AMP Acta Médica Peruana

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ARTÍCULO ORIGINAL

Prueba de microneutralización para la detección

de anticuerpos contra el virus dengue serotipo 2
Microneutralization test for detecting antibodies
against serotype 2 dengue fever virus

Lucas Sevilla Drozdek1,a , Egma Mayta Huatuco1,b,c, Enrique Mamani Zapana1,b,d,

Nora Reyes Puma2,e,f, Karla Vásquez Cajachahua1,a, Bernardo Quispe Bravo1,c, Joe
Hermosilla Jara1,a, Adrián Quintana Bedoya1,a, Juan Sulca Herencia1,c
1 Laboratorio de Virología Clínica y Molecular. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
2 Instituto Nacional Daniel Alcides Carrión, Lima, Perú.
a Biologo con menciòn en Microbiología y Parasitología
b Doctor en Ciencias: Area de Microbiología
c Biólogo
d Doctor en Ciencias Biológicas
e Médico cirujano
f Doctor en Medicina

Correspondencia
Lucas Augusto Sevilla Drozdek RESUMEN
[email protected]
Objetivo: Optimizar la prueba de microneutralización (MNT) para detección de anticuerpos
neutralizantes contra el virus dengue serotipo 2 (DENV-2) en la línea celular Vero-76. Materiales
Recibido: 08/01/2023
Arbitrado por pares
y métodos: Se evaluaron diferentes concentraciones celulares (0.6 x105 cel/mL, 0.9 x105 cel/mL,
Aprobado: 22/06/2023 1.2 x105 cel/mL), porcentajes de 2 %, 3 % y 4 % de suero bovino fetal (SBF), número de pasajes
del stock de virus y los días de incubación. La semilla viral se confirmó por RT-qPCR. El DENV-2
Citar como: Sevilla-Drozdek L,
Mayta E, Mamani E, Reyes N,
se propagó realizando 5 pasajes en células Vero-76, seguidamente se tituló el virus en placas
Vasquez K, Quispe-Bravo B, de 96 pozos y se evaluaron 2 métodos de infección celular: monocapa y células en suspensión,
Hermosilla J, Quintana A y Sulca J. además se determinó el día óptimo de coloración de las células. Obtenidos los resultados, se
Prueba de microneutralización para procesaron mediante MNT para DENV-2 las siguientes muestras: 5 sueros negativos a DENV-2
la detección de anticuerpos contra
el virus dengue serotipo 2. Acta y YFV (Virus de la Fiebre Amarilla), 5 sueros negativos de anticuerpos a DENV-2 y positivos de
Med Peru. 2023;40(2):104-12. doi: anticuerpos a YFV y 5 sueros positivos de anticuerpos a DENV-2 seleccionados mediante la prueba
https://doi. org/10.35663/ de neutralización por reducción de placas (PRNT). Resultados: El método óptimo para MNT
amp.2023.402.2538
utilizó células en suspensión (0.9 x 105 cel/mL), 2 % de SBF y semilla viral pasaje 5. La mínima
Este es un artículo Open Access dilución capaz de diferenciar una muestra positiva a DENV-2 fue 1:40 y el tiempo de incubación
publicado bajo la licencia Creative para la MNT para DENV-2 fue de 10 días. Conclusión: La MNT con el método de células en
Commons
Atribución 4.0 Internacional. suspensión y medio de cultivo con 2 % de SBF permite detectar anticuerpos neutralizantes IgG
(CC-BY 4.0) contra DENV-2 con resultados confiables, pudiendo analizar un mayor número de muestras con
ahorro de materiales.

Palabras claves: Dengue; Serotipo; Neutralización; Optimización; Inmunoglobulina. (Fuente:

DeCS-BIREME)

104 Acta Med Peru. 2023;40(2):104-12 ISSN electrónica 1728-5917

Prueba de microneutralización para detección del virus dengue serotipo 2 Sevilla-Drozdek L, et al.

ABSTRACT
Objective: To optimize the microneutralization test (MNT) for the detection of neutralizing antibodies against serotype 2 of
dengue fever virus (DENV-2) in a Vero-76 cell line. Materials and methods: Different cell concentrations were assessed (0.6 X
105 cells/mL, 0.9 X 105 cells/mL, and 1.2 x 105 cells/mL) with 2%, 3%, and 4% fetal bovine serum, virus stock passage number,
and incubation days. Viral particles were confirmed using RT-qPCR. DENV-2 disseminated with 5 passages in Vero-76 cells, then,
the virus was titrated in 96-well plaques, and two methods for cell infection were evaluated: single layer, and suspended cells.
Also, the optimum day for cell staining was determined. Once results were obtained, the following samples were processed
using MNT for DENV-2: five sera negative for DENV-2 and yellow fever virus (YFV), five sera negative for antibodies against
DENV-2 and positive for antibodies against YFV, and five sera positive for antibodies against DENV-2 that were selected using
the plate reduction neutralization test. Results: The optimum method for MNT used suspended cells (0.9 X 105 cells/mL), 2%
fetal bovine serum, and viral particles at the 5th passage. The minimal dilution able to differentiate a positive sample for DENV-
2 was 1:40, and the MNT incubation time for DENV-2 was ten days. Conclusion: MNT with the cell suspension method and a
culture medium with 2% fetal bovine serum allows the detection of IgG neutralizing antibodies against DENV-2 with reliable
results, so that larger sample sizes may be assessed, saving materials to be used.

