EXTRACCIÓN DE ADN
BIOQUIMICA
INTEGRANTES:
Abigail Vargas Hernández
Melanie Michelle Popocatl Terán
Miledy Concepción Cruz
Genesis Rodríguez Leyva
Glendy Lucely Mayo
Segundo cuatrimestre
16/04/24
RESUMEN
Todos los seres vivos tenemos genes, los genes son las unidades de almacenamiento de la
información genética, segmentos de ADN que contienen la información sobre cómo deben
funcionar las células del organismo. Los genes tienen elementos que indican de donde a
donde se ha de leer y su contenido determina la composición de las proteínas que se han de
formar.
Las fresas son ideales para hacer este experimento por los motivos: son la fruta con la que se
obtiene mas cantidad de ADN y, además, son octoploides, es decir, tienen ocho juegos de
cromosomas (las células hermanas son diploides, es decir, tienen dos juegos de cromosomas
a excepción de los gametos).
Estas circunstancias hacen que el ADN de las fresas sea fácil de extraer y de ver.
Es cuando a los componentes presentes en la solución de extracción: el jabón ayuda a disolver
las membranas celulares y se añade la sal para romper las cadenas de proteínas que unen los
ácidos nucleicos liberando las cadenas de ADN. Finalmente se utiliza el alcohol por que
ADN ES INSOLUBLE el ADN será sustancia blanquecina que observamos en nuestra
mezcla.
INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar, tiene que
romperse la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula, y
posteriormente romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Además
de proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo.
La lisis de las células se consigue mediante la adición de tampones con concentraciones
elevadas de iones que ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas
como las proteínas y que forman parte de su estructura celular. La adición de un detergente
como el SDS (Dodecil Sultato Sódico) es necesaria a menudo para eliminar las
membranas. Generalmente, el ADN se encuentra asociado a proteínas, por lo que se suele
añadir proteasas al tampón de extracción, a la vez que usamos el acetato (amónico o
sódico) para precipitar dichas proteínas.
El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar con etanol frío o
isopropanol y recuperar mediante un proceso de centrifugación. El sedimento o pellet
resultante se puede re-suspender posteriormente en agua o tampón tras ser secado
completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante
electroforesis en un gel de agarosa y que posteriormente se tiñe con Gel Red o Midori
Green y observación con luz UV. También se puede detectar directamente al
espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350nm. El ADN purificado
se cuantifica con un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 260nm de longitud de
onda. O midiendo directamente las concentraciones en un Nanodrop.
MARCO TEORICO
Cuantificación de ácidos nucleicos
El espectrofotómetro es una herramienta muy utilizada en Bioquímica y en Biología
Molecular. Sus aplicaciones son muy variadas, tales como el análisis cualitativo de pureza
de muestras, la cuantificación de ADN, proteínas u otros reactivos, medición de la
densidad óptica, análisis de espectros de absorción, etc. Su fundamento reside en la
premisa de que muchos compuestos absorben o dispersan luz de unas longitudes de onda
determinadas, bien en el espectro ultravioleta (de 200 a 400nm), el visible (de 400 a
700nm) o el infrarrojo cercano (700 a 900nm).
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos tienen la capacidad de absorber luz
ultravioleta, con un máximo a 260nm. Esta propiedad puede ser utilizada para calcular la
concentración y pureza de los ácidos nucleicos gracias al empleo de un espectrofotómetro.
En el caso del ADN bicatenario, una unidad de absorbancia a 260nm (A260 = 1,0)
corresponde a una concentración de 50 ug/ml.
Una solución de ADN puro de doble cadena presenta una relación A260/A280 de 1,8
mientras que la presencia de proteínas o fenol disminuye esta relación: las
proteínas absorben a 280nm debido a los anillos aromáticos. La presencia de ARN en una
preparación de ADN hace aumentar la relación A260/A280 por encima de 1,8 debido al
efecto hipercrómico (dos cadenas sencillas absorben más que una doble), de forma que la
relación A260/A280 para el RNA puro es de 2,0. Cuando el RNA (y también el ADN)
está contaminado de nucleótidos (por ejemplo, debido a degradación), la relación
A260/A280 es superior a 2,3. Otra medida de absorbancia que nos determina la presencia
de impurezas (enlaces peptídicos) es A230. Cuando la absorbancia a esta longitud de onda
es mayor que 0,30 nos indica que debemos purificar las muestras.
Si se expone por mucho tiempo la muestra vegetal a rayos ultravioletas, esto provoca
daños sobre la estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar
efectos sobre la cadena del ADN.
