INGENIERÍA GENÉTICA

Las diferentes técnicas de ingeniería genética tienen múltiples aplicaciones

Ingeniería genética es una rama de la biotecnología (conjunto de técnicas, mediante las que se obtienen
productos útiles para las personas a partir de seres vivos o de sus productos) que consiste en el uso de
diversas técnicas para manipular el ADN de los organismos, mediante una transferencia de ADN de unos
organismos a otros.
Biotecnología
 Biología:
o Estudios evolutivos: organismos extinguidos y/o actuales
o Huellas genéticas (dactilares del ADN = finguerprints) en investigaciones forenses, pruebas
de paternidad…
 Arqueología e historia: momias…
 Biosanitarias
o Obtención de proteínas y vacunas: insulina, interferon, anticuerpos (monoclonales)
o Terapia génica: manipular el genoma para conseguir o sustituir el gen defectuoso
o Diagnóstico clínico con sondas de ADN
o Organismos transgénicos en investigación y producción de medicinas, vacunas…

Secuenciación de ADN
 Permite deducir la secuencia de aminoácidos de las proteínas y, en consecuencia, sus estructuras y
funciones
 revela información sobre la regulación de los genes
Consta de la siguiente estrategia
1. cortar el ADN en fragmentos para facilitar su secuenciación
2. Determinar la secuencia de nucleótidos de cada fragmento
3. determinar el orden de los fragmentos en la cadena
Existen dos tipos, la enzimática o método determinación de la cadena didesoxi de Saguer, Sanger
descubrió un método enzimático que hacía posible la secuenciación de moléculas mayores de ADN, de
manera rápida y económica, de la que se obtenia como resultado genomas completos muy complejos.

El método precisa de múltiples copias idénticas de la cadena de ADN a secuenciar, valores radioactivos,
formados por un corto número de nucleótidos complementarios a los situados en el extremo 3’ de la
cadena de ADN, una cadena ADN pol y los cuatro didesoxirribonucleotidos marcados con una molécula
específica fluorescente
1. Se desnaturaliza el ADN a secuenciar
2. Se mezclan todos los componentes de la reacción y se forman nuevas cadenas de ADN que se
emplean como molde para el que se quiere secuenciar. La síntesis comienza en el extremo 3’ del
cebador y continúa hasta que se inserta en uno de los desoxirribonucleotidos deteniéndose la
síntesis. Al final se logra una mezcla de cadenas de ADN de longitudes variadas, que llevan en su
extremo 3’ los nucleótidos con la molécula fluorescente
3. Se separan las cadenas marcadas mediante la electroforesis, de tal manera que las más cortas son
las que se mueven con mayor rapidez, todas las cadenas de ADN van marcadas con un detector de
 fluorescencia, a lo largo que avanzan se van viendo. El color de la marca nos indica que
didesoxinucleotido ocupa el extremo 3’ del fragmento terminal de ADN.
4. Se obtiene un espectrograma que nos dará la secuencia de bases complementarias a la cadena
molde.

Y la automática, esta es una variable de la anterior, en la que los cebes se unen a marcas fluorescentes, se
lleva a cabo a una gran escala, utilizando hasta 96 tubos, de modo que se pueden procesar 96 muestras a la
vez.

Obtención de fragmentos de ADN

El proceso de ingeniería genética comienza con la obtención de un fragmento o gen de ADN, para el que se
pueden emplear las siguientes técnicas: ADN recombinante, obtención de un ADN complementario y
síntesis de ADN en un laboratorio.

Tecnología del ADN recombinante

Esta técnica permite cortar la molécula de ADN por lugares concretos para posteriormente, unir los
fragmentos obtenidos con un ADN procedente de una fuente diferente y lograr así una sola molécula de
ADN que se conoce como ADN recombinante.
Se desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de restricción o endonucleasa de restricción (son
un grupo de enzimas propias de bacterias, cuya función es destruir los ADN víricos que puedan entrar en
estos organismos, para lo que realizan cortes en el ADN extraño).

