo de glutamilo hasta doce residuos
(Sybesma et al., 2003a). Los folatos que contienen hasta tres residuos glutamilos son
transportados a la membrana y liberados al medio extracelular (FE) mientras que los de cadenas
más largas quedan retenidos en el citoplasma (FI) (Shane et al., 1975), porque las enzimas
folatos dependiente tienen mayor afinidad por las formas poliglutámicas que por las
monoglutámicas (McGuire et al., 1984).
En nuestros estudios, el criterio de selección de cepas de BAL productoras de folatos se
realizó de acuerdo a los niveles de folatos liberados al medio extracelular (FE). De los
microorganismos analizados, S. macedonicus CRL415, S. thermophilus CRL417, y L.
bulgaricus CRL863 produjeron elevados niveles de FE. Estos resultados confirman las
observaciones de Crittenden et al. (2003) que demostraron que cepas de S. thermophilus tienen
habilidad para sintetizar FE. A diferencia de lo observado en S. thermophilus, L. plantarum

70
Resultados Selección de cepas productoras de folato

CRL103 sintetizó preferentemente FI, mientras que Sybesma et al. 2003b, estudiando la
producción de folatos por BAL, encontraron cepas de L. plantarum productoras de FE.
La especie L. bulgaricus, ha sido considerada por muchos años, consumidora de folatos
(Kneifel et al., 1991; Leblanc et al., 2011; Rao et al., 1984). En el genoma de L. bulgaricus
ATCC11842 (van de Guchte et al., 2006) se identificaron genes que codifican para las enzimas
involucradas en la síntesis de folatos; sin embargo, los ensayos bioquímicos revelaron la
incapacidad de esta cepa de producir folatos. Los resultados de nuestros estudios demuestran,
por primera vez, que cepas de L. bulgaricus fueron capaces de crecer y sintetizar de novo folatos
en un medio definido libre en dicha vitamina.
La relación entre síntesis de folatos y crecimiento microbiano fue cepa dependiente. En
L. bulgaricus CRL871 y S. macedonicus CRL415 se obtuvo una curva lineal positiva entre
ambas variables; conforme aumentó el número de células viables incrementó la cantidad de
folatos totales obtenidos. Un comportamiento diferente se observó para L. bulgaricus CRL863
y S. thermophilus CRL803, la relación entre las mencionadas variables no fue lineal, sino tuvo
forma sigmoidea. En este caso, la síntesis de folatos aumentó linealmente durante las primeras
etapas de multiplicación celular hasta un dado crecimiento, a partir del cual la producción de
folatos incrementó exponencialmente pero no fue concomitante con el aumento del número de
células. Es decir, en esta etapa del crecimiento, la producción de vitaminas fue dependiente de
la actividad metabólica del microorganismo pero no del número de células viables.
De acuerdo a la literatura, no hay antecedentes de la producción de folatos y su relación
con el crecimiento microbiano, por lo que nuestros estudios constituyen aportes originales que
demuestran que la síntesis de folatos por cultivos iniciadores no solo depende de la cepa sino
de su estado metabólico, fase de crecimiento y posiblemente de la actividad de las enzimas
responsables del tamaño de los folatos sintetizados.

71
Resultados Selección de cepas productoras de folato

1.3. Conclusiones parciales

Los resultados obtenidos en este capítulo permitieron: 1) seleccionar cepas de BAL que
sintetizan elevadas concentraciones de folatos totales y 2) disponer de cepas de L. bulgaricus
con capacidad de sintetizar esa vitamina.

72
Evalluaciónn de la influenc
i cia de los
l parrámetroos de cu
ultivo
en la
l prodducciónn de fola
atos

11. Efectto del precurs

p sor pAB
BA sobrre la sínntesis de
d
folaatos en medioo químiccamentte definnido

2. E
Efecto de la fuente
fu dde carbo
ono sob
bre la ssíntesiss de
folaatos en medioo químiccamentte definnido

3. Influenncia dee las coondicion

nes de cultivoo sobre la
s
síntesis de folaatos en fermen
f ntadorees
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

A fin de profundizar en los aspectos bioquímicos de la producción de folatos por BAL

seleccionadas se continuaron los estudios en un medio químicamente definido libre de folatos
(MQD-SF) como base para evaluar el efecto del ácido p-aminobenzoico (pABA) y de distintos
azúcares. Se inició el estudio de diferentes concentraciones de pABA debido a que este
componente constituye la parte central de la molécula del folato (Sección Introducción).

2.1.1. Resultados

2.1.1.1. Efecto del pABA sobre la capacidad de S. thermophilus CRL803 y S.

macedonicus CRL415 para producir folatos

La adición de pABA en concentraciones menores a 1,5 mM, tuvo un efecto positivo

sobre la producción de folatos y la velocidad de crecimiento de las BAL, siendo dicho efecto
dependiente de la cepa (Figura 2.1).
S. thermophilus CRL803 (Figuras 2.1A, C y E), en presencia de pABA (10 µM),
sintetizó folatos luego de 4 h de incubación. A las 6 h, la concentración de FE fue 2,5 veces
mayor que la determinada en ausencia de pABA (27,3 ± 3,9 y 10,75 ± 1,6 µg/L,
respectivamente) (Figura 2.1C). Por el contrario, no se observaron cambios notables en los
niveles de FI (Figura 2.1E) con y sin adición de pABA a las 6 h, mientras que a las 24 h, se
determinó un marcado aumento (aprox. 8,5 veces) en presencia del precursor. El incremento en
la concentración de pABA (hasta 150 µM) no modificó el comportamiento de los
microorganismos para producir folatos (FT, FE y FI) pero los valores de vitamina fueron
significativamente superiores a partir de las 6 h. Sin embargo, la adición de pABA a una
concentración de 1,5 mM no produjo diferencias significativas en la síntesis de folatos (Figura
2.1) respecto a lo determinado para 150 µM.
La adición de pABA (10 µM) al MQD-SF estimuló marcadamente la velocidad de
síntesis de folatos en S. macedonicus CRL415 (Figuras 2.1B, D y F) obteniéndose elevados
niveles de FT (72,2 ± 3,8 µg/L) (Figura 2.1B) en menor tiempo de incubación (4-6 h), a
diferencia de lo observado sin pABA (>10 h). En ausencia de pABA, los FT (Figura 2.1B)
alcanzaron elevada concentración (63,1 ± 4,9 µg/L) a las 12 h, mientras que en presencia de
pABA valores similares fueron obtenidos a las 6 h, manteniéndose en ambas condiciones
(ausencia y presencia de pABA) constante hasta las 24 h. En presencia de pABA, los FE
también alcanzaron su máximo a las 6 h (61,9 ± 4,6 µg/L) (Figura 2.1D), mientras que los FI

74
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

(Figura 2.1F) fueron sintetizados en bajas concentraciones (entre 4,6 ± 0.3 y 14,9 ± 1,2 µg/L)
durante el tiempo evaluado.
Contrariamente a lo determinado en S. thermophilus CRL803, mayores concentraciones
(>10 µM) de pABA no tuvieron un efecto estimulante sobre la producción de folatos por S.
macedonicus CRL415, las diferencias en los valores de concentración de FT (Figura 2.1B) y
FE fueron significativas a las 24 h (Figura 2.1D).
S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

A B
100 e e e 100 c c
b
Folatos totales (µg/L)

80 e 80 b
d d d
60 60 b b b b,d d
c d
40 40
b a a a a
20 a a 20 a a a
a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
C D
Folatos extracelulares (µg/L)

100 100
d
80 d d d 80 b
b b b
b
60 a c 60
a b c
c
40 40
b b
20 a a a a a 20
a a a a a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
E F
50 50
Folatos intracelulares (µg/L)

d
40 40

30 30
c
b b
20 b 20 b b
a
a a a
10 10 a a
a
a a a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
0 µM pABA 10 µM pABA 150 µM pABA 1,5 mM pABA

Figura 2.1. Producción de FT (A y B), FE (C y D) y FI (E y F) por S. thermophilus CRL803 y S.

macedonicus CRL415 en medio MQD-SF con el agregado de distintas concentraciones de pABA. Los
resultados se expresan como la media ± desvío estándar (DE), letras distintas indican diferencia
significativa (p<0,05).

75
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

El crecimiento bacteriano también fue influenciado por la presencia de pABA en el

MQD-SF. La adición de 10 µM tuvo un efecto positivo sobre el desarrollo de S. thermophilus
CRL803 (Figura 2.2A, C, E), dado que tuvo una velocidad de crecimiento superior (µmáx 0,82)
respecto a la determinada en ausencia de pABA (µmáx 0,59 h-1) y alcanzó fase estacionaria a las
10 h de incubación (0,7 Δlog UFC/mL, Figura 2.2C). El número de células viables se mantuvo
sin cambios hasta el final del crecimiento a diferencia de lo observado sin pABA. Una mayor
concentración del precursor incrementó la velocidad de crecimiento (µmáx 1,04 h-1 con 150 µM
pABA). Esto se reflejó en una mayor acidificación (Figura 2.2E) respecto a 0 µM de pABA.

A B
6 S. thermophilus CRL803 6 S. macedonicus CRL415
5 5 d d d
DO580

d
4 4
b b
3 b 3
b c c c c
2 a 2
1 a a a 1 a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

C D
10 10
c c c
9 9 c
b
log (UFC/mL)

d d d
8 c 8 a

7 a 7
b b
b a
6 6

5 5
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
E F
8 8

7 7
a a
pH

6 6
b b
b b
b b,c
5 5 c
c c
c
4 4
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

0 µM pABA 10 µM pABA 150 µM pABA 1,5 mM pABA

Figura 2.2. Crecimiento [DO580 (A, B); log UFC/mL (C, D); pH (E, F)] de S. thermophilus CRL803 y
S. macedonicus CRL415 en MQD-SF con la adición de diferentes concentraciones de pABA. Los
resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

76
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

El comportamiento de S. macedonicus CRL415 (Figuras 2.2B, D y F) fue similar a S.

thermophilus CRL803, la fase exponencial se inició a las 4 h con aumento de la DO hasta las
10 h (Figura 2.2B), siendo los valores de absorbancia significativamente superiores a los de S.
thermophilus CRL803 (Figura 2.2A). El número de células viables (log (UFC/mL) se
incrementó gradualmente desde las primeras horas de incubación hasta las 8 h (2,6 Δlog
UFC/mL) con una µmáx de 0,96 h-1, mayor que la determinada para S. thermophilus CRL803
(Figura 2.2C), ingresando en fase estacionaria a las 8 h (Figura 2.2D). El aumento de la
concentración de pABA no produjo cambios significativos sobre el crecimiento (DO y log
(UFC/mL) (Figuras 2.2B, D y F) de esta cepa.

2.1.1.2. Efecto del pABA sobre la capacidad de L. bulgaricus CRL871 para producir
folatos

L. bulgaricus CRL871 no fue capaz de crecer en MQD-SF, a diferencia de lo observado

en S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415. Por lo tanto, se realizaron
modificaciones en la concentración de varios constituyentes (casaminoácidos, aspartato,
asparagina, triptófano y guanina) del MQD-SF (Materiales y métodos apartado 3.6) que
permitieron el desarrollo del microorganismo, obteniéndose una adecuada densidad celular
luego de 20 h de cultivo. Por lo tanto, los estudios de producción de folatos y crecimiento
bacteriano se realizaron a las 24 h de incubación.
L. bulgaricus CRL871 no fue capaz de sintetizar folatos en ausencia de pABA (Figuras
2.3A, B y C). Sin embargo, el agregado de 10 µM produjo un efecto positivo en la capacidad
de CRL871 para sintetizar y liberar folatos (Figura 2.3B) en concentraciones que fueron
significativamente más bajas a las producidas por los estreptococos, en el mismo tiempo de
incubación. Los niveles reducidos de FI permanecieron sin variaciones significativas en función
del tiempo de incubación y aún en presencia de mayores concentraciones de pABA (Figura
2.3C).
La síntesis de folatos por L. bulgaricus CRL871 fue dependiente de la presencia de
pABA disponible en el medio de cultivo, no afectada por el aumento de su concentración.

77
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

A B
7 7

Folatos extracelulares (µg/L)

a a
6 6
Folatos totales (µg/L)

5 b 5 a,b
4 c 4 b
3 3
2 2
1 1
0 0
0 µM pABA 10 µM 150 µM 1,5 mM 0 µM 10 µM 150 µM 1,5 mM
pABA pABA pABA pABA pABA pABA pABA

C
7
Folatos intracelulares (µg/L)

6
5
4
3
2
1
0
0 µM 10 µM 150 µM 1,5 mM
pABA pABA pABA pABA

Figura 2.3. Producción de FT (A), FE (B) y FI (C) por L. bulgaricus CRL871 en medio MQD-SF con
el agregado de distintas concentraciones de pABA. Los resultados se expresan como la media ± DE,
letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

L. bulgaricus CRL871 fue capaz de crecer en presencia de pABA, alcanzando valores

elevados de DO (aprox. 4,1) (Figura 2.4A) y un incremento de 2 log UFC/mL (Figura 2.4B),
que fue concomitante con la disminución de pH (Figura 2.4.C), luego de 24 h de incubación.
Este comportamiento fue similar entre las concentraciones de pABA evaluadas (Figura 2.4A).

78
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

A B a
5 9 a a
a a
8
4 b 7

log (UFC/mL)
6
DO580

3
5
2 4
3
1 2
1
0 0
0 µM 10 µM 150 µM 1,5 mM 0 µM 10 µM 150 µM 1,5 mM
pABA pABA pABA pABA pABA pABA pABA pABA

C
8
a
7
6
b b b
5
4
pH

3
2
1
0
0 µM 10 µM 150 µM 1,5 mM
pABA pABA pABA pABA

Figura 2.4. Crecimiento [DO580 (A); log (UFC/mL) (B); pH (C)] de L. bulgaricus CRL871 en MQD-
SF con la adición de diferentes concentraciones de pABA. Los resultados se expresan como la media ±
DE, letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

79
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

2.1.2 Discusión

Las variaciones de las condiciones de cultivo pueden influenciar la capacidad de cepas

de Lactococcus (Lc.) lactis, S. thermophilus y Leuconostoc (Leuc.) para sintetizar folatos
(Sybesma et al., 2003c). En nuestros estudios se analizó el efecto del pABA en la producción
de folatos por S. thermophilus CRL803, S. macedonicus CRL415 y L. bulgaricus CRL871. Los
resultados mostraron que la adición de diferentes concentraciones de pABA tuvo un efecto
positivo en la síntesis de vitamina el cual fue variable entre los microorganismos.
Contrariamente, el crecimiento en MQD-SF no fue afectado por el agregado de pABA. En este
sentido, el desarrollo bacteriano sin pABA fue dependiente de la capacidad de adaptación de la
cepa, al medio de cultivo. Si bien los estreptococos crecieron en ausencia de pABA, la
producción de folatos fue variable. S. thermophilus CRL803 sintetizó escasos niveles de folatos
durante todo el ensayo, a diferencia de S. macedonicus CRL415. Estos resultados sugieren que
S. macedonicus CRL415 fue capaz de sintetizar suficientes cantidades de pABA, que le
permitieron crecer adecuadamente y sintetizar folatos. Por el contrario S. thermophilus CRL803
exhibió menor desarrollo, el cual podría deberse a una menor adaptación de la cepa. La misma
sintetizaría pABA en cantidades que le permitan crecer en el medio y de allí producir folatos
más lentamente que S. macedonicus CRL415.
En general, la adición de mayores concentraciones de pABA resultó en el aumento de
los niveles de FT. Sin embargo, la producción de folatos por S. thermophilus CRL803
incrementó hasta 150 µM de pABA mientras que mayores concentraciones no tuvieron efecto.
Sybesma et al. (2003c) demostraron, en Lc. lactis, que concentraciones de pABA superiores a
100 µM no estimulaban la síntesis de folatos. Posteriormente, se demostró que es necesario
sobreexpresar simultáneamente los genes involucrados en la síntesis de pABA (pabA y pabBC)
y de folatos (folKE y folC) para que, frente a mayores niveles de pABA, se logre incrementar
la síntesis de folatos en Lc. lactis, (Wegkamp et al., 2007).
Otro factor limitante de la síntesis de folatos observado fue el tiempo de incubación. Se
determinó un mínimo de 6 h para que S. thermophilus CRL803 sea capaz de sintetizar los
mayores niveles de folatos mientras que para lograr su máximo crecimiento fue necesario 8 h.
La extensión del tiempo de incubación, en ausencia o en presencia de diferentes
concentraciones de pABA, produjo una disminución de la cantidad de FE y aumento de los
niveles de FI. Esto podría deberse a una modificación del tamaño de los folatos producidos,
incrementando aquellos de cadenas glutámicas mayores a 4 residuos que quedarían retenidos

80
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

en el citoplasma (Shane et al., 1975). Este comportamiento sería el resultado de distintas

situaciones: mayor actividad de la enzima folilpoliglutamato sintetasa (FolC); aumento de la
expresión y síntesis de la enzima FolC, o cambios en el transporte de folatos hacia el medio
extracelular, como consecuencia de modificaciones en el medio de cultivo o estado metabólico
de la bacteria en sus distintas fases de crecimiento.
S. macedonicus CRL415 fue capaz de sintetizar folatos en niveles similares en presencia
de pABA, independientemente de su concentración, indicando que la capacidad de CRL415
para producir folatos sería la más elevada en esas condiciones de cultivo.
En L. bulgaricus CRL871, el crecimiento y la síntesis de folatos estuvieron fuertemente
influenciados por el precursor pABA. Cuando CRL871 se inoculó en MQD-SF sin pABA no
fue capaz de crecer. Esto se debería a la incapacidad de sintetizar pABA. Por el contrario, en
presencia de pABA, su comportamiento fue distinto. Cantidades muy bajas del precursor (10
µM) permitieron un buen crecimiento, similar al observado con mayores concentraciones, luego
de 24 h de incubación, independiente de la concentración del precursor aún después de varios
repiques. La cepa CRL871 sintetizó bajas concentraciones de FT (5,3 ± 0,9 µg/L), a diferencia
de los estreptococos que fueron capaces de crecer en elevadas densidades celulares y producir
altas concentraciones de FT.
Los resultados permitieron señalar que la producción de folatos por BAL depende del
medio y las condiciones de cultivo, factores que tendrían impacto en la manufactura de los
productos lácteos, específicamente en la obtención de yogur enriquecido en folatos por cepas
altamente productoras las cuales se incorporarían a los fermentos de yogur.

81
Resultados Efecto del precursor pABA sobre la síntesis de folato

2.1.3. Conclusiones parciales

La síntesis de folatos en presencia de distintas concentraciones de pABA depende del

crecimiento del microorganismo y de su actividad metabólica, siendo una característica cepa
dependiente.
El crecimiento de los estreptococos sin pABA fue dependiente de la capacidad de
adaptación de la cepa, al medio de cultivo. S. macedonicus CRL415 creció más rápido y
sintetizó cantidades de folatos significativamente superiores respecto a S. thermophilus
CRL803, indicando una mejor adaptación a la ausencia del precursor mientras que L. bulgaricus
CRL871 no fue capaz de crecer en estas condiciones.
La síntesis de folatos por S. thermophilus CRL803 fue limitada por la concentración de
pABA, mientras que las otras BAL sintetizaron la misma cantidad de folatos
independientemente de la concentración de pABA.
La evaluación de la cinética de síntesis de folatos y crecimiento de las cepas en relación
a su precursor inmediato pABA permitió profundizar los conocimientos de la síntesis de esta
vitamina.

82
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

2.2.1.1. Efecto de la fuente de carbono sobre la capacidad de S. thermophilus

CRL803 y S. macedonicus CRL415 para producir folatos

Glucosa, sacarosa o lactosa, usados como única fuente de carbono, en MQD-SF

adicionado con 1,5 mM de pABA afectaron la producción de FT (Figura 2.5), mientras que
variaciones en la concentración de cada carbohidrato no modificaron la síntesis de folatos
(Figura 2.5) ni el crecimiento (Figura 2.6) de los microorganismos.

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

A B
160 160
Folatos totales (µg/L)

140 140
120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
4 6 8 10 12 24 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Glucosa (1%) Glucosa (2%) Glucosa (3%)
C 160 D 160
Folatos totales (µg/L)

140 140
120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
4 6 8 10 12 24 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Sacarosa (1%) Sacarosa (2%) Sacarosa (3%)
E F
160 160
Folatos totales (µg/L)

140 140
120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
4 6 8 10 12 24 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Lactosa (1%) Lactosa (2%) Lactosa (3%)

Figura 2.5. Producción de FT por S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 en medio

MQD-SF en presencia de diferentes concentraciones de glucosa (A, B), sacarosa (C, D) o lactosa (E,
F) como única fuente de carbono. Los resultados se expresan como la media ± DE.

83
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

A 10 B
10
8
log (UFC/mL)

8
6 6
4 4
2 2
0 0
4 6 8 10 12 24 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Glucosa (1%) Glucosa (2%) Glucosa (3%)

C 10 D 10
log (UFC/mL)

8 8
6 6
4 4
2 2
0 0
4 6 8 10 12 24 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Sacarosa (1%) Sacarosa (2%) Sacarosa (3%)

E 10 F 10
8 8
log (UFC/mL)

6 6
4 4
2 2
0 0
4 6 8 10 12 24 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
Lactosa (1%) Lactosa (2%) Lactosa (3%)

Figura 2.6. Crecimiento de S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 en medio MQD-SF

en presencia de diferentes concentraciones de glucosa (A, B), sacarosa (C, D) o lactosa (E, F) como
única fuente de carbono. Los resultados se expresan como la media ± DE.

Teniendo en cuenta estos resultados y los correspondientes al estudio de la influencia

de pABA sobre la producción de folatos, donde los niveles de la vitamina aumentan
significativamente dependiendo de la cepa y de la presencia del precursor cuya concentración
fue un factor limitante en la producción de la vitamina en algunos casos, se evaluó la
influencia de la fuente de carbono (glucosa, sacarosa o lactosa) al 2% (p/v) en presencia de 10
y 150 µM de pABA. Estos estudios se realizaron a fin de determinar si pABA también
limitaba la cantidad de folatos sintetizados al modificarse la fuente de carbono, y establecer si
los carbohidratos ejercían influencia en la producción de la vitamina, independientemente de
la cantidad del precursor.

84
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

En presencia de 10 µM pABA y sacarosa como única fuente de carbono, S.

thermophilus CRL803 alcanzó los mayores valores de FT (98,5 ± 3,7 µg/L) y FE (82,2 ± 4,5
µg/L) a las 8 h (Figuras 2.7A y C). Con glucosa, el comportamiento fue similar pero los
niveles de vitamina fueron significativamente menores (Figuras 2.7A y C). En lactosa, el
incremento fue visible recién a las 10 h de incubación. Sin embargo, el agregado de mayor
concentración (150 µM) de pABA, tuvo un efecto estimulante en la síntesis de FT alcanzando
los máximos valores a las 24 h de incubación, en presencia de sacarosa o lactosa (Figura
2.7A) donde FE y FI participaron en similar proporción en los niveles de FT. Lactosa (150
µM pABA), indujo incremento de los FE a las 6 h de cultivo con un máximo a las 10 h (82,5
± 4,5 µg/L) (Figura 2.7C), mientras que con sacarosa a las 8 h, los niveles de FE (53,9 ± 3,4
µg/L) fueron significativamente menores a los obtenidos con 10 µM pABA. En relación a los
FI, las mayores concentraciones se obtuvieron a las 24 h independientemente de la fuente de
carbono, determinándose los mayores valores en presencia de lactosa (10 µM pABA) y
sacarosa (150 µM pABA) (71,6 ± 4,6 y 71 ± 4 µg/L, respectivamente) (Figura 2.7E).
A diferencia de lo observado en CRL803, en S. macedonicus CRL415 la presencia de
10 o 150 µM pABA, y utilizando una misma fuente de carbono, no tuvo efecto sobre la
síntesis de FT y FE (Figuras 2.7B y D). Sin embargo, la variación de la fuente de carbono
modificó la capacidad del microorganismo para producir folatos. Los mayores niveles de FT y
FE se obtuvieron con sacarosa, determinándose un incremento (6,7 veces) de la concentración
a las 4 h de incubación y aumentando progresivamente hasta las 8 h con máximos valores de
FT (74,5 ± 4,5 µg/L) y FE (75,9 ± 3,1 µg/L). Similar cinética de producción de folatos se
observó con glucosa mientras que con lactosa, el aumento (aproximadamente 7 veces) de los
niveles de folatos fue visible a las 6 h.
En general, los FI fueron menores que los otros folatos obteniéndose valores entre 4,9
± 0,4 y 5,2 ± 0,5 µg/L para lactosa y sacarosa, respectivamente, independientemente de la
cantidad de pABA en el medio (Figura 2.7F). Por el contrario, en presencia de glucosa, las
diferencias en los niveles de FI fueron significativas usando 10 o 150 µM de pABA. Con 10
µM, los mayores valores de FI (10,1 ± 3,5 µg/L) se alcanzaron a las 4 h manteniéndose hasta
las 24 h, mientras que con 150 µM, se observaron a las 10 h y disminuyeron
significativamente con el tiempo de incubación.
En relación al crecimiento [DO, log (UFC/mL) y pH], S. thermophilus CRL803
mostró un comportamiento diferente al observado en la síntesis de la vitamina. En presencia
de sacarosa o glucosa y 10 µM de pABA, el desarrollo bacteriano fue similar (Figuras 2.8A,
C y E) durante todo el ensayo, mientras que con lactosa, fue más lento (Figuras 2.8A, C y E).

85
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

Sin embargo a las 24 h, independientemente del carbohidrato usado, los parámetros

alcanzaron valores similares. Una respuesta diferente se observó con 150 µM pABA. En
glucosa, la cepa CRL803 fue capaz de crecer rápidamente y alcanzar los mayores valores de
DO (2,8 ± 0,1) y log (UFC/mL) (8,3± 0,2) y menor pH a las 10 h de crecimiento (Figuras
2.8A, C y E). Si bien con sacarosa o lactosa el crecimiento fue menor, no se observaron
diferencias significativas entre los 2 azúcares en ninguno de los parámetros evaluados durante
todo el estudio (Figuras 2.8A, C y E).

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

A 180 B 180
160 160
Folatos totales (µg/L)

140 f 140
120 e d,e d,e e 120
100 100 d d d d d
80 c d d 80
60 b c,d c c 60
b c
40 40 b c
a b
20 a 20
a a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
C D
100 f 100
Folatos extracelulares (µg/L)

f f
f e e e e
80 f 80
d d e
60 d,e 60 d
d d e d d
e d
40 c 40 c
c
b b
20 b b 20
a a a
a a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
E F
100
Folatos intracelulares (µg/L)

100

80 80
d
60 60

40 c 40
b b
a
20 a a 20

0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

Glucosa (10 µM pABA) Sacarosa (10 µM pABA) Lactosa (10 µM pABA)

Glucosa (150 µM pABA) Sacarosa (150 µM pABA) Lactosa (150 µM pABA)

Figura 2.7. Producción de FT (A y B), FE (C y D) y FI (E y F) por S. thermophilus CRL803 y S.

macedonicus CRL415 en medio MQD-SF en presencia de glucosa, sacarosa o lactosa como única
fuente de carbono al 2% (p/v). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican
diferencia significativa (p<0,05).

86
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

Por su parte, S. macedonicus CRL415 (Figuras 2.8B, D y F) presentó un

comportamiento diferente respecto a CRL803. En cuanto a la DO, S. macedonicus CRL415
sólo presentó diferencias significativas entre los azúcares sin afectar las variaciones en la
concentración de pABA. La mayor DO se observó con glucosa (Figura 2.8B). En cambio, el
recuento de células viables fue similar en los carbohidratos evaluados con 10 o 150 µM de
pABA, durante todo el tiempo de incubación (Figura 2.8D) manteniéndose el número de
células viables hasta las 24 h.

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

A 5
B 5
d d d d
4 4
DO580

d e
d c
3 d 3
c c c
2 b 2 c
c b
1 a 1 a b
a a a
a
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
C 12
D 12
10 10
log (UFC/mL)

b b b
b
8 8
6 6
a a
4 4
2 2
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

E 8 F 8
7 a a 7
a
6 6
5 b 5
pH

c c c
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
0 4 6 8 10 12 24 0 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

Glucosa (10 µM pABA) Sacarosa (10 µM pABA) Lactosa (10 µM pABA)

Glucosa (150 µM pABA) Sacarosa (150 µM pABA) Lactosa (150 µM pABA)

Figura 2.8. Crecimiento [DO580 (A, B); log UFC/mL (C, D); pH (E, F)] de S. thermophilus CRL803 y
S. macedonicus CRL415 en medio MQD-SF en presencia de glucosa, sacarosa o lactosa como única
fuente de carbono al 2% (p/v). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican
diferencia significativa (p<0,05).