Key words: Dengue, Serotype; Neutralization; Optimization; Immunoglobulin. (Source: MeSH-BIREME)

INTRODUCCIÓN siendo necesaria una evaluación meticulosa de la técnica para

su utilización. Por lo cual el objetivo del presente estudio fue
El dengue es la arbovirosis de mayor morbilidad y mortalidad optimizar la prueba de microneutralización para la detección de
en áreas tropicales y subtropicales del planeta, sobre todo en anticuerpos neutralizantes contra DENV-2.
las zonas urbanas y semiurbanas [1]. En Perú, hasta el 2022,
20 departamentos presentan hiperendemicidad a dengue
principalmente por el virus dengue serotipo 2 (DENV-2) del
genotipo Americano/Asiático [2] y genotipo Cosmopolita asociado
MATERIALES Y MÉTODOS
a los últimos brotes en Puno, Cuzco y Madre de Dios [3]. La El trabajo se desarrolló en el laboratorio de Virología clínica y
detección de anticuerpos del tipo IgG son importantes para molecular de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. La
la confirmación de casos sospechosos a dengue y estudios de cepa de DENV-2 corresponde a un aislamiento peruano del año
prevalencia siendo las pruebas de ELISA las más usadas por su 2015. La cepa del virus de fiebre amarilla (YFV) corresponde a
elevada sensibilidad; sin embargo, la baja especificidad debido una cepa vacunal de STAMARIL (lote: k5338). Las células Vero-
a las reacciones cruzadas entre los cuatro serotipos del virus 76 y las muestras de suero fueron obtenidas del laboratorio de
dengue (DENV) y los miembros de la familia Flaviviridae puede Virología clínica y molecular de la UNMSM, siendo este estudio
generar sesgos en sus resultados [4,5], por lo cual se requiere la aprobado por el Comité Institucional de Ética en Investigación
confirmación de las muestras positivas con otras pruebas con del Instituto de Medicina Tropical “Daniel Alcides Carrión” de
mejores niveles de especificidad como la prueba de neutralización UNMSM (Constancia de aprobación CIEI-2021-17).
por reducción de placas (PRNT) considerada la prueba de oro
para la detección de anticuerpos neutralizantes y es utilizada
para validar otras pruebas de detección de anticuerpos como Producción de la semilla viral DENV-2 y evaluación
las pruebas de ELISA y las pruebas cromatográficas, se usa de la pureza viral
también para determinar la seroconversión de anticuerpos Se inoculó 200 µL de la cepa de DENV-2 diluido 1:10 en un
post vacunación y en estudios epidemiológicos permite la frasco de 25 cm2 con monocapa confluente de células Vero-76,
discriminación de muestras falsas positivas que pueden aparecer se incubó por 60 min a 37 °C y se adicionó 8 mL de medio de
si se utilizan en el tamizaje inicial pruebas altamente sensibles mantenimiento al 2% de suero bovino fetal (SBF), se incubó 9
pero con baja especificidad; sin embargo, la prueba de PRNT es días para la aparición de ECP, se centrifugó el sobrenadante y se
una prueba laboriosa, costosa y difícil de ejecutar, lo cual dificulta almacenó a - 80 °C. Para evaluar la pureza de la semilla se realizó
su utilización [6-8]. Por este motivo es necesario desarrollar un ensayo de RT-PCR múltiplex en tiempo real. La extracción del
pruebas en micrométodos como la microneutralización (MNT), ARN se realizó usando el kit QIAmp viral RNA (Qiagen), siguiendo
la cual utiliza el mismo principio inmunológico que el PRNT, las indicaciones de fabricante [12]. Para el ensayo de RT-PCR en
presenta elevada sensibilidad y especificidad permitiendo tiempo real se utilizó el kit Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit
procesar un mayor número de muestras séricas con ahorro (Qiagen), y el set de cebadores y sondas de hidrólisis TaqMan
de materiales [9]. La MNT ha sido utilizada para la detección de descritos por Johnson et al., 2005 [13]. Se empleó el termociclador
anticuerpos contra los virus Rocio, Ilheus, Zika y otros [10,11], sin Rotor-Gene Q para llevar a cabo el ensayo bajo los siguientes
embargo su uso en la detección de anticuerpos contra DENV ha parámetros: Transcripción reversa a 50°C por 15 min, un paso de
presentado dificultades debido a la baja producción de efecto activación a 95°C por 15 min; 45 ciclos de desnaturación a 95°C
citopático (ECP) de las cepas de DENV en las líneas celulares por 15 seg hibridación/extensión a 60° por 15 seg.

