Técnicas de amplificación de ADN- RT- PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain
Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología
molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de
ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molécula. La PCR se basa en la
replicación celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de
ADN a partir de otra que funciona como molde. En procariontes se han encontrado al
menos 12 proteínas involucradas en la replicación.
Estas proteínas actúan en diferentes actividades, como: 1) la identificación del sitio de
origen de la replicación; 2) el desenrollamiento de la doble hélice; 3) la estabilización de la
estructura desenrollada; 4) la generación de cadenas iniciadoras complementarias con un
extremo 3’ libre que sirve de iniciador para que la ADN polimerasa comience su actividad
catalizadora; 5) el avance de la bifurcación replicadora por desenrollamiento; 6) los pasos
finales del ensamblaje de dos cadenas complementarias; 7) la identificación de los sitios
de terminación y 8) el superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN . Sin
embargo, la enzima más importante en la replicación es la polimerasa del ADN
dependiente de ADN, comúnmente conocida como ADN polimerasa, porque es la
encargada de incorporar nucleótidos durante la síntesis de las nuevas cadenas de ADN
Como se lleva a cabo esta técnica
En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular. La síntesis de
nuevas cadenas de ADN se lleva a cabo mezclando: el ADN que contiene el o los
fragmentos que se van a amplificar; la polimerasa; los iniciadores (fragmento de ADN de
15-30 nucleótidos que flanquean la región a amplificar y que aportan el extremo 3’ libre
para que inicie la transcripción); desoxinucleótidos (dNTPs); cloruro de magnesio (MgCl2)
u otro co-factor necesario para que trabaje la polimerasa PCR: reacción en cadena de la
polimerasa y una solución amortiguadora que mantenga el pH apropiado para que se lleve
a cabo la síntesis
Existen estas tres etapas: 1) desnaturalización, 2) alineamiento y 3) extensión del ADN
Origen de la técnica de PCR
La PCR surgió en 1971 cuando Gobind Khorana describe la técnica al explicar la replicación
de un fragmento de ADN usando dos iniciadores, pero fue en 1983 cuando Kary Mullis y
sus compañeros de la compañía californiana Cetus Corporation la llevaron a cabo por
primera vez mientras trabajaban en la fabricación de oligonucleótidos y en el uso de
iniciadores para la secuenciación de ADN. Mullis y colaboradores usaron dos iniciadores
que se alineaban con cada una de las hebras del ADN, adicionaron ADN polimerasa I de
Escherichia coli y nucleótidos trifosfatados. Como resultado obtuvieron la replicación
exponencial del fragmento de ADN flanqueado por los iniciadores (Mullis y Faloona 1987).
En un principio, para llevar a cabo el ciclo de PCR, se calentaba la mezcla en baño María
Amplificación de ADN mediante PCR
Un ciclo de amplificación consta de tres etapas: separación de las hebras de ADN
(desnaturalización), unión de los iniciadores a una secuencia complementaria del ADN
molde (alineamiento) y la síntesis semiconservativa de una nueva cadena por adición de
nucleótidos debido a la acción de la ADN polimerasa (extensión). Cada una de las etapas
está determinada por una temperatura. Teóricamente el proceso permite generar en 30
ciclos de amplificación más de dos billones de copias de ADN a partir de una sola molécula
En la actualidad, para llevar a cabo la PCR, únicamente se necesita mezclar en micro tubos
el ADN molde, la ADN polimerasa; los desoxirribonucleótidos adenina (dATP), guanina
(dGTP), citosina (dCTP) y timina (dTTP); una solución amortiguadora; un co-factor de la
polimerasa (regularmente se usa magnesio) y los iniciadores.
La reacción se efectúa en equipos conocidos como termocicladores que se programan
para que produzcan los ciclos de temperatura a los que se realiza la amplificación.