87
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

2.2.1.2. Efecto de la fuente de carbono en la capacidad de L. bulgaricus CRL871

para producir folatos

Previamente, se determinó que L. bulgaricus CRL871 en MQD-SF alcanzó una

adecuada densidad celular luego de 20 h de cultivo, en consecuencia las mediciones se
realizaron a las 24 h de incubación. Esta especie de lactobacilo no crece en sacarosa por lo
tanto la síntesis de los folatos fue evaluada en presencia de lactosa o glucosa y 10 o 150 µM
de pABA.
La cepa fue capaz de sintetizar y liberar folatos, en ambas fuentes de carbono
independiente de la concentración del precursor, siendo las concentraciones de folatos
significativamente menores a las producidas por los estreptococos (Figura 2.9).

A B
8 8
Folatos extracelulares (µg/L)
Folatos totales (µg/L)

7 a a 7
6 a 6
5 b 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
Glucosa (10 Lactosa (10 Glucosa Lactosa Glucosa Lactosa (10 Glucosa Lactosa
µM pABA) µM pABA) (150 µM (150 µM (10 µM µM pABA) (150 µM (150 µM
pABA) pABA) pABA) pABA) pABA)

C
Folatos intracelulares (µg/L)

8
7
6
5
4
3 b
2 b
1 a a
0
Glucosa (10 Lactosa (10 Glucosa Lactosa
µM pABA) µM pABA) (150 µM (150 µM
pABA) pABA)

Figura 2.9. Producción de FT (A), FE (B) y FI (C) por L. bulgaricus CRL871 en medio MQD-SF en
presencia de glucosa o lactosa como única fuente de carbono. Los resultados se expresan como la
media ± DE, letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

Además, la síntesis de folatos estuvo relacionada con el crecimiento bacteriano

(Figuras 2.10A, B y C). A las 24 h se observó que la densidad celular (Figura 2.10A) fue
mayor (6 veces) con glucosa respecto a lactosa, sin variaciones entre 10 y 150 µM de pABA

88
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

para cada azúcar. Sin embargo, los recuentos de microorganismos [log (UFC/mL)] (Figura
2.10B) no tuvieron diferencias significativas en ninguna de las condiciones evaluadas
indicando que ni la fuente de carbono ni las concentraciones de pABA afectaron la viabilidad
del microorganismo.
L. bulgaricus CRL871 acidificó el MQD-SF luego de 24 h de crecimiento,
obteniéndose un pH final de 4,51 ± 0,3 en glucosa, que fue significativamente menor respecto
a lactosa (5,8 ± 0,2), sin diferencias entre 10 y 150 µM de pABA (Figura 2.10C).

A 5 B 9
a a 8
4 7

log (UFC/mL)
DO580

6
3 5
2 4
3
1 b b 2
1
0 0
Glucosa (10 Lactosa (10 Glucosa Lactosa Glucosa Lactosa (10 Glucosa Lactosa
µM pABA) µM pABA) (150 µM (150 µM (10 µM µM pABA) (150 µM (150 µM
pABA) pABA) pABA) pABA) pABA)

C
7
b b
6
5 a a
4
pH

3
2
1
0
Glucosa (10 Lactosa (10 Glucosa Lactosa
µM pABA) µM pABA) (150 µM (150 µM
pABA) pABA)

Figura 2.10. Crecimiento [DO580 (A); log (UFC/mL) (B); pH (C)] de L. bulgaricus CRL871 en medio
MQD-SF en presencia de glucosa o lactosa como única fuente de carbono. Los resultados se expresan
como la media ± DE, letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

89
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

2.2.2 Discusión

La fuente de carbono es un factor determinante del crecimiento bacteriano debido a

que constituye la principal fuente de energía para la célula. Diversos autores estudiaron el
metabolismo de los hidratos de carbono en S. thermophilus (Hutkins et al., 1987), S.
macedonicus (De Vuyst et al., 2008) y L. bulgaricus (Kandler, 1983; van de Guchte et al.,
2006) en relación al crecimiento bacteriano. S. thermophilus (Dworkin et al., 2006) y S.
macedonicus son capaces de crecer sobre diferentes azúcares como lactosa y sacarosa, entre
otros, mientras que L. bulgaricus sólo puede fermentar glucosa, lactosa y fructosa (Dworkin
et al., 2006).
Considerando que sacarosa representa una fuente de carbono mucho más económica
que glucosa, y que lactosa es el carbohidrato presente en leche, los estudios de producción de
vitamina se llevaron a cabo usando sacarosa o lactosa como única fuente de carbono en
estreptococos, y glucosa o lactosa en L. bulgaricus. Además, los antecedentes sobre el efecto
de la fuente de carbono en la síntesis de folatos por BAL son muy escasos. Algunos estudios
fueron realizados en S. thermophilus (Mousavi et al., 2013) mientras que son inexistentes para
las especies S. macedonicus y L. bulgaricus. En este contexto, los estudios realizados
permitieron evaluar si los distintos carbohidratos, usados como única fuente de carbono,
tuvieron una acción positiva sobre la síntesis de folatos, y determinar si el efecto observado
fue por estimulación del crecimiento o por la síntesis propiamente dicha.
En presencia de glucosa o sacarosa y 10 µM de pABA, el crecimiento de S.
thermophilus CRL803 fue similar, contrariamente a lo observado cuando se incrementó la
concentración del precursor que influyó positivamente en la velocidad de crecimiento de la
cepa sólo en presencia de glucosa. Las diferencias en el desarrollo bacteriano según la fuente
de carbono, también fueron observadas en la síntesis tanto de FE como FI durante la
incubación, aunque los niveles de FT fueron similares al final del período. Estos resultados
sugieren que la síntesis de folatos estaría influenciada por el crecimiento microbiano,
específicamente la adaptación metabólica de las BAL a la fuente de carbono disponible; todo
ello determinaría la capacidad de las mismas para obtener la energía necesaria para sus
funciones metabólicas. S. thermophilus CRL803 produjo mayores valores de folatos y
crecimiento en presencia de sacarosa. Estos resultados difieren de los informados por
Mousavi et al. (2013), quienes determinaron mayor síntesis de folatos por S. thermophilus
BAA-250 usando lactosa (3 %). En nuestros estudios, diferentes concentraciones de cada

90
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

azúcar no modificaron los niveles de folatos sintetizados, razón por la cual se usó una
concentración final del 2 % (p/v). Más aún, en el trabajo de Mousavi et al. (2013), el efecto de
distintas concentraciones pABA (0-150 µM) fueron evaluadas usando lactosa 3%, no
observándose diferencias significativas en las concentraciones de folato obtenidas entre 10
µM y 150 µM pABA. Los resultados obtenidos evidenciaron que la síntesis de folatos por S.
thermophilus CRL803 fue dependiente de la concentración de pABA presente.
Además, en los ensayos realizados por Mousavi et al. (2013) se usó M17, como medio
de cultivo, el cual contiene extracto de levadura como fuente de nitrógeno constituyendo la
principal fuente de vitaminas del grupo B (incluyendo folatos); a diferencia del MQD-SF
usado en estos estudios. La composición del medio fue determinante para evaluar el efecto de
diferentes carbohidratos, como fuente de carbono, ya que afecta directamente la síntesis de
folatos.
S. macedonicus CRL415 presentó un comportamiento diferente al observado en S.
thermophilus CRL803. El crecimiento de la cepa CRL415, medido en función de la DO,
versus tiempo de incubación fue dependiente del tipo de azúcar usado como fuente de
carbono, pero no de la concentración del precursor. En cambio, los recuentos celulares [log
(UFC/mL)] fueron similares en todas las condiciones evaluadas durante el ensayo.
Las diferencias observadas entre turbidez (DO) y viabilidad celular [log (UFC/mL)]
ponen de manifiesto distintas capacidades de adaptación del microorganismo a las
condiciones de cultivo influyendo, de este modo, en la síntesis de folatos. Los mayores
niveles de FT se determinaron a las 24 h con 10 µM de pABA independiente del azúcar
presente, para una misma concentración del precursor. La cepa CRL415 creció en los distintos
azúcares lo que revela la adaptación de su sistema fermentativo para obtener la energía
necesaria para sus funciones sintéticas, siendo la síntesis de vitamina dependiente de factores
como la concentración de pABA.
A diferencia de S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415, los resultados
demostraron que cuando L. bulgaricus CRL871 creció en MQD-SF, independientemente de la
concentración de pABA y fuente de azúcar presente, fue capaz de sintetizar folatos de novo.
Estas concentraciones fueron significativamente bajas, indicando que la cepa solo produce
folatos en cantidades suficientes que permitan su crecimiento. Si bien, históricamente L.
bulgaricus fue considerada una especie consumidora de folatos, los resultados obtenidos
mostraron que la cepa CRL871 fue capaz de sintetizar folatos. Por ello resulta interesante
profundizar los estudios metabólicos en esta cepa a fin de conocer su comportamiento como
productora y consumidora de folatos.

91
Resultados Efecto de la fuente de carbono sobre la síntesis de folatos

2.2.3 Conclusiones parciales

La síntesis de folatos en S. thermophilus CRL803 fue dependiente del crecimiento y de

la capacidad de adaptación a la fuente de carbono disponible. Todo ello determinó su
actividad metabólica y por lo tanto la síntesis de folatos, la cual fue dependiente de la
concentración de pABA.
Por el contrario, en S. macedonicus CRL415, la fuente de carbono no tuvo influencia
en la viabilidad celular ni en la síntesis de folatos. Según el azúcar presente en el medio de
cultivo, la producción de folatos dependió de la concentración de pABA.
En L. bulgaricus, los azúcares tuvieron influencia en el crecimiento sin afectar la
síntesis de folatos.

92
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

Previamente, se determinó que las cepas seleccionadas fueron capaces de crecer en

MQD-SF y que la adición del precursor pABA y sacarosa, como fuente de carbono,
estimularon la síntesis de novo de folatos, siendo este efecto dependiente de cepa y en algunos
casos del crecimiento. Otros factores extrínsecos que pueden afectar la síntesis de vitamina
son el pH y la temperatura de incubación. No se conoce como estos parámetros influyen en la
producción de folatos. Para realizar estos estudios, fue necesario modificar la composición del
LAPTg (estreptococos) y MRS (lactobacilos). Ambos medios de cultivo contienen extracto de
levadura (fuente de vitaminas del grupo B) por lo tanto se eliminó de su composición y en el
MRS se redujo (75 %) la concentración de extracto de carne (folatos en baja concentración).
Los medios modificados se denominaron LAPTg-SL y MRS-SLC, respectivamente. S.
thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 fueron cultivados en LAPTg-SL y L.
bulgaricus CRL871 en MRS-SLC a pH no controlado y a pH controlados de 5,0 y 6,0 e
incubados a 37ºC y 42ºC.
Un factor muy importante a tener en cuenta en los estudios de producción de vitaminas
en medios complejos es evaluar, en nuestro caso la presencia de folatos. En ambos medios
modificados sin inocular se determinó la concentración de folatos presentes, la cual fue
sustraída de los valores de folatos medidos durante el ensayo a fin de obtener una mejor
aproximación de la cantidad absoluta de folatos producidos por el microorganismo.

2.3.1 Resultados

2.3.1.1. Efecto del pH y temperatura de incubación sobre la capacidad de S.

thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 para producir folatos

El comportamiento de S. thermophilus CRL803 para producir folatos durante 24 h a

pH 5,0 y 6,0 se muestra en las Figuras 2.11 y 2.12.
A 37ºC y pH controlado 5.0, la cepa presentó la mayor concentración de FT (Figura
2.11A) liberando elevada concentración de vitamina (FE) (Figura 2.11C) a las 8 h de
incubación (35,1 ± 2,1 y 28,4 ± 2,9 µg/L, respectivamente), a diferencia de los FI que
aumentaron durante todo el tiempo de incubación (13,7 ± 1,8 µg/L) (Figura 2.11E), aunque
los valores fueron significativamente menores que a pH libre. Sin embargo, el crecimiento fue
muy lento observándose aumento de 1 unidad log (Figura 2.12D) y de la turbidez (1,27 ±
0,14) (Figura 2.12B) a las 24 h.

93
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

A 280
B 280
d
240 240 d d d d
Folatos totales (µg/L)

200 d 200
d d
d c c
160 160 c c c c
120 c c c 120 b
c b b b b
80 b b 80 a b
a a a
40 a a a 40
a a
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
C D
180 180 d
Folatos extracelulares (µg/L)

d d d
160 160
d
140 140
120 120 c c c c c
d d d c
100 d 100
80 80 b b b
c b
60 c c 60 b b
c c c
40 b 40 a
b
20 b 20 a
a b b b
0 b 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
E F
120 120
Folatos intracelulares (µg/L)

100 d 100 d
d d
80 c,d d d
80 b,d
c b
b b,c
60 60
b b c c
c,e
40 40 e
a,b c
20 a a a
a a a 20 a a
a a
0
0
0 2 4 6 8 10 12 24
0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h)
Tiempo (h)
pH Libre pH 5,0 pH 6,0

Figura 2.11. Producción de FT, FE y FI por S. thermophilus CRL803 en LAPTg-SL a pH libre y

controlado a 37ºC (A, C y E) y 42ºC (B, D y F). Los resultados se expresan como la media ± DE,
letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

Una respuesta diferente se observó a pH controlado 6,0 y 37ºC, condición donde la

cepa fue capaz de sintetizar concentraciones de vitamina superiores que las encontradas a pH
controlado 5,0. Los mayores niveles de FE (98,2 ± 3,9 µg/L) (Figura 2.11C) se alcanzaron a
las 8 h, a diferencia de los FI (89,7 ± 1,3 µg/L) que fue a las 12 h (Figura 2.11E), mientras que
los FT (Figura 2.11A) permanecieron elevados entre las 8 y 12 h de incubación, siendo estos
valores 5 veces mayores que los medidos a pH controlado 5,0. La síntesis de folatos estuvo
ligada al crecimiento obteniéndose elevada DO (5,79 ± 0,37) a las 8 h (Figura 2.12B), siendo

94
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

5 veces mayor que a pH controlado 5,0 y 3 veces superior respecto a pH libre. Al igual que a
pH libre, el número de células viables incrementó en forma continua (µmáx = 1,13 h-1, g = 0,61
h) hasta las 8 h, con un máximo de 8,8 ± 0,2 log (UFC/mL) (Figura 2.12D).
En fermentaciones a pH libre, S. thermophilus CRL803 produjo a las 6 h, los mayores
valores de FE (50,1 ± 1,5 µg/L) y FT (95,1 ± 3,9 µg/L) (Figuras 2.11C y A, respectivamente),
mientras que la mayor producción de FI (58,8 ± 2,4 µg/L) fue a las 10 h de incubación (Figura
2.11E) coincidente con la mayor DO (1,8 ± 0,2) (Figura 2.12B), aunque el mayor recuento
microbiano se observó las 6 h [7,8 ± 0,2 log (UFC/mL)], con una µmáx = 0,91 h-1 y g= 0,76 h,
permaneciendo constante hasta el final del ensayo (Figura 2.12D).
S. thermophilus CRL803, incubado a 42ºC y pH controlado 6,0 o 5,0, sintetizó folatos
en concentraciones significativamente superiores que las determinadas a 37ºC (Figuras 2.11B,
D y F), con el máximo valor (entre 3 y 4 veces) a las 6 h de incubación. Respecto al
crecimiento, en ambos pH controlados, la DO incrementó pronunciadamente hasta las 8 h (5,4
± 0,4) (Figura 2.12C), aunque el mayor recuento de células viables se obtuvo a las 6 h [9,0 ±
0,4 y 7,9 ± 0,4 log (UFC/mL); µmáx= 1,95 h-1 y 1,6 h-1; g= 0,36 h y 0,43 h] a pH 6,0 y 5,0,
respectivamente (Figura 2.12E). A pH libre y 42ºC, los valores de FE fueron casi el doble de
los obtenidos a 37ºC, con un máximo (95,9 ± 2,1 µg/L) a las 12 h (Figura 2.11D); sin
embargo, los valores de FI disminuyeron con el tiempo de incubación (Figura 2.11F). Por lo
tanto los niveles de FT (Figura 2.11B) no tuvieron diferencias significativas entre ambas
temperaturas. Con respecto a la DO, a 42ºC el valor inicial se triplicó a las 2 h (0,3 ± 0,04)
alcanzando el máximo a las 6 h (1,5 ± 0,2) (Figura 2.12C), mientras que la mayor viabilidad
[7,7 ± 0,3 log (UFC/mL)], µmáx = 1,96 h-1 y g = 0,35 h, se observó a las 4 h (Figura 2.12E),
demostrando un crecimiento más rápido que a 37ºC.
El comportamiento de S. macedonicus CRL415 se muestra en las Figuras 2.13 y 2.14.
A 37ºC y pH controlado 5,0, la cepa sintetizó folatos más lentamente que S. thermophilus
CRL803 (Figura 2.11). Los mayores valores de FE (35,0 ± 2,2 µg/L) y FT (40,7 ± 2,6 µg/L)
se obtuvieron luego de 12 h (Figuras 2.13C y A, respectivamente) mientras que para los FI
(9,6 ± 0,9 µg/L) fue a las 24 h (Figura 2.13E), siendo estos valores (FT y FE) similares a los
obtenidos a pH libre. Sin embargo, el crecimiento, medido indirectamente por DO, evidenció
una fase de latencia de 8 h, incrementándose hasta las 24 h (4,1 ± 0,3) (Figura 2.14B). Por el
contrario, el recuento de células viables incrementó a partir de las 2 h con un máximo [8,1 ±
0,4 log (UFC/mL)] a las 10 h (Figura 2.14D).

95
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

A 7
6
5
4
3 37ºC

pH
2 42ºC
1
0
0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h)

B 8 C 8
f f f
7 c c c 7 f
c
6 6 e
e e e
DO580

5 5 e
4 4 d
3 b 3
a a a a c
2 2 c c c c
b
1 a 1 a
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

D 10 E 10 d
d c c
d,e e c c c
e c,e b
8 c 8
log (UFC/mL)

b e c c
b b b b
6 a a a a a 6 a a
a
4 4

2 2

0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
pH Libre pH 5,0 pH 6,0

Figura 2.12. Crecimiento [pH; DO580; log (UFC/mL)] de S. thermophilus CRL803 en LAPTg-SL a
pH libre y controlado a 37ºC (B, D) y 42ºC (C, E). Los resultados se expresan como la media ± DE,
letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

A pH controlado 6,0, S. macedonicus CRL415 sintetizó folatos (FE, FI y FT) en

concentraciones significativamente superiores que a pH controlado 5,0 y pH no controlado,
alcanzando los mayores valores de FE (66,5 ± 1,4 µg/L) y de FT y FI (32,7 ± 1,5 µg/L) en
menor tiempo de incubación (6 h) respecto a pH controlado 5,0 (12 y 24 h, respectivamente)
(Figuras 2.13C y E). El crecimiento celular, medido por turbidez, tuvo una fase de latencia de
2 h, diferente a lo observado a pH controlado 5,0 de 8 h, alcanzando los mayores valores de
DO a las 6 h (Figura 2.14B). El recuento celular no mostró una fase de latencia,

96
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

incrementando progresivamente hasta las 6 h [9,3 ± 0,3 log (UFC/mL), µmáx = 1,86 h-1 y g =
0,37 h] (Figura 2.14D).
A pH libre, S. macedonicus CRL415 aumentó paralelo al crecimiento los niveles de
folatos producidos, presentando las mayores concentraciones a las 10 h de crecimiento (FE=
27,6 ± 1,6 µg/L; FI= 6,4 ± 0,8 µg/L; FT= 33,9 ± 1,8 µg/L) (Figuras 2.13C, E y A,
respectivamente). Estos valores fueron comparables a los obtenidos por S. thermophilus
CRL803 a pH controlado 5,0. Según, las medidas de DO, hubo una pronunciada fase de
latencia (4 h), luego un crecimiento continuo y exponencial hasta las 8 h (1,9 ± 0,2), entrando
inmediatamente en fase estacionaria (Figura 2.14B). Contrariamente, la viabilidad celular
aumentó progresivamente hasta un máximo [8,4 ± 0,4 log (UFC/mL)] a las 6 h de incubación
(Figura 2.14D), con una µmáx = 2,5 h-1 y g = 0,3 h.
En esta cepa, el incremento de la temperatura de incubación a 42ºC produjo valores de
folatos (FT, FE y FI) significativamente superiores (Figuras 2.11B, D y F) a los obtenidos a
37ºC; mostrando un comportamiento similar al observado para S. thermophilus CRL803.
Con S. macedonicus CRL415, a pH controlado 5,0, los mayores valores de folatos
producidos se alcanzaron a las 10 h, donde los niveles de FE y los FI (Figuras 2.13D y F,
respectivamente) fueron 6 veces más elevados que a 37ºC. En consecuencia, los FT (Figura
2.13B) aumentaron 5 veces respecto a 37ºC (183,8 ± 12,5 µg/L) en ese tiempo de incubación,
manteniéndose constantes hasta las 24 h. El crecimiento [DO y log (UFC/mL)] durante las
primeras 12 h de incubación, fue similar a 37 y 42ºC. Sin embargo, con la extensión del
tiempo de incubación a 24 h, se observaron diferencias en la turbidez que fue menor (DO =
2,3 ± 0,2, aproximadamente 2 veces), respecto a 37ºC (4,1 ± 0,3) (Figura 2.14C) y en la
viabilidad celular que se redujo significativamente (6,5 ± 0,2 log) (Figura 2.14E), al igual que
la µmáx (0,89 h-1) y g (0,78 h).
La cepa presentó un comportamiento diferente a 42ºC a pH controlado 6,0 (Figuras
2.13B, D y F). Los folatos fueron sintetizados en menor tiempo de incubación que lo
encontrado a pH controlado 5,0. A las 8 h, se determinaron los mayores niveles de FE y a las
10 h de FI (Figuras 2.13D y F, respectivamente), los cuales fueron aproximadamente 3 veces
mayores que a 37ºC y superiores que a pH libre. La concentración de FT, por consiguiente,
fue mayor a las 8 h a 42ºC (Figura 2.13B), con niveles superiores a los determinados a pH
libre y representaron 2,5 veces más que lo sintetizado a 37ºC. El desarrollo bacteriano (Figura
2.14C), medido por absorbancia, alcanzó un máximo (5,4 ± 0,4) a las 8 h, aunque fue menor
que a 37ºC. Sin embargo, igual que a pH controlado 5,0, el recuento de microorganismo fue

97
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

menor (1 unidad log) que el determinado a 37ºC y a pH libre, donde el valor máximo fue 8,7
± 0,3 log, con una µmáx = 2,3 h-1 y g = 0,3 h a las 8 h de incubación (Figura 2.14E).

A 240
B 240 f
f f f
Folatos totales (µg/L)

200 200
c c
160 160 c
c c,e
120 c 120 c,e
d d
d d e
80 80 b b
b b b d
40 a 40
a
b b
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
C D a
200 200 a
f
Folatos extracelulares (µg/L)

f
160 160
c c c
120 120 c,f
e
c e e
80 c c 80 b
c c b
40 b 40 d
b a
a a
b b b
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
E F
50 50 c
Folatos intracelulares (µg/L)

c
40 b 40
b a
30 b,c 30 a a
a a
c c a
20 20
d d
10 a a a 10
a
a b
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
pH Libre pH 5,0 pH 6,0

Figura 2.13. Producción de FT, FE y FI por S. macedonicus CRL415 en LAPTg-SL a pH libre y

controlado a 37ºC (A, C y E) y 42ºC (B, D y F). Los resultados se expresan como la media ± DE,
letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

La cepa CRL415 desarrollada a pH libre e incubada a 42ºC fue capaz de producir

folatos en menor tiempo de incubación siendo los niveles de FE (Figura 2.13D) 12 veces más
elevados (122,2 ± 2,1 µg/L) a las 4 h de incubación respecto a lo encontrado a 37ºC. Estos
valores fueron constantes hasta las 8 h de crecimiento, disminuyendo recién al final de la
incubación. Este comportamiento no se observó a 37ºC. La producción de FI (Figura 2.13F)
tuvo una dinámica similar a la de FE. Por consiguiente, a las 4 h, se determinaron los mayores
98
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

niveles de FT (139,7 ± 2,7 µg/L) (Figura 2.13B), los cuales fueron aproximadamente 10 veces
superiores a pH libre y 42ºC que lo encontrado a 37ºC. El crecimiento celular, medido a
través de la DO (Figura 2.14C), fue mayor a la temperatura más alta, obteniéndose mayor
valor de DO (1,8 ± 0,2) a las 6 h de incubación. La viabilidad celular tuvo un comportamiento
similar a la DO, aunque el mayor valor se presentó a las 4 h de incubación a 42ºC (8,4 ± 0,3
log), con una µmáx = 1,5 h-1 y g = 0,5 h (Figuras 2.14E).

A 8
7 b
6
c a
5 a c,a a a
pH

4
a 37ºC
3 a,d d d d
2 42ºC
1
0
0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h)

B 8 C 8
7 7
6 b b b b 6 c
b c c c
DO580

5 a 5
b
4 4
3 a,d a 3 a a
a a a a a
2 a a 2 a
1 c 1
d
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

D 10 c E 10
c c c c c c c c c c
c
8 8
a b
log (UFC/mL)

a a b b
6 a a a 6 a
a d
b
4 4

2 2

0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tíempo (h) Tíempo (h)
pH Libre pH 5,0 pH 6,0

Figura 2.14. Crecimiento [pH; DO580; log (UFC/mL)] de S. macedonicus CRL415 en LAPTg-SL a pH
libre y controlado a 37ºC (B, D) y 42ºC (C, E). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras
distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

99
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

2.3.1.2. Determinación de la viabilidad en S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus

CRL415 mediante citometría de flujo

Los estudios anteriores determinaron que los estreptococos, cultivados a pH

controlado 6,0 e incubados a 42ºC durante 6 h, incrementaron significativamente los valores
de DO y la concentración de folato producido. El recuento de colonias [log (UFC/mL)]
también aumentó, pero no en la misma magnitud que la DO. Para investigar estas diferencias
en la medida de crecimiento, se decidió utilizar la citometría de flujo para evaluar la
viabilidad celular.
Los resultados se muestran en Tabla 2.1 y Figuras 2.15 y 2.16. La población celular de
S. thermophilus CRL803, incubado en las mencionadas condiciones de cultivo durante 6 h
estuvo constituida por un % de células vivas (93,7 ± 0,4 %) que fue significativamente mayor
respecto a pH libre (83,7 ± 2,3 %), siendo el % de células dañadas menor (4,1 ± 0,7 %) que el
obtenido a pH no controlado (15,8 ± 2,4 %). El porcentaje de células muertas fue muy bajo en
ambas condiciones [1,7 ± 0,3 % (pH controlado 6,0) y 0,2 ± 0,02 % (pH no controlado)]. La
extensión del tiempo de incubación, a pH controlado 6,0, no produjo cambios en las
poblaciones contrariamente a lo encontrado a pH libre donde la cantidad de células dañadas
incrementó a expensas de las células vivas a mayores tiempos de incubación.

A B C
Muertas Dañadas Dañadas Dañadas
Muertas Muertas

Vivas Vivas Vivas

D E F

Figura 2.15. Poblaciones celulares de S. thermophilus CRL803, desarrollado a pH controlado 6,0 a las
4 h (A, D), 6 h (B, E) y 8 h (C, F) de incubación a 42ºC determinado mediante citometría de flujo. En
D, E y F, células vivas (verde), dañadas (verde y rojo) y muertas (rojo). IP: ioduro de propidio; NT:
naranja de tiazol.
100
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

A B C
Dañadas Dañadas Dañadas
Muertas Muertas Muertas

Vivas
Vivas Vivas

D E F

Figura 2.16. Poblaciones celulares de S. thermophilus CRL803, desarrollado a pH no controlado a las

4 h (A, D), 6 h (B, E) y 8 h (C, F) de incubación a 42ºC determinado mediante citometría de flujo. En
D, E y F, células vivas (verde), dañadas (verde y rojo) y muertas (rojo). IP: ioduro de propidio; NT:
naranja de tiazol.

Tabla 2.1. Recuento de las poblaciones celulares de S. thermophilus CRL803 mediante citometría de
flujo. Porcentaje de células vivas, dañadas y muertas.