ISSN electrónica 1728-5917 Acta Med Peru. 2023;40(2):104-12 105

 Sevilla-Drozdek L, et al. Prueba de microneutralización para detección del virus dengue serotipo 2

Producción de la semilla viral YFV de suspensión celular en base al método de Juarez, 2009 [10] con
algunas modificaciones.
Se inoculó 200 µL de la cepa vacunal de YFV diluido 1:10 en un
frasco de 25 cm2 con monocapa confluente de células Vero-76,
se incubó por 60 min a 37 °C y se adicionó 8 mL de medio de Titulación DENV-2 por el método de monocapa
mantenimiento al 2 % de SBF, se incubó 4 días para la aparición completa
de ECP, se centrifugó el sobrenadante y se almacenó a - 80 °C.
Se prepararon 3 placas de 96 pozos, cada placa contenía 3
concentraciones celulares (0.6 x105 cel/mL, 0.9 x105 cel/mL,
Adaptación de la semilla viral a la línea celular Vero-76 1.2 x 105 cel/mL) de células Vero-76 en medio de crecimiento al
Se propagó la semilla viral inoculando 200 µL del DENV-2 en 10 % SBF dispensado en 100 µL/pozo/cuadruplicado. Las placas
la dilución 1:25 en frascos de cultivo de 25 cm2 con monocapa se incubaron a 37°C / 48 h. Seguidamente se infectó con 100 µL
confluente de células Vero-76. Se incubó a 37°C por 1 h. Se de DENV-2 /pozo de la dilución 10-1 hasta 10-7 usando controles
adicionó 8 mL del medio de mantenimiento al 2 % SBF y se incubó de células en cada dilución. Los pozos se colorearon a los días 9,
hasta la manifestación ECP de 3+. Se centrifugó la suspensión 10 y 11 con Azul negro de naftol. Se determinó el TCID50 (Dosis
viral a 2000 rpm/10 min y el sobrenadante se preservó a -80°C. infectiva del 50 % en cultivo de células) mediante el método de
Este proceso se realizó 5 veces.
Reed y Muench [16].

Titulación viral por plaqueo y PRNT70 para DENV-2

Titulación DENV-2 por el método de suspensión
El método empleado se basó en el método desarrollado por celular
Alvarez et al., 2010 (14). Para determinar el título viral, se
preparó 3 placas de 24 pozos con una suspensión de células Se prepararon 3 placas de 96 pozos con concentraciones celulares
de Vero-76 a una concentración de 2.5 x 105 cel/mL. Se inoculó de 0.6 x105 cel/mL, 0.9 x105 cel/mL, 1.2 x105 cel/ml diluidos
50 µL/pozo/triplicado de cada dilución (10-1 a 10-7) de DENV-2. en medio de mantenimiento al 2 % SBF dispensado en 100
Después de 4 horas, se adicionó medio de recubrimiento con 6 % µL/pozo/cuadruplicado. Seguidamente se infectó con 100 µL
de carboximetilcelulosa (CMC), se incubó a 37°C y se coloreó los de DENV-2 /pocillo desde la dilución 10-1 hasta 10-7 utilizando
días 7, 8 y 9 días con azul negro de naftol. Una vez determinado controles de células en cada dilución. Se colorearon las células
el día óptimo de coloración se realizó la PRNT70 para DENV-2, se a los 9, 10 y 11 días con azul negro de Naftol. Se determinó el
inactivó todos los sueros a 56°C x 30 min para los respectivos TCID50 y posteriormente, una vez obtenida la concentración
estudios. Los sueros negativos a anticuerpos para DENV-2 fueron celular óptima, se evaluó la prueba de plaqueo usando medio
evaluados en las diluciones finales de 1:5; 1:10 y 1:20. Los sueros de mantenimiento con 3 % y 4 % SBF. Finalmente se reevaluó el
positivos a anticuerpos para DENV-2 se evaluaron en diluciones grado de infección de los pozos y se determinó el TCID50 mediante
finales de 1:160; 1:320 y 1:640. La mezcla DENV-2 y suero de el método de Reed y Muench [16].
anticuerpos se incubó a 37oC por 1h, se inoculó 50 µL/pozo/
duplicado de la mezcla en una suspensión celular de 2.5x105 cel/
mL, se incubó por 4 horas y se adicionó 500 µL/pozo de medio de MNT para anticuerpos neutralizantes contra DENV-2
recubrimiento, se incubó a 37oC y se coloreó la placa al octavo día. Con los sueros evaluados y seleccionados por PRNT se prepararon
diluciones finales de suero negativos a anticuerpos para
Titulación viral por plaqueo y PRNT70 para YFV DENV-2 (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160) y suero positivo a
anticuerpos a DENV-2 (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320,
Se inoculó 50ul/pozo/triplicado de las diluciones (10-1 a 10-7) de 1:640). Se dispensó 100 µL/pozo de la mezcla virus-suero en la
la cepa vacuna en una monocapa confluente de células Vero-76
placa de 96 pozos según corresponda la dilución del suero y se
en placa de 24 pozos, se adicionó medio de recubrimiento al
incubaron a 37°C por 1 hora. La suspensión celular se preparó
3 % CMC, se incubó a 37°C hasta el sexto día de tinción. Para
a una concentración celular de 0.9 x 105 cel/mL (conteniendo
seleccionar muestras positivas y negativas a anticuerpos a YFV
mediante la PRNT, se realizó la mezcla YFV- suero en la dilución 2 % de SBF), luego se adicionó a razón de 100 µL /pozo. Las
de 1:5 y se incubó a 37oC por 1h, se inoculó 50 µL/pozo/duplicado placas se incubaron hasta el tiempo óptimo de coloreo a 37°C
de la mezcla incubada en placas de 24 pozos con monocapa en condiciones herméticas y se coloreó con 70 µL/pozo de azul
completa de células Vero-76, se incubó por 3 horas, se adicionó negro de Naftol. Se usaron pocillos como control de células,
500 µL/pozo de medio de recubrimiento con 3 % CMC y se coloreó control de virus y control TCID50.
al sexto día la placa [15].
Análisis estadístico
Optimización de la MNT para DENV-2 La correlación entre los resultados de los sueros analizados por
Para la optimización se evaluó el método de monocapa la PRNT y MNT se realizó mediante el coeficiente de correlación
completa recomendada por Roehrig et al., 2008 [8] y el método de rangos de Spearman usando SPSS v 20.0.