 Primero se reconoce en el ADN una pequeña secuencia de bases palindrómicas determinada entre
cuatro y ocho nucleótidos y el sitio de restricción.
 Para luego cortar las dos hebras de ADN por ese lugar (es por eso, por lo que se compara con unas
tijeras, llamadas, “tijeras moleculares”). El corte es consecuencia de la hidrólisis del enlace
fosfodiéster, que une entre sí, dos de los nucleótidos que forman la hebra de ADN y genera dos
fragmentos de ADN denominados fragmentos de restricción.

Modo de acción de las enzimas de restricción

Algunas enzimas como la Hae lll cortan ambas cebras
justo por el centro, resultando dos fragmentos de
ADN bicatenario cuyos extremos no contienen bases
desemparejadas se denominan extremos romos.
Otras enzimas, como por ejemplo la Eco Rl, no cortan
la secuencia justo por la mitad, sino que dejan unos
extremos monocatenarios complementarios o
extremos cohesivos que facilitan la unión de
fragmentos de ADN cortados con la misma enzima de
restricción, aunque procedan de diferentes ADN.

 Para insertar un ADN pasajero en el seno de un ADN

receptor se han de cortar ambos con la misma
enzima de restricción, para que de este modo, las
bases nitrogenadas de los extremos cohesivos
puedan unirse (mediante puentes de hidrógeno),
para que este proceso se lleve a cabo es necesario la
presencia de la enzima ADN ligasa (une fragmentos->
ADN recombinante).

 Estas uniones son temporales, pero se pueden hacer

permanentes en la presencia de la enzima ADN ligasa que cataliza la formación de enlaces que
cierran los esqueletos de azúcar-fosfato, (la ADN ligasa requiere la presencia de un grupo fosfato en
el extremo 5’ y un grupo OH en el extremo 3’).
  Este ADN recombinante puede incorporarse a las células de otros organismos, en los que podrá
expresar la información genética que contiene.

Síntesis de ADN complementario

En organismos eucarioticos se obtiene un ADN formado por intrones y exones, cuya transcripción origina un
ARNm que debe ser sometido a un proceso de maduración. Es por eso por lo que cuando se quiere
conseguir muchas copias de un ADN concreto se recurre a la enzima transcriptasa inversa (proteína
específica de los retrovirus que lleva como material genético el ARN), ya que es capaz de dirigir la síntesis de
un ADN complementario o ADN copia (ADNc) de cadena sencilla empleando un molde de ARNm maduro.
Este ADNc sirve como molde para la síntesis de otro ADNc de doble cadena que carece de intrones,
regiones, reguladoras o repeticiones y puede ser traducido por bacterias.

Obtención de un ADNc
1. Se aísla y purifican un ARNm maduro y se añade un
oligonucleotido de timina que hibride con la cola poliA y funciona
como cebador de la transcriptasa inversa. El ARNm actúa como
molde para la síntesis de un ADNc de cadena sencilla.
2. Se añade la disolución NaOH, que hidroliza el ARNm. Se forma en
el ADNc sintetizado un lazo en horquilla que se convierte en
cebador para que la ADN pol l sintetice la segunda hebra de ADNc.
3. Se elimina la horquilla con una enzima específica (la nucleasa S1) y
se obtiene un ADNc de doble cadena.

El ADN se puede clonar en el interior de las células

La clonación es un proceso que consiste en la producción de individuos genéticamente, idénticos mediante
reproducción asexual, en o o de ADNc formado a partir de un ARNm. se denomina clonación de tipo celular,
debido a que tiene lugar en el interior de un organismo que hace de hospedador.
Todos los hospedadores deben tener unas condiciones determinadas
 Ser de crecimiento rápido para obtener generaciones en poco tiempo
 No ser patógenos para no introducir infecciones
 Favorecer la entrada de ADN recombinante incorporar a su genoma el ADN
 Deben poseer un amplio conocimiento y ser fácilmente manipulables (Ej: [Link])