Vivas Dañadas Muertas

Hora
pH 6 pH L pH 6 pH L pH 6 pH L
0 96,1 ± 0,3ª 96,1 ± 0,2ª 2,6 ± 0,5ª 2,6 ± 0,3ª 0,7 ± 0,1 0,8 ± 0,1
4 95,2 ± 0,4ª 94,9 ± 0,6ª 3,2 ± 0,4ª 2,2 ± 0,8ª 1,2 ± 0,2 0,3 ± 0,1
6 93,7 ± 0,4ª 83,7 ± 2,3b 4,1 ± 0,7ª,b 15,8 ± 2,4c 1,7 ± 0,3 0,2 ± 0,08
8 93,7 ± 0,6ª 76,2 ± 4,4c 4,2 ± 0,8ª,b 23,3 ± 3,5c 1,6 ± 0,2 0,2 ± 0,07

Los resultados se expresan como la media ± DE. Entre 2 columnas, letras distintas indican diferencia
significativa (p<0,05).

S. macedonicus CRL415 presentó un comportamiento similar a S. thermophilus

CRL803 pero con mayores diferencias entre las poblaciones (Tabla 2.2). A pH 6,0, no se
observaron variaciones en la población de células vivas (94,6 ± 2,1 %) y dañadas (4,1 ± 0,9
%), a diferencia de lo observado a pH libre. En esta última condición, las células vivas
101
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

disminuyeron significativamente (50,4 ± 3,5 %) mientras que se incrementaron, en el mismo

orden, las células dañadas (43,2 ± 3,5 %) y muertas (5,9 ± 0,7 %). Luego de 8 h de incubación
y a pH controlado 6,0, se redujeron las células vivas (78,7 ± 2,8 %) y aumentaron las dañadas
(16,2 ± 1,9 %). A pH no controlado se observó un comportamiento similar, con marcada
disminución de células vivas (14,1 ± 2,2 %), y mayor incremento de la población de células
dañadas (62,3 ± 4,6 %) y muertas (23,2 ± 2,6 %).

A B C
Dañadas Dañadas Dañadas
Muertas Muertas Muertas

Vivas Vivas
Vivas

D E F

Figura 2.17. Poblaciones celulares de S. macedonicus CRL415, desarrollado a pH controlado 6,0 a las
4 h (A, D), 6 h (B, E) y 8 h (C, F) de incubación a 42ºC determinado mediante citometría de flujo. En
D, E y F, células vivas (verde), dañadas (verde y rojo) y muertas (rojo). IP: ioduro de propidio; NT:
naranja de tiazol.

102
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

A B C
Dañadas Dañadas Dañadas
Muertas Muertas Muertas

Vivas
Vivas Vivas

D E F

Figura 2.18. Poblaciones celulares de S. macedonicus CRL415, desarrollado a pH no controlado a las

4 h (A, D), 6 h (B, E) y 8 h (C, F) de incubación a 42ºC determinado mediante citometría de flujo. En
D, E y F, células vivas (verde), dañadas (verde y rojo) y muertas (rojo). IP: ioduro de propidio; NT:
naranja de tiazol.

Tabla 2.2. Recuento de las poblaciones celulares de S. macedonicus CRL415 mediante

citometría de flujo. Porcentaje de células vivas, dañadas y muertas.

Vivas Dañadas Muertas

Hora
pH 6 pH L pH 6 pH L pH 6 pH L
0 94,1 ± 0,6ª 94,2 ± 0,6ª 1,7 ± 0,2ª 1,7 ± 0,1ª 0,1 ± 0,01ª 0,08 ± 0,01
4 94,3 ± 4,1ª 95,4 ± 1,5ª 3,8 ± 0,8b 2,5 ± 0,5b 0,4 ± 0,1ª 1,4 ± 0,2b
6 94,6 ± 2,1ª 50,4 ± 3,5c 4,1 ± 0,9b 43,2 ± 3,5d 0,5 ± 0,1ª 5,9 ± 0,7c
8 78,7 ± 2,8b 14,1 ± 2,2d 16,2 ± 1,9c 62,3 ± 4,6e 0,95±0,1b 23,2 ± 2,6d

Los resultados se expresan como la media ± DE. Entre 2 columnas, letras distintas indican diferencia
significativa (p<0,05).

103
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

2.3.1.3 Influencia de las condiciones de cultivo (pH del medio y temperatura de

incubación) sobre la síntesis de folatos y crecimiento por L. bulgaricus CRL871

El comportamiento de L. bulgaricus CRL871 incubado a 37ºC y a pH controlado (5,0

y 6,0) y pH libre se muestra en la Figuras 2.19 y 2.20, respectivamente.
A pH controlado 5,0, la síntesis de folatos disminuyó en función del tiempo de
incubación (Figuras 2.19A, C y E), de manera similar a lo encontrado a pH libre. La baja
concentración de folatos no fue el resultado del consumo de la vitamina, sino a la falta de
crecimiento ya que la DO y el recuento de células viables [log (UFC/mL)] fue máximo (0,5 ±
0,1 y 7,0 ± 0,2 log, respectivamente) a las 24 h de incubación (Figuras 2.20B y D),
demostrando que la cepa no pudo crecer en estas condiciones de cultivo. Contrariamente, a
pH libre, la DO incrementó hasta las 24 h (2,1 ± 0,1), mientras que el número de células
viables, aumentó lentamente alcanzando fase estacionaria a las 8 h (7,3 ± 0,2 log) (Figura
2.20D), con una µmáx = 0,58 h-1 y g = 1,2 h.
Contrariamente a pH controlado 6,0, los niveles de FT (Figura 2.19A) aumentaron en
función del tiempo de incubación con valores máximos (67,4 ± 3,4 µg/L) a las 10 h. Los
elevados valores de FT resultaron del incremento de FE (Figura 2.19C), los cuales fueron
concomitantes con el crecimiento sostenido hasta las 10 h, con valores similares a los
alcanzados a pH libre (Figura 2.20B). Además el crecimiento de la cepa fue lento obteniendo
los mayores recuentos celulares (7,2 ± 0,3 log) a las 8 h, µmáx (0,68 h-1) y g (1,01 h) (Figura
2.20D).
A 42ºC, L. bulgaricus CRL871 tanto a pH controlado 5,0 como a pH libre, presentó
valores de folatos (Figuras 2.19D, F y B) similares a los medidos a 37ºC. En ambos pH, la
cepa sólo sintetizó folatos intracelulares en baja concentración (Figura 2.19F). Sin embargo,
el crecimiento medido por turbidez fue significativamente menor que a 37ºC, incrementando
el recuento celular en 1 unidad log a las 10 h (Figura 2.20E).
A pH controlado 6,0, tanto a 42ºC como a 37ºC, L. bulgaricus CRL871 incrementó la
concentración de FT y FE, sin detectarse niveles de FI (Figuras 2.19B, D y F). Este
comportamiento fue totalmente diferente al observado a pH libre y pH controlado 5,0.
Respecto al crecimiento, la máxima DO se observó a las 10 h de incubación (0,6 ± 0,03) a
42ºC (Figura 2.20C) aunque fue menor que a 37ºC. El recuento de células viables aumentó
(6,9 ± 0,2 log) a las 8 h (Figura 2.20E), de manera similar a lo observado a pH libre y pH
controlado 5,0.

104
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

La incubación de L. bulgaricus CRL871 a mayor temperatura (42ºC) en condiciones

de pH libre, no produjo cambios notables en su capacidad acidificante, donde el pH
disminuyó hasta 5,3 ± 0,2 (Figura 2.20A) mientras que a 37ºC los valores finales de pH
fueron de 4,5 ± 0,3 (Figura 2.20A).

A 80 B 80
f c
70 f 70 c
Folatos totales (µg/L)

f
60 e 60
d
50 50 b,d
b
40 d 40
30 30 a
20 c 20
b e
10 b b 10
a a
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
C D
80 e 80
Folatos extracelulares (µg/L)

d,e c
70 d 70 c
d
60 60 d d
50 c 50 b
40 40 a
30 b 30
20 20
a
10 10
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
E F
10 a 10
Folatos intracelulares (µg/L)

a
8 a 8
a a
6 a 6 a a
b
4 4 a,b
b
b b
b b b
2 2

0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
pH Libre pH 5,0 pH 6,0

Figura 2.19. Producción de FT, FE y FI por L. bulgaricus CRL871 en MRS-SLC a pH libre y

controlado a 37ºC (A, C y E) y 42ºC (B, D y F). Los resultados se expresan como la media ± DE,
letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

105
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

A 7
6 b b,d d
a d
a b
5 c
e e,f
4 f

pH
3 37ºC
2 42ºC
1
0
0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h)

B 2,5 C 2,5
f
2,0 e 2,0
d
DO580nm

1,5 d 1,5
c
1,0 c 1,0
b
b b b b
0,5 a a a 0,5 b
a a
a
a a b
a
0,0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

D 9 E 9
d d
8 c 8
b c a,b b b b
7 a 7 a
log (UFC/mL)

a c c a
6 a a 6
5 a a a 5 c
4 4
3 3 d
2 2
1 1
0 0
0 2 4 6 8 10 12 24 0 2 4 6 8 10 12 24
Tiempo (h) Tiempo (h)
pH Libre pH 5,0 pH 6,0

Figura 2.20. Crecimiento (pH; DO; log UFC/mL) de L. bulgaricus CRL871 en MRS-SLC a pH libre
y controlado a 37ºC (B, D) y 42ºC (C, E). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras
distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

106
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

2.3.2 Discusión

Numerosos trabajos (Antoniou et al., 1990; Degeest et al., 2002; Mousavi et al.,
2013), demuestran que las condiciones de cultivo, como temperatura de incubación y pH del
medio son factores que pueden influenciar el crecimiento de los microorganismos afectando
las funciones celulares como cambios en la actividad de las enzimas y procesos metabólicos,
induciendo una respuesta adaptativa dependiente del tipo y grado del estímulo al cual fue
sometido el microorganismo en estudio. En nuestros estudios, S. thermophilus CRL803 y S.
macedonicus CRL415 sintetizaron FT en concentraciones diferentes según el pH del medio y
fueron mayores a 42ºC, demostrando que la temperatura y el pH son factores extrínsecos que
afectan la síntesis de folatos. A pesar de las diferentes concentraciones de FT sintetizadas, el
comportamiento de las cepas fue similar observándose mayor síntesis de la vitamina a pH 6,0
que a pH libre. Estos resultados sugerirían que la elevada capacidad de producción de folatos
se debería a un mayor crecimiento de las cepas debido a la neutralización de la acidez del
medio, evitando así la inhibición del desarrollo bacteriano por acidificación del cultivo, como
fue observado a pH libre. Similares observaciones fueron reportadas por varios autores
(Gonçalves et al., 1997; Kashket, 1987; McDonald et al., 1990) quienes demostraron que la
producción de ácido láctico u otros ácidos lleva a una inhibición del crecimiento a través de
diferentes mecanismos. Esto estaría sustentado en los valores de DO que fueron superiores a
pH 6,0 que a pH no controlado, independientemente de la temperatura de incubación. En S.
thermophilus CRL803, la mayor turbidez del cultivo se observó a 42ºC mientras que para S.
macedonicus CRL415 fue 37ºC. En general, valores elevados de DO se relacionan con mayor
viabilidad celular y, en consecuencia, mayor cantidad de folatos sintetizados. Las mediciones
de turbidez determinadas para S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 sugerirían
elevados recuentos celulares. Sin embargo, a pH libre y pH 6,0, los recuentos de células
viables fueron similares posiblemente atribuible a cambios en la permeabilidad de la
membrana bacteriana como resultado de la acidez desarrollada lo que incrementaría la
población de células dañadas, siendo S. macedonicus CRL415 más sensible a este parámetro.
Contrariamente, el elevado % de células vivas determinadas en S. thermophilus CRL803 se
debería a una mayor resistencia a pH 6,0, favoreciendo su actividad metabólica y por lo tanto
su crecimiento y síntesis de vitamina. Sin embargo, bajo estas condiciones, las células pueden
a sufrir cambios que afectarían su capacidad de crecer en medios agarizados, es decir las
células viables tienen dificultades para desarrollar en medios de cultivos convencionales (de
laboratorio). A fin de determinar si la diferencia de turbidez observada a pH 6,0 y pH libre, se
107
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

debía a diferentes proporciones entre las poblaciones de células vivas y muertas, se determinó
la viabilidad celular en función del tiempo de incubación mediante citometría de flujo. Se usó
el ioduro de propidio (IP) como marcador de células muertas y naranja de tiazol (NT) de
células totales. Los resultados demostraron que la población de células muertas en S.
thermophilus CRL803 fue similar a la de S. macedonicus CRL415, aunque su magnitud no
permite explicar la diferencia encontrada entre los recuentos de colonias y la DO. Más aún,
casi todas las células fueron viables con bajo % de células dañadas. Estos resultados sugieren
que las células estaban en un estado denominado “viables no cultivables” (Byrd et al., 1991;
Fakruddin et al., 2013; Oliver, 2005; Oliver et al., 1991) es decir las células, aunque
mantienen su actividad metabólica, son incapaces de formar colonias en medio agarizado.
Este fenómeno es muy común cuando las bacterias son incubadas en condiciones de estrés o
cuando alcanzan densidades celulares elevadas en cortos tiempos de incubación (Andersson et
al., 1996). Este comportamiento se observó en ambos estreptococos a pH controlado 6,0
donde se incrementó marcadamente la masa celular en un breve período, mientras que el
recuento de colonias no aumentó de manera similar. Además, la elevada concentración de
vitamina sintetizada no solo fue debido al incremento de la cantidad de células, sino
posiblemente a una mayor actividad metabólica de las células. La mayoría de las enzimas
responsables de la síntesis de folatos tienen un pH óptimo de reacción cercano a la neutralidad
(Ballantine et al., 1994; Mathis et al., 1970; McGuire et al., 1984; Pongsamart et al., 1984;
Rao, 2000; Richey et al., 1969; Suzuki et al., 1979; Yoo et al., 1998) de manera que cambios
en el pH del medio afectarían las actividades enzimáticas. Diversos autores (Nannen et al.,
1991; O'Sullivan et al., 1997) indicaron que cambios de pH del medio podrían modificar el
pH intracelular. Se demostró que las bacterias, incluidas las BAL, tienen mecanismos de
regulación y control del pH intracelular en respuesta a modificaciones del pH extracelular
Así, el crecimiento de las BAL a pH libre resulta en una acidificación del medio extracelular
que lleva a la adaptación celular para permitir el crecimiento y síntesis de folatos durante un
determinado tiempo de incubación. En cambio, cuando las cepas crecen en un medio con un
pH controlado cercano al óptimo de las enzimas intracelulares, conduciría a una mayor
actividad enzimática, observándose estimulación del crecimiento y multiplicación celular.
Esta situación posibilita a las células que sinteticen más cantidad de folatos y consuman los
nutrientes del medio en mayor velocidad generando una situación de estrés, donde las células
mantienen su viabilidad pero no son capaces de formar colonias en medios agarizados.
Los estreptococos demostraron que en condiciones de pH controlado 6,0 y a 42ºC,
sintetizaron las mayores cantidades de FT, sugiriendo de esta manera que las enzimas

108
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

responsables de la síntesis de folatos poseen actividades elevadas cuando el pH extracelular se

mantiene constante, sin variaciones del pH intracelular, lo que estimularía la actividad
enzimática y el crecimiento. Además cabe destacar que este fenómeno de células viales no
cultivables sólo se observó en las cepas de esteptococos. De esta manera se estableció que las
condiciones óptimas para obtener elevada cantidad de células así como de folatos son pH 6,0,
temperatura de incubación 42ºC durante 6 h para S. thermophilus CRL803 y 8 h para S.
macedonicus CRL415.
L. bulgaricus CRL871, a diferencia de los estreptococos, no mostró cambios
significativos para un mismo pH y a 37 o 42ºC. Las diferencias se observaron entre las
distintas condiciones de pH evaluadas. A pH libre y pH controlado 5,0, la cepa se comportó
como consumidora de vitamina, mientras que fue productora de folatos a pH 6,0.
El pH del medio de cultivo tuvo marcada influencia en la capacidad de síntesis,
observándose inhibición a pH 5,0 y pH libre. Este comportamiento sugiere que, al igual que
los estreptococos, la variación del pH extracelular conduciría a una adaptación al medio
mostrando un fenotipo “consumidor de vitamina”. Por el contrario a pH 6,0 se favorecería la
actividad de las enzimas involucradas en la síntesis de folatos aunque el crecimiento fue
similar en ambas temperaturas de incubación.
La capacidad de L. bulgaricus CRL871 para producir folatos dependería tanto del
crecimiento como de su actividad metabólica.

109
Resultados Influencia de las condiciones de cultivo sobre la síntesis de folatos

2.3.3. Conclusiones parciales

La temperatura de incubación y el pH del medio de cultivo influyeron en la síntesis de

folatos. S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 presentaron los mayores niveles
de folatos producidos a 42ºC y pH controlado 6,0 como resultado del incremento en la
cantidad de células viables pero no cultivables, determinando mediante citometría de flujo.
L. bulgaricus CRL871 sólo sintetizó folatos a pH controlado 6,0, siendo la
temperatura un parámetro no determinante, ya que los valores de vitamina fueron similares a
las dos temperaturas ensayadas.

110
 Identif
ificacióón de loos geness involu
ucradoos en la
biiosíntessis de folatos
f y evalu
uación de
d su ex
expresióón
mediannte qRTT-PCR
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

3. Prospección de los genes implicados en la biosíntesis de folatos en las cepas

de bacterias lácticas seleccionadas

Con el objeto de profundizar los estudios en relación a la capacidad de síntesis de

folatos por las cepas seleccionadas de S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415, se
evaluó mediante qRT-PCR el grado de expresión relativa de los genes fol involucrados en la
síntesis de los folatos (Figura 3.1).

Figura 3.1. Representación esquemática de la biosíntesis de folatos por bacterias lácticas.

1: folE (GTP ciclohidrolasa I); 4: folQ/folB (Dihidroneopterina aldolasa); 5: folK
(dihidropteridinhidroximetil pirofosfokinasa); 8: folP (dihidropteroato sintetasa); 9: folC (dihidrofolato
sintetasa); 10: folA/dfrR (dihidrofolato reductasa).

3.1. Diseño de los cebadores específicos de los genes involucrados en la síntesis de

folatos

3.1.1. Resultados

Los cebadores diseñados (Materiales y métodos Tablas M2 y M3) se usaron en las

reacciones de PCR a fin de determinar la presencia de los genes fol en las cepas CRL803 y
CRL415, obteniéndose los correspondientes productos de amplificación (Figuras 3.2 y 3.3).

112
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

Marc. folE folQ folK folP folC1 folC2 folA gyrB

1kb

400
300
200
100

Figura 3.2. Geles de agarosa (2%) de los productos de amplificación empleando los cebadores
diseñados para los genes fol y gyrB de S. thermophilus CRL803.

Marc. folE folB folK folP folCA folCB dfrR gyrB

100bp

1000

400
300
200

100

Figura 3.3. Geles de agarosa (2%) de los productos de amplificación empleando los cebadores
diseñados para los genes fol y gyrB de S. macedonicus CRL415.

Los fragmentos obtenidos fueron purificados y secuenciados (Tablas 3.1 y 3.2).

113
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

Tabla 3.1. Secuencias genes fol de S. thermophilus CRL803.

Identidad Identidad
Genes fol Secuencias (nucleótidos) E E
Prot. (%)* Nucl. (%)**
GGACTATCAAAATTGGCACGTGCTGTTGAAGTGGCAGCCCGTCGTCCACAATTGCAA
GAACGTCTCACAGATCAAGTCGCTACAGCGCTTGAAGAAGCCCTTAATCCTCGAGGG
folE (GTP Ciclohidrolasa I) GTCTTTGTTATGGTGGAAGCTGAGCACATGTGTATGACTATGCGTGGTATTAAAAAAC 97 5e-48 99 9e-120
CAGGAAGTAAGACCATCACAACGGTTGCTAAAGGTATCTATAAAGAAGACCGTGAA
NAACNNAAGGA
GGCAAGTTTTTGTGGTAGATCTGGAGTTGGCTGTTGATTTGACCAGGGCTTCACAAAG
TGACAATCTAGCAGATACGGTTCATTATGGTTTAGTTTTTGAAGCCGTACAGAGACAG
folQ (Dihidroneopterin
GTGGAAGAAGAAAAGTATATTTTGATTGAGCGTTTAGCTGGTGCTATTTGTGAGGAC 99 5e-58 100 8e-141
aldolasa) TTGTTTGATCAATTTGTGCCAATCCAATCTATTAAAATTCGAATTACTAAAGAAAATC
CACCAATTAATGGGCACTATAGAAGTGTTGGAATTGAATT
CTCTTNTTNTGAGANGGCTGCTTGGGGNNTAACTGACCAGGCTGATTTTTTGAATCTC
GCTTTAGCACTTGACACTCAGTTGCCGGCTGAAAGCTTGCTGAGTGCTTGTCAGGCAA
TTGAGAAAGATTTAGACCGCGTTCGCCATGAGCATTGGGGCCCTCGAACTGTGGATA
TTGATATTCTTTTATATGGGCAGGAAATCTGGAGGACTGAGCACCTTAAAGTGCCTCA
folK (2-amino-4-hidroxi-6- TCCTCTCATGACTCAAAGGGCCTTTGTTTTGGTTCCTCTGCTANANNNNGCCGAGAAA
hydroximetildihidropteridin NNNNNAAACAAAGGCTTTNANTCATGAGAGGATGANGCACTTTAAGGTGCTCANTCC 93 2e-57 98 2e-136
difosfokinasa) TCCAGATTTCCTGCCCATATAAAAGAATATCAATATCCACAGTTCGAGGGCCCCAAT
GCTCATGGCGAANGCNNTCTANATCTTTCTCAATTGCCTGACANNCACTCAGCANCTT
TCANCCNNNNNCTGNNNNNNNANGTGCTAAAGCNANATTCAAAAAATCANCCTGGT
CANTTAATCCCCAAGCAGCCNTCTCATAATAANAGGNNNNTGCTTTAACTTCCNTCTC
AAGCANCGATCCAATGACT
GTTGAGCGTATGATTTCCCAAGGGGCTAGCATTATCGATGTANGNGGNGAATCTACA
AGACCNGGAGCGGANNNNGTAACCGAGGAAGANNANANTGCTCGTATAGTGCCAAT
folP (Dihidropteroato
TATACAAGCTATTAAGGAAAAATATGATGTTCTTATCAGTATTGATACTTACAAGACA 93 2e-34 95 5e-113
sintetasa) GCCACTGCCAGAGCTGCTCTTGAAGCAGGTGCAGATATTCTTAATGATGTCTGGGCA
GGACTTTATGATGGTCA
TGCTNTCATTGAAGCAGGGNNTGGGGGANAGCTTGATTCAACCAATNGTGCTTTCGC
CGGAGCTNNGNCATCTGCACTTCAATTAGCTTTGATCACACTGAAACTTNNGGGCGA
folC1 (Folilpoliglutamato
TAGCCTAATAGATATTGCTAGACATAAAGCGGGCGTCATGCGAGAAAACACTCCTAT 76 2e-33 96 2e-127
sintetasa) ATTACTCGGTCGCGTTTCTGAAGAAGTTTCACATCTCTTCAAACAAAAATCCCAAGAA
CTTCAGGCTCCTATAGCAAACATTGATCGAGAAATCCAGCTTC
GCGGTCTTGGGCAATACTCATGCTGAANTTGCTACAGAAAAGGCTGGTGTTTTAAAA
AATGGAGCATCTTTTATTTATGCGACTGACCGTACTGACGTTCGAGATGTTTTTAAAC
folC2 (Folilpoliglutamato
AGAAGGCGAATGAAGAAGGTTCTAAGACCTATGAGTTGGGTAAAGATTTCACCGCTG 98 1e-54 99 4e-139
sintetasa) AAGGGTCTAGCCATTCCTTTGATTTTATTTACAAGGAGCAGAGGTTGGAGGGTATAG
CCTTGGCTATGGCTGGTCAACATCAGGTGGCANATGCTAGTTTA
CACCATGCCGTGGCNCTTGCCTGCTGAACTGGCACATTTCAAGAAAACGACTATGGG
TTCAGCAATTCTTATGGGACGTGTGACCTTTGATGGCATGAACCGTCNTNGCCTCCCA
folA (Dihidrofolato
GGACGTGAAACCTTAATTCTAACACGAGACAAGGACTTCGACTGTGAGGAAGTAACG 97 2e-47 99 8e-136
reductasa) ACCGTTACGAGTGTTGAGGAAGCTCTAGCTTGGTTTGAACAGCAAGATAAGGATCTC
TATATTGCTGGTGGTGCTAGTGTCTACAAGGCNTTTTGATGGA
*Identidad con proteína expresada en %. ** Identidad con nucleótidos expresada en %.
114
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

Tabla 3.2. Secuencias de genes fol de S. macedonicus CRL415

Identidad Identidad
Genes fol Secuencias (nucleótidos) E E
Prot. (%)* Nucl. (%)**
ACCAAGAGNNGTTTTCAGGCTTAAATGAAGACCCAAAAGANCAATTTACAGCTGTTT
TTACAGAAAATCATGATGAAGTAGTTTTAGTTAAAGATATCCCATTTTATTCAATGTG
folE (GTP Ciclohidrolasa I) TGAACATCATTTGGTTCCCTTTTATGGAAAAGCTCATGTTGCTTATTTGCCAAGTGAC 98 5e-54 99 6e-127
GGTCGTGTGACTGGTTTGAGTAAGTTAGCGCGTGCCGTTGAAGTGGCTAGTAAACGT
CCGCAATTGCAAGAGCGTTTGA
GCTTGGTCAGANTTTTGTCGTTGANTGCACCTTGTCTGTTGATTTACAAAAAGCATCA
CAGTCTGATGTGCTAGAAGATACTGTTCATTATGGACTGGTTTTTGAAACGATAAAAA
folB (Dihidroneopterin
GACAAGTTGAAGAAGAACGCTACGCTTTAATTGAACGTTTGGCAGGAGCAATTTGTC 98 3e-59 99 5e-143
aldolasa) AAGATATTTTTGAACAATTTCCTCCAGTTCAAGCCATTAACATTAAGATTTTTAAAGA
AAATCCGCCAATCAATGGGCATTATGATGCGGTTGGTATTGAGTTANNAACGGG
CTTCTGTGACGTCGGTCTCTTCATTTTATGAAACAGCAGCATGGGGAAAGACAGACC
folK (2-amino-4-hidroxi-6- AAGATGATTTTTTGAATAGTTGTTGTGAGCTCGAGACAGATTTGACGCCGCAAGAATT
hidroximetildihidropteridin ATTACTTGCTTGTCAAAACATCGAAAAAGAGCTGAAGCGTGTTAGGCATGAACATTG 99 1e-52 99 2e-122
difosfokinasa) GGGACCTCGTACCATTGATATCGACATTCTGTTGTATGGTAATGAGACGATTGCTACT
GAAANNTTGAGC
TAAAACTGAACAGCACGGGCTGCCTTGGAAGCAGGTGCTGATATTTTAAATGACGTT
TGGGCTGGTCTTTATGACGGAAAAATGCTGGCGCTGGCAGCTGAGAAAAATGTTCCT
folP (Dihidropteroato
ATCATTTTGATGCATAATCAAGAGGAAGAAAAATACGATAATATCACTAAAGAAGTT 100 4e-57 99 1e-139
sintetasa) TGTGATTTTTTAACAGAACGTGCCCAAGCTGCTTTGGACTCAGGCGTTACGCTTGAAA
ATATTTGGATTGACCCAGGGTTTGGTTTTGCTAAAAACGAGGCACA
GCTNTCTACAACATATTTTTTCACTAGCTGGTTATGAGGTTGGAACATTTACCTCTCCT
TACNTNGTTGATTTTCGTGAACGTATTAGTTTAAACGGTCAAANGATTTCANAGACTG
folCA (Folilpoliglutamato
NTNNNCTNGACTTGNTNGANCGTGTTCGCCCAGTAGTGGAACGTTTGCCGCTTGAAA 92 3e-36 95 4e-124
sintetasa) CGACTTTAGAACCTGCGACAGAATTTGAAGTTATCACGGTCTTGATGTTTGAATATTT
TGGGCATATGCACCCTGTTGACATTGCTTTTATCG
GTCNCTGCTCTCATGTTTTATTATTTTGCAGTCATTAATCCCGTCGATATTGCGGTCAT
CGAAGCTGGGNTTGGTGGCACTTACGATTCAACCAATGTTTTCACAGCCAAAGCCGT
folCB (Folilpoliglutamato CATTTGCCCCTCAATCAGCATCGACCACCAAGAAACACTCGGTAATTCCCTAGCTGA
GATTGCCCAGCACAAAGCAGGTGTCTTAAAAACAAACGTTCCCTTTATTTTTGGAGA 97 4e-59 99 7e-147
sintetasa)
AATGGCAGAGCCCATTCGCCGCATTTTTTATCAGAAAGCCGAAGAGACAATNTCCAG
C
TTTTAACAAGAGANAAGTCCTTTGAGGCAGATGGTGTAACAATCGTTCATGACATGG
ATGAGGTTTTTGATTGGTTTGAAAAGCAGGATAAGACCCTTTATATCGTTGGTGGGGC
dfrR (Dihidrofolato
TAGTATCTATAAAGCTTTTCTACCGCATTGTGATGCTATTATTAAAACAACGGTTCAT 99 1e-52 99 5e-128
reductasa) GGTGTTTTTGAAGGTGATACGTATTTCCCAGACGTTGATTTGACAAGCTTTAGAAAAG
TGTCTGAAACCTTCAACGA
*Identidad con proteína expresada en %. ** Identidad con nucleótidos expresada en %.
115
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

Con las secuencias obtenidas previamente se diseñaron los cebadores específicos para
el estudio de la expresión de los genes fol y los genes de referencia recA y gyrB mediante
qRT-PCR (Materiales y métodos Tablas M4 y M5). Los productos de amplificación obtenidos
(Figuras 3.4 y 3.5) fueron secuenciados y confirmada su identidad.

gyrB recA folE folQ folK folP folC1 folC2 folA

Marc.
100bp

1000

400
300
200

100

Figura 3.4. Geles de agarosa (2%) de los productos de amplificación empleando los cebadores
diseñados para qRT-PCR de los genes fol, gyrB y recA de S. thermophilus CRL803.