Equipo
Termociclador
Vortex
Micro pipetas de 2, 20, 100 y 200 µl,
Microcentrífuga
Fotodocumentador
Material
Guantes desechables de látex, vinil o nitrilo
Tubos para PCR
Puntas para micro pipetas
Baño de hielo
Gradilla
Ciclos Copias de ADN
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1,024
11 4,092
12 8,192
13 16,384
14 32,768
15 65,536
16 131,072
17 262,144
18 524,288
19 1,048,576
20 2,097,152
21 4,194304
22 8,388,608
23 16,777,216
24 33,554,432
25 67,108,864
26 134,217,728
27 268,435,456
28 536,870,912
29 1,073,741,824
30 2,147,483,648
Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (Rt-PCR)
Es una variante de la PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología
molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso
llamado amplificación (reacción en cadena de la polimerasa). En la RT-PCR,
se retrotranscribe una hebra o cadena o banda de ARN en ADN complementario (ADNc)
usando una enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se
amplifica mediante una PCR tradicional
Esta técnica es muy precisa, ya que se diseñan primers (también llamados cebadores)
específicos para amplificar una secuencia determinada
Los principales usos de la RT-PCR están relacionados con el campo del diagnóstico
molecular y con la investigación científica. Puede utilizarse como método de detección
molecular de genes, para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (por
ejemplo, el VIH), el virus de la gripe (el virus de la influenza, o el SARS-CoV-2.)
Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc
generado ya no lleva los intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al expresar
el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente
por exones. Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más importantes:
insertar genes eucariota en organismos procariota.
Patologías relacionadas
El ZIKV es un virus ARN, pero las pruebas moleculares detectan y amplifican normalmente
secuencias de ADN, por lo que para el diagnóstico del ZIKV es necesario utilizar una
prueba que permita la lectura de ARN como la RT-PCR, en la que se utiliza la enzima
transcriptasa inversa para que el ARN pueda ser transcrito en el ADN complementario, lo
que hace que el análisis de PCR de moléculas de ARN sea posible
Para que esto pase se ve la especificidad y sensibilidad de las pruebas, cabe resaltar que
en los estudios la técnica que se utilizo fue la RT-PCR y se utilizaron como muestras
biológica orina, suero y sangre total; siendo esta la técnica hasta el momento más
recomendada.
La PCR es la prueba molecular más utilizada en el diagnóstico virológico ya que permite la
detección del genoma viral o fragmentos de él y lleva a un diagnóstico certero. Hasta el
momento la RT-PCR es la más utilizada para el diagnóstico de la infección por el virus Zika
no solo porque es una prueba que se ha estandarizado en muchos laboratorios, sino
también porque presenta una alta sensibilidad y especificidad, garantizando un
diagnóstico acertado.
Patologías donde se puede diagnosticar
Infecciones respiratorias
Para el diagnostico de las infecciones respiratorias se usa la técnica RT-PCR.
Pero el diagnóstico de las infecciones respiratorias es un reto, ya que en numerosas
ocasiones no se consigue llegar al microorganismo o a los microorganismos causantes
por lo que no es posible establecer un diagnóstico etiológico basándose únicamente en los
síntomas y signos del paciente, por otro lado, el desarrollo de las técnicas moleculares
permite la instauración temprana de un tratamiento antibiótico y el aislamiento del
paciente si es causa de un microorganismo causante
Conclusión:
Las técnicas de biología molecular permiten alcanzar un diagnóstico rápido y definitivo,
que permitiría mejorar el pronóstico de muchas de las enfermedades infecciosas, y utilizar
tratamientos antibióticos adecuados
Pregunta #1 ¿Cuáles son las tres etapas para que se lleve a cabo la síntesis? R/ 1)
desnaturalización, 2) alineamiento y 3) extensión del ADN
Pregunta #2 ¿Que equipos se utiliza en esta reacción? R/
Termociclador
Vortex
Micro pipetas de 2, 20, 100 y 200 µl,
Microcentrífuga
Fotodocumentador
Pregunta #3 ¿Cuantas proteínas están involucradas en la replicación? R/ 12 PROTEINAS EN
PROCARIONTES
Pregunta #4 ¿Cuáles son los dos iniciadores alineadas a las hebras del ADN? R/ADN
polimerasa I de Escherichia coli y nucleótidos trifosfatados
Pregunta #5 ¿Qué enzima se usa para retrotranscibir el ADN? R/ La transcriptasa inversa