Para incorporar el gen o fragmento de ADN que se quiere clonar en el hospedador, se emplean vectores de
clonación, que son moléculas de ADN capaces de transportar ADN extra y replicarse dentro del organismo
hospedador.
Todos los vectores de clonación deben tener unas características comunes:
 Deben portar unos genes
 Marcadores que sirvan para su rápida y fácil identificación
La elección de un u otro vector dependerá del tamaño del ADN que se quiere clonar.
Vectores de clonación:
 Plásmidos: son moléculas de ADN bicatenario de pequeño tamaño y estructura circular cerrada,
presentes de manera libre en el citoplasma de numerosas bacterias, no forman parte del
cromosoma bacteriano y tienen capacidad para replicarse, independientemente ya que tienen su
propio origen de replicación, muchos plásmidos llevan genes que confieren resistencia a algunos
antibióticos (tetraciclina o ampicilina) que otorgan al hospedador alguna característica que le
permite identificar con facilidad el gen que portan.
 Virus bacteriófagos: (lambda) es un virus que infectan a bacterias, en general, se replican mediante
la introducción de su genoma en células eucariotas o procariotas (infección) lo que resulta muy útil
para conseguir la clonación del ADN utilizando como vectores los virus modificados. Cada especie
de virus infecta a unas células determinadas y dependiendo del genoma vírico admite una mayor o
menor cantidad de ADN.
  Cósmidos: Son vectores sintéticos que combinan características de plásmidos y bacteriófagos, de
modo que su ADN puede replicarse en la célula como un plásmido o empaquetarse como un fago.
Tiene un origen de replicación plasmidico y uno o más genes marcadores que confieren resistencia
a determinados antibióticos y varios sitios de restricción donde se puede insertar el ADN foráneo.
 Cromosomas artificiales: este tipo de vectores han sido diseñados por su capacidad para llevar
porciones de gran tamaño de ADN. Existen dos tipos, los BAC (cromosomas artificiales bacterianos)
que son vectores sintéticos, derivados del plásmido F o del fago P1 y los YAC (cromosomas
artificiales de levadura) que pueden llevar fragmentos de ADN de hasta un millón de pares de
bases, y se construyen a partir de un plásmido bacteriano en el que se introducen los componentes
necesarios de un cromosoma de levadura para que pueda ser clonado tanto en una bacteria como
en una levadura.

Clonacion:
 Hacer copias idénticas
 Aislamiento y obtención del gen: utilizan enzimas de restricción para cortar y aislar
 Selección del vector: plásmidos, genomas víricos y genomas, bacterianos artificiales (cosmidos)
o moléculas pequeñas que se autoreplican independientemente del cromosoma
o Se incluyen marcadores (resistencia a antibióticos)
 Formación del ADN recombinante utilizando ADN ligasa
Eucariotas
 Dificultades:
o Genes contienen intrones
o Mecanismos de expresión más complejos
o No expresan toda la información
o No captan el ADN naturalmente
 Si el gen se inserta en:
o Células reproductoras o embrionarias: el gen estará en todas las células -> Organismo
transgénico
o Células somáticas: gen en un tejido órgano -> Terapia génica
 Selección del gen
o ADNc → del ARNm
o ADN sintético → de la secuencia de aa de la proteína
 Vectores deben insertar el gen en algún cromosoma
o Virus (adenovirus, viruela...) especialmente retrovirus
o Cromosamas artificiales: YAC (Yeast artificial chromosomes) son molec de ADNr
o Plasmidos Ti para células vegetales (plasmido de Agrobacterium tumefaciens)
 Sección de las células hospedadoras
o Celulas vegetales
o Levaduras (hongos)
o Células animales de tejidos como hepáticos, embrionarias
 Introducción del gen
o Microinyección en células embrionarias u ovulos
o Electroporación: impulsos eléctricos de alto V para hacer permeable la membrana
plasmática
o Pistola de genes
o Liposomas: vesículas de bicapas lipidicas con con ADN
o Agrobacterium
Aplicaciones: Org Clónicos (Dolly)