Marc. recA folE folB folK folP folCA folCB dfrR

100bp

1000

400
300
200

100

Figura 3.5. Geles de agarosa (2%) de los productos de amplificación empleando los cebadores
diseñados para qRT-PCR de los genes fol y recA de S. macedonicus CRL415.

116
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

3.2. Estudio de expresión de los genes implicados en la síntesis de folatos mediante

qRT-PCR

Mediante qRT-PCR se midió la expresión relativa de los genes folE, folQ, folK, folP,
folA y folC respecto a los genes de referencia gyrB y recA, en condiciones óptimas (T= 42ºC y
pH controlado 6,0) respecto a la condición de referencia (T= 42ºC pH libre) (Figura 3.7 y
3.10). Los primeros 4 genes codifican las enzimas encargadas de la síntesis de novo de folatos
mientras que los 2 últimos (folA y folC) codifican las enzimas responsables de la reducción
(folA) junto con el alargamiento y acortamiento de las cadenas glutámicas (folC) de los folatos
captados del medio de cultivo y/o los sintetizados.

3.2.1. Resultados

3.2.1.1. Expresión génica en S. thermophilus CRL803

Para evaluar la variación de la expresión génica en el tiempo, se consideraron tres

momentos de incubación i) antes de la máxima concentración (4 h), ii) en el momento de
máxima concentración (6 h) y iii) posterior a la máxima concentración (10 h) que
correspondió a la fase estacionaria de crecimiento (Figura 3.6).

10
8
log (UFC/mL)

6
4 pH Libre
pH 6,0
2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)

Figura 3.6. Crecimiento [log (UFC/mL)] de S. thermophilus CRL803. Las flechas indican el tiempo
de crecimiento de toma de muestra para el estudio de expresión por qRT-PCR.

Los resultados mostraron que, a las 4 h de crecimiento (fase log de crecimiento), no se

observaron modificaciones significativas en la expresión de ninguno de los genes evaluados
(Figura 3.8). Por el contrario, a las 6 h (pico de síntesis de folatos) hubo un incremento

117
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

significativo de la expresión de los genes que participan en la síntesis de novo de los folatos
con una mayor expresión en folE (GTP ciclohidrolasa I) y folK (pirofosfokinasa), y sin
cambios en los genes folA (dihidrofolato reductasa) y folC (folilpoliglutamato sintetasa)
(Figura 3.8) a pH controlado 6,0 respecto a pH libre.
A las 10 h (fase estacionaria) de crecimiento, se observó disminución en la expresión
de todos los genes, excepto el folP (dihidropteroato sintetasa) (Figura 3.8).

B C

Figura 3.7. Estudio de la expresión de genes fol a pH controlado 6,0 vs pH libre de S. thermophilus
CRL803. A) Curva de amplificación (Intensidad de fluorescencia vs Ciclos de amplificación CT) a las
6 h de los genes fol indicando la diferencia de expresión de cada gen representada por sus
correspondientes CT; B) Gráfico de picos de curva de Melting [-d(RFU)/dT vs Temperatura (ºC)] de
cada par de cebadores empleados, demostrando la ausencia tanto de dímeros de cebadores como de
amplificaciones inespecíficas; C) Curva de Melting [Intensidad de fluorescencia vs Temperatura (ºC)];

118
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

5
b

Cambio de expresión
pH 6,0 vs pH libre
4 b b
3 b

(2-ΔΔCT)
4h
2 c
6h
c c b
a a
a a
a
10 h
1 a a
a
0
folE folQ folK folP folC1 folC2 folA

Figura 3.8. Evaluación de la expresión de genes fol a pH controlado 6,0 vs pH libre de S.

thermophilus CRL803, medida como Cambios de expresión (fold changes) de genes fol. Los
resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

Estos resultados son coincidentes con el incremento en el recuento de células viables

durante la fase exponencial de crecimiento y su disminución en fase estacionaria (Figura 3.6).

3.2.1.2. Expresión génica en S. macedonicus CRL415

En S. macedonicus CRL415, el incremento significativo de la expresión de todos los

genes evaluados, tanto los que participan de la síntesis de novo como los responsables de la
reducción de los folatos y de la elongación de la cadena poliglutámica (dfrR y folC,
respectivamente) (Figura 3.11), se observó a las 8 h, coincidente con la máxima síntesis de la
vitamina. En cambio a las 10 h (fase estacionaria), sólo se observó disminución de la
expresión de folE (GTP ciclohidrolasa I) y folQ (dihidroneopterin aldolasa) (enzimas iniciales
en la síntesis de novo), pero fue significativamente superior respecto a pH libre (Figura 3.11).

119
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

10
8

log (UFC/mL)
6
pH Libre
4
pH 6,0
2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
Figura 3.9. Crecimiento [log (UFC/mL)] de S. macedonicus CRL415. Las flechas indican el tiempo
de crecimiento de toma de muestra para el estudio de expresión por qRT-PCR.

B C

Figura 3.10. Estudio de la expresión de genes fol a pH controlado 6,0 vs pH libre en S. macedonicus
CRL415. A) Curva de amplificación (Intensidad de fluorescencia vs Ciclos de amplificación CT) a las
8 h de los genes fol indicando la diferencia de expresión de cada gen representada por sus
correspondientes CT; B) Gráfico de picos de curva de Melting [-d(RFU)/dT vs Temperatura (ºC)] de
cada par de cebadores empleados, demostrando la ausencia tanto de dímeros de cebadores como de
amplificaciones inespecíficas; C) Curva de Melting [Intensidad de fluorescencia vs Temperatura (ºC)].

120
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

12
b

Cambio de expresión
10

pH 6,0 vs pH libre
8 b

(2-ΔΔCT)
b 6h
6 b b
c
b
8h
4 a a a a a
b
a a a 10 h
a a
2 c a

0
folE folQ folB folP folC1folC2 dfrR

Figura 3.11. Evaluación de la expresión de genes fol a pH controlado 6,0 vs pH libre de S.

macedonicus CRL415, medida como Cambios de expresión (fold changes) de genes fol. Los
resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05)

En esta cepa, si bien se observó un incremento de la síntesis de ARNm de todos los

genes el recuento de colonias no fue superior a pH 6,0 respecto a la condición de referencia,
como ocurrió con S. thermophilus CRL803. De esta manera, la expresión de los genes y la
síntesis de vitamina por S. macedonicus CRL415 se relacionaría con la actividad metabólica
independiente de la cantidad de bacterias.

121
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

3.3. Discusión

La producción de folatos es una característica de cada microorganismo. Numerosos

investigadores han demostrado que, en S. thermophilus, la síntesis de folatos es común entre
integrantes de esta especie (Iyer et al., 2009a; Mousavi et al., 2013). Las cepas de S.
thermophilus, cuyos genomas fueron publicados, poseen todos los genes de la biosíntesis de
novo de folatos y de su precursor inmediato pABA, por lo que es común encontrar cepas
productoras de folatos, siendo más interesante la capacidad del microorganismo de
incrementar los niveles de esta vitamina en aquellos sustratos que contienen folatos como es
la leche. De esta manera, los productos fermentados, como yogur y leches fermentadas,
poseen niveles de folatos superiores a los encontrados en leche, debido a la síntesis
microbiana.
Streptococcus macedonicus, bacteria láctica aislada inicialmente de queso griego
(Tsakalidou et al., 1998), al igual que S. thermophilus, posee todos los genes de la síntesis de
folatos y del precursor pABA, como puede observarse en el genoma publicado
correspondiente a la cepa S. macedonicus ACA-DC194 (Papadimitriou et al., 2012). Teniendo
en cuenta que ambas cepas seleccionadas poseen todos los genes necesarios para la síntesis de
folatos y su capacidad de crecer y sintetizar la vitamina de novo, se evaluó la expresión
relativa de los genes fol en las condiciones óptimas (pH 6,0 y 42ºC) respecto a la condición de
referencia (pH libre y 42ºC) en función del tiempo.
El análisis de la expresión génica en S. thermophilus CRL803 mostró que 2 h antes de
alcanzar la mayor producción de folatos no se observó incremento significativo en los niveles
de ARNm de las muestras en ambas condiciones. Sin embargo, la mayor expresión de los
genes de la síntesis de novo (folE, folQ, folK y folP) se observó a las 6 h de cultivo, lo que se
reflejó en la mayor concentración de folatos sintetizada. Estos resultados sugieren que el
mayor crecimiento del microorganismo, logrado en condiciones de cultivo óptimas, resultó en
un incremento de los niveles de ARNm lo que llevaría a un aumento en la síntesis de enzima
y mayor actividad enzimática por efecto del pH. Este hecho resultó en una mayor producción
de folatos de novo con la consecuente liberación al medio extracelular, mientras que la
acumulación de la vitamina se debería a un aumento de la actividad enzimática. No se
observó mayor nivel de ARNm de los genes folA y folC, en relación a las condiciones de
referencia (pH libre). De allí que, el aumento de la expresión de los genes de síntesis de novo
está correlacionado con el aumento de la actividad metabólica en las condiciones óptimas. En

122
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

fase estacionaria, la expresión de los genes disminuyó, a excepción del folP, responsable de la
enzima dihidropteroato sintetasa que cataliza la síntesis de dihidropteroato (producto de la
condensación de pABA con 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7,8-dihidropteridina,
proveniente del GTP). Estos resultados se deberían a que la expresión de este gen permaneció
elevada debido a su actividad metabólica y su viabilidad permitiendo la síntesis de vitamina
aun cuando el crecimiento y/o la división celular cesaron, evidenciado por la disminución en
el recuento de colonias.
En S. macedonicus CRL415, a diferencia de S. thermophilus, los niveles de ARNm de
los genes folE, folB y folK aumentaron significativamente 2 h antes del pico de síntesis de
vitamina. A las 8 h de crecimiento, que corresponde a la máxima concentración de folatos, (se
determinó la mayor expresión de todos los genes fol evaluados, que fue superior (2-3 veces)
en relación a S. thermophilus CRL803. Sin embargo, a las 10 h de crecimiento la expresión de
todos los genes fol evaluados disminuyeron excepto folP y dfrR. Estos estudios confirman que
el incremento en la concentración de folatos a pH 6,0 se debe al aumento de la expresión de
los genes fol, lo que conduciría a una mayor síntesis de estas enzimas y posterior actividad
biosintética.
El marcado incremento en la expresión de los genes respecto a la condición de
referencia coincide con el aumento de la DO registrado en los mismos tiempos. Estos
resultados y los del estudio de viabilidad celular por citometría de flujo y recuento de
UFC/mL permiten afirmar que las células son viables y se encuentran en un estado
metabólico altamente estimulado en estas condiciones óptimas pero que no son cultivables, es
decir no forman colonias en medio agarizado, pero si crecen en medio líquido.
Los resultados obtenidos son similares a los reportados por otros autores quienes
demostraron un significativo aumento en la expresión de genes considerados de referencia
(16S rRNA, gyrB, ldhL, groES, rpoB) (Marco et al., 2008) cuando L. plantarum crece en
condiciones óptimas respecto a situaciones de falta de nutrientes, o bien cuando la bacteria se
encuentra en un ambiente hostil como es el tracto gastrointestinal (Marco et al., 2007).
Hasta el momento no se han realizado estudios sobre la expresión de genes fol y su
relación con la síntesis de folatos en Streptococcus. Si bien estos resultados demuestran
diferencias en el grado de expresión de los genes fol entre S. thermophilus y S. macedonicus,
ambas especies mostraron un patrón de expresión similar: aumento significativo de la
expresión génica en el momento de mayor síntesis de vitamina con posterior disminución.
Estos resultados coinciden con los observados en Lc. lactis (Hugenholtz et al., 2002a;
Sybesma et al., 2003b) donde se demostró que sólo es necesario sobreexpresar los genes folK

123
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

y folE para incrementar la síntesis de folatos. Más aun, la sobreexpresión de otros genes como
son los que codifican para la síntesis de pABA no resultó en un aumento de la concentración
de folato si no se sobreexpresan simultáneamente los genes folK y folE.

124
Resultados Expresión de genes fol en bacterias productoras de folato

3.4. Conclusiones parciales

La mayor expresión de los genes fol en S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus

CRL415 fue concomitante con la máxima concentración de vitamina producida. En S.
thermophilus CRL803, bajo condiciones óptimas de fermentación (pH 6,0 y 42ºC), a las 6 h
de incubación, los niveles de expresión de los genes de la síntesis de novo (folE, folQ, folK y
folP) fueron mayores (2-3 veces) respecto a las condiciones de referencia; contrariamente, en
fase estacionaria disminuyó la expresión de la mayoría de los genes fol, excepto de folP.
En S. macedonicus CRL415 los niveles de expresión fueron significativamente
superiores comparados a S. thermophilus CRL803 coincidiendo con el aumento de síntesis de
vitamina y actividad metabólica.

125
Estu
udioss tecn
nológ
gicos
y funncion
nales
Diseño de un prooducto lácteo fermen
f ntado
bio
o-enriquuecido en fola
atos
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.1. Diseño de un producto fermentado naturalmente bio-enriquecido en

folatos

Con el objeto de determinar las condiciones óptimas para diseñar un producto lácteo
fermentado naturalmente bio-enriquecido en folatos, se evaluó la producción de la vitamina
en leche fermentada con las cepas S. thermophilus CRL803, S. macedonicus CRL415, L.
bulgaricus CRL863, CRL871 y CRL872. L. bulgaricus CRL872 y CRL863 se incluyeron
porque fueron capaces de sintetizar elevadas concentraciones de folatos en medio FACM. Los
microorganismos fueron usados como cultivos iniciadores monovalentes y polivalentes
incubados a 37ºC y 42ºC durante 24 h, de acuerdo al esquema 4.1. La incorporación de las
cepas CRL872 y CRL863 fue para determinar si mantenían su fenotipo productor y cual
combinación de cepas incrementaba los niveles de folatos en el producto final.

Esquema 4.1. Representación gráfica de la preparación de leches fermentadas empleando cultivos

simples y polivalentes de las cepas seleccionadas.

128
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.1.1. Resultados

4.1.1.1. Evaluación de la síntesis de folatos en leche por cultivos simples

Los resultados demostraron que cuando las cepas crecieron individualmente en leche a
37ºC, L. bulgaricus CRL863 fue la única cepa de lactobacilo que incrementó los niveles de
folatos (Figura 4.1A) a las 24 h. Los otros 2 lactobacilos (CRL871 y CRL872) no modificaron
la concentración de folatos (Figura 4.1A). En el caso de S. thermophilus CRL803, los niveles
de folatos se incrementaron significativamente un 32% y 39,5% a las 6 y 24 h
respectivamente, mientras que S. macedonicus CRL415 sintetizó la vitamina a las 6 h
representando un incremento de 29%, que se mantuvo hasta el final del experimento (Figura
4.1A).

A 80 B 80

60 60
Folatos (µg/L)
Folatos (µg/L)

40 40

20 20

0 0
0 6 8 24 0 6 8 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

L. bulgaricus CRL863 L. bulgaricus CRL871 L. bulgaricus CRL872

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

Figura 4.1. Concentración de folatos en leche fermentada (µg/L) a 37ºC (A) y 42ºC (B). Los
resultados se expresan como la media ± DE.

A 42ºC, L. bulgaricus CRL863 inoculado en leche tuvo un comportamiento diferente

comparado a 37ºC. El incremento de la temperatura produjo un aumento de la concentración
de folatos (más del 78%) a las 6 h de fermentación comparado al inicio de la fermentación
(t=0), disminuyendo luego a las 24 h de fermentación (Figura 4.1B). En el caso de las otras
cepas de lactobacilos, los niveles de vitamina disminuyeron ligeramente a las 6 h
manteniéndose hasta las 24 h. S. thermophilus CRL803 incrementó un 99% la concentración
de folatos a las 8 h siendo a las 24 h 175% mayor, mientras que S. macedonicus CRL415 a las

129
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

6 h de fermentación, incrementó la vitamina 137%, manteniéndose hasta las 24 h de

incubación (Figura 4.1B).

A B
7 a a 7 a
a a
6 6 c
5 b 5
b b

pH
4 4
pH

b b
3 c 3 b
2 2
1 1
0 0
0 6 8 24 0 6 8 24
Tiempo (h) Tiempo (h)

L. bulgaricus CRL863 L. bulgaricus CRL871 L. bulgaricus CRL872

S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

Figura 4.2. Acidificación (pH) en leche fermentada a 37ºC (A) y 42ºC (B). Los resultados se expresan
como la media ± DE, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

Tanto a 37ºC como a 42ºC, L. bulgaricus CRL863 disminuyó el pH (ΔpH= 1,3

unidades) a las 6 h coagulando la leche, aunque el pH más bajo (3,8 ±0,1) se alcanzó a las 24
h de incubación en ambas temperaturas. Las otras cepas (CRL871 y CRL872) mostraron
menores velocidades de acidificación respecto a la cepa CRL863 (Figura 4.2).
S. thermophilus CRL803 tuvo similar comportamiento que la cepa CRL863
alcanzando el menor valor (3,9 ± 0,2) a las 24 h en ambas temperaturas (Figura 4.2). Aun
cuando S. macedonicus CRL415 mostró un comportamiento similar en ambas temperaturas,
fue más acidificante a 42ºC con valores de 4,8 ± 0,2 a las 6 h de incubación.

4.1.1.2. Evaluación de la síntesis de folatos en leche por cultivos polivalentes

Previo al empleo de cultivos polivalentes, se evaluó la compatibilidad entre las

diferentes cepas, empleando el sobrenadante de cultivo de cada una de ellas mediante el
método de difusión en agar. Los resultados demostraron que todas las cepas fueron
compatibles entre sí, dada la ausencia de halos de inhibición de crecimiento en las diferentes
pruebas.

130
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

El comportamiento de las combinaciones fue diferente al observado con los cultivos

individuales a 37ºC y 42ºC, dependiendo de las cepas y de la relación coco:bacilo. Se
evaluaron en total 17 combinaciones de cepas (Tabla 4.1).
De acuerdo a los valores de folatos medidos, se determinó el tiempo y la temperatura
óptima de incubación. La menor concentración de folatos fue obtenida con la combinación
CRL863-872-415 tanto a 37ºC como 42ºC luego de 6 h de fermentación (Tabla 4.1). A 37ºC,
la mayor concentración de folatos se obtuvo con la combinación CRL863-872-803-415 luego
de 8 h de fermentación (Tabla 4.1), mientras que a 42ºC fue la combinación CRL871-803-415
luego de 6 h (Tabla 4.1).
Con respecto a la acidificación, se observó que tanto a 37ºC como a 42ºC, sólo 7 de las
17 combinaciones no modificaron el pH luego de 6 h de fermentación. Sin embargo, a las 24
h de incubación la mayoría de las combinaciones disminuyeron el pH a un valor próximo a 4
unidades (Tabla 4.2).
Se seleccionaron las combinaciones I, N, O, P, Q y R, debido a que fueron las
combinaciones que presentaron concentraciones de vitamina superiores a 70 µg/L a las 6 h y
por la estabilidad del fenotipo productor, y se establecieron las condiciones óptimas de
fermentación para obtener la mayor concentración de folatos (42ºC, 6 h de incubación).

131
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

Tabla 4.1. Concentración de folatos (µg/L) en leche fermentada a 37ºC y 42ºC

37ºC 42ºC
Combinación
0 h* 6h 8h 24 h 0h 6h 8h 24 h
a a a a a
CRL863-803 (A) 47,2 (1,4) 80,7 (0,1) 75,4 (0,4) 64,5 (1,8)a 23,2 (1,4) 66,1 (1,1) 62,7 (0,4) 78,1 (1,8)
b
CRL863-415 (B) 52,4 (0,7) 53,5 (0,9) 54,3 (1,1) 43,9 (0,6) 40,3 (0,7) 39,4 (0,9) 49,2 (1,1) 60,3 (1,1)
b a a
CRL803-415 (C) 53,7 (1,7) 66,6 (0,7) 74,3 (1,2) 65,9 (0,4)a 37,2 (1,7) 51,3 (0,7) 50,7 (1,5) 70,5 (0,4)
CRL871-872 (D) 44,7 (0,3) 33,3 (1,3) 49,3 (0,3) 57,7 (0,8) 46,1 (0,4) 41,4 (0,3) 39,6 (0,6) 42,1 (0,3)
b a b b a
CRL871-803 (E) 51,9 (1,1) 60,7 (0,2) 78,2 (1,5) 60,2 (0,2)a 55,4 (1,1) 74,6 (9,8) 89,3 (12,2) 79,9 (7,4)
a
CRL871-415 (F) 51,2 (0,3) 57,6 (0,6) 70,1 (2,6) 56,5 (0,9) 44,5 (0,7) 38,2 (0,7) 49,1 (0,7) 41,6 (0,6)
b b b
CRL872-803 (G) 51,8 (0,2) 51,1 (0,8) 58,1 (0,2) 57,2 (0,8) 44,8 (1,1) 74,4 (6,9) 78,3 (8,5) 63,1 (4,3)
a
CRL872-415 (H) 49,5 (0,2) 54,2 (0,2) 45,7 (0,5) 60,6 (0,5)a 45,1 (0,7) 46,9 (0,3) 61,8 (1,3) 42,4 (0,3)
b a c b a
CRL863-803-415 (I) 58,2 (0,9) 69,3 (1,1) 76,7 (0,6) 65,3 (0,9)a 33,8 (0,9) 96,5 (1,1) 81,7 (0,6) 76,7 (0,9)
CRL863-871-803 (J) 49,6 (1,4) 99,3 (18,8) 88,4 (14,6) 107,3 (19,4) 49,6 (1,4) 93,8 (22,8) 101,2 (21,2) 101,2 (22,7)
a
CRL863-871-415 (K) 49,3 (2,9) 43,5 (1,5) 24,6 (1,7) 32,4 (0,7) 49,3 (2,9) 31,1 (1,5) 63,8 (1,7) 23,2 (0,7)
b b a
CRL863-872-803 (L) 51,7 (2,3) 64,1 (1,8) 93,9 (1,7) 95,5 (0,9)c 51,7 (2,3) 35,5 (1,8) 25,4 (1,6) 83,3 (1,1)
CRL863-872-415 (M) 54,7 (2,7) 18,4 (0,5) 22,5 (0,5) 26,9 (0,9) 54,7 (2,7) 14,5 (0,5) 16,3 (0,5) 26,4 (0,9)
a d c c
CRL871-803-415 (N) 51,9 (0,6) 84,1 (0,8) 54,3 (1,1) 61,4 (0,8) 50,9 (1,3) 107,3 (3,6) 108,3 (2,1) 110,6 (1,3)
a c
CRL872-803-415 (O) 54,3 (0,2) 82,2 (0,2) 61,6 (0,1) 69,3 (0,2) 46,8 (1,6) 88,4 (0,6) 50,7 (0,6) 39,3 (0,5)
c b d b c
CRL863-871-803-415 (P) 53,7 (1,3) 90,3 (2,9) 98,1 (0,9) 102,1 (2,3)b 53,7 (0,7) 102,2 (1,6) 93,4 (1,1) 96,7 (0,4)
c b
CRL863-872-803-415 (Q) 49,9 (1,6) 55,1 (0,6) 104,9 (2,6) 95,1 (1,1)c 49,9 (0,5) 77,1 (0,7) 62,9 (0,4) 63,5 (0,4)
a b d b a
CRL871-872-803-415 (R) 48,6 (2,4) 75,6 (4,5) 80,2 (2,6) 70,2 (1,8)a 46,5 (2,1) 98,8 (2,8) 90,1 (1,5) 84,5 (1,9)
Leche (S) 47,4 (0,4) 45,1 (0,3) 42,1 (0,5) 48,1 (0,4) 50,1 (2,4) 48,7 (1,2) 32,9 (0,7) 28,4 (0,3)

*El tiempo se expresa en hora (h). Los resultados se expresan como la media (DE). En una misma columna y entre temperaturas para el mismo tiempo, letras
distintas indican diferencias significativas (p<0,05).
132
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

Tabla 4.2. Acidificación (pH) en leche fermentada a 37ºC y 42ºC

37ºC 42ºC
Combinaciones
0 h* 6h 8h 24 h 0h 6h 8h 24 h
CRL863-803 (A) 6,6 (0,2) 4,9 (0,2) 4,7 (0,3) 3,7 (0,2) 6,5 (0,3) 4,2 (0,2) 3,9 (0,3) 3,6 (0,2)
CRL863-415 (B) 6,6 (0,1) 5,2 (0,2) 5,1 (0,1) 3,7 (0,3) 6,5 (0,2) 4,8 (0,1) 4,4 (0,1) 3,8 (0,1)
CRL803-415 (C) 6,6 (0,3) 5,3 (0,1) 5,1 (0,2) 4,2 (0,3) 6,5 (0,2) 4,7 (0,2) 4,4 (0,1) 4,1 (0,1)
a a a a a a
CRL871-872 (D) 6,5 (0,2) 6,4 (0,2) 6,4 (0,3) 4,8 (0,2) 6,5 (0,1) 6,4 (0,2) 6,4 (0,2) 6,2 (0,3)
a a b
CRL871-803 (E) 6,6 (0,3) 6,2 (0,3) 5,9 (0,2) 4,1 (0,1) 6,5 (0,1) 5,7 (0,2) 4,7 (0,3) 4,1 (0,3)
a a b a a a
CRL871-415 (F) 6,6 (0,2) 6,2 (0,2) 6,1 (0,3) 4,4 (0,2) 6,5 (0,2) 6,4 (0,3) 6,3 (0,2) 6,3 (0,2)
a a b
CRL872-803 (G) 6,5 (0,2) 6,2 (0,3) 6,1 (0,2) 4,2 (0,3) 6,5 (0,2) 5,7 (0,3) 4,7 (0,1) 4,1 (0,3)
a a a,b a a a
CRL872-415 (H) 6,5 (0,3) 6,3 (0,1) 6,1 (0,3) 4,5 (0,2) 6,5 (0,1) 6,3 (0,2) 6,3 (0,3) 6,2 (0,1)
a a c
CRL863-803-415 (I) 6,6 (0,2) 6,3 (0,2) 6,2 (0,3) 6,1 (0,3) 6,5 (0,3) 4,4 (0,1) 4,1 (0,2) 3,6 (0,2)
CRL863-871-803 (J) 6,5 (0,2) 5,1 (0,1) 4,7 (0,2) 4,1 (0,1) 6,5 (0,2) 4,9 (0,3) 4,6 (0,2) 3,9 (0,2)
CRL863-871-415 (K) 6,5 (0,2) 5,3 (0,2) 4,7 (0,2) 3,9 (0,3) 6,5 (0,3) 5,1 (0,3) 4,6 (0,2) 3,8 (0,1)
CRL863-872-803 (L) 6,5 (0,1) 4,7 (0,3) 4,3 (0,2) 3,8 (0,1) 6,5 (0,3) 4,4 (0,2) 4,2 (0,1) 3,9 (0,2)
CRL863-872-415 (M) 6,4 (0,2) 4,6 (0,2) 4,2 (0,3) 3,7 (0,2) 6,4 (0,3) 4,2 (0,2) 4,1 (0,2) 3,8 (0,1)
b
CRL871-803-415 (N) 6,6 (0,2) 5,3 (0,2) 4,6 (0,3) 4,1 (0,3) 6,5 (0,2) 5,9 (0,3) 4,8 (0,3) 4,1 (0,2)
a,b
CRL872-803-415 (O) 6,5 (0,1) 5,6 (0,1) 4,8 (0,1) 4,1 (0,2) 6,5 (0,3) 6,2 (0,2) 5,1 (0,3) 4,1 (0,3)
CRL863-871-803-415 (P) 6,5 (0,3) 5,1 (0,3) 4,7 (0,2) 4,1 (0,3) 6,5 (0,2) 5,1 (0,3) 4,6 (0,2) 3,9 (0,2)
CRL863-872-803-415 (Q) 6,5 (0,2) 4,4 (0,1) 4,5 (0,2) 3,8 (0,2) 6,5 (0,1) 4,5 (0,2) 4,1 (0,3) 3,9 (0,1)
CRL871-872-803-415 (R) 6,4 (0,2) 4,9 (0,1) 4,6 (0,3) 4,2 (0,3) 6,6 (0,2) 4,7 (0,3) 4,5 (0,2) 4,1 (0,3)
a a c a a a
Leche (S) 6,6 (0,2) 6,6 (0,2) 6,6 (0,3) 6,6 (0,3) 6,6 (0,2) 6,6 (0,3) 6,6 (0,2) 6,6 (0,2)

*El tiempo se expresa en hora (h). Los resultados se expresan como la media (DE). En una misma columna y entre temperaturas para el mismo tiempo, letras
distintas indican diferencias significativas (p<0,05).
133
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.1.1.3. Diseño de una leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en folatos

Las combinaciones seleccionadas I, N, O, P, Q y R, a partir de ahora denominadas A,

B, C, D, E y F respectivamente, se inocularon (2% v/v) en leche descremada (10% p/v) y se
incubaron a 42ºC durante 6 h, evaluando la concentración folatos, viabilidad y acidez durante
la elaboración y almacenamiento a 4ºC del producto.