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Prueba de microneutralización para detección del virus dengue serotipo 2 Sevilla-Drozdek L, et al.

RESULTADOS Prueba de plaqueo y optimización de la MNT para

DENV-2
Evaluación de la pureza viral, producción de la semilla viral
La prueba de plaqueo para DENV-2 por el método con monocapa
La pureza de la semilla viral fue confirmada mediante la RT- PCR completa mostró un ECP bajo sin poderse diferenciar las
multiplex en tiempo real dando como resultado positivo a DENV-2 diluciones virales del control de células y por el método de
y negativo a los otros serotipos de DENV. suspensión celular mostró buen ECP y permitió diferenciar las
diluciones virales con el control de células. La concentración
celular óptima fue 0.9 x 105 cel/mL. La concentración celular de
Adaptación de la semilla viral DENV-2 en la línea
0.6 x 105 cel/mL mostró monocapa incompleta en el control de
celular Vero-76 células y la concentración celular de 1.2 x 105 cel/mL, mostró
Se evaluó la adaptación de la semilla viral para cada pasaje monocapa completa en el control de células, pero el efecto
mediante la manifestación de ECP en los cultivos celulares y citopático de la cepa nativa DENV-2 no fue muy marcado. El
la formación de placas líticas en la prueba de plaqueo de 24 medio de mantenimiento con 2 % SBF fue el porcentaje óptimo
pozos. En el primer y segundo pasaje se observó un ECP débil al evidenciar la formación de monocapa confluente y una buena
sobre el 25 % y 50 % de la monocapa (1+ a 2+ respectivamente), manifestación del ECP viral comparado con los otros porcentajes
además se observó placas líticas tenues no definidas para DENV-2
de SBF (Figura 2).
(mediante PRNT) y en el quinto pasaje se observó ECP sobre el
75 % o más de la monocapa (3+) y placas líticas definidas.

Día óptimo de coloración y determinación del TCID50

Prueba de Plaqueo y PRNT para DENV-2 y YFV
El décimo día como fue el día óptimo de coloreo, el control de
Mediante la prueba de plaqueo, el titulo viral de DENV-2 y
YFV fueron 1.4 x 106 UFP/mL (Figura 1) y 1.07x107 UFP/mL células presentó monocapa completa al 100% de confluencia y el
respectivamente. Por PRNT se seleccionó 10 sueros negativos TCID50 fue 10 3,48 TCID50/ mL según el método de Reed and Munch.
a DENV-2 (de los cuales 5 sueros fueron negativos a YFV y 5
sueros positivos a YFV en las diluciones 1:5 y 1:10) y 5 sueros
Citotoxicidad
positivos a DENV-2.
En ninguna de las diluciones evaluadas se observó efecto
citotóxico.

Evaluación de los resultados obtenidos mediante

PRNT y MNT para DENV-2
La tabla 1 indica los resultados de la optimización de la MNT para
DENV-2 y las concentraciones usadas en la prueba.

Tabla 1. Comparación entre la PRNT y MNT para DENV-2

PRNT MNT
Concentración de
2.5 x 105 cel/mL 0.9 x 105 cel/mL
células
Ensayo de
6 muestra x 12 muestras x
muestras por placa
placa/duplicado placa/triplicado
(con una dilución)
Tiempo de
obtención de 8 días 10 días
resultados
Tiempo de
ejecución del 12 h 5h
ensayo
24 mL
Medio por placa 9.6 mL (M.M)
(MC + overlay)

Figura 1: Prueba de plaqueo para DENV-2 por el metodo SBF/placa 1.2 mL 0.384 mL
semisólido usando células Vero-76 en suspensión y medio de Abreviatura: PRNT: Prueba de Neutralización por Reducción de Placas, MNT:
Pruebas de Microneutralización, SBF:.Suero Bovino Fetal
recubrimiento con 6 % CMC.

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Figura 2: Optimización de la MNT para DENV-2 por el método de suspensión celular evaluando 3 concentraciones
celulares suspendidas en medio de mantenimiento al 2 % de SBF.