Renaturalizacion e hibridación de ácidos nucleicos

La hibridación consiste en aparear cadenas de secuencias complementarias, ya sea de ADN o ARN.
Los ácidos nucleicos son muy estables en condiciones normales, pero pueden sufrir desnaturalización por
efecto de un pH elevado o una alta temperatura, como consecuencia, perdiendo su conformación
tridimensional. En el caso de ADN, los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas se
rompen separando las dos hebras, pero sin que la estructura primaria resulte alterada ya que los enlaces
fosfodiéster no se rompen.
Este proceso está basado en la renaturalizacion de dos cadenas sencillas de ADN que se consigue enfriar
lentamente una disolución de ADN bicatenario previamente desnaturalizado con calor, con lo que se forma
una nueva hélice con total funcionalidad. Cuando las dos hebras que se renaturalizan proceden de
moléculas diferentes el proceso se denomina híbrida cuanto más relaciona los ácidos ácidos un, mayor será
el porcentaje de renaturalizacion.

Genotecas = biblioteca genética

Es una colección de clones que contienen el genoma de un organismo completo
 Librería de c-ADN -> colección de clones que contienen copias de los ARNm expresados en una
célula, tejido u organismo
 Librería genómica del genoma humano
o tamaño del genoma humano 3x10^9 pb
o Son necesarios, 150.000 clones de un tamaño medio de 20kb
 Restricciones del uso de los plásmido en la construcción de librerías
o Solo se pueden clonar pequeños fragmentos de ADN
o La baja eficiencia de la transformación en [Link] limita el número de clones que se
puede obtener
 Ventajas o inconvenientes del uso del bacteriófago lambda
o Pueden clonarse fragmentos más grandes
o Mayor eficiencia de transformación que los plásmidos
o La manipulación es más complicada que en el caso del plásmido, ya que muchos llevan
genes que les confieren resistencia a algunos antibióticos, como por ejemplo la
ampicilina o tetraciclina que otorgan al operador alguna característica que permite
identificar con facilidad el gen que portan)

PCR = reacción en cadena de la polimerasa

Es una técnica para replicar el ADN in vitro en grandes cantidades,
gracias a que emplea ADN pol extraídas de microorganismos
termófilos, que no se desnaturalizan por el calor. Fue desarrollada en
1985 por el científico Kari Mullis.
La PCR se emplea cuando se dispone de poca cantidad de ADN para
la obtención de copias del mismo, como alternativa a su introducción
en bacterias. Para realizar una PCR se necesitan los siguientes
elementos:
 El ADN que se va a clonar o ADN diana
 Los cuatro desoxirribonucleotidos trifosfatos necesarios para
sintetizar ADN
 Dos segmentos de ADN monocatenaria específicos que
actúan como cebadores ambos lados de la zona que se
quiere clonar
 Una fuente de calor
 La ADN pol termorresistente
El proceso se desarrolla por la repetición de ciclos, que constan de tres etapas:
 Desnaturalización del ADN: se calientan los productos reaccionan antes a unos 80°, para que se
desnaturalice y se separe la doble hélice. Cada una de las cadenas simples sirve de molde para
sintetizar una nueva cadena complementaria
 Hibridacion de los cebadores: se añaden los cebes y se disminuye la temperatura para permitir que
se puedan unir mediante enlaces de hidrógeno a cada uno de los extremos de las cebras de ADN
separadas previamente.
  Extensión: la ADN pol sintetiza una cadena sencilla de ADN en dirección 5’ -> 3’ en cada hebra del
ADN

Características del genoma humano

 Contiene más de 3000 millones de nucleótidos. Solo el 1,5 %, codifican proteínas
 El 50 % es secuencia repetidas
 Contiene unos 25.000 genes
 Muchos de los genes identificados no tienen una función molecular conocida
 Los genes no se distribuyen uniformemente por los cromosomas
 El número de intrones en los genes humanos varía desde cero (en los genes de las histonas) hasta
los 234 (el gen de la titina)
 3 millones de bases de la secuencia variada entre individuos (0.1%)
¿Que hizo posible la secuenciación del genoma humano? - El avance del conocimiento científico y el gran
desarrollo tecnológico en la década de los 80 del siglo XX.
 La PCR
 Secuenciación automática basada en fluorurocromos
 Software de análisis de secuencias
El gran esfuerzo económico de los países más ricos (principalmente Estados Unidos)
El Consorcio público pH