4.1.1.3.1. Síntesis de folatos y crecimiento en leches fermentadas

La concentración de folatos en las muestras fue medida con o sin previo tratamiento
tri-enzimático con el objeto de determinar indirectamente la cantidad de folatos
poliglutamilados (con más de 4 residuos glutámicos) dado que no son detectados por el
método microbiológico.
El dosaje de folatos sin tratamiento enzimático demostró que todas las leches
fermentadas incrementaron significativamente la concentración de folatos entre 45,4% y
124,1% a las 6 h (Figura 4.3A). La presencia de L. bulgaricus CRL871 en las combinaciones
estimuló la síntesis obteniéndose elevados niveles de folatos. En el producto B se registró el
máximo incremento (124,1 %) de folatos a diferencia del E que presentó los menores valores
(77,1 ± 0,9 µg/L), equivalente a 45,4% de aumento (Figura 4.3).

200 b
Folatos (µg/L)

150 a d a
a a a
c a
100 e
50

0
A B C D E F

Sin tratamiento tri-enzimático

Con tratamiento tri-enzimático

Figura 4.3. Concentración de folatos (µg/L) en leches fermentadas. Los resultados se expresan como
la media ± DE, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

El tratamiento tri-enzimático de las muestras previo a la determinación de folatos

resultó en un incremento (12,8 – 61,2%) de la concentración de folatos respecto a las muestras
no tratadas (Figura 4.3). La leche fermentada B tuvo la mayor concentración de folatos, por lo
tanto el tratamiento tri-enzimático resultó ser fundamental para lograr una medida más precisa
134
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

y representativa de la concentración de folatos producidos (Figura 4.3). De esta manera, si se

comparan las concentraciones determinadas luego del tratamiento respecto al basal, el
incremento de los folatos fue (84,1 – 261,4%), el doble respecto a la determinada sin
tratamiento. Con los valores de folatos, determinados con tratamiento, se estimó su aporte (%)
a la Ingesta Diaria Recomendada (IDR) para folatos. Los resultados indicaron que al final de
la elaboración el producto B aportó 10% IDR, mientras que la leche fermentada E significó el
menor aporte (5,5% IDR).
Por otro lado, se determinó la productividad volumétrica de folatos (expresada en µg
B9.L-1.h-1) al final de la fermentación. De los productos elaborados, la leche fermentada B
presentó la mayor productividad volumétrica (29,5 ±1,2 µg B9.L-1.h-1) demostrando que su
cultivo polivalente es más eficiente para sintetizar folatos respecto de los restantes cultivos
(Tabla 4.3).

Tabla 4.3. Concentración de folatos*,**, producción volumétrica** y aporte de ingesta diaria

recomendada (% IDR) en una porción de leche fermentada (225 mL)

Producción
Folatos* Folatos** IDR
volumétrica***
A 105,5 (3,8)a 108,9 (4,4)a 6,1 (0,2)a 18,1 (0.8)a
B 171,6 (8,7)b 177,1 (7,1)b 10,1 (0,2)b 29,5 (1,2)b
C 105,3 (4,9)a, d 108,6 (4,3)a, d 6,1 (0,3)a 18,1 (1,6)a
D 123,1 (5,2)c 127,1 (5,1)c 7,1 (0,1)c 21,2 (1,2)c
E 94,5 (4,7)a 97,6 (3,9)a 5,5 (0,2)d 16,3 (1,8)a
d
F 110,1 (6,2) 113,5 (4,5)d 6,4 (0,3)a 18,9 (1,9)a

La concentración de folatos se expresa en *ng B9/g de leche fermentada y **µg B9/L de leche
fermentada. ***La producción volumétrica se expresa como µg B9.L-1.h-1. Los resultados se expresan
como la media ± DE. En una misma columna, letras distintas indican diferencias significativas
(p<0,05).

Paralelamente a la determinación de folatos se evaluó el crecimiento [log (UFC/mL)],

capacidad de acidificación (pH y acidez titulable) y sinéresis durante la elaboración de las
diferentes leches fermentadas. Para el recuento de células viables se usaron medios selectivos
para lactobacilos (LBS) y estreptococos (M17).
Al final de la fermentación (t= 6 h) todas las leches fermentadas tuvieron un pH final
entre 4,5 y 5,1 unidades, logrando la coagulación de la matriz láctea (Tabla 4.4), con una
acidez titulable entre 0,5 y 0,6 % de ácido láctico.

135
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

Tabla 4.4. Acidificación (pH y acidez titulable) y sinéresis (%) en leches fermentadas bio-
enriquecidas

pH Acidez (%)* Sinéresis (%)

A 4,5 (0,1) 0,62 (0,16) 40,1 (1,5)a
B 5,1 (0,2)a 0,55 (0,12) 34,4 (1,1)b
C 4,6 (0,1) 0,59 (0,14) 48,3 (1,6)c
D 4,8 (0,2) 0,57 (0,21) 50,9 (2,1)c
E 4,5 (0,2) 0,63 (0,14) 49,5 (2,4)c
F 4,7 (0,1) 0,56 (0,18) 51,2 (1,7)c

*Acidez titulable expresada como % de ácido láctico. Los resultados se expresan como la media (DE).
En una misma columna, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

Los recuentos microbianos revelaron que al final de la fermentación todos los

productos tuvieron un número de lactobacilos entre 7,1 ± 0,2 y 7,2 ± 0,3 log (UFC/mL) sin
diferencias significativas entre las leches fermentadas (Figura 4.4A). El número de
estreptococos osciló entre 8,2 ± 0,3 y 8,6 ± 0,4 log (UFC/mL) (Figura 4.4B), resultando ser el
género dominante.

b
A 9 b
B 9
8 a A 8 a
7 B 7
6 6
log(UFC/mL)

5 C 5
4 4
3 D 3
2 E 2
1 1
0 F 0
0 6 0 6
Tiempo (h) Tiempo (h)

Figura 4.4. Viabilidad celular [log (UFC/mL)] en leches fermentadas bio-enriquecidas. A) Recuento
de lactobacilos en LBS y B) recuento de estreptococos en M17. Los resultados se expresan como la
media ± DE, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

4.1.1.3.2. Concentración de folatos y crecimiento en las leches fermentadas durante

su almacenamiento (Vida de estante)

Se determinaron los niveles de folatos totales, viabilidad celular y acidez durante el

almacenamiento de las leches fermentadas a 4ºC por 28 d.
En el caso de los folatos medidos sin tratamiento tri-enzimático, se observaron
variaciones significativas durante los 28 d en todos los productos (Figura 4.5A).

136
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

A 200 d B 200 b b
d b b b
d d d b b b
150 e A 150
Folatos (µg/L)

Folatos (µg/L)
b b b b b b,e c a,c c c a,ca,c c
b bb aa a a a aa a a aa a a a aa
B a aa
a a,b a a a a a a a a d d d
100 a c c c b 100 d d de d d d
c c c cc bb C
f f f
50 D 50
E
0 F 0
LF 1 3 7 14 21 28 LF 1 3 7 14 21 28
Tiempo (d) Tiempo (d)

Figura 4.5. Concentración de folatos (µg/L) en leches fermentadas bio-enriquecidas durante su

almacenamiento (28 d) a 4ºC (Vida de estante). A) Folatos determinados sin tratamiento tri-enzimático
y B) Folatos determinados con tratamiento tri-enzimático. LF: leche fermentada. El tiempo se expresa
en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican diferencias
significativas (p<0,05).

Con el objeto de establecer si esta variación en las concentraciones de folatos se debía

a este recambio (tamaño de los folatos sintetizados) y su unión a diferentes proteínas
(disponibilidad del folatos) se realizó la determinación de folatos usando el tratamiento tri-
enzimático. Los dosajes de folatos totales (µg/L) con tratamiento tri-enzimático revelaron que
en todas las leches fermentadas, las concentraciones de folatos se mantuvieron durante los 28
d (Figura 4.5B), indicando que existe un recambio e interacción entre los folatos y la matriz
de la leche fermentada, influyendo en la detección mediante el método microbiológico.
El cálculo del % de IDR aportado por la leche fermentada indicó que se mantuvo en
10 % IDR hasta el día 28, indicando que es posible almacenar los productos sin cambios
significativos en las concentraciones de folatos. Por lo tanto, estos alimentos bio-enriquecidos
constituyen una alternativa para su comercialización.
Con el objeto de verificar la viabilidad de los cultivos iniciadores durante su
almacenamiento a 4–6ºC, se realizaron los recuentos diferenciales de lactobacilos y
estreptococos en LBS y M17 respectivamente. Los recuentos (UFC/mL) de lactobacilos, en
LBS, se mantuvieron constantes hasta los 14 d de almacenamiento (Figura 4.6A), y
disminuyeron ligeramente a los 28 d, pero con valores superiores a los basales (t= 0 h) (Figura
4.6A). En el caso de los estreptococos no se observaron variaciones significativas en los
recuentos de UFC/mL durante todo el almacenamiento (28 d) (Figura 4.6B) siendo similares a
los alcanzados al final de la fermentación.
No hubo variaciones significativas en los valores de pH durante los 28 d evaluados en
ninguno de los productos conservados (Figura 4.6C).

137
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

Por otra parte también se evaluó la sinéresis o separación de las fases suero–coágulo
durante el almacenamiento. Para ello al final de la elaboración de las leches fermentadas, los
mismos fueron homogeneizados por agitación y almacenados a 4–6ºC. Se realizó un
seguimiento visual cada 2 h durante las primeras 6 h posteriores a su almacenamiento,
continuando con una observación diaria. De acuerdo a los resultados la leche fermentada B
(pH= 5,1 unidades) no mostró sinéresis visible durante todo el almacenamiento, con una
acidez 0,8 ± 0,2 % ácido láctico, mientras que en los demás productos la sinéresis se hizo
evidente desde las 4 h posteriores al inicio de su almacenamiento y se incrementó hasta el día
1 post-almacenamiento, permaneciendo sin cambios hasta los 28 d (Tabla 4.6), con valores de
acidez superiores respecto a la leche fermentada B (Tabla 4.6).

A 9 B 9
8 8
7 A 7
log (UFC/mL)

log (UFC/mL)
6 6
5 B 5
4 C 4
3 3
D
2 2
1 E 1
0 F 0
LF 1 3 7 14 21 28 LF 1 3 7 14 21 28
Tiempo (d) Tiempo (d)
C 8
7
6 b a b a b b
5 a a b a ab a a a
a a a
pH

4
3
2
1
0
LF 1 3 7 14 21 28
Tiempo (d)

Figura 4.6. Viabilidad celular [log (UFC/mL)] y pH en leches fermentadas bio-enriquecidas durante
su almacenamiento (28 d) a 4ºC (Vida de estante). A) Recuento de lactobacilos en LBS; B) recuento
de estreptococos en M17 y C) pH. El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como
la media ± DE, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

138
 Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

Tabla 4.6. Acidez titulable* y sinéresis** en leches fermentadas bio-enriquecidas durante su

almacenamiento a 4ºC

Acidez (%) Sinéresis (%)

1 d*** 3d 7d 14 d 21 d 28 d 1d 3d 7d 14 d 21 d 28 d
A 1,0 (0,2) 1,1 (0,1) 1,1 (0,2) 1,1(0,3) 1,1 (0,2) 1,1 (0,2) 40,1 41,5 41,9 43,4 44,7 44,2
B 0,8 (0,2) 0,8 (0,2) 0,7 (0,1) 0,8 (0,3) 0,7 (0,2) 0,7 (0,2) 34,6 34,9 35,3 34,2 34,9 35,4
C 0,9 (0,1) 0,9 (0,2) 1,1 (0,3) 1,1 (0,2) 1,1 (0,3) 1,1 (0,2) 48,7 49,6 51,4 52,4 54,2 54,7
D 0,8 (0,3) 0,9 (0,1) 0,9 (0,3) 1,0 (0,3) 1,0 (0,2) 1,0 (0,3) 50,9 52,4 53,4 53,1 54,3 54,4
E 1,0 (0,2) 1,1 (0,3) 1,1 (0,2) 1,1 (0,2) 1,1 (0,3) 1,1 (0,2) 49,9 51,4 52,5 52,8 52,5 53,7
F 0,9 (0,1) 0,9 (0,2) 1,0 (0,3) 1,0 (0,2) 1,0 (0,3) 1,0 (0,3) 51,4 52,6 52,9 54,1 54,6 55,2

*La acidez titulable se expresa en % ácido láctico. **La sinéresis se expresa como %. ***El tiempo se
expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media (DE). En una misma columna, letras
distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

Basados en estos resultados se seleccionó la leche fermentada B naturalmente bio-

enriquecida en folatos la cual fue elaborada con la combinación de L. bulgaricus CRL871, S.
thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415.

4.1.1.4. Etiquetado nutricional de la leche fermentada bio-enriquecida.

A fin de caracterizar el producto de acuerdo con las normas establecidas por el Código
Alimentario Argentino (CAA) (ANMAT, 2010) se realizó el rotulado nutricional del mismo,
demostrándose que cumple con los valores nutricionales establecidos.

Tabla 4.7. Rotulado nutricional del producto bio-enriquecido

Cant.(g)/100 g

Valor energético 37 Kcal = 156 kJ

Humedad 90,0 g

Hidratos de carbono 5,9 g

Proteínas 3,2 g

Lípidos 0,1 g

Cenizas 0,7 g

Fibra alimentaria 0g

Sodio 190,3 mg

Calcio 157,7 mg

139
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.1.2. Discusión

Tradicionalmente la leche no es considerada un buena fuente de folatos, debido a su

baja concentración (20 – 50 µg/L), por lo tanto se utilizaron numerosas estrategias con el fin
de incrementar sus niveles, como la fermentación microbiológica donde la síntesis de folatos
se lleva a cabo in situ (Crittenden et al., 2003; Holasova et al., 2005; Hugenholtz et al.,
2002b; Papastoyiannidis et al., 2006; Wouters et al., 2002).
La evaluación de la capacidad de sintetizar folatos en leche por las cepas seleccionadas
reveló que sólo L. bulgaricus CRL863 fue capaz de incrementar la concentración de folatos
finales, siendo mayor a 37ºC que a 42ºC, mientras que los demás L. bulgaricus no aumentaron
significativamente la vitamina. Si bien las cepas de lactobacilos crecieron en ausencia de
folatos (ver Resultados 1.1 - Tabla 1.1), posiblemente su capacidad de síntesis estaría
determinada por la presencia de folatos en el medio de cultivo. Los estreptococos inoculados
individualmente tuvieron un comportamiento diferente dado que las 2 cepas incrementaron la
concentración de folatos en leche en ambas temperaturas, siendo mayor a 42ºC, temperatura
que corresponde a su óptima de crecimiento. Estos resultados demostraron que en
Streptococcus la presencia de folatos en el medio no tuvo influencia en la síntesis de vitamina.
El comportamiento de las cepas en relación a la capacidad de sintetizar folatos, varió
en las distintas combinaciones, indicando que existe una interacción de las cepas inoculadas
en leche, con la síntesis de vitamina. Numerosos estudios (Crittenden et al., 2003;
Gangadharan et al., 2010; Holasova et al., 2004) indicaron que la obtención de un producto
fermentado enriquecido en folatos dependía de las especies de bacterias y/o sus
combinaciones. A pesar de ello, y que muchos autores han logrado elaborar yogures y leches
fermentadas enriquecidas en folatos, todos emplearon diferentes estrategias para dicho
enriquecimiento, como: i) la suplementación con extractos o pulpas de frutas (fuentes de
vitamina B9) (Holasova et al., 2005); ii) bacterias modificadas genéticamente (Hugenholtz et
al., 2002a; LeBlanc et al., 2010b); iii) bifidobacterias y otras especies de bacterias lácticas
como L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus; y iv) otras BAL que normalmente no son
empleados como cultivos iniciadores (Holasova et al., 2004; Hugenholtz et al., 2002a; Iyer et
al., 2009a; Pompei et al., 2007; Santos et al., 2008). Sólo algunos autores han diseñado leches
fermentadas con cultivos iniciadores como Lc. lactis, pero en estos casos se emplearon
principalmente cepas modificadas genéticamente capaces de sobreexpresar los genes
involucrados en la síntesis de folatos (LeBlanc et al., 2010b). Entre las principales desventajas

140
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

que poseen estas estrategias podemos mencionar los incrementos en los costos de producción
cuando se emplean agregados ya sea bacterianos o suplementos, o bien que incluyen cepas
modificadas genéticamente limitando su empleo y consumo en determinadas partes del
mundo, pues la aceptabilidad por dichos productos es muy variada, como fue demostrado en
un estudio en la provincia de Shanxi (China) empleando arroz modificado genéticamente a fin
de incrementar el contenido de folatos (De Steur et al., 2010) y en otras regiones del mundo.
Varios estudios demuestran que la aceptación de alimentos con componentes modificados
genéticamente depende del conocimiento sobre los riesgos del consumo de dicho alimento
(Huffman et al., 2007; Lusk et al., 2004), la utilidad de dicha modificación (Lusk et al., 2002)
y del ahorro económico que representa su consumo (Curtis et al., 2004), entre otras razones.
A diferencia de estas estrategias, en este trabajo de tesis se estudió la elaboración de
un producto fermentado (leche fermentada) empleando cepas naturalmente productoras de
folatos y cultivos iniciadores comunes en la industria láctea. Esta estrategia de bio-
fortificación proporciona una gran ventaja sobre las otras, debido a que no origina costos extra
dado que son los mismos cultivos iniciadores quienes sintetizan los folatos durante la
fermentación y además no se encuentran modificados genéticamente por lo que pueden ser
empleados en la elaboración de alimentos para consumo humano.
En el caso particular de las combinaciones evaluadas, se observó que tanto el número
de cepas presentes en la combinación, como el tiempo y la temperatura de fermentación
influyeron sobre la síntesis de folatos. La combinación CRL863-872-415 (relación
coco:bacilo 1:2) sintetizó la menor concentración de folatos luego de 6 h de fermentación
(Tabla 4.1) tanto a 37ºC como a 42ºC, mientras que la combinación CRL871-803-415
(relación coco:bacilo 2:1) sintetizó la mayor cantidad de folatos a 42ºC luego de 6 h de
cultivo.
Una adecuada combinación de cepas y condiciones de cultivo son importantes para
lograr la mayor síntesis de folatos, dado que determinan el crecimiento, metabolismo y por
tanto las interacciones simbióticas entre las bacterias empleadas. Los resultados permitieron
seleccionar la mejor combinación de cepas y condiciones de fermentación que permitieron
incrementar la concentración de folatos.
Las muestras sometidas al tratamiento tri-enzimático al inicio y final de la
fermentación, permitieron inferir en forma indirecta, el tamaño de los folatos producidos y por
tanto la actividad intracelular de la enzima folilpoliglutamato sintetasa, codificada por el gen
folC, responsable de la síntesis de las cadenas poliglutámicas (McGuire et al., 1980; Sybesma

141
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

et al., 2003a) que constituyen una parte fundamental de los folatos pues son las responsables
de retener la vitamina en el interior de las células.
Además, se demostró que si no se utiliza el tratamiento enzimático, gran parte de los
folatos sintetizados presentes en la leche fermentada no son detectados por el método
microbiológico (Iyer et al., 2009b), dando como resultado una subestimación de la cantidad
absoluta de folatos presentes.
La concentración de la vitamina en el producto B fue significativamente superior a
otros productos lácteos fermentados previamente descriptos, en los cuales se han empleado
suplementos (Holasova et al., 2005) y otras especies diferentes a los cultivos iniciadores
(Holasova et al., 2004; Pompei et al., 2007; Santos et al., 2008; Wouters et al., 2002).
La OMS/FAO estableció como valores de IDR recomendados para folatos en adultos
400 µg/día y 200 µg/día para niños (FAO/WHO, 2002). En nuestro país se han adoptado los
valores propuestos por la OMS (ANMAT, 2013). De esta manera, los resultados indicaron
que al final de su elaboración el producto fermentado B aportó un 10 % IDR para adultos y un
20% para niños. Dado que para que una leche fermentada sea considerada una buena fuente
de folatos (Ohio State University, 2005) y naturalmente enriquecida en esta vitamina se
requiere un aporte entre el 10 y 20 % IDR (Ohio State University, 2005), la leche fermentada
B puede considerarse naturalmente enriquecida en folatos.
El recuento diferencial de microorganismos determinó que ambos géneros
(Lactobacillus y Streptococcus) crecieron adecuadamente. Sin embargo Streptococcus fue el
género dominante. Esta diferencia cuantitativa final fue similar ya sea que la relación
coco:bacilo fuera 2:1 o 2:2 y aun cuando las UFC/mL al inicio de la fermentación fueran
similares (2 x 105 UFC/mL). Estos resultados son similares a los descriptos previamente que
indican que, en la simbiosis lactobacilos-estreptococos (Smid et al., 2013), los estreptococos
crecen produciendo ácido fórmico, permitiendo el posterior desarrollo de los lactobacilos
quienes degradan las proteínas aportando los aminoácidos libres y péptidos a los
Streptococcus para su crecimiento (Sieuwerts et al., 2008; Smid et al., 2013). Si bien
Streptococcus fue el género predominante, la síntesis de folatos fue dependiente de cepa.
Por su parte, otro de los parámetros evaluados fue la acidez (pH y acidez titulable) y la
sinéresis. Estos parámetros resultan fundamentales en la evaluación de una leche fermentada
dado que permiten caracterizar el producto y determinar la calidad del mismo, pues el
porcentaje de ácido láctico adecuado es extremadamente importante para obtener un producto
de alta calidad con sabor, cuerpo y textura propia, y de esa manera el producto tenga el
mínimo porcentaje de sinéresis durante el almacenamiento (Granata et al., 1996). Dado que la

142
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

sinéresis es considerada un defecto en los productos fermentados, se estableció que firmeza

sin sinéresis es esencial para obtener una leche fermentada como el yogur de alta calidad
(Vélez‐Ruiz et al., 1997). Debido a que los estreptococos poseen una capacidad de
acidificación mucho mayor que L. bulgaricus, las diferentes combinaciones de cepas
acidificaron en diferentes grados al final de la fermentación, donde la acidez titulable tuvo
influencia en el grado de sinéresis de los productos obtenidos, siendo la leche fermentada B la
de mayor pH (5,1 unidades de pH) y menor acidez (0,6 ± 0,2 % ácido láctico), y por ello
ausencia de sinéresis visible con un porcentaje de sinéresis menor al 42%, por lo que cumple
con los requisitos para ser considerado, en principio, un producto de alta calidad (Alatriste,
2002).
La comparación de las concentraciones de folatos obtenidas durante el
almacenamiento sin y con tratamiento tri-enzimático permitió demostrar diferencias en los
niveles de folatos sintetizados. Estos resultados sugieren la existencia de un continuo
recambio de folatos de diferentes tamaños como también su unión a la matriz de la leche
fermentada, lo cual hace que tanto la disponibilidad como el tamaño varíe y por tanto los
valores determinados. Probablemente, el recambio inferido dependió de la actividad
metabólica de los microorganismos influyendo a su vez en la actividad de la enzima
folilpoliglutamato sintetasa. Este suceso no sólo evidencia que las bacterias se encuentran
metabólicamente activas, sino además que la vitamina experimenta un ciclo dinámico de
síntesis y consumo. Sin embargo, cuando se empleó el método enzimático, la concentración
de folatos totales permaneció constante y estable en el tiempo, sin las variaciones observadas
en las muestras no tratadas. Estos resultados refuerzan aún más la hipótesis sobre el continuo
recambio de folatos y sus variaciones en el tamaño de la cadena glutámica lo cual afecta
directamente a su tamaño y posterior detección.
Como consecuencia de la estabilidad de las concentraciones de folatos, el 10% IDR
aportado por el producto B se mantuvo sin variaciones significativas durante el
almacenamiento. Más aún, el estudio de viabilidad celular (UFC/mL) demostró que los
lactobacilos permanecieron sin cambios hasta el día 14, luego del cual presentaron una ligera
disminución, mientras que los estreptococos permanecieron viables en la misma cantidad
durante los 28 d de evaluación.
La leche fermentada B presentó la mayor concentración de folatos, mantuvo la
viabilidad de los cultivos iniciadores empleados, presentó el mayor pH final con valores de
acidez (0,7 ± 0,1 % ácido láctico) que se encuentran dentro del rango establecido (0,6 a 1,5 %
ácido láctico) en el CAA en su Resolución GMC Nº080/94 (ANMAT, 2010) y el CODEX

143
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

alimentarius (CODEX, 2012), y ausencia de sinéresis visible (34,5 ± 1,1%). Todas estas
características permanecieron estables durante el período de almacenamiento evaluado
sugiriendo que los microorganismos no continuarían con el proceso fermentativo y por tanto
con la consecuente acidificación del producto.
Se eligió la leche fermentada B para los posteriores estudios relacionados con la
tolerancia al tránsito gastrointestinal y estudios in vivo a fin de evaluar su capacidad para
prevenir y/o restituir los niveles de folatos plasmáticos durante una deficiencia de folatos en
un modelo animal experimental. Por otra parte, también se realizó el etiquetado nutricional,
demostrándose que cumple con los valores establecidos en el CAA (ANMAT, 2010).
Debido a que todos estos resultados permitieron establecer que la leche fermentada B
presenta características similares a la del yogur, y que el cultivo iniciador o fermento posee
una base de yogur por la presencia de L. bulgaricus y S. thermophilus, se propone la leche
fermentada B como un yogur adicionado naturalmente bio-enriquecido en folatos. Además,
esta leche fermentada seleccionada es un buen candidato para los estudios posteriores de
escalado y seguridad para un potencial desarrollo tecnológico.

144
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.2. Evaluación de la tolerancia al tracto gastrointestinal y a sales biliares en las

cepas seleccionadas

Debido a que previamente se diseñó una leche fermentada naturalmente bio-

enriquecida en folatos, se procedió a evaluar si las cepas seleccionadas poseen la capacidad de
llegar viables al intestino. Para ello, se evaluó la tolerancia al tracto gastrointestinal y a sales
biliares empleando condiciones simuladas de jugo gástrico e intestinal in vitro, de las cepas
individuales y de la leche fermentada seleccionada. La evaluación se llevó a cabo de acuerdo
al siguiente esquema (Esquema 4.2).

Esquema 4.2. Representación esquemática de la evaluación de la tolerancia al tracto gastrointestinal

en condiciones simuladas in vitro. LF: leche fermentada.

4.2.1 Resultados

4.2.1.1. Tolerancia al tracto gastrointestinal

Los resultados de la evaluación de las cepas individuales, demostraron que L.

bulgaricus CRL871 no sobrevivió a la acción del jugo gástrico, dado que no fue capaz de
mantenerse viable luego de 30 min de incubación en presencia de pepsina a pH 2,0 (Figura
4.7A). Por su parte, al igual que L. bulgaricus CRL871, S. macedonicus CRL415 también

145
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

perdió viabilidad a los 30 min de incubación, mientras que S. thermophilus CRL803 resistió
hasta 1 h de incubación en el jugo gástrico (Figura 4.7A).
En cambio, la evaluación de la tolerancia gastrointestinal de las cepas en la leche
fermentada demostró un comportamiento totalmente diferente y promisorio. En este último
caso, se realizó el recuento diferencial entre Lactobacillus y Streptococcus, observándose que
ambos géneros lograron sobrevivir al jugo gástrico, shock de bilis y jugo intestinal (Figura
4.7B). Si bien los microorganismos sobrevivieron al jugo gástrico sin variaciones
significativas, a los 90 min de incubación se registró una disminución del recuento total de
células (8,6 ± 0,4 log UFC/mL) manteniendo Streptococcus una sobrevida del 94%, mientras
que Lactobacillus un 97%. Durante la incubación con bilis, la sobrevida fue 80%
(Streptococcus) y 81% (Lactobacillus). En Streptococcus el % de sobrevida se mantuvo hasta
el final del experimento (Figura 4.7B) mientras que en los Lactobacillus fue 75% al final del
ensayo. Estos resultados demuestran que la matriz de la leche fermentada fue capaz de
proteger a las bacterias del efecto letal de los jugos gastrointestinales y la bilis, permitiendo
que los mismos lleguen viables al intestino.