Electroforesis en geles de agarosa
La mayoría de los polímeros biológicos, tales como proteínas y ácidos nucleicos, tienen
grupos ionizables que normalmente les confiere carga negativa en disolución acuosa. En
el caso específico del ADN la ionización de las moléculas es una función directa del
número de nucleótidos (pares de bases en una molécula de ADN bicatenario) de los
fragmentos disueltos. Por lo tanto, si sometemos un conjunto de moléculas de ADN de
diferentes tamaños a un campo eléctrico, se producirá una migración diferencial
consecuencia de su diferente ionización y de su tamaño desigual, finalizando en una
separación física de las mismas. Esta es la base físico- química de la electroforesis, y es
aplicable a cualquier polímero biológico susceptible de ionizarse.
La electroforesis se realiza en diferentes tipos de matrices o geles, que actúan a modo de
red o tamiz. Estos geles permiten una mayor estabilidad y precisión en el proceso de
separación. Para el caso específico de la electroforesis de fragmentos de ADN se emplean
los geles de agarosa, un polímero obtenido de las algas rojas (Rodofitas).
DISEÑO METODOLOGICO
Objetivos Específicos Prácticos:
Familiarización con el Proceso de Extracción de ADN:
• Observar cada etapa del proceso de extracción de ADN, desde la lisis celular hasta
la cuantificación y visualización de los fragmentos de ADN.
• Demostrar experimentalmente cada etapa del proceso utilizando muestras de ADN
vegetal.
Identificación y Caracterización de Fragmentos de ADN:
• Permitir a los alumnos identificar y caracterizar los fragmentos de ADN
amplificados y separados mediante electroforesis en geles de agarosa.
• Fomentar la observación y análisis de los patrones de bandas en el gel para
entender la relación entre la migración de los fragmentos de ADN y su tamaño
molecular.
Objetivos Específicos Teóricos:
• Descripción de la Molécula de ADN y sus Propiedades Físico-Químicas:
• Proporcionar a los alumnos una comprensión detallada de la estructura molecular
del ADN, incluyendo su doble hélice y las interacciones físico-químicas que la
estabilizan.
• Identificación del ADN como Molécula Responsable de la Información Genética:
• Explicar el papel fundamental del ADN como portador de la información genética
en los organismos.
Función de los Elementos en la Extracción de ADN:
• Describir la función de cada componente utilizado en el proceso de extracción de
ADN, desde los tampones de lisis hasta los detergentes y precipitantes.
• Base Físico-Química de la Electroforesis en Agarosa:
• Profundizar en los principios físico-químicos que sustentan la técnica de
electroforesis en geles de agarosa, explicando cómo los fragmentos de ADN se
separan según su tamaño y carga eléctrica.
Procedimiento en el Laboratorio:
Objetivos:
• Realizar la extracción de ADN vegetal utilizando técnicas sencillas y reflexionar
sobre la composición del ADN.
• Observar la estructura fibrilar del ADN mediante técnicas de microscopía.
Actividades:
• Preparar muestras de ADN vegetal y llevar a cabo la extracción utilizando un
protocolo establecido.
• Observar las muestras de ADN extraido bajo microscopio para visualizar su
estructura fibrilar.
• Discutir las propiedades químico-físicas del ADN y cómo se relacionan con el
proceso de extracción.
PROCEDIMIENTO EN EL LABORATORIO
Objetivos
1. Realzar la extracción de ADN vegetal y reflexionar sobre la simpleza de su
composición con sencillas técnicas.
2. Observar la estructura fibrilar de ADN.
3. Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades quimicofisicas
del ADN.
Materiales necesarios.
1. Muestra vegetal (fresas).
2. Cucharitas.
3. Agua mineral.
4. Sal común (NaCl).
5. Bolsas de plástico.
6. Detergente líquido.
7. Zumo de piña.
8. Filtros de café.
9. Vasos de precipitados.
10. Alcohol del 96°.
Procedimiento:
1) Trocear las fresas e introducirlas en una bolsa plástica con dos cucharadas de agua
y un poco de sal. Cerrar la bolsa.
2) Amasar la bolsa con ambas manos hasta obtener una papilla de fresas.
3) Colocar la papilla con el filtro de café sobre un baso de precipitado.
4) Añadir 1 cucharada de detergente al filtrado y remover suavemente 30 segundos
5) Dejar reposar 10 min la mezcla.
6) Añadir alcohol del 96° con mucho cuidado, dejando resbalar por las paredes para
que forme una capa sobre el filtrado. Dejar reposar 10 min. Este crea una capa por
encima del agua, de tal forma que el ADN es capaz de flotar entre las 2 capas.
7) En caso de que el ADN de la muestra vegetal no se pueda apreciar muy claramente.
Tenemos que agitar el tubo un poco para poder apreciarlo mejor.
8) Se debe de obtener como un copo de algodón mojado.
9) Tomamos una muestra y observamos en el microscopio.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFIAS
[Link]
[Link]
fresas/
[Link]
Prácticas-genéticas.-Extración-ADN.-Abril-2016.-Alumnos[1].pdf