Títulos de anticuerpos neutralizantes contra DENV-2 reacción cruzada entre el virus DENV-2 y los anticuerpos del YFV.
obtenidos por PRNT y MNT A partir de la dilución 1:40 no se presentó reacción cruzada entre
DENV-2 y YFV por MNT.
Los títulos de anticuerpos neutralizantes de las 15 muestras
evaluadas se presentan en la tabla 02.
Los títulos de anticuerpos neutralizantes obtenidos en las
muestras positivas a DENV-2 y YFV por MNT fueron menores
Evaluación de la reacción cruzada entre YFV y DENV-2 en comparación con la PRNT en dos muestras, siendo todas
en la MNT para DENV-2 las muestras positivas para la presencia de anticuerpos
neutralizantes del tipo IgG en ambas pruebas. Al comparar
Mediante la MNT, los 5 sueros negativos a la presencia de
la correlación de los resultados de la MNT y el PRNT por el
anticuerpos neutralizantes contra DENV-2 y YFV presentaron
coeficiente de correlación de rangos de Spearman se encontró
la monocapa celular sin ECP, no pudiendo diferenciar entre
un R = 0,887 y p < 0,05.
muestras positivas y negativas contra estos virus en las diluciones
1:5 y 1:10; considerandose como indeterminados. Las muestras
negativas a DENV-2 y YFV por PRNT son negativas por MNT a
partir de la dilución 1:20. DISCUSIÓN
De los 5 sueros negativos a DENV-2 y positivos a YFV mediante En el presente estudio se realizó 5 pasajes virales y se encontró
PRNT, 3 sueros mostraron reacción cruzada en la dilución 1:20 que en el primer y segundo pasaje de DENV-2 las placas líticas
y 2 sueros mostraron reacción cruzada en 1:10 (se observó una en la prueba de plaqueo no fueron definidas; no obstante,
monocapa celular sin ECP) considerando el resultado como una en el quinto pasaje las placas líticas mostraron una mejor

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Prueba de microneutralización para detección del virus dengue serotipo 2 Sevilla-Drozdek L, et al.

Tabla 2. Evaluación de 5 sueros negativos a DENV-2 y YFV, 5 Sueros negativos a DENV-2 y positivos a YFV y 5 sueros positivos a DENV-2
y YFV; mediante la PRNT y MNT para DENV-2.

Título de anticuerpos neutralizantes

contra DENV-2 Título de anticuerpos
Grupo de suero N° Sueros neutralizantes YFV por PRNT
PRNT MNT (Título/Resultado)
(Título/Resultado) (Título/Resultado)
Negativos a anticuerpos 5 <1:5 / Negativo 1:10 / Indeterminado <1:10 / Negativo
contra DENV-2 y YFV

Negativos a 2 <1:5 / Negativo 1:10 / Rx. Cruzada 1:10 / Positivo

anticuerpos 3 <1:5 / Negativo 1:20 / Rx. Cruzada 1:10 / Positivo
contra DENV-2 y
positivos a YFV

Positivo a 1 1:160 / Positivo 1:40 / Positivo 1:10 / Positivo

anticuerpos 3 ≥ 1:640 / Positivo 1:640 / Positivo 1:10 / Positivo
contra DENV-2 y YFV 1 1:320 / Positivo 1:80 / Positivo 1:10 / Positivo

Abreviaturas: DENV-2: Virus del Dengue Serotipo 2, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla , PRNT: Prueba de Neutralización por Reducción de Placas , MNT: Pruebas de
Microneutralización

definición, siendo necesario estos pasajes virales para adaptar una monocapa confluente lo suficientemente densa para permitir
el virus a la línea celular Vero. Teniendo en cuenta la alta tasa la manifestación de un buen ECP y la discriminación de los pozos
de mutación de DENV, es aconsejable mantener los stocks de infectados y no infectados mediante la coloración de las células.
virus con pasajes bajos y en las líneas celulares como la Vero-76 El SBF tiene factores de crecimiento, hormonas, minerales, lípidos
se sugiere propagar hasta 20 pasajes para prevenir mutaciones y otros micronutrientes que ayudan a la proliferación y adhesión
en las células que pudieran afectar la replicación viral [17]. Se celular jugando un rol principal en la formación de la monocapa
encontró que el método óptimo para la MNT fue el método celular [18] y es uno de los componentes más costosos del medio
que utiliza células en suspensión a una concentración de 0,9 de cultivo. El porcentaje óptimo de SBF encontrado fue 2 % donde
x 105 cel/mL. Esta concentración de células en conjunto con la se puede se evidenciar la presencia del ECP a diferencia de las
adecuada concentración de SBF (2 %) permiten la formación de concentraciones de 3 % y 4 % donde no se pudo visualizar el ECP

DILUCIÓN
1280

≥ 640

320

160

80

40 PRNT
20 MNT
10

<5

SUERO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

DENV-2 (-) DENV-2 (-) DENV-2 (+)

YFV (-) YFV (+) YFV (+)

Figura 4: Evaluación de 15 muestras de suero por la prueba de PRNT y MNT para la detección de anticuerpos
contra DENV-2.