A a B a
10 b 10
b
8 8
log (UFC/mL)

6 6
4 4
2 2
0 0
0 30 60 90 0 10 0 30 60 90 0 30 60 90 0 10 0 30 60 90
TG (pepsina pH Shock TI (pancreatina, TG (pepsina pH Shock TI (pancreatina,
2,0) Bilis bilis 0,3% pH 8,0) 2,0) Bilis bilis 0,3% pH 8,0)
(bilis 1% (bilis 1%
pH 8,0) pH 8,0)

Tiempo (min) Tiempo (min)

L. bulgaricus CRL871 S. thermophilus CRL803 L. bulgaricus CRL871
Estreptococos
S. macedonicus CRL415 LF Yogur

Figura 4.7. Viabilidad celular durante el tracto intestinal in vitro [log (UFC/mL)]. A) Recuento de
células viables empleando cepas individuales y recuento de células viables totales en leche fermentada
(LF), B) Recuento total (LF) de microorganismos y recuento diferencial de lactobacilos y
estreptococos en leche fermentada. LF: representa el recuento total (lactobacilos y estreptococos) en la
leche fermentada bio-enriquecida. Los resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas
indican diferencias significativas (p<0,05).

146
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.2.1.2 Tolerancia a sales biliares

Además se evaluó la tolerancia a sales biliares de las cepas seleccionadas

individualmente. Esta evaluación se realizó midiendo el crecimiento a través de la DO600nm en
función del tiempo (DO vs t) y frente a diferentes concentraciones de bilis (DO vs % oxgall),
utilizándose oxgall como fuente de bilis fresca deshidratada.
Para evaluar la tolerancia de L. bulgaricus CRL871 a sales biliares en función del
tiempo, se empleó el medio MRS suplementado con oxgall 0,3 % p/p (Bilis) y MRS sin
oxgall (Control). L. bulgaricus CRL871 se inoculó a una DO inicial de 0,1 y se incubó
durante 9 h a 37ºC midiéndose a cada hora la DO. Finalmente se calculó el tiempo requerido
para crecer (tiempo lag) considerado como la diferencia entre el tiempo de crecimiento en
medio con oxgall respecto a medio control sin oxgall cuando se presentó una diferencia de 0,3
unidades. En la Figura 4.8A, se muestra el crecimiento de L. bulgaricus CRL871. En ausencia
de oxgall alcanzó una DO de 3,6 unidades a las 9 h de incubación, mientras que en presencia
de oxgall la DO permaneció en 0,1 unidades durante las 9 h de incubación, demostrando que
el microorganismo fue sensible a la presencia de bilis en el medio de cultivo.
Las cepas de estreptococos presentaron un comportamiento totalmente diferente entre
sí cuando crecieron en presencia de oxgall. En el caso de S. thermophilus CRL803, en
ausencia de oxgall la cepa creció normalmente alcanzando su mayor valor de DO (2,2 ± 0,3) a
las 6 h de crecimiento. Similar comportamiento se observó con S. macedonicus. El agregado
de oxgall afectó la viabilidad de la cepa CRL803 mientras que en la cepa CRL415 la DO
comenzó a incrementarse a partir de las 2 h de incubación, alcanzando el máximo a las 6 h
(DO = 1,1 ± 0,4) lo cual indicó que S. macedonicus CRL415 es ligeramente tolerante a la
presencia de bilis (Figura 4.8C).

147
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

A4 B 2,5
2,0
3
DO600

DO600
1,5
2
1,0
1 0,5
0 0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (h) Tiempo (h)

C 3,0
2,5
2,0
DO600

1,5
C (0% oxgal)
1,0
0,5 S (0,3% oxgal)
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (h)

Figura 4.8. Tolerancia a sales biliares en función del tiempo de A) L. bulgaricus CRL871; B) S.
thermophilus CRL803 y C) S. macedonicus CRL415, medida mediante DO600. C: Control sin oxgall;
S: suplementado con 0,3 % de oxgall. Los resultados se expresan como la media ± DE.

Además de la tolerancia a sales biliares en función del tiempo, se evaluaron diferentes

concentraciones de oxgall (0,2–2%) adicionadas a los medios de cultivo específicos. Se midió
la turbidez y se determinó la menor concentración inhibitoria del crecimiento de la cepa
evaluada.
Frente a las diferentes concentraciones de oxgall, L. bulgaricus CRL871 fue incapaz
de crecer aún frente a la menor concentración evaluada (0,2 % oxgall) (Tabla 4.7). Por su
parte, S. thermophilus CRL803 aumentó 3 veces la DO luego de 12 h de incubación frente a
0,4 % de oxgall, no pudiendo crecer frente a concentraciones superiores (Tabla 4.7). En
cambio, S. macedonicus CRL415 presentó un buen desarrollo, con una DO en presencia de
bilis (1,4 ± 0,2) cuando se incubó con 0,2 % de oxgall. Este crecimiento disminuyó con el
incremento en la concentración de bilis hasta 2 % de oxgall donde la DO fue de 0,5 ± 0,1
unidades a las 24 h de incubación. Los resultados demuestran que S. macedonicus CRL415
tuvo mayor tolerancia a las sales biliares permitiendo crecer en concentraciones normalmente
presentes en el intestino (Tabla 4.7).

148
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

Tabla 4.8. Tolerancia de las cepas seleccionadas a diferentes concentraciones de bilis medida
mediante DO600

Bilis L. bulgaricus CRL871 S. thermophilus CRL803 S. macedonicus CRL415

[%] 0h 12 h 24 h 0h 12 h 24 h 0h 12 h 24
0,0 0,11 (0,01) 3,20 (0,33) 3,10 (0,04) 0,11 (0,02) 2,16 (0,24) 2,20 (0,12) 0,11 (0,01) 2,70 (0,43) 2,40 (0,27)
0,2 0,11 (0,01) 0,17 (0,02) 0,42 (0,03) 0,10 (0,01) 0,45 (0,02) 0,42 (0,03) 0,11 (0,02) 1,39 (0,25) 1,37 (0,29)
0,4 0,10 (0,02) 0,18 (0,02) 0,31 (0,02) 0,11 (0,02) 0,30 (0,03) 0,21 (0,02) 0,12 (0,02) 0,91 (0,08) 0,81 (0,09)
0,6 0,10 (0,01) 0,19 (0,03) 0,18 (0,02) 0,10 (0,01) 0,13 (0,02) 0,18 (0,02) 0,11 (0,01) 0,75 (0,05) 0,69 (0,07)
0,8 0,11 (0,02) 0,18 (0,02) 0,20 (0,03) 0,12 (0,02) 0,13 (0,03) 0,18 (0,03) 0,10 (0,01) 0,46 (0,04) 0,60 (0,05)
1,0 0,11 (0,02) 0,19 (0,01) 0,26 (0,03) 0,11 (0,01) 0,17 (0,02) 0,22 (0,01) 0,11 (0,02) 0,31 (0,04) 0,55 (0,06)
1,2 0,11 (0,01) 0,18 (0,01) 0,26 (0,02) 0,10 (0,02) 0,14 (0,02) 0,21 (0,03) 0,10 (0,01) 0,35 (0,04) 0,62 (0,04)
1,4 0,12 (0,01) 0,19 (0,02) 0,27 (0,03) 0,09 (0,01) 0,13 (0,01) 0,22 (0,02) 0,12 (0,03) 0,35 (0,05) 0,68 (0,05)
1,6 0,11 (0,02) 0,20 (0,02) 0,30 (0,02) 0,11 (0,02) 0,14 (0,02) 0,22 (0,03) 0,11 (0,02) 0,31 (0,03) 0,64 (0,05)
1,8 0,10 (0,01) 0,21 (0,01) 0,29 (0,03) 0,12 (0,02) 0,15 (0,02) 0,20 (0,02) 0,10 (0,02 0,34 (0,04) 0,61 (0,03)
2,0 0,11 (0,01) 0,20 (0,02) 0,30 (0,02) 0,11 (0,01) 0,14 (0,01) 0,21 (0,03) 0,09 (0,01) 0,32 (0,03) 0,56 (0,03)

Los resultados se expresan como la media (DE).

4.3. Evaluación de la sensibilidad a antibióticos

Se evaluó la sensibilidad de las cepas a diferentes antibióticos a fin de determinar el

perfil de resistencia considerando su posible uso como cultivos iniciadores en la elaboración
de las leches fermentadas bio-enriquecidas. Los resultados demostraron que todas las cepas
empleadas fueron sensibles a todos los antibióticos aún en las menores concentraciones
ensayadas (Tabla 4.9).

Tabla 4.9. Perfil de resistencia a antibióticos en las cepas L. bulgaricus CRL871, S.

thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415

Microorganismos AMP VAN GEN KAN STR ERY CLI TET CHL
L. bulgaricus CRL871 S S S S S S S S S
S. thermophilus CRL803 S S S S S S S S S
S. macedonicus CRL415 S S S S S S S S S

Los resultados se expresaron como S= sensible; R= resistente. AMP, Ampicilina; CHL, Cloranfenicol;
CLIN, Clindamicina; ERI, Eritromicina; GEN, Gentamicina; KAN, Kanamicina; STREP,
Estreptomicina; TET, Tetraciclina; VAN, Vancomicina.

149
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.2.2. Discusión

Con el objeto de determinar la tolerancia al tracto gastrointestinal, se evaluó in vitro la

sobrevida de las cepas seleccionadas individualmente y en el producto.
L. bulgaricus CRL871 y S. thermophilus CRL803 perdieron su viabilidad a los 30 min
de incubación con pepsina a pH 2,0, mientras que S. macedonicus CRL415 resistió sólo 1 h
de incubación. Posteriormente todas las cepas perdieron su viabilidad por completo.
Se demostró y confirmó que los cultivos iniciadores empleados (L. bulgaricus, S.
thermophilus y S. macedonicus) son sensibles al paso por el tracto gastrointestinal (Conway et
al., 1987; Elli et al., 2006). Sin embargo, cuando las cepas se encuentran en una matriz
compleja como la leche fermentada, las bacterias resistieron los efectos del ácido, enzimas
digestivas y sales biliares, permitiéndoles sobrevivir al paso por el tracto digestivo y por tanto
llegar viables al intestino (Mater et al., 2005). Resultados similares fueron reportados por
otros autores (Fernández de Palencia et al., 2008; Paéz et al., 2012).
Se evaluó la resistencia de las cepas a 0,3% de oxgall dado que es la mínima cantidad
de bilis que normalmente se encuentra en el intestino (Noriega et al., 2004). En este caso, la
tolerancia a bilis se evaluó mediante el tiempo lag empleando el análisis propuesto por
Chateau et al. (1994), quien distingue 4 grupos de acuerdo a la demora en el crecimiento
inducida por el oxgall respecto al control sin oxgall: Resistentes [demora en el crecimiento (d)
≤ 15 min], Tolerantes (15 < d ≤ 40 min), Débilmente tolerantes (40 < d ≤ 60 min) y Sensibles
(d > 60 min). Sólo S. macedonicus CRL415 demostró ser débilmente tolerante a bilis,
mientras que las otras 2 especies fueron totalmente sensibles.
Por su parte, cuando se determinó la resistencia a diferentes concentraciones de bilis,
se observó que L. bulgaricus fue sensible a la menor concentración evaluada (0,2 %), al igual
que S. thermophilus CRL803 el cual sólo toleró hasta un 0,4 % de oxgall. En cambio, S.
macedonicus CRL803 presentó un buen crecimiento en la menor concentración de bilis (0,2
% oxgall), e incluso incrementó 3 veces su valor de DO a las 12 h frente a la mayor
concentración de oxgall (2% oxgall). Esto significa que S. macedonicus posee una gran
capacidad de adaptación a la presencia de bilis, sugiriendo la posible presencia de enzimas
capaces de deconjugar los ácidos biliares y así permitir su crecimiento. Contrariamente L.
bulgaricus CRL871 y S. thermophilus CRL803 fueron incapaces de crecer en presencia de
bilis, coincidiendo parcialmente con lo observado por otros autores, donde si bien ambas
especies de bacterias lácticas pueden crecer en presencia de bilis, ésta capacidad varía entre

150
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

diferentes cepas (Lye et al., 2010; Pereira et al., 2002; Pigeon et al., 2002; Vinderola et al.,
2003).
La evaluación de la sensibilidad de las BAL a diferentes antibióticos siguiendo las
normas de la EFSA (European Food Safety Authority) (EFSA/FEEDAP, 2012), permitió
demostrar que ninguna de las cepas presentó resistencia frente a los antibióticos evaluados.
Por lo tanto las cepas pueden considerarse seguras y aptas para su uso en alimentos.
La funcionalidad de la leche fermentada bio-enriquecida será evaluada in vivo en un
modelo animal de deficiencia de folatos.

151
Resultados Elaboración de un producto fermentado enriquecido en folatos

4.3. Conclusiones parciales

Se determinó que la combinación óptima de cepas productoras correspondió a la

mezcla S. thermophilus CRL803 – S. macedonicus CRL415 – L. bulgaricus CRL871 –en una
relación coco:bacilo 2:1, por ser la que sintetizó la mayor concentración de folatos a 42ºC. El
nivel de vitamina en leche dependió principalmente de la combinación de cepas, como así
también de la temperatura y tiempo de fermentación. Basado en ello, se determinó que las
condiciones óptimas de fermentación fueron: T=42ºC; t= 6 h. Se elaboró una leche
fermentada naturalmente enriquecida en folatos que presentó una concentración final de
folatos de 180 ± 7 µg/L, aportando un 10% IDR para folatos en adultos y 20% IDR para
niños, con un grado de acidez media (pH: 5,0 – 5,2 y acidez titulable: 0,6 – 0,8% de ácido
láctico). La concentración de folatos en el producto bio-enriquecido permaneció estable a 4–
6ºC durante 28 d, manteniéndose el % IDR. En la leche fermentada bio-enriquecida las cepas
conservaron su viabilidad celular, sin modificaciones del pH y acidez, y sin sinéresis visible
durante su almacenamiento a 4–6ºC.
Se evaluó in vitro en condiciones simuladas la tolerancia al tracto gastrointestinal,
observándose que ninguna de las BAL en medio de cultivo sobrevivió las condiciones
simuladas. Sin embargo, todas las cepas sobrevivieron a las condiciones del tracto
gastrointestinal cuando formaron parte de la leche fermentada bio-enriquecida, indicando que
la matriz láctea protegió los cultivos iniciadores.
L. bulgaricus CRL871 y S. thermophilus CRL803 en cultivos puros fueron sensibles a
las sales biliares, mientras que S. macedonicus CRL415 fue débilmente tolerante.
Además todas las cepas resultaron sensibles a todos los antibióticos probados.
Como la leche fermentada seleccionada presentó características similares a la del
yogur, y su cultivo iniciador está constituido posee una cepa de L. bulgaricus y otra de S.
thermophilus, se propone considerarla un yogur adicionado naturalmente bio-enriquecido en
folatos, donde el microorganismo adicionado es la cepa S. macedonicus CRL415 con el objeto
de incrementar la concentración de folatos.

152
Valooraciónn de la eficaciia del alimento
a o bio-eenriquecido
coon folattos, pro
oducidoos por las
l BAL L selecccionadaas,
mediaante enssayos inn vivo (modellos animmales)

1. D d deficiencia dde fola

Desarrrollo dee un moodelo de atos

2. Evvaluaciión de la
l lechee fermeentada naturaalmentee bio-
enrriquecidda en folatos
fo een el modelo
m de
d deficciencia
a de
ffolatoss

3. Efectoo de la leche fe
fermenttada na aturalm
mente biio-
enriquuecida en folaatos en la prevvenciónn de la
deficien
d ncia dee folatoss
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5. Valoración de la eficacia del alimento bio-enriquecido con folatos,

producidos por las BAL seleccionadas, mediante ensayos in vivo

5.1. Desarrollo de un modelo de deficiencia de folatos

Con el objeto de valorar la efectividad de la leche fermentada (LF) bio-enriquecida

para la recuperación y/o prevención de la deficiencia de folatos, se puso a punto un modelo de
deficiencia de folatos empleando ratones BALB/c. Para ello se evaluó el tiempo de
alimentación, uso del antibiótico succinilsulfatiazol 1% (ATB) y edad de los animales
(infantes y adultos) según esquema 5.1:

Dieta de composición definida (DCD)

conteniendo 2 mg ácido fólico/kg Ci+ATB
suplementada con succinilsulfatiazol 1%

Dieta de composición definida certificada

libre de folato (DCD-SF) suplementada Di+ATB
BALB/c infantes con succinilsulfatiazol 1%
(3 semanas) 42 d
Dieta de composición definida (DCD)
Ci
conteniendo 2 mg ácido fólico/kg dieta

Dieta de composición definida certificada

Di
libre de folato (DCD-SF)

Dieta de composición definida (DCD)

conteniendo 2 mg ácido fólico/kg Ca+ATB
suplementada con succinilsulfatiazol 1%

Dieta de composición definida certificada

libre de folato (DCD-SF) suplementada Da+ATB
BALB/c adultos con succinilsulfatiazol 1%
(6 semanas) 42 d
Dieta de composición definida (DCD)
Ca
conteniendo 2 mg ácido fólico/kg dieta

Dieta de composición definida certificada Da

libre de folato (DCD-SF)

Esquema 5.1. Esquema representativo del protocolo de alimentación empleando dieta de composición
definida (DCD) con 2 mg ácido fólico/kg de dieta y dieta de composición definida certificada libre de
folatos (DCD-SF), con o sin el agregado de succinilsulfatiazol 1% (ATB). Ratones infantes y adultos
se alimentan durante 42 d con la correspondiente dieta. El tiempo se expresa en días (d).

154
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Las muestras de sangre entera y órganos fueron tomadas cada 7 d durante 42 d, y se

evaluaron los siguientes parámetros:
a. Peso corporal;
b. Consumo de alimento;
c. Peso de órganos (hígado, bazo y riñón);
d. Relación peso de órgano/ peso corporal (PO/PC);
e. Translocación bacteriana a hígado y bazo: recuento de colonias en MRS, BHI y McConkey;
f. Hemograma;
g. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera;

5.1.1. Resultados

5.1.1.1. Peso corporal y consumo de alimento

Los animales infantes del grupo experimental (Di) presentaron un crecimiento y

ganancia de peso sostenida en el tiempo, alcanzando un peso final aproximado de 25 ± 2 g
(Figura 5.1A), que fue similar a los determinados en los grupos controles (Ci). Todos los
grupos de animales adultos evaluados mantuvieron el peso durante todo el ensayo en
presencia o ausencia de ATB (Figura 5.1A). Respecto al consumo de alimento, todos los
grupos experimentales mostraron una ingesta promedio de 3,2 ± 0,2 g/d/ratón (Figura 5.1B).
Ninguna de las dietas evaluadas, ni la presencia de ATB, afectaron el desarrollo de los
animales.

A B
45 5
Consumo alimento (g/d/r)

40
Peso corporal (g)

35 4
30
3
25
20 2
15
10 1
5
0 0
0 7 14 21 28 35 42 1 7 14 21 28 35 42
Tiempo (d) Tiempo (d)

Ci+ATB Di+ATB Ci Di Ca+ATB Da+ATB Ca Da

Figura 5.1. Parámetros de crecimiento animal. A) Peso corporal (g) y B) Consumo de alimento
(g/d/ratón). El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE.

155
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.1.1.2. Peso de órganos y relación peso de órganos/peso corporal (PO/PC)

El peso de los órganos en los grupos de ratones infantes alimentados con la dieta libre
de folatos (con o sin ATB) fueron similares a sus respectivos controles (Figura 5.2). La
relación PO/PC (Tabla 5.1) no mostró variaciones significativas respecto a los grupos Ci. En
el caso de los animales adultos no se observaron diferencias significativas en ninguno de los
grupos deficientes (con o sin ATB) respecto a los grupos Ca (Tabla 5.1) y la relación PO/PC
se mantuvo constante.

A 2,50
B 0,16
2,00 0,14

gramos
0,12
gramos

1,50 0,10
0,08
1,00
0,06
0,50 0,04
0,02
0,00 0,00
0 7 14 21 28 35 42 0 7 14 21 28 35 42
Tiempo (d) Tiempo (d)

C 0,6
Ci+ATB
0,5
Di+ATB
gramos

0,4 Ci
0,3 Di
0,2 Ca+ATB
0,1 Da+ATB
0 Ca
0 7 14 21 28 35 42
Da
Tiempo (d)

Figura 5.2. Peso de Hígado (A), Bazo (B) y Riñones (C). Ci+ATB: grupo control infantes
alimentados con DCD suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Di+ATB: grupo deficiente infantes
alimentados con DCD-SF suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Ci: grupo control infantes
alimentados con DCD; Di: grupo deficiente infantes alimentados con DCD-SF; Ca+ATB: grupo
control adultos alimentados con DCD suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Da+ATB: grupo
deficiente adultos alimentados con DCD-SF suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Ca: grupo
control adultos alimentados con DCD; Da: grupo deficiente adultos alimentados con DCD-SF. El
tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE.

156
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.1. Relación Peso de órganos – Peso corporal (%)* en animales infantes (A) y adultos (B)
A)
Tiempo Ci+ATB Di+ATB Ci Di
(d)* Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón
7 6,56 0,36 1,51 5,53 0,52 1,50 5,87 0,42 1,48 5,36 0,51 1,58
14 5,27 0,44 1,61 5,48 0,46 1,39 4,63 0,36 1,36 5,44 0,40 1,21
21 5,13 0,35 1,56 4,81 0,43 1,24 4,33 0,36 1,30 5,32 0,42 1,29
28 5,46 0,31 1,43 5,19 0,44 1,25 5,75 0,31 1,28 6,89 0,43 1,29
35 6,21 0,41 1,43 5,95 0,41 1,42 5,66 0,37 1,16 6,57 0,37 1,29
42 5,63 0,43 1,32 5,80 0,40 1,27 5,30 0,34 1,20 6,00 0,42 1,32

B)
Tiempo Ca+ATB Da+ATB Ca Da
(d)* Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón
7 5,46 0,37 1,43 5,19 0,38 1,25 5,75 0,37 1,28 6,89 0,39 1,29
14 6,21 0,48 1,43 5,95 0,41 1,42 5,66 0,37 1,16 6,57 0,44 1,29
21 5,63 0,40 1,32 5,80 0,43 1,27 5,30 0,40 1,20 6,00 0,38 1,32
28 5,51 0,42 1,20 5,81 0,37 1,44 5,07 0,33 1,02 5,76 0,40 1,19
35 5,36 0,35 1,22 5,58 0,38 1,28 5,12 0,35 1,01 5,72 0,32 1,35
42 5,29 0,40 1,15 5,47 0,34 1,27 5,20 0,34 0,95 5,62 0,35 1,28

Ci+ATB: grupo control infantes alimentados con DCD suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Di+ATB: grupo deficiente infantes alimentados con DCD-
SF suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Ci: grupo control infantes alimentados con DCD; Di: grupo deficiente infantes alimentados con DCD-SF;
Ca+ATB: grupo control adultos alimentados con DCD suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Da+ATB: grupo deficiente adultos alimentados con DCD-SF
suplementada con succinilsulfatiazol 1%; Ca: grupo control adultos alimentados con DCD; Da: grupo deficiente adultos alimentados con DCD-SF. *El tiempo
se expresa en días (d).
157
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.1.1.3. Translocación bacteriana a órganos

Se evaluó el pasaje de bacterias o translocación bacteriana a hígado y bazo, a fin de

determinar si la deficiencia de folatos, el tratamiento con ATB, o una combinación alteraría la
permeabilidad de la pared intestinal. Diluciones seriadas de homogenatos de hígado, bazo y
riñón fueron sembradas en MRS (lactobacilos), McConkey (enterobacterias) y BHI
(microorganismos nutricionalmente exigentes).
No se observó crecimiento en los diferentes medios agarizados luego de 48 h de
incubación a 37ºC, indicando que ni la deficiencia de vitamina ni el tratamiento con ATB o la
combinación de ambos alteró la permeabilidad intestinal, impidiendo la translocación
bacteriana.

5.1.1.4. Hemograma

Se realizó el recuento total y diferencial de leucocitos en sangre periférica con el

objeto de determinar si la deficiencia de folatos produjo alguna modificación en la morfología
y recuento de leucocitos. La ausencia de folatos en la dieta no indujo cambios significativos ni
en el recuento (total y diferencial) de leucocitos ni en su morfología (Figura 5.3).
Los folatos son esenciales en el proceso eritropoyético, ya que son precursores de la
síntesis de ADN. Su deficiencia afecta la maduración de los eritrocitos y síntesis de
hemoglobina generando cambios morfológicos apreciables como incremento del tamaño
celular sin palidez central. A medida que la deficiencia se acentúa, el tamaño aumenta
llegando a producir incremento de los índices hematimétricos (VCM, HCM y CHCM) con
disminución de la concentración de hemoglobina y alteraciones detectables en el extendido de
sangre, que si se acompañan de sintomatología clínica el diagnóstico es anemia
megaloblástica. Dado que esta anemia puede ser causada por deficiencia de folatos o vitamina
B12, el diagnóstico diferencial se realiza midiendo la concentración de folatos y/o vitamina
B12 en suero o plasma (Wickramasinghe, 2006).
Como parte del estudio hematológico, se realizó:
a. Recuento total de glóbulos rojos y hematocrito;
b. Concentración de hemoglobina;
c. Índices hematimétricos;
d. Evaluación morfológica del extendido de sangre;

158
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Los recuentos totales y diferenciales de leucocitos y las concentraciones de

hemoglobina en los grupos infantes y adultos alimentados con la dieta libre de ácido fólico no
mostraron diferencias respecto a los grupos controles, independientemente de la presencia o
ausencia de ATB. Por su parte, el análisis de los índices hematimétricos reveló que sólo los
grupos Di y Di+ATB presentaron valores de VCM (Tabla 5.2) superiores pero no
significativos, respecto a los grupos controles, a los 14 d de alimentación. El resto de los
grupos evaluados (Ci; Ci+ATB; Ca; Ca+ATB; Da y Da+ATB) tuvieron valores normales
(Tabla 5.2 y 5.3). El examen microscópico de los extendidos de sangre periférica no mostró
alteraciones significativas de los elementos en general en ninguno de los grupos
experimentales.

A 8
B 7
Linfocitos (109 cél/L)
Leucocitos (109 cél/L)

7 6
6 5
5
4
4
3
3
2 2
1 1
0 0
7 14 21 28 35 42 7 14 21 28 35 42
Tiempo (d) Tiempo (d)

C 1,6 Ci+ATB
PMNN (109 cél/L)

1,2 Di+ATB
Ci
0,8 Di
Ca+ATB
0,4
Da+ATB
0 Ca
7 14 21 28 35 42
Da
Tiempo (d)

Figura 5.3. Recuento total y diferencial de leucocitos en sangre periférica. A) Recuento total de
leucocitos (109 cél/L); B) recuento de linfocitos (109 cél/L) y C) Recuento de PMNN (109 cél/L).
PMNN: Polimorfonucleares neutrófilos. El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan
como la media ± DE.