Objetivo del proyecto genoma humano

 Identificar todos los genes
 Determinar las secuencias de los 3 billones de nucleótidos distribuidos en 23 cromosomas
 Localizar y situar todos los genes en sus posiciones exactas
 Conocer las relaciones entre los genes

Clonación de un Gen humano en un plásmido bacteriano

Es el método más común de la clonación genética en el que se emplea
como célula hospedadora la bacteria [Link] y como vector de clonación
uno de sus plásmidos:
1. El plásmido usado como vector lleva al menos 2 genes marcados
el gen amp que confiere a la bacteria de resistencia al antibiótico
ampicilina y el gen lacZ que codifica la beta galactosidasa (Lleva
solo un sitio de restricción)
2. Si aísla el ADN humano y el plásmido y se cortan con la misma
enzima de restricción. El ADN se rompe en múltiples
fragmentosya que cuenta con muchos sitios de restricción.
Mientras que el plásmido solo provoca un corte en el gen lacZ
donde se encuentra el sitio de restricción, inactivándose su
acción
3. Se mezclan los fragmentos de ADN humano con los plásmidos
cortados. El ADN humanos se inserta en alguno de los plásmidos
ya que presenta varios extremos cohesivos que pueden unirse
gracias a la complementariedad de bases. Se agrega una ADN
ligasa que une los fragmentos del ADN con los plásmidos
bacterianos formándose numerosos plásmidos tanto
recombinantes como no recombinantes.
4. Se mezclan los plásmidos con bacterias que carecen de plásmidos
y llevan el gen lacZ del cromosoma bacteriano.
a. Habrá bacterias que por transformación incorporen
plásmidos recombinantes que lleven el gen de interés
b. También las habrá que contengan plásmidos sin
recombinar
c. O que incorporen plásmidos recombinantes con un ADN que no tiene interés.
 5. Se siembran las bacterias sobre una placa de Petri con un medio de cultivo que contiene ampicilina
y una sustancia similar a la lactosa se incuban hasta qué proliferan las bacterias.

Selección de clones con una sonda marcada radioactivamente

1. Una vez que se ha desarrollado el proceso de clonación, es necesario separar las colonias de
bacterias que han incorporado los plásmidos recombinantes que llevan el gen de interés, de las que
han añadido otros plásmidos recombinantes. Para ello las bacterias con los plásmidos
recombinantes se transfieren a una nueva placa de Petri con un medio de cultivo adecuado hasta
que proliferen colonias visibles.
2. Se toma un filtro de material absorbente, se presiona ligeramente contra la placa original para que
las bacterias se transfieran al filtro y se puedan obtener imágenes especulares de las colonias, se
retira el filtro y se le da la vuelta para numerar las colonias
3. El filtro de nitrocelulosa se trata con un detergente que rompa las membranas celulares para que
las células puedan liberar su contenido, las moléculas de ADN desnaturalizándose y unirse a la
nitrocelulosa. El filtro se incuba con una sonda de ADN que hibrida únicamente los ADN
recombinantes que hayan incorporado el gen de interés. Solo las secuencias de ADN buscadas
formarán híbridos con la sonda de ADN.
4. Para detectar aquellas colonias en las que se ha producido hibridación el filtro se coloca debajo de
una película fotográfica que luego se revela, en donde quedarán marcados aquellos lugares en los
que se ha producido la hibridación
5. Se gira la película revelada y se comparan las marcas existentes con las de la placa original para
localizar las colonias portadoras del gen de interés.