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del DENV-2. El uso de SBF al 2 % permitió reducir los costos en DENV y miembros de la familia Flaviviridae [5].Para evitar la reacción
la MNT [19] y previene el desprendimiento celular en muestras cruzada entre DENV-2 y YFV en sueros de zonas endémicas es
positivas por la neutralización del virus. En este estudio se necesario trabajar las muestras a partir de la dilución 1:40 para
observó que utilizando una concentración de 0.6 x105 cel/mL la evitar la reacción cruzada de los anticuerpos de YFV y evitar falsos
monocapa celular en el control de células no alcanzó un 100 % de positivos en la detección de DENV-2. El análisis estadístico de la
confluencia. Esto podría deberse a que en nuestra metodología correlación de los títulos obtenidos por PRNT y MNT para DENV-2
la propagación y mantenimiento de los cultivos celulares en fue estadísticamente significativo (p < 0,05), con una correlación
frascos y placas se realizó en una incubadora sin inyectar CO2. considerada como muy buena y directamente proporcional
El uso de CO2 en los cultivos celulares permite mantener el (R = 0,887). La prueba de PRNT es considerada la prueba de
equilibrio carbonato-bicarbonato del medio y estabiliza su oro para la detección de anticuerpo neutralizantes y permite
pH [20]. No obstante, los cultivos celulares producen su propio trabajar diluciones más bajas que la MNT. En el 2008, Putnak y
CO2 y este fue utilizado para mantener el pH del medio de cultivo colaboradores describieron que la PRNT es más sensible que la
al emplear frascos y placas selladas. Por otro lado, el medio se MNT para DENV [25]. Existen otras técnicas como la MNT-ELISA
utilizó con un pH de 7.1 y estabilizado con buffer HEPES [8] para la cual usa el principio inmunológico de la MNT y el proceso de
evitar la alcalinización en un sistema que no utiliza incubadoras coloración de células es remplazado por un revelado mediante
con inyección de CO2. una prueba de ELISA. Esta técnica no necesita esperar la aparición
del ECP reduciendo el tiempo de incubación de las muestras;
En un estudio realizado para determinar la presencia de sin embargo, utiliza reactivos adicionales como el conjugado,
anticuerpos contra los virus Rocío y Ilheus, se usó una el sustrato y anticuerpos monoclonales o policlonales para la
concentración de células Vero-76 de 5 x 105 cel/mL en medio realización del inmunoensayo aumentando los costos de la
de mantenimiento al 3 % de SBF empleando el método de prueba [21,6]. La MNT presenta el mismo principio inmunológico
suspensión celular [10], esto posiblemente se deba a que el ECP de que la PRNT y grandes ventajas como el procesamiento de un
estos virus es más fuerte, por lo cual necesita una monocapa más mayor número de muestras séricas y ahorro de materiales,
densa lo cual se logra incrementando la concentración de células y insumos y tiempo de procesamiento, los cuales reducen
de SBF [18]. Otro estudio evaluó la presencia de anticuerpos contra los costos de los ensayos, brinda resultados confiables y se
DENV-2 mediante MNT se usó una concentración de células convierte en una herramienta útil en los estudios de vigilancia
Vero a 1 x 104 cel/mL con el método de monocapa completa y epidemiológica para identificar, medir y analizar problemas de
se infectó con DENV-2 (cepa de Nueva Guinea) incubando toda salud que perjudican a la población, tomar decisiones destinadas
la noche a 37°C [21] la cual es una cepa referencial utilizada en a promocionar la salud y prevenir enfermedades [26].
diferentes estudios [22,23] y en este estudio utilizamos una cepa
nativa de DENV-2 (aislamiento peruano del 2015). Las cepas Es importante resaltar que los anticuerpos neutralizantes
nativas de DENV pueden presentar un ECP débil debido a que son anticuerpos de alta especificidad que van a neutralizar
aún no están adaptadas a las líneas celulares al virus viable reconociendo los epítopos virales específicos
produciéndose la reacción antígeno - anticuerpo In vitro. Ninguna
El título viral del DENV-2 para MNT por el método de Reed y prueba hasta el momento es superior o reemplaza a la PRNT [25];
Muench fue 10 3,48 TCID50/ mL. En un estudio realizado por Juarez, no obstante, la microneutralización tiene ventajas en la reducción
2009 describió que el título del virus Rocio e Ilheus por MNT fue de costos de los ensayos, reducción de tiempo de incubación y
10 5.17 y 10 6.36 TCID50/ mL respectivamente [10]. Medina et al., 2012 del procesamiento de la prueba.
reportó que el DENV no alcanza títulos tan altos como otros virus
para uso en ensayos biológicos [17], lo cual fue corroborado en Agradecimientos: Un agradecimiento muy especial a los
este estudio. Con respecto a la citotoxicidad de las muestras de docentes y colegas del Laboratorio de Virología Clínica y
sueros, las altas concentraciones de suero podrían desprender Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNMSM
la monocapa celular debido a la toxicidad interfiriendo con por permitir desarrollar el presente estudio de investigación.
los resultados de la prueba y pudiendo reportar resultados Contribuciones de autoría: Lucas Augusto Sevilla Drozdek
falsos negativos por MNT [24], para este estudio no se presentó (Procesamiento de las muestras séricas y DENV-2, Optimización
citotoxicidad en las células Vero-76 a partir de la dilución 1:5; de las pruebas, Análisis de resultados y redacción del artículo);
cabe señalar que los 15 sueros fueron inactivados a 56°C x 30 Enrique Walter Mamani Zapana (Asesor de tesis y revisión del
min para inactivar el sistema complemento. artículo); Egma Marcelina Mayta Huatuco (Asesoría y revisión del
artículo); Nora Reyes Puma ( Revisión de artículo); Karla Verónica
Los 5 sueros negativos a DENV-2 y YFV presentaron monocapa Vásquez Cajachahua (Procesamiento de prueba de YFV y revisión
completa en la dilución final 1:10 esto podría deberse a que los del artículo); Bernardo Esteban Quispe Bravo (Mantenimiento
sueros aportan nutrientes a las células lo cual podría interpretarse de cultivos celulares y revisión del artículo); Joe Hermosilla Jara
como falsos positivos para la MNT. Para evitar este sesgo se (Colaboró en el diagnóstico molecular por qRT – PCR y revisión del
sugiere trabajar las muestras a partir de una dilución de 1:40. Los 5 artículo); Adrián Quintana Bedoya (Mantenimiento de cultivos
sueros negativos a DENV-2 y positivos a YFV presentaron reacción celulares y revisión del artículo); Juan Samuel Sulca Herencia
cruzada en las diluciones 1:10 y 1:20 para DENV-2, debido a los (Asesor de tesis, Supervisor del proyecto y co – redactor del
determinantes antigénicos compartidos entre los serotipos del artículo)