159
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.2. Evaluación de la serie roja en animales infantes (A) y adultos (B) durante el
período de depleción

A)
GR Hb Hto VCM HCM CHCM Plaquetas
Grupo d* 12
10 cél/L g/L % fL pg g/L 109 plaq/L
7 6,21 (0,31) 126 (6) 40 (3) 54,2 (2,7) 16,3 (0,8) 298 (14) 1100 (55)
14 6,63 (0,38) 128 (5) 42 (3) 54,7 (2,9) 16,8 (0,7) 307 (10) 1108 (54)
21 6,24 (0,36) 130 (6) 45 (4) 54,9 (2,4) 16,4 (0,6) 301 (12) 1245 (62)
Ci+ATB
28 6,81 (0,34) 131 (4) 44 (2) 54,6 (2,7) 16,6 (0,8) 304 (12) 1183 (59)
35 6,48 (0,32) 124 (5) 42 (3) 54,2 (2,5) 16,6 (0,6) 297 (16) 1185 (54)
42 6,90 (0,35) 127 (7) 45 (2) 54,1 (2,7) 16,4 (0,3) 302 (14) 1189 (59)
7 6,45 (0,37) 129 (3) 45 (4) 55,6 (2,8) 16,2 (0,4) 291 (14) 1195 (54)
14 6,83 (0,39) 132 (4) 47 (3) 60,1 (3,1) 16,9 (0,7) 281 (12) 1284 (64)
21 6,81 (0,34) 124 (5) 41 (3) 59,4 (3,1) 16,4 (0,6) 274 (13) 1102 (55)
Di+ATB
28 6,92 (0,35) 130 (6) 44 (1) 60,3 (3,4) 16,9 (0,4) 284 (14) 1242 (62)
35 6,94 (0,35) 125 (5) 45 (2) 59,8 (2,4) 16,8 (0,7) 281 (13) 1354 (69)
42 6,70 (0,34) 127 (6) 42 (3) 61,3 (2,8) 16,9 (0,7) 287 (15) 1219 (61)
7 6,58 (0,33) 128 (7) 43 (2) 54,3 (2,7) 16,1 (0,2) 287 (14) 1129 (56)
14 6,27 (0,41) 130 (7) 45 (4) 54,4 (2,8) 15,7 (0,3) 289 (13) 829 (41)
21 6,58 (0,33) 124 (5) 41 (3) 54,8 (2,1) 16,1 (0,4) 310 (10) 1102 (55)
Ci
28 7,02 (0,35) 131 (4) 45 (1) 54,7 (2,6) 16,6 (0,5) 290 (12) 1209 (60)
35 6,84 (0,34) 129 (6) 43 (3) 55,2 (2,9) 16,7 (0,4) 308 (13) 1352 (68)
42 6,98 (0,35) 130 (7) 44 (2) 55,1 (3,1) 16,3 (0,5) 288 (12) 1198 (60)
7 6,60 (0,33) 124 (4) 40 (3) 55,3 (2,1) 16,3 (0,6) 294 (14) 1119 (56)
14 6,87 (0,34) 120 (3) 40 (2) 59,1 (2,4) 17,5 (0,7) 296 (13) 1540 (77)
21 6,20 (0,31) 123 (5) 42 (3) 59,4 (3,1) 17,1 (0,2) 265 (14) 1120 (56)
Di
28 6,30 (0,32) 125 (6) 41 (1) 60,2 (2,7) 17,0 (0,5) 280 (13) 1134 (57)
35 6,12 (0,29) 121 (2) 40 (3) 59,6 (2,4) 17,2 (0,3) 274 (12) 1210 (61)
42 6,20 (0,31) 122 (3) 42 (2) 60,6 (3,1) 17,1 (0,4) 283 (15) 1165 (58)

GR: glóbulos rojos; Hb: hemoglobina; Hto: hematocrito; VCM: volumen corpuscular medio; HCM:
hemoglobina corpuscular media; CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media. *El
tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media (DE).

160
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

B)
GR Hb Hto VCM HCM CHCM Plaquetas
Grupos d*
1012 cél/L g/L % fL pg g/L 109/L
7 6,40 (0,38) 120 (4) 40 (2) 54,3 (2,4) 16,2 (0,3) 296(15) 1143 (69)
14 6,94 (0,42) 114 (3) 38 (2) 54,3 (2,5) 16,4 (0,4) 302 (14) 1194 (72)
21 6,48 (0,39) 124 (5) 42 (3) 54,2 (2,6) 16,6 (0,4) 297 (12) 1185 (71)
Ca+ATB
28 6,57 (0,35) 126 (7) 43 (2) 54,3 (2,4) 16,3 (0,3) 304 (15) 1212 (73)
35 6,58 (0,39) 124 (6) 41 (3) 54,8 (2,7) 16,1 (0,2) 310 (18) 1102 (54)
42 6,43 (0,34) 127 (7) 42 (3) 54,6 (2,9) 16,3 (0,4) 295 (16) 1167 (70)
7 6,30 (0,38) 123 (4) 43 (4) 56,7 (3,1) 16,3 (0,4) 308 (13) 1130 (68)
14 6,89 (0,41) 124 (6) 42 (3) 55,8 (2,7) 16,7 (0,3) 318 (17) 1499 (90)
21 6,40 (0,32) 126 (4) 43 (3) 59,4 (2,4) 17,4 (0,5) 289 (14) 1356 (75)
Da+ATB
28 6,50 (0,39) 124 (5) 45 (4) 60,2 (2,8) 17,2 (0,4) 168 (15) 1136 (68)
35 6,70 (0,42) 123 (5) 41 (2) 60,1 (2,6) 17,1 (0,3) 176 (13) 1214 (73)
42 6,80 (0,41) 125 (8) 42 (3) 60,2 (2,4) 17,2 (0,4) 302 (15) 1234 (54)
7 6,20 (0,37) 121 (2) 42 (4) 54,6 (2,1) 16,4 (0,3) 294 (14) 1204 (58)
14 6,28 (0,44) 118 (3) 39 (5) 54,4 (2,3) 16,2 (0,4) 198 (16) 1159 (70)
21 5,80 (0,35) 124 (5) 41 (3) 54,6 (2,3) 16,3 (0,4) 314 (14) 1250 (68)
Ca
28 6,11 (0,37) 126 (3) 41 (2) 54,3 (2,6) 16,4 (0,3) 302 (16) 1134 (35)
35 5,90 (0,33) 128 (7) 43 (4) 55,4 (2,7) 16,5 (0,2) 307 (12) 1300 (75)
42 6,20 (0,37) 124 (6) 42 (5) 54,7 (2,6) 16,7 (0,5) 297 (16) 1128 (34)
7 6,70 (0,41) 121 (3) 42 (4) 53,4 (2,1) 16,4 (0,5) 189 (12) 1156 (37)
14 6,24 (0,43) 114 (4) 39 (4) 55,1 (2,5) 15,7 (0,3) 286 (11) 1579 (79)
21 6,50 (0,39) 124 (3) 41 (2) 57,8 (2,3) 16,8 (0,4) 198 (13) 1432 (84)
Da
28 6,80 (0,41) 123 (6) 43 (3) 59,3 (2,5) 16,9 (0,6) 291 (14) 1254 (74)
35 7,01 (0,42) 121 (4) 42 (2) 60,4 (2,8) 17,2 (0,7) 271 (13) 1532 (84)
a
42 6,90 (0,41) 127 (5) 40 (3) 58,5 (2,6) 16,9 (0,6) 288 (13) 1324 (58)

GR: glóbulos rojos; Hb: hemoglobina; Hto: hematocrito; VCM: volumen corpuscular medio; HCM:
hemoglobina corpuscular media; CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media. *El
tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media (DE).

161
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.1.1.5. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera

Dado que la deficiencia de folatos es un proceso subclínico que se establece

lentamente en el tiempo, sin producir modificaciones hematológicas y clínicas visibles
durante su desarrollo, la única forma de diagnosticarla es la determinación específica de la
concentración de folatos y vitamina B12 en suero o plasma como también en glóbulos rojos o
sangre entera. Frente a una deficiencia, no se detectan disminuciones significativas en los
niveles eritrocitarios. Sin embargo, los folatos plasmáticos son mucho más sensibles a la
deficiencia de esta vitamina constituyendo una medición sensible para la detección temprana
de la deficiencia de folatos y así evitar su evolución.

A 600
b
B 70
b b b b b b
b b b 60 b b
500 b b b bb b b b b b b b b b b
bbb
Folatos (µg/L)

b b b b
b bb 50 b b
400 a b b
a aa a a a a b
a a a aa aa 40 a
300 b
30 aa
a
200 dd dd
20 dd
100 10 cc cc cc cc cc
0 0
0 7 14 21 28 35 42 0 7 14 21 28 35 42
Tiempo (d) Tiempo (d)
Ci+ATB Di+ATB Ci Di Ca+ATB Da+ATB Ca Da

Figura 5.4. Concentración de folatos (µg/L) en sangre entera (A) y plasma (B) durante el período de
depleción (42 d). El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE,
letras distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

La determinación de la concentración de folatos en sangre entera no mostró

diferencias significativas en ninguno de los grupos D evaluados con y sin ATB, respecto de
los grupos C y en los tiempos ensayados (Figura 5.4A). Sin embargo, la medición de folatos
plasmáticos permitió detectar una disminución significativa de su concentración en los grupos
D respecto a los grupos C, con diferencias significativas entre los grupos D (Figura 5.4B).
Los grupos Di y Di+ATB mostraron una reducción en la concentración de folatos
plasmáticos respecto a los grupos Ci y Ci+ATB (Figura 5.4B) a los 14 d de alimentación. En
el caso de los grupo Da y Da+ATB también presentaron valores menores respecto a los
grupos Ca y Ca+ATB (Figura 5.4B). De esta manera, la deficiencia se visualizó a los 28 d
para el grupo Da y a los 21 d para el grupo Da+ATB, mientras que en los grupos Di y
Di+ATB fue evidente a los 14 d. Esto demuestra que en el caso de los animales adultos, la

162
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

alimentación previa con una dieta normal retardó la deficiencia, haciendo necesario el
agregado de ATB para reducir el tiempo de desarrollo de la misma. En cambio, en los
animales infantes, donde al momento del destete fueron alimentados con la dieta carente de
ácido fólico, desarrollaron la deficiencia luego de 2 semanas (14 d) de alimentación
independientemente de la presencia o ausencia de ATB.

163
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.1.2. Discusión

Se puso a punto el modelo de deficiencia de folatos en ratones normales de 3

(infantes) y 6 semanas (adultos) de edad usando una dieta libre de folatos con el objeto de
evaluar la efectividad de la leche fermentada bio-enriquecida elaborada con las cepas L.
bulgaricus CRL871, S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415.
Los resultados demostraron que la ni la dieta libre de folatos ni la administración de
ATB causó pérdida de peso ni alteración del comportamiento de los animales durante todo el
ensayo. Tampoco se observó diarrea, alteración en el pelaje de los animales ni en su
comportamiento general como signos de nerviosismo, pérdida del apetito, o letargia. Estos
resultados fueron similares a los reportados previamente donde el comportamiento y
crecimiento de ratones no fue alterado por la deficiencia de folatos (Cravo et al., 1992; Knock
et al., 2006; Lindzon et al., 2009).
Los animales infantes con y sin ATB, presentaron relaciones PO/PC similares a los
grupos C, indicando que no hubo alteraciones patológicas en los órganos.
No se observó crecimiento de microorganismos (enterobacterias, lactobacilos y otros)
en ninguno de los medios selectivos indicando que ni la deficiencia de folatos ni el ATB
indujeron alteraciones de la permeabilidad intestinal que permita la translocación bacteriana a
hígado y bazo.
El hemograma completo no mostró modificaciones significativas en los recuentos
(total y diferencial) de leucocitos, ni en los parámetros hematológicos de la serie roja en
ninguno de los grupos experimentales estudiados. Estos resultados coinciden con aquellos
observados por otros autores en modelos de deficiencia de folatos empleando
succinilsulfatiazol (Burgoon et al., 2002; Challet et al., 2013). Sin embargo se observó un
ligero incremento no significativo en el VCM en los grupos Di con y sin ATB a partir de los
14 d de alimentación, a diferencia de los grupos Da y Da+ATB donde no hubo
modificaciones durante todo el período de alimentación, lo que demostró la progresión de la
deficiencia de folatos.
Las concentraciones de folatos determinadas en sangre entera, no variaron
significativamente en ninguno de los grupos D evaluados respecto a los grupos C. Estos
resultados coinciden con aquellos reportados por otros autores (Challet et al., 2013;
Unnikrishnan et al., 2011) donde la edad de los animales es un factor que determinar el
tiempo requerido para que se establezca la deficiencia. En el caso de animales adultos, se
necesitaron más de 30 d de alimentación con dieta deficiente y el empleo de ATB a fin de
164
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

poder desarrollar la deficiencia. Contrariamente, la determinación de las concentraciones de

folatos en plasma permitió detectar la deficiencia de folatos. Los grupos Di y Di+ATB
presentaron los menores niveles a los 14 d de alimentación mientras que en los grupos Da y
Da+ATB la deficiencia se observó a los 28 y 21 d respectivamente. Estos resultados indicaron
que la alimentación previa con una dieta de composición definida conteniendo 2 mg de ácido
fólico/Kg, produjo una demora entre 7 y 14 d para el establecimiento de la deficiencia en los
animales adultos (Da y Da+ATB) debido a la existencia de depósitos de folatos en el
organismo, a diferencia de los grupos Di y Di+ATB, alimentados con la dieta deficiente desde
el destete hasta el final del experimento. La administración de ATB sólo tuvo influencia en
los animales adultos, dado que el grupo Da+ATB desarrolló la deficiencia 7 d antes que el
grupo Da. Eso ese debe a que el succinilsulfatiazol es un ATB no absorbible que se emplea
normalmente en modelos de deficiencia de folatos dado que disminuye la microbiota normal
del intestino que posee la capacidad de sintetizar los folatos que se absorben por al organismo
(Champier et al., 2012; Fournier et al., 2002; Said et al., 2000).
Basados en estos resultados, se puso a punto el modelo de deficiencia de folatos en
ratones normales, que comprende ratones BALB/c de 3 semanas de edad (al destete)
alimentados durante 14 d con una dieta libre de ácido fólico.

165
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.2. Evaluación de la leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en

folatos en el modelo de deficiencia de folatos

Se evaluó si la leche fermentada (LF) naturalmente bio-enriquecida en la vitamina era

capaz de restituir los niveles de folatos plasmáticos en animales deficientes y así constituir
una alternativa viable a la fortificación con AF. Para ello se empleó el modelo animal de
deficiencia de folatos previamente descripto de acuerdo al siguiente protocolo de
alimentación:

BALB/c infantes
(3 semanas) 0d
Período de depleción

14 d

7d
N (DCD) D (DCD-SF)
(n=8) (n=8)

35 d 14 d
Período de repleción

21 d
21 d

N (DCD) D (DCD-SF) R (DCD) LF-B (DCD-SF LF (DCD-SF 28 d

(n=8) (n=8) (n=8) + LF) (n=8) + LF) (n=8)

35 d

Esquema 5.2. Protocolo de alimentación empleando dieta de composición definida con 2 mg ácido
fólico/kg de dieta (DCD) y dieta de composición definida certificada libre de folatos (DCD-SF). N:
grupo control normal; D: grupo deficiente; R: grupo repletado con DCD; LF-B: grupo repletado con
DCD-SF + leche fermentada bio-enriquecida; LF: grupo repletado con DCD-SF + leche fermentada no
bio-enriquecida. n= número de animales/punto/grupo. El tiempo se expresa en días (d).

Ratones BALB/c infantes (al destete) fueron divididos en 2 grupos: a) grupo N:

ratones alimentados con dieta de composición definida conteniendo 2 mg ácido fólico/kg de
dieta (DCD), y b) grupo D: ratones alimentados, durante 14 d, con dieta de composición
definida certificada libre de AF (DCD-SF).
Finalizado el período de depleción, el grupo D se dividió en 4 grupos: a) Grupo D: los
animales continúan con la alimentación con DCD-SF (control de depleción); b) grupo R:
animales repletados con DCD (control de repleción); c) grupo LF-B: animales alimentados
con DCD-SF con el agregado de leche fermentada bio-enriquecida, y d) grupo LF: animales
alimentados con DCD-SF con el agregado de una leche fermentada elaborada con cepas de L.
bulgaricus y S. thermophilus no productoras de folatos (control de leche fermentada). Los

166
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

animales de cada grupo fueron alimentados durante 21 d con sus correspondientes dietas y
leches fermentadas (Período de repleción). El grupo N fue alimentado con DCD durante todo
el ensayo (35 d) con DCD.

Durante el período de depleción (0 a 14 d) y repleción (15 a 35 d) se tomaron muestras

de órganos y sangre entera, y se evaluaron los siguientes parámetros:
a. Peso corporal;
b. Consumo de alimento;
c. Peso de órganos (hígado, bazo y riñón);
d. Relación peso de órgano/ peso corporal (PO/PC);
e. Hemograma;
f. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera;
g. Dosaje de folatos en órganos;
h. Dosaje de homocisteína;

5.2.1. Resultados

5.2.1.1. Peso corporal y consumo de alimento

Al final de la depleción, los grupos N y D presentaron una ganancia de peso (Figura

5.5A) y consumo de alimento sostenido en el tiempo (Figura 5.5B), sin observarse cambios en
el comportamiento general, ausencia de diarrea y otras alteraciones, indicando crecimiento
normal de los animales. Luego del período de repleción, todos los grupos experimentales
evidenciaron ganancia de peso (Figura 5.5A) sin variaciones en el consumo de alimento
(Figura 5.5B).

167
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

A B
40 4,5

Consumo alimento (g/d/r)

35 4,0
Peso corporal (g)

30 3,5
25 3,0
2,5
20
2,0
15 1,5
10 1,0
5 0,5
0 0,0
0 7 14 21 28 35 7 14 21 28 35
Período de depleción Período de repleción Período de depleción Período de repleción

Tiempo (d) Tiempo (d)

N D R Y-B Y

Figura 5.5. Peso corporal (A) y consumo de alimento (B). El peso corporal se expresó en g, y el
consumo de alimento en gramos por d por ratón (g/d/r) durante el período de depleción y repleción.
Los resultados se expresan como la media ± DE.

5.2.1.2. Peso de órganos y Relación PO/PC

Los animales D presentaron, al final de la depleción, pesos de órganos similares al

grupo N (Figura 5.6), con una relación PO/PC similar a la del grupo control. Luego de la
repleción, los grupos R, LF-B y LF no presentaron diferencias significativas en los pesos de
órganos respecto de los grupos D y N (Figura 5.6), con relaciones PO/PC similares entre
todos los grupos evaluados (Tabla 5.3).

168
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

A B
2,5 0,14
2 0,12
N
0,1
gramos

1,5 D 0,08

gramos
1 R 0,06
LF-B 0,04
0,5
LF 0,02
0 0
21 28 35 21 28 35
Tiempo (d) Tiempo (d)

C
0,6
0,5
gramos

0,4
0,3
0,2
0,1
0
21 28 35
Tiempo (d)

Figura 5.6. Peso de Hígado (A), Bazo (B) y Riñones (C) durante el período de repleción. N: grupo
control normal; D: grupo deficiente alimentado con dieta libre de folato; R: grupo repletado
alimentado con dieta suplementada (2 mg ácido fólico/kg); LF-B grupo repletado alimentado con
leche fermentada bio-enriquecida; LF: grupo repletado alimentado con leche fermentada control no
bio-enriquecida. El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE.

169
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.3. Relación Peso de órganos – Peso corporal (%) durante el período de repleción

N D R LF-B LF
d*
Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón
21 5,13 0,35 0,40 4,81 0,43 0,32 5,36 0,30 0,37 6,67 0,49 0,46 5,87 0,30 0,50
28 5,46 0,31 0,47 5,19 0,44 0,40 5,17 0,24 0,41 6,11 0,44 0,48 5,60 0,27 0,53
35 6,21 0,41 0,42 5,95 0,41 0,41 5,95 0,31 0,43 6,45 0,50 0,52 5,93 0,36 0,50

N: grupo control normal; D: grupo deficiente alimentado con dieta libre de folato; R: grupo repletado alimentado con dieta suplementada (2 mg ácido
fólico/kg); LF-B grupo repletado alimentado con leche fermentada bio-enriquecida; LF: grupo repletado alimentado con leche fermentada control no bio-
enriquecida. *El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE.
170
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.2.1.3. Hemograma

El recuento total y diferencial de leucocitos permitió determinar que al final del

período de depleción y repleción no se observaron diferencias significativas en los recuentos y
morfología de los leucocitos en los grupos respecto al grupo N (Figura 5.7).
La evaluación de la serie roja al final de la depleción en el grupo D mostró un ligero
incremento en el VCM respecto al grupo N (Tabla 5.4). Por el contrario, luego del período de
repleción, no hubo diferencias significativas en ninguno los grupos repletados (R, LF-B y LF)
respecto al grupo N (Tabla 5.4), mostrando una tendencia hacia la normalización del
hemograma.

A B
8,0 7,0
Luecocitos (109 cél/L)

Linfocitos (109 cél/L)

7,0 6,0
6,0 5,0
N
5,0
4,0
4,0 D
3,0
3,0 R
2,0 2,0
1,0 LF-B 1,0
0,0 LF 0,0
14 28 35 14 28 35
Tiempo (d) Tiempo (d)

C
1,2
PMNN (109 cél/L)

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
14 28 35
Tiempo (d)

Figura 5.7. Recuento total y diferencial de leucocitos en sangre periférica al final de la depleción (14
d) y durante la repleción (28 y 35 d). A) Recuento total de leucocitos (109 cél/L); B) recuento de
linfocitos (109 cél/L) y C) recuento de PMNN (109 cél/L). PMNN: Polimorfonucleares neutrófilos. El
tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE.

171
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.4. Evaluación de la serie roja al final del período de depleción (14 d) y durante la
repleción (28 y 35 d)

GR Hb Hto VCM HCM CHCM Plaquetas

Grupos d*
1012 cél/L g/L % fL Pg g/L 109/L
14 6,52 (0,51) 128 (7) 45 (3) 54,4 (2,6) 15,7 (0,6) 289 (17) 1124 (50)
N 28 7,21 (0,44) 130 (8) 45 (4) 54,9 (2,7) 16,4 (0,4) 301 (18) 1245 (34)
35 6,83 (0,45) 129 (5) 43 82) 55,2 (2,6) 16,7 (0,3) 308 (16) 1352(81)
14 6,79 (0,42) 120 (6) 40 (4) 59,5 (3,4) 17,5 (0,7) 290 (14) 1340 (54)
D 28 6,91 (0,43) 125 (4) 45 (3) 60,4 (2,4) 16,8 (0,6) 285 (16) 1354 (62)
35 6,24 (0,34) 126 (7) 40 (2) 60,7 (2,3) 17,2 (0,8) 287 (17) 1210 (54)
14 - - - - - - -
R 28 6,52 (0,39) 124 (5) 42 (3) 54,2 (2,7) 16,6 (0,6) 297 (14) 1185 (34)
35 6,65 (0,34) 124 (7) 41 (4) 54,8 (2,4) 16,1 (0,2) 310 (19) 1102 (21)
14 - - - - - - -
LF-B 28 6,29 (0,37) 123 (6) 42 (3) 54,8 (2,6) 17,1 (0,7) 287 (14) 1120 (28)
35 6,97 (0,46) 132 (8) 47 (4) 55,2 (2,6) 16,9 (0,6) 294 (15) 1284 (45)
14 - - - - - - -
LF 28 6,47 (0,34) 128 (5) 43 (4) 55,4 (2,7) 16,5 (0,3) 307 (14) 1300 (42)
35 6,58 (0,44) 126 (7) 44 (6) 54,4 (2,3) 16,2 (0,2) 298 (16) 1159 (37)

GR: glóbulos rojos; Hb: hemoglobina; Hto: hematocrito; VCM: volumen corpuscular medio; HCM:
hemoglobina corpuscular media; CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media; N: grupo
control normal; D: grupo deficiente; R: grupo repletado con dieta suplementada 2 mg ác. fólico/kg;
LF-B grupo repletado con leche fermentada bio-enriquecida; LF: grupo repletado con leche
fermentada control no bio-enriquecida. *El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan
como la media (DE).

5.2.1.4. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera

A los 14 d (final de la depleción), los valores de folatos plasmáticos en el grupo D

fueron significativamente inferiores (88%) respecto al grupo N (Figura 5.8A). Luego del
período de repleción, se determinaron diferencias significativas entre los grupos
experimentales. En el caso del grupo control de leche fermentada (LF), los valores fueron
inferiores a N y similares a D (Figura 5.8A). Por su parte, el grupo LF-B (leche fermentada
bio-enriquecida) tuvo valores significativamente superiores comparado a D aun menores que
los del grupo N y R. El grupo control de repleción (R) presentó valores de folatos plasmáticos
similares al grupo N.
A diferencia de lo observado en plasma, al final de la repleción los niveles de folatos en
sangre entera fueron normalizados en los grupos R y LF-B (Figura 5.8B).

172
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

A B
50 600
a a
a a 500 a
40 a a a a a

Folatos (µg/L)
Folatos (µg/L)

a
c c 400
30 b
c b b b b
e 300 b
d,e
20 d
200
10 b b b b b
b b 100
0 0
14 21 28 35 14 21 28 35
Tiempo (d) N D R LF-B LF Tiempo (d)

Figura 5.8. Concentración de folatos en plasma (A) y sangre periférica (B) durante el período de
depleción y repleción. El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ±
DE, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

5.2.1.5. Dosaje de folatos en Hígado, Bazo y Riñón

En los grupos experimentales, durante todo el ensayo, no se observaron cambios en los

niveles de folatos en hígado (Tabla 5.5). Por el contrario, las dietas usadas en el período de
repleción no fueron capaces de normalizar la concentración de la vitamina en bazo y riñón.
Sólo el grupo R fue capaz de restituir los niveles de folato, mientras que el grupo LF-B
mostró una tendencia hacia la normalización.

173
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.5. Concentración de folatos (µg de folato/g de órgano) en hígado, bazo y riñón
durante el período de repleción (21 a 35 d)

Tiempo (d)*
Órganos Grupo 21 28 35
N 1,71 (0,21) 1,22 (0,19) 1,45 (0,37)
D 1,31 (0,26) 1,06 (0,13) 1,59 (0,19)
Hígado R 1,48 (0,18) 1,56 (0,19) 1,37 (0,16)
LF-B 1,38 (0,17) 1,47 (0,22) 1,56 (0,26)
LF 1,31 (0,18) 1,33 (0,23) 1,32 (0,15)
N 3,86 (0,46) 5,23 (0,63) 4,16 (0,52)
a a
D 2,96 (0,32) 2,34 (0,28) 1,39 (0,17)a
a a
Bazo R 2,46 (0,29) 2,58 (0,31) 2,78 (0,33)b
LF-B 2,24 (0,27)a 2,65 (0,32)a 2,95 (0,31)b
a,b a,b
LF 2,11 (0,25) 2,14 (0,22) 2,23 (0,27)c
N 5,46 (0,61) 4,63 (0,51) 5,41 (0,52)
D 1,82 (0,22)b 1,94 (0,25)b 1,64 (0,21)a
Riñón R 4,14 (0,24) 4,26 (0,47) 4,47 (0,34)
LF-B 2,93 (0,31)a 3,24 (0,38) 3,47 (0,41)
a a
LF 2,63 (0,31) 2,87 (0,35) 2,98 (0,36)b

*El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media (DE). En una misma
columna, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

5.2.1.6. Dosaje de Homocisteína en plasma

La determinación de la concentración de homocisteína en plasma es uno de los

parámetros más útiles en la detección de la deficiencia de folatos debido a que participa en el
metabolismo de los folatos. La homocisteína es responsable de la transferencia de los grupos
metilos desde el 5-metilTHF hacia la metionina para formar la SAM, principal dador de
grupos metilos en las reacciones intracelulares. De esta manera, cuando se produce una
deficiencia de folatos, los niveles de homocisteína plasmática aumentan, razón por la cual
constituye un parámetro fundamental en la detección de la deficiencia de folatos.
Los animales deficientes incrementaron 8 veces los niveles de homocisteína (40,1 ±
2,1 µM) respecto al grupo N (4,5 ± 0,7 µM) (Figura 5.9).
En los animales repletados la administración de la leche fermentada enriquecida
(grupo LF-B) produjo disminución del nivel de homocisteína plasmática a partir de los 28 d
(Figura 5.9) logrando normalizar este parámetro; similar comportamiento fue observado en el

174
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

grupo R (Figura 5.9). A diferencia del grupo LF, cuyos valores de homocisteína plasmática
fueron significativamente superiores al grupo N.
70
e

Homocisteína (µM)
60 d d
50 d
b b N
40
b D
30
R
20 c c LF-B
a a a a
10 a LF
0
21 28 35
Tiempo (d)

Figura 5.9. Concentración de homocisteína en plasma (µM) durante el período de repleción (21, 28 y
35 d). El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras
distintas indican diferencia significativa (p<0,05).