Proteómica
Descripción: estudio y aislamiento de las proteínas y sus funciones
 Los datos del genoma humano indican la existencia de unos
25.000 genes. Sin embargo, debido al procesamiento, el número de proteínas codificadas por esos
genes puede ser hasta cinco veces mayor. Es decir, en el genoma humano, un gen puede codificar
hasta cinco proteínas distintas.
 El proteoma = conj. las proteínas expresadas por el genoma.
o Es dinámico: cambia dependiendo del estado de desarrollo del organismo, del tejido al que
pertenece o incluso de acuerdo a las condiciones del medio en las encuentra o de la etapa
del ciclo celular
o Gran tamaño
Objetivos:
 La deducción de la estructura. Esto implica:
o La identificación de las proteínas expresadas por un organismo en una condición dada:
secuencia, cantidad, modificaciones, (proteómica descriptiva o estructural, todas las
proteínas expresadas en un momento y en un contexto)
o La identificación de los cambios en el nivel de expresión de proteínas asociados a cambios
en las condiciones del organismo (proteómica comparativa, cuáles proteínas cambian
cuando un organismo se somete a condiciones diferentes)
  Describir las interacciones de todas las proteínas en una célula dada, tanto en salud como en la
enfermedad:
 La identificación de conjuntos funcionales de proteínas, es decir, grupos de proteínas que se
localizan en un mismo sitio celular y que operan en mutua interacción (interacciones proteína-
proteína, proteómica funcional)
 La identificación de las proteínas que forman un órgano celular (este enfoque conduce a la
elaboración de un mapa
molecular de la célula)
 La comparación de mapas proteícos de células sanas con los mapas de células enfermas podría
permitir a los investigadores entender los cambios que ocurren en las señales que generan las
células y los procesos metabólicos que se llevan a cabo. Por ejemplo, las empresas farmacéuticas
podrían diseñar nuevas pruebas de diagnóstico e identificar nuevos y mejores receptores para
nuevos fármacos.

Dificultades:
Dentro de la versatilidad de las proteínas encontramos que:
 Numerosas proteínas cambian su forma deliberadamente
mientras realizan su función.
 Pueden asociarse selectivamente con colaboradores (cofactores) para llevar a cabo su tarea de
forma más eficiente.
 Numerosas transformaciones postraducción afectan las propiedades de numerosas proteínas.
 Tienen la capacidad de diversificarse en conglomerados desde simples dimeros a cientos de
subunidades.

Terapia génica:
La terapia génica es el proceso mediante el cual se inserta material genético en células afectadas, con el fin
de reemplazar genes defectuosos, corregir el daño que han causado al organismo o dotar a las células de
una nueva función que cubra las diferencias en un determinado tejido. Busca elimina causas de la
enfermedad en lugar de reducir sus síntomas.
Para la inserción del material genético, se utilizan vectores, que pueden ser de origen viral (transducción) o
no viral (transfección) la terapia génica se puede llevar a cabo en células somáticas o germinales. Las
alteraciones genéticas, introducidas en las células somáticas no se transmiten a la descendencia.
La terapia génica en células somáticas puede realizarse de varias formas:
 Ex vivo: se extraen las células del paciente, se corrige el defecto genético en el
laboratorio y después se reintegran al interior del organismo.
 In vivo: la transferencia de los genes terapéuticos se hace directamente al paciente mediante un
vector, por ejemplo, una inyección intravenosa.
 In situ: se lleva a cabo directamente en las células del paciente, introduciendo los genes funcionales
en el órgano afectado, se emplea en aquellos casos en los que las células son difíciles, de extraer y
de implantar nuevamente.

Epigenética
Cambios heredables en la expresión génica que no van acompañados de cambios en la secuencia de ADN
Modificación por el entorno, edad, dieta, tabaco.…
Roles de la epigenética: la genética participa en:
 Desarrollo embrionario
 Diferenciación tisular
 Impronta génica
 Inactivación del cromosoma X
 Represión de ADN parasito (transposores)
 Papel menor en la regulación génica (islas CpG normalmente no metiladas) pero importante en
patología.
 Mecanismos silenciadores: comprende:
o Metilación de ADN
 o Modificación de listonas:
o Desacetilación
o Metilación
o ARN de interferencia
Cambios que no cambian la secuencia pero que no dejan expresarla

CASPR CAS