110 Acta Med Peru. 2023;40(2):104-12 ISSN electrónica 1728-5917

Prueba de microneutralización para detección del virus dengue serotipo 2 Sevilla-Drozdek L, et al.

Fuente de Financiamiento: INNOVATE – Contrato N° 132- FINCyT- Viral Immunol [Internet]. 2008 Jun;21(2):123–32. Available from:
IB-2013 – PERÚ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18476771.
Potencial conflictos de interés: Los autores declaran no tener 9. CDC. Laboratory Guidance and Diagnostic Testing. Dengue. 2016.
conflictos de interés. (internet) Disponible en:http://www.cdc.gov/dengue/clinicallab/
laboratory.htmL.
10. Juarez Espinoza DS.. Detección de anticuerpos neutralizantes contra
los virus Rocío, Ilheus y Oeste del Nilo en una población humana
ORCID de Iquitos entre los años 2003-2007. ( Tesis de Título Profesional).
Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Mayor de
Sevilla Drozdek, Lucas, https://orcid.org/0000-0002-8086-0523 San Marcos. 2009. https://hdl.handle.net/20.500.12672/901.
Mayta Huatuco, Egma, https://orcid.org/0000-0001-8471-1675 11. Nascimento EJM, Bonaparte MI, Luo P, Vincent TS, Hu B, George JK,
Mamani Zapana, Enrique, https://orcid.org/0000-0003-4127-1248 et al. Use of a blockade-of-binding ELISA and microneutralization
Reyes Puma, Nora, https://orcid.org/0000-0003-1671-5169 assay to evaluate Zika virus serostatus in dengue-endemic areas. Am
Vasquez Cajachahua, Karla, https://orcid.org/0000-0002-2000-3597 J Trop Med Hyg. 2019;101(3):708–15. doi: 10.4269/ajtmh.19-0270.
Quispe-Bravo, Bernanrdo, https://orcid.org/0000-0002-9361-7709 12. Qiagen. RNeasy® Mini Handbook. (Fourth edition ed.). [no place]:
Hermosilla Jara, Joe, https://orcid.org/0000-0001-9017-3324 QUIAGEN; June 2012. http://www.bea.ki.se/documents/EN-
Quintana Bedoya, Adrian, https://orcid.org/0000-0003-1252-0268 RNeasy%20handbook.pdf
Juan Sulca Herencia, Juan, https://orcid.org/0000-0003-4078-7744 13. Johnson BW, Russell BJ, Lanciotti RS. Serotype-specific detection of
dengue viruses in a fourplex real-time reverse transcriptase PCR
assay. J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):4977-83. doi: 10.1128/
JCM.43.10.4977-4983.2005.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 14. Álvarez Vera M, González Rodríguez A, Díaz Morejón D, Morier Díaz
L, Tirado G, G M. Normalización de la técnica de neutralización por
1. World Health Organization. Dengue and Severe dengue. 2022.
placas en las células Vero para los virus del dengue. Rev Cubana
Disponible en: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/
Med Trop [Internet]. 2010 Aug [cited 2016 Sep 8];62(2):138–137.
detail/dengue-and-severe-dengue.
Available from: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_
2. Ministerio de Salud. Situación del dengue en el Perú (a la SE abstract&pid=S0375-07602010000200009&lng=es&nrm=iso&tln
21); Boletín epidemiológico Volumen 26 (8): 688 – 691., 2017 g=es.
Disponible en: https://www.dge.gob.pe/portal/docs/vigilancia/
15. Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí (IPK). Técnicas de
boletines/2017/21.pdf.
laboratorio para el diagnóstico y la caracterización de los virus
3. Ministerio de Salud. Situacion epidemiologica del dengue y otras del dengue. La Habana, Cuba: Ministerio de Salud. 2013. https://
arbovirosis; Centro Nacional de Epidemiología, prevención y www.paho.org/hq/dmdocuments/2011/Protocolos_Dengue_
control de enfermedades. 2021. Disponible en: https://www.dge. IPK_2009_I.pdf
gob.pe/portalnuevo/wp-content/uploads/2021/05/Vigilancia-
16. Ramakrishnan MA, Dhanavelu M. Influence of Reed-Muench
Epidemiologica-de-dengue-y-otras-arbovirosis.pdf.
Median Dose Calculation Method in Virology in the Millennium.
4. Cabezas César, Paquita García María, Valle Jorge, Yañez Pamela, 2018;(December). 28(2):16-18. https://www.researchgate.net/
Fachin Luis, Sinti Carmen et al. Transmisión vertical del virus del publication/329774869_Influence_of_Reed-Muench_Median_
dengue en el Aedes aegypti, Perú. Rev. perú. med. exp. salud Dose_Calculation_Method_in_Virology_in_the_Millennium.
publica [Internet]. 2015 Ene [citado 2023 Jul 03] ; 32( 1 ): 191-192.
17. Medina, F., Medina, J.F., Colón, C., Vergne, E., Santiago, G.A.
Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_
and Muñoz‐Jordán, J.L. Dengue Virus: Isolation, Propagation,
arttext&pid=S1726-46342015000100028&lng=es.
Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology,
5. Rockstroh A, Barzon L, Pacenti M, Palù G, Niedrig M, Ulbert S. (2012), 27: 15D.2.1-15D.2.24. doi:10.1002/9780471729259.
Recombinant Envelope-Proteins with Mutations in the Conserved mc15d02s27 Disponible en: https://currentprotocols.onlinelibrary.
Fusion Loop Allow Specific Serological Diagnosis of Dengue- wiley.com/doi/epdf/10.1002/9780471729259.mc15d02s27.
Infections. PLoS Negl Trop Dis [Internet]. 2015 Nov;9(11):e0004218.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26565964. 18. Escobar LM, Moraantes S, Cordero CP, Aristizabal F. Implementación
de estrategias in vitro para evaluar la funcionalidad de un suero fetal
6. Sulca Herencia J. Laboratory Tests Used in the Diagnostic and bovino colombiano. Rev Colomb Ciencias Químico-Farmacéuticas
Research of Dengue Virus: Present and Future. Dengue Fever - a [Internet]. 2011 Jul [cited 2017 Aug 2];40(2):201–21. Available
Resilient Threat in the Face of Innovation [Internet]. 1st ed. London: from: http://revistas.unal.edu.co/index.php/rccquifa/article/
Jorge Abelardo Falcón-Lezama, Miguel Betancourt-Cravioto and view/45583.
Roberto Tapia-Conyer; 2019 [cited 11 April 2020]. p. 169. Available
from: https://www.intechopen.com/books/dengue-fever-a- 19. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-
resilient-threat-in-the-face-of-innovation/laboratory-tests-used-in- neutralization Assay. J. Vis. Exp. (118), e54897, doi:10.3791/54897
the-diagnostic-and-research-of-dengue-virus-present-and-future. (2016).
7. Timiryasova TM, Bonaparte MI, Luo P, Zedar R, Hu BT, Hildreth SW. 20. Epidemiología Molecular de Enfermedades Infecciosas. La
Optimization and validation of a plaque reduction neutralization instrumentación del laboratorio de cultivo celular. 2012. Disponible
test for the detection of neutralizing antibodies to four serotypes de: https://epidemiologiamolecular.com/laboratorio-cultivo-
of dengue virus used in support of dengue vaccine development. celular/.
Am J Trop Med Hyg [Internet]. 2013 May;88(5):962–70. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23458954. 21. Li J, Hu D, Ding X, Chen Y, Pan Y, Qiu L, et al. Enzyme-linked
immunosorbent assay-format tissue culture infectious dose-50 test
8. Roehrig JT, Hombach J, Barrett ADT. Guidelines for Plaque-Reduction for titrating dengue virus. PLoS One [Internet]. 2011;6(7):e22553.
Neutralization Testing of Human Antibodies to Dengue Viruses. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21799894.