175
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.2.2. Discusión

La deficiencia de folatos afecta el cierre del tubo neural en niños recién nacidos y en
los adultos conduce a la anemia megaloblástica (Blencowe et al., 2010; De Wals et al., 2007;
Eichholzer et al., 2006; Grewal et al., 2009; Morris et al., 2007). Si bien muchos países han
adoptado políticas y programas de fortificación de alimentos (Bailey et al., 2003; Bailey et
al., 2010; Jacques et al., 1999; Kim, 2004b), más precisamente de harinas, empleando AF, la
deficiencia es muy frecuente tanto en países desarrollados como sub-desarrollados
(Dhonukshe-Rutten et al., 2007; Gamble et al., 2005; Konings et al., 2001; Morris et al.,
2007). Sin embargo se ha demostrado que la ingesta de altas cantidades de AF produce
numerosos efectos adversos (Baggott et al., 2012; Bailey et al., 2009; Melnyk et al., 1999;
Ulrich et al., 2006).
Está ampliamente descripto el efecto de la fortificación de alimentos con AF sobre los
DTNs y otras patologías relacionadas a su deficiencia. También existen antecedentes de
bacterias lácticas modificadas genéticamente que sobreexpresan genes fol en modelos
animales de deficiencia (LeBlanc et al., 2010b). Sin embargo no hay antecedentes
relacionados con el uso de productos naturalmente enriquecidos en folatos pro fermentación
microbiana sobre la deficiencia de folatos usando distintos modelos animales.
Los estudios realizados in vivo demostraron que la cantidad de folatos presentes en la
leche fermentada bio-enriquecida (190 µg/L) fue efectiva y suficiente para revertir e
incrementar los niveles plasmáticos de folatos en más de un 90 % y disminuir a valores
normales la concentración de homocisteína plasmática. Este efecto fue comparable al de la
dieta control, donde la concentración de AF es 10 veces superior a los niveles de folatos en la
leche fermentada. Esto evidencia que el folato natural producido por los microorganismos es
tan efectivo como el AF, ya que éste es absorbido y transportado en el organismo con mayor
rapidez y eficiencia que los folatos naturales (Dudeja et al., 1997; Said et al., 2000; Zhao et
al., 2011). Esto se debería probablemente a que el principal tipo de folatos presente sea el 5-
metilTHF o 10-formilTHF, que son las formas más usadas por las células en las reacciones
metabólicas.
En el caso de los animales que recibieron la leche fermentada control (grupo LF)
presentaron valores comparables con los del grupo D en todos los parámetros evaluados,
demostrando que la baja cantidad de folatos normalmente presentes en una leche fermentada
es insuficiente para revertir parcialmente la deficiencia de folatos, de allí que productos
lácteos y sus derivados no son considerados una buena fuente de folatos.
176
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Dado la efectividad de la leche fermentada bio-enriquecida elaborada con las cepas

productoras de folato, en la reversión de la deficiencia de folatos, constituye una adecuada
fuente de folatos biodisponibles.

177
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.3. Efecto de la leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en folatos en

la prevención de la deficiencia de folatos

Previamente se demostró que la leche fermentada naturalmente bio-enriquecida en

folatos elaborado con las cepas L. bulgaricus CRL871, S. thermophilus CRL803 y S.
macedonicus CRL415 fue eficiente para restablecer parcialmente los niveles de folatos
plasmáticos y normalizar los folatos en sangre periférica así como la concentración plasmática
de homocisteína. De esta manera se demostró la eficiencia de la leche fermentada desarrollada
en la reversión de la deficiencia de folatos.
A partir de estos resultados, se evaluó si la leche fermentada bio-enriquecida era capaz
de prevenir la deficiencia de folatos cuando se lo administra en forma conjunta con una dieta
balanceada libre de folatos desde el inicio de la depleción.
Para ello se siguió el siguiente esquema de alimentación:

BALB/c infantes
(3 semanas) 0d
Período de alimentación

35 d 7d
14 d
21 d
N (DCD) D (DCD-SF) LF-B (DCD-SF LF (DCD-SF
(n=8) (n=8) + LF) (n=8) + LF) (n=8) 28 d
35 d

Esquema 5.3. Protocolo de alimentación empleando dieta de composición definida con 2 mg ácido
fólico/kg de dieta (DCD) y dieta de composición definida certificada libre de folatos (DCD-SF). N:
grupo control normal; D: grupo deficiente; LF-B: grupo alimentado con DCD-SF + leche fermentada
bio-enriquecida; LF: grupo alimentado con DCD-SF + leche fermentada no bio-enriquecida. n=
número de animales/punto/grupo. El tiempo se expresa en días (d).

Ratones BALB/c infantes (al destete) fueron divididos en 4 grupos: a) grupo N:

ratones alimentados con dieta de composición definida conteniendo 2 mg ácido fólico/kg de
dieta (DCD); b) grupo D: ratones alimentados con dieta de composición definida certificada
libre de folato (DCD-SF); c) grupo LF-B: ratones alimentados con DCD-SF junto con la leche
fermentada bio-enriquecida, y d) grupo LF: animales alimentados con DCD-SF junto con un
leche fermentada elaborada con cepas de L. bulgaricus y S. thermophilus no productoras de
folatos (control de leche fermentada). La duración del ensayo fue 35 d.
Cada 7 d se tomaron muestras de órganos y sangre entera, y se evaluaron los
siguientes parámetros:

178
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

a. Peso corporal;
b. Consumo de alimento;
c. Peso de órganos (hígado, bazo y riñón);
d. Relación peso de órgano/ peso corporal (PO/PC);
e. Hemograma;
f. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera;
h. Dosaje de homocisteína;

5.3.1. Resultados

5.3.1.1. Peso corporal y consumo de alimento

Todos los grupos experimentales mostraron una ganancia de peso y consumo de

alimento sostenido (Figura 5.10), sin diferencias significativas respecto al grupo N.

A B
40 4
Consumo alimento (g/d/r)

35 3,5
Peso corporal (g)

30 3
N
25 2,5
20 D 2
15 LF-B 1,5
10 1
LF
5 0,5
0 0
0 7 14 21 28 35 1 7 14 21 28 35
Tiempo (d) Tiempo (d)

Figura 5.10. Peso corporal (A) y consumo de alimento (B). El peso corporal se expresa en g, y el
consumo de alimento en gramos por d por ratón (g/d/r). N: grupo control normal; D: grupo deficiente;
LF-B: grupo alimentado con leche fermentada bio-enriquecida; LF: grupo alimentado con leche
fermentada control no bio-enriquecida. El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan
como la media ± DE.

179
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.3.1.2. Peso de órganos y Relación PO/PC

Al final del experimento, ningún grupo experimental presentó pérdidas de peso

significativas respecto al grupo N en ningún órgano (hígado, bazo y riñón) (Figura 5.11), por
lo tanto no se observaron modificaciones significativas en la relación PO/PC.

A B
2,5 0,16
0,14
2 0,12
gramos

1,5 0,1

gramos
N
0,08
1 D 0,06
0,5 LF-B 0,04
0,02
LF
0 0
7 14 21 28 35 7 14 21 28 35
Tiempo (d) Tiempo (d)

C
0,6
0,5
0,4
gramos

0,3
0,2
0,1
0
7 14 21 28 35
Tiempo (d)

Figura 5.11. Peso de Hígado (A), Bazo (B) y Riñones (C) en gramos (g). N: grupo control normal; D:
grupo deficiente; LF-B: grupo alimentado con leche fermentada bio-enriquecida; LF: grupo
alimentado con leche fermentada control no bio-enriquecida. El tiempo se expresa en días (d). Los
resultados se expresan como la media ± DE.

180
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.6. Relación Peso de órganos – Peso corporal (%)

N D LF-B LF
d* Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón Hígado Bazo Riñón
7 8,9 0,48 1,9 8,3 0,84 2,2 8,7 0,64 2,1 9,1 0,64 2,1
14 5,1 0,45 1,6 7,1 0,57 1,8 6,9 0,57 1,9 6,7 0,43 2,5
21 4,3 0,25 1,3 4,7 0,45 1,3 6,1 0,46 1,7 6,1 0,32 2,1
28 5,3 0,33 1,4 5,6 0,45 1,4 6,2 0,49 1,4 6,1 0,34 1,7
35 5,4 0,39 1,3 5,7 0,46 1,3 6,1 0,44 1,5 5,4 0,37 1,6

N: grupo control normal; D: grupo deficiente; LF-B: grupo alimentado con leche fermentada bio-
enriquecida; LF: grupo alimentado con leche fermentada control no bio-enriquecida. *El tiempo se
expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media.

5.3.1.3. Hemograma

Ninguno de los grupos experimentales mostró variaciones en el recuento total y

diferencial de leucocitos en sangre periférica durante todo el ensayo (Figura 5.12).
Tampoco se observaron diferencias significativas en ninguno de los parámetros de la
serie roja evaluados (recuento de glóbulos rojos, hematocrito, hemoglobina e índices
hematimétricos) (Tabla 5.7), excepto en el VCM donde el grupo D mostró un ligero
incremento en sus valores respecto al grupo N (Tabla 5.7).

181
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

A B
Leucocitos (109 cél/L) 8,0 7,0
7,0

Linfocitos (109 cél/L)

6,0
6,0 N 5,0
5,0 D 4,0
4,0
LF-B 3,0
3,0
2,0 LF 2,0
1,0 1,0
0,0 0,0
14 28 35 14 28 35
Tiempo (d) Tiempo (d)

C
1,0
PMNN (109 cél/L)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
14 28 35
Tiempo (d)

Figura 5.12. Recuento total y diferencial de leucocitos en sangre periférica. A) Recuento total de
leucocitos (109 cél/L); B) recuento de linfocitos (109 cél/L) y C) recuento de PMNN (109 cél/L).
PMNN: Polimorfonucleares neutrófilos. *El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan
como la media ± DE.

182
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

Tabla 5.7. Evaluación de la serie roja durante el período de repleción (28 y 35 d)

GR Hb Hto VCM HCM CHCM Plaquetas

Grupos d*
1012 cél/L g/L % fL pg g/L 109/L
14 d 6,51 (0,52) 128 (5) 43 (3) 55,4 (2,7) 16,5 (0,6) 307 (25) 1120 (56)
N 28 d 6,83 (0,54) 127 (6) 40 (2) 54,4 (2,5) 16,2 (0,3) 298 (18) 1220 (34)
35 d 7,12 (0,47) 128 (8) 42 (3) 54,7 (2,7) 16,8 (0,5) 307 (23) 1230 (36)
14 d 6,44 (0,41) 126 (5) 45 (2) 60,1 (2,1) 16,9 (0,8) 281 (14) 1134 (18)
D 28 d 6,83 (0,44) 127 (3) 41 (3) 59,4 (2,3) 16,4 (0,6) 274 (16) 1204 (21)
35 d 6,94 (0,46) 125 (6) 45 (3) 60,4 (2,3) 16,8 (0,5) 281 (15) 1263 (28)
14 d 6,96 (0,52) 126 (7) 42 (3) 54,3 (2,4) 16,4 (0,7) 302 (19) 1245 (31)
LF-B 28 d 6,58 (0,48) 124 (3) 41 (2) 54,8 (2,6) 16,1 (0,3) 310 (21) 1320 (29)
35 d 6,55 (0,43) 124 (5) 41 (3) 54,8 (2,1) 16,1 (0,2) 310 (24) 1240 (34)
14 d 6,48 (0,44) 124 (5) 42 (3) 56,4 (2,6) 16,6 (0,6) 297 (19) 1270 (27)
LF 28 d 6,84 (0,53) 129 (7) 43 (5) 55,2 (2,4) 16,7 (0,5) 308 (21) 1245 (29)
35 d 6,72 (0,54) 128 (6) 45 (4) 55,7 (2,7) 16,2 (0,3) 289 (18) 1278 (21)

GR: glóbulos rojos; Hb: hemoglobina; Hto: hematocrito; VCM: volumen corpuscular medio; HCM:
hemoglobina corpuscular media; CHCM: concentración de hemoglobina corpuscular media; N: grupo
control normal; D: grupo alimentado con dieta libre de folato; LF-B grupo alimentado con leche
fermentada bio-enriquecida; LF: grupo alimentado con leche fermentada control no bio-enriquecida.
*El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media (DE).

5.3.1.4. Dosaje de folatos en plasma y sangre entera

El grupo alimentado con la leche fermentada bio-enriquecida (grupo LF-B) no mostró

diferencias significativas en la concentración de folatos plasmáticos respecto al grupo C
(Figura 5.13A) durante todo el experimento, mientras que en el grupo alimentado con la leche
fermentada control (LF) los parámetros evaluados fueron menores respecto a los grupos LF-B
y N (Figura 5.13A).
El grupo D tuvo menor concentración de folatos en sangre entera en relación al grupo
N (Figura 5.13B). Por el contrario, el grupo LF-B, presentó niveles similares al grupo N y
superiores a los grupos D y LF (Figura 5.13B). De esta manera se demostró que, a diferencia
de la leche fermentada control, la leche fermentada bio-enriquecida fue efectiva en prevenir la
deficiencia de folatos cuando se lo administra simultáneamente con una dieta libre de folatos.

183
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

A B
50 a 600 c
a
a a,c a,c a,c
40 a a a 500 a a
Folatos (µg/L) a a a a a a

Folatos (µg/L)
a,b a a a
b b 400 a a
30 b b
b b b
300 b
e e
20
d 200
c,d
10 c c c c
100
0 0
0 7 14 21 28 35 0 7 14 21 28 35
Tiempo (d) N D LF-B LF Tiempo (d)

Figura 5.13. Concentración de folatos en plasma (A) y sangre periférica (B) en µg/L. *El tiempo se
expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican
diferencias significativas (p<0,05).

5.3.1.5. Dosaje de folatos en Hígado, Bazo y Riñón

Los resultados demostraron que los niveles de folatos en hígado fueron similares en
todos los grupos experimentales durante el ensayo (Tabla 5.8). Sólo el grupo D tuvo niveles
de folatos en bazo y riñón significativamente menores que el grupo N.

Tabla 5.8. Concentración de folatos (µg de folato/g de órgano) en hígado, bazo y riñón

Tiempo (d)*
Órganos Grupo 7 14 21 28 35
N 1,78 (0,21) 1,64 (0,21) 1,58 (0,19) 1,44 (0,17) 1,47 (0,18)
D 1,82 (0,22) 1,75 (0,21) 1,62 (0,19) 1,42 (0,17) 1,26 (0,18)
Hígado
LF-B 1,72 (0,21) 1,68 (0,20) 1,57 (0,22) 1,43 (0,17) 1,41 (0,17)
LF 1,75 (0,21) 1,63 (0,19) 1,56 (0,18) 1,51 (0,18) 1,43 (0,17)
N 5,13 (0,62) 4,89 (0,59) 4,67 (0,56) 4,33 (0,52) 4,25 (0,51)
a a a
D 4,12 (0,49) 3,45 (0,41)a 2,92 (0,31) 2,38 (0,26) 1,54 (0,19)
Bazo
LF-B 4,98 (0,59) 4,37 (0,52) 4,24 (0,51) 4,17 (0,49) 4,21 (0,51)
LF 4,87 (0,58) 4,53 (0,54) 4,32 (0,52) 4,15 (0,42) 4,02 (0,48)
N 5,43 (0,65) 5,21 (0,59) 5,19 (0,62) 5,17 (0,48) 5,28 (0,76)
a
D 5,24 (0,63) 2,68 (0,32) a 2,31 (0,28) 2,13 (0,26) a 1,69 (0,27)a
Riñón
LF-B 5,54 (0,66) 5,23 (0,63) 4,98 (0,35) 4,78 (0,52) 4,35 (0,69)
LF 5,43 (0,65) 5,18 (0,52) 5,12 (0,61) 4,64 (0,31) 4,13 (0,51)

*El tiempo se expresa en días (d). Los resultados se expresan como la media (DE). En una misma
columna, letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05).

184
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.3.1.6. Dosaje de Homocisteína en plasma

Los animales alimentados sólo con DCD-SF (grupo D) y con DCD-SF junto a la leche
fermentada control (grupo LF) mostraron concentraciones de homocisteína plasmática casi 8
veces superiores respecto al grupo N (Figura 5.14). En cambio, los animales que fueron
alimentados con DCD-SF junto con la leche fermentada bio-enriquecida (LF-B) desde el
primer día de alimentación, tuvieron valores normales de homocisteína en plasma,
demostrando que la leche fermentada bio-enriquecida fue capaz de evitar el incremento de la
concentración plasmática de homocisteína y por lo tanto la deficiencia de folatos.

70
e
Homocisteína (µmol/L)

60
d
50
40 b N
30 D
c c c
20 LF-B
10 a a a a a a LF
0
14 28 35
Tiempo (d)

Figura 5.14. Concentración de homocisteína en plasma (µmol/L). El tiempo se expresa en días (d).
Los resultados se expresan como la media ± DE, letras distintas indican diferencia significativa
(p<0,05).

185
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.3.2. Discusión

El incremento en la concentración de homocisteína plasmática y la disminución del

folato plasmático representan los principales indicadores de la deficiencia de la mencionada
vitamina. Previamente se demostró que la leche fermentada bio-enriquecida presentó una
concentración de folatos suficiente para restaurar parcialmente los niveles plasmáticos de
folatos y normalizar la concentración de folatos en sangre entera así como el nivel de
homocisteína plasmática en un modelo animal de deficiencia.
En base a estos antecedentes se evaluó si la leche fermentada bio-enriquecida era
capaz de evitar el desarrollo de una deficiencia de folatos cuando se la administraba en forma
simultánea a una dieta libre de folatos desde el primer día del período de depleción.
Los animales pertenecientes al grupo deficiente (D) y los del grupo control de leche
fermentada (LF) elaborada con cepas no productoras de folatos, presentaron disminución
significativa de folatos tanto en plasma como en sangre entera, e incremento de la
concentración plasmática de homocisteína si se comparan con el grupo N. Por el contrario, los
animales alimentados, desde el primer día posterior al destete, con la leche fermentada bio-
enriquecida (LF-B), tuvieron valores normales de folatos en plasma y sangre entera, sin
modificaciones significativas en la concentración de homocisteína en plasma ni en ningún
otro parámetro evaluado respecto al grupo N. De esta manera, los resultados demostraron que
la concentración de folatos presentes en la leche fermentada bio-enriquecida fue suficiente
para evitar el desarrollo de la deficiencia de folatos cuando se administró junto a una dieta
libre de folatos desde el primer día de depleción. Por lo tanto la leche fermentada bio-
enriquecida en folatos puede ser considerado una adecuada fuente de folatos capaz de evitar la
deficiencia de vitamina B9 constituyendo una alternativa efectiva, viable y útil a la
fortificación con AF.

186
Resultados Evaluación in vivo de la eficacia de la leche fermentada bio-enriquecida

5.4. Conclusiones parciales

Se puso a punto un modelo de deficiencia de folatos en ratones BALB/c, estableciendo

la edad adecuada de los animales, el tiempo de alimentación y la administración del ATB,
siendo las principales características del modelo las siguientes:
a. Edad de los animales: 3 semanas (al destete);
b. Tiempo de alimentación: 21 d desde el destete;
c. Administración de antibiótico: no es necesario su empleo junto a la dieta.
El modelo permitió desarrollar la deficiencia luego de 14 d de alimentación. Los
animales deficientes presentaron sólo una disminución significativa de los folatos en plasma y
sangre entera, así como incremento de la concentración plasmática de homocisteína.
Se demostró que la leche fermentada bio-enriquecida elaborada con las cepas L.
bulgaricus CRL871, S. thermophilus CRL803 y S. macedonicus CRL415 fue efectiva para
restituir parcialmente los niveles de folatos plasmáticos y normalizar los mismos en sangre así
como los niveles de homocisteína plasmática. Este comportamiento fue similar la dieta
control suplementada con ácido fólico.
La leche fermentada bio-enriquecida (180 ± 7 µg de folatos/L) no sólo logró revertir
parcialmente la deficiencia de folatos, sino que administrada junto a la dieta deficiente en
ácido fólico, logró prevenir la deficiencia evidenciado por la presencia de valores normales de
folatos en plasma y sangre entera, y de homocisteína plasmática. La leche fermentada bio-
enriquecida no causó ningún tipo de efecto adverso (ausencia de diarrea, letargo,
translocación bacteriana, pérdida de peso y/o apetito, entre otros parámetros) lo que
constituye una alternativa útil, viable, económica, segura y sumamente efectiva respecto a la
fortificación de los alimentos con AF, con efecto beneficioso en la salud del consumidor.

187
Concllusioones geneeralees
Conclusiones generales

Conclusiones generales

• La evaluación de la capacidad de BAL (146 cepas) para producir folatos, usando un

medio químicamente definido libre de folatos, permitió identificar 60 cepas que
sintetizan la vitamina. Esta propiedad funcional fue variable, dependiente de cepa.
• Los estudios fisiológicos y bioquímicos de la producción de folatos determinaron que
S. thermophilus CRL415 y CRL803, S. macedonicus CRL415 y L. bulgaricus
CRL871 producen elevados niveles de folatos en medio de cultivo y en leche.
• L. bulgaricus previamente fue considerada una especie consumidora de folato. Por
primera vez, en el marco de esta tesis doctoral, se identificaron cepas con capacidad de
sintetizar folatos en ausencia y en presencia de la vitamina en medios de cultivo y en
leche.
• La relación entre síntesis de folatos y crecimiento microbiano fue una característica de
cepa. El agregado del precursor pABA, la fuente de carbono y las condiciones de
cultivo afecta la síntesis de la vitamina y es variable entre los microorganismos.
• Por primera vez, se evaluó la expresión génica de la síntesis de folatos en S.
thermophilus y S. macedonicus. Los resultados permitieron determinar: i) aumento
significativo de la expresión de los genes involucrados tanto en la síntesis de novo de
los folatos como los responsables de la reducción de los folatos y de la elongación de
la cadena poliglutámica (coincidente con la máxima síntesis de la vitamina) y ii)
disminución de la expresión génica de las enzimas iniciales de la síntesis de novo
durante fase estacionaria de crecimiento.
• La combinación de cepas productoras de folatos constituida por S. thermophilus
CRL803 – S. macedonicus CRL415 – L. bulgaricus CRL871 –en una relación
coco:bacilo 2:1, fue utilizada para obtener una leche fermentada naturalmente bio-
enriquecida en folatos que aporta el 10% IDR.
• La evaluación de la leche fermentada naturalmente enriquecida en folatos, mediante el
uso de modelos animales, demostró que la vitamina producida fue capaz de: i) revertir
la deficiencia de folatos en ratones, restituyendo los niveles de folatos en plasma y
órganos, y normalizando la homocisteína plasmática; ii) prevenir el desarrollo de la
deficiencia de folatos, evidenciado por los valores normales de folatos en plasma y
sangre entera, como también de homocisteína.

El presente trabajo de tesis doctoral permitió profundizar los conocimientos fisiológicos,

bioquímicos y moleculares de BAL capaces de producir folatos

189
Proyyecciioness
Proyecciones

De los resultados obtenidos en este trabajo de tesis doctoral, surgen las siguientes
proyecciones:

• Profundizar los estudios de los precursores (pABA, GTP) y otros compuestos

(aminoácidos, vitaminas) en la síntesis de folatos en las BAL seleccionadas;

• Continuar los estudios de la síntesis de folatos en las bacterias productoras,

mediante el empleo de técnicas de proteómica, que permitan ahondar en los
cambios producidos a nivel intracelular como respuesta a: situaciones de estrés
(deficiencia de nutrientes del medio de cultivo); modificaciones del estado
fisiológico de las células (como células viables no cultivables).

• Evaluar el efecto del pH extracelular, la fuerza iónica y otras condiciones del

medio de cultivo en el transporte de los folatos en bacterias lácticas productoras
de dicha vitamina;

• Diseñar otras alternativas, a los productos fermentados, como formulaciones

(nanocápsulas y/o micropartículas cargadas de folatos y/o con las cepas
productoras adsorbidas a la superficie, entre otras), a fin de proveer estrategias
más seguras a la fortificación con ácido fólico;

• Estudiar, en modelos animales, la seguridad de los productos suplementados con

altas dosis de folatos naturales.

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206
Lista
a de abreeviatturass
Lista de Abreviaturas

Abreviaturas
µ máx velocidad máxima de crecimiento
ác. ácido
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADP Adenosina-5'-difosfato
AF Ácido fólico
AMP Ampicilina
ANMAT Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica
ARN Ácido ribonucleico
ARNm Ácido ribonucléico mensajero
ATB antibióticos
ATCC American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo)
ATP Adenosina-5'-trifosfato
BAL Bacterias ácido lácticas
BLAST Herramienta Básica de Búsqueda de alineamiento local
bp pares de bases
C1 Unidades de un carbono
Ca Grupo control adultos sin ATB
Ca+ATB Grupo control adultos con ATB
CAA Código Alimentario Argentino
CBS Cistationina β sintetasa
cél. células
CERELA Centro de Referencia para Lactobacilos
CGPM Conferencia General de Pesas y Medidas
CHCM Concentración de hemoglobina corpuscular media
CHL Cloranfenicol
Ci Grupo control infantes sin ATB
Ci+ATB Grupo control infantes con ATB
CLIN Clindamicina
conc. concentración
CRL CERELA
D Grupo deficiente
Da Grupo deficiente adultos sin ATB
Da+ATB Grupo deficiente adultos con ATB
DCD Dieta de composición definida
DCD-SF Dieta de composición definida certificada libre de folatos
DE Desvío estándar
DHF Dihidrofolato
DHFR Dihidrofolato reductasa
Di Grupo deficiente infantes sin ATB
Di+ATB Grupo deficiente infantes con ATB
DNMT ADN metiltransferasa
dTMP Desoxitimidina-5'-monofosfato
DTN Defectos del tubo neural
dUMP Desoxiuridina-5'-monofosfato
EFSA Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria
ERI Eritromicina
FACM Medio para dosaje microbiológico de ácido fólico para L. casei
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
FDA Administración de drogas y alimentos de Estados Unidos
FE Folatos extracelulares
FI Folatos intracelulares
Folbp1 Proteína ligadora de folatos
FR Receptor de folatos
FT Folatos totales

208
Lista de Abreviaturas

g *tiempo de duplicación
GEN Gentamicina
GI Tracto Gastrointestinal
GR Glóbulos rojos
GTP Guanosina-5'-trifosfato
Hb Hemoglobina
Hcy Homocisteína
Hto Hematocrito
ICSH Comité Internacional para la Estandarización en Hematología
IDR Ingesta diaria recomendada
IP Ioduro de propidio
KAN Kanamicina
Kb kilobases
KEGG Enciclopedia de Kyoto de genes y genómica
LF Leche fermentada
MQD Medio químicamente definido
MQD-SF Medio químicamente definido sin ácido fólico
MRP1/5 Proteína 1/5 asociada a resistencia multidroga
MRP3 Proteína 3 asociada a resistencia multidroga
MS Metionina sintetasa
MTHFR Metilentetrahidrofolato reductasa
N Grupo normal
NADH Nicotinamida adenina dinucleótido reducido
NADP+ Nicotinamida adenina dinucleótido
NCBI Centro Nacional para la Información Biotecnológica
NICE Sistema de expresión controlado por nisina
NT Naranja de Tiazol
OMS/WHO Organización Mundial de la Salud
pABA Ácido p-aminobenzoico
PBS Buffer fosfato salino
PC peso corporal
PCFT Transportador de folatos acoplado a protón
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PMNN Polimorfonucleares neutrófilos
PO peso de órgano
qRT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa
R Repletado
r ratón
RFC Transportador de folatos reducidos
SAH S-adenosilhomocisteína
SAM S-adenosilmetionina
SHMT Serina hidroximetiltransferasa
SI Sistema Internacional
STREP Estreptomicina
T Temperatura
TE Buffer Tris-EDTA
TET Tetraciclina
TGI Tolerancia al tracto gastrointestinal
THF tetrahidrofolato
TS Timidilato sintetasa
VAN Vancomicina
VCM Volumen corpuscular medio
Vmáx Velocidad máxima

* indica tiempo de duplicación bacteriana cuando se indica junto a µ máx

209
Lista de Abreviaturas

Microorganismos
B. Bifidobacterium
E. Enterococcus
L. Lactobacillus
Lc. Lactococcus
Leuc. Leuconostoc
P. Propionibacterium
S. Streptococcus

Unidades y símbolos
% porciento
µg microgramo
µL microlitro
µm micrometro
µM micromolar
c.s.p. cantidad suficiente para
Cat. Catálogo
d días
DO Densidad óptica
EDTA ácido etilendiaminotetraacético
Fe Hierro
g gramo
h hora
H2O agua
HCl Ácido clorhídrico
kg kilogramo
L litro
log logaritmo
M molar
m masa
Mg Magnesio
mg miligramo
min minutos
mL mililitro
mM milimolar
mm milimetro
N normal
NaCl cloruro de sodio
NaOH hidróxido de sodio
ng nanogramo
nm nanometro
ºC temperatura en grados centígrados
p peso
pg picogramo
s segundos
SDS dodecilsulfato de sodio
t tiempo
UFC Unidades formadoras de colonias
V voltios
v / vol. Volumen

Se adoptó el Sistema Internacional de Unidades (SI) recomendado por la Conferencia General de

Pesas y Medidas (CGPM).

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