ISSN electrónica 1728-5917 Acta Med Peru. 2023;40(2):104-12 111

 Sevilla-Drozdek L, et al. Prueba de microneutralización para detección del virus dengue serotipo 2

22. Côrtes Luzia M de C, Barth Ortrud M, Pantoja Josery R, Alves Carlos 24. Logan N, McMonagle E, Drew AA, Takahashi E, McDonald M, Baron
R. Comparative immunological recognition of proteins from New MD, et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-
Guinea "C" dengue virus type 2 prototype and from a dengue pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in
quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine [Internet]. 2016
virus type 2 strain isolated in the State of Rio de Janeiro, Brazil. Feb;34(6):814–22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Mem. Inst. Oswaldo Cruz [Internet]. 2003 Apr [cited 2020 May pubmed/26706278.
27] ; 98( 3 ): 331-334. Available from: http://www.scielo.br/scielo.
25. Putnak JR, de la Barrera R, Burgess T, Pardo J, Dessy F, Gheysen D,
php?script=sci_arttext&pid=S0074-02762003000300007&lng=en. et al. Comparative evaluation of three assays for measurement of
https://doi.org/10.1590/S0074-02762003000300007. dengue virus neutralizing antibodies. Am J Trop Med Hyg [Internet].
2008 Jul;79(1):115–22. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.
23. Pitcher TJ, Gromowski GD, Beasley DWC, Barrett ADT. Conservation gov/pubmed/18606774.
of the DENV-2 type-speci fi c and DEN complex-reactive antigenic
sites among DENV-2 genotypes. Virology [Internet]. Elsevier Inc.; 26. Pujol, M. y Limón, E.. Epidemiología general de las infecciones
nosocomiales. Sistemas y programas de vigilancia. 2013.
2012;422(2):386–92. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, pp. 108-113.
virol.2011.10.020. ISSN 0213-005X. DOI 10.1016/j.eimc.2013.01.001.

112 Acta Med Peru. 2023;40(2):104-12 ISSN electrónica 1728-5917