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Técnicas Instrumentales en Genética Forense

El documento presenta un manual sobre técnicas instrumentales en genética forense, diseñado para servir como referencia para nuevos profesionales en el campo. Se abordan aspectos cruciales como la recolección, conservación y análisis de muestras biológicas, enfatizando la importancia de la documentación y el manejo adecuado de las muestras para evitar contaminación y degradación. Además, se destaca la necesidad de actualizar continuamente los protocolos debido a la rápida evolución de la biotecnología.

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MEDICINA FORENSE

Colección Mateo Tomás Buenaventura Orfilia y Rotger

Técnicas Instrumentales
En Genética Forense

Autores:

Fabricio González Andrade & Begoña Martínez Jarreta

Departamento de Medicina Legal, Genética Forense,

Toxicología y Legislación Sanitaria
Universidad de Zaragoza

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© González-Andrade F, Martínez-Jarreta B (2.001) Técnicas Instrumentales en Genética Forense, Manual de

Laboratorio, Zaragoza, España.

©Reservados todos los derechos

Prohibida su reproducción o almacenamiento en un sistema de recuperación o transmisión de forma alguna
por medio de cualquier procedimiento sea este mecánico, electrónico, de fotocopia, grabación o cualquier
otro, sin autorización escrita de los autores.
2

PROLOGO

“Lo fácil se ha de emprender como lo dificultoso y lo dificultoso como fácil”

Baltasar Gracián

Con este número iniciamos una serie de publicaciones sobre Medicina Forense,
componentes de una colección titulada Mateo Tomás Buenaventura Orfilia y Rotger, en
recuerdo del padre de las Ciencias Forenses en España, prestigioso biólogo, químico y
médico que en los inicios de la Medicina representó con creces a la cada vez más
importante clase científica de la época. Esta colección nace como un retoño de la revista
Ciencia Forense, editada por la Institución Fernando el Católico.

Por otro lado, cada año se abren las puertas de la Genética Forense a nuevos
profesionales en todo el mundo, y en particular, en Iberoamérica. Sin embargo, todos los
noveles estudiosos de este campo se encuentran con una inmensa cantidad de
información desorganizada que dificulta los primeros pasos en el trabajo de laboratorio.
Este texto nace de esa necesidad, de poder contar con un Iibro de referencia de los
procedimientos básicos en la aplicación técnica de la ciencia.

Hemos reunido aquí los protocolos utilizados en la práctica diaria del Laboratorio de
Genética Forense de la Universidad de Zaragoza. Nuestra compilación abarca los
procedimientos más comunes, que sin ser los únicos, son los de mayor relevancia en el
momento. Este libro no pretende ser un documento científico complejo, sino un
compendio de Técnicas Instrumentales que faciliten la práctica en el laboratorio.

Además, no debemos olvidar que dada la continua evolución y el rápido desarrollo de la

biotecnología esta revisión se someterá a revisiones periódicas para actualizar los
procedimientos en esta cambiante especialidad.

Debemos señalar que la mayoría de los protocolos han sido adaptados de las versiones
de los autores originales; además, han sido validados desde el punto de vista práctico.
Esto no quiere decir que no puedan modificarse. Cada investigador deberá ajustar estos
protocolos a sus necesidades individuales y a la disponibilidad de recursos de sus propios
laboratorios, sin perder de vista, desde luego, que el vertiginoso avance de la ciencia nos
ofrecerá en poco tiempo nuevas alternativas y tecnologías, que revolucionaran nuestro
proceder y que nos obligarán a cambiar.

Finalmente, reiteramos nuestra intención de facilitar el aprendizaje de la Genética Forense

y esperamos que esta aportación constituya una ayuda para todos aquellos que trabajan
en esta área.

Los Autores

Técnicas Instrumentales en Genética Forense | Fabricio González Andrade & Begoña Martínez Jarreta ©
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CAPÍTULO 1
ASPECTOS PRELIMINARES

En esta sección inicial revisaremos los siguientes temas:

Recolección y conservación de las muestras

Las aplicaciones forenses de las técnicas Instrumentales
Algoritmos para el análisis de laboratorio

1. Recolección y conservación de muestras para el análisis por Genética Forense

Se considera MUESTRA a todo vestigio biológico de un ser humano u otro ser vivo (en
algún caso particular que amerite este punto) que pueda ser analizado por una técnica de
laboratorio. En Genética Forense las muestras provienen con frecuencia de los individuos
implicados en un delito, o de las personas que solicitan una prueba de paternidad. En
criminalística, las muestras pueden obtenerse de la víctima de hechos delictivos, de los
instrumentos usados, del autor del delito y del escenario del crimen.

Una muestra obtenida adecuadamente es importante porque puede llegar a ser una
EVIDENCIA durante un proceso judicial, y una evidencia a su vez puede ser utilizada, en
cualquiera de los siguientes casos: para demostrar la filiación entre varias personas,
demostrar la relación de una muestra de una determinada persona con un delito y
demostrar que los restos hallados corresponden a un determinado individuo.

Las muestras más frecuentes para obtener ADN provienen de la sangre fresca, la saliva,
el semen, manchas de cualquier tipo con fluidos mixtos que contengan semen-sangre-
células epiteliales, los tejidos cadavéricos (tejidos blandos, dientes y huesos largos), así
como fluidos sobre soportes sólidos como papel filtro, hisopos, etcétera.

Sin embargo, existen otras fuentes menos frecuentes para obtención de ADN como son
los tejidos fijados en parafina o con tinciones celulares, sobre todo provenientes de
estudios patológicos, las uñas que pueden contener células o sangre, estampillas o
sobres que tendrán restos de saliva, las colillas de cigarrillos, los restos dejados sobre
copas, cubiertos, cepillos de dientes, afeitadoras, restos dejados en armas blancas,
principalmente sangre, la orina que contiene células del uroepitelio, entre algunas otras
que no hemos citado. En estos casos la obtención de ADN es más difícil porque existe un
alto grado de contaminación ambiental, y además consideramos que la cantidad de ADN
a obtenerse será muy pequeña.

Se han realizado análisis forenses con una concentración mínima de 1 nanogramo por
microlitro de ADN y se han obtenido buenos resultados, pero debemos recordar que las
muestras para los casos forenses son limitadas. Por lo tanto, todo procedimiento debe ser
optimizado al máximo para alcanzar resultados más claros con escasas cantidades de
material genético, ADN.

No se puede extraer igual cantidad de ADN de todos los tipos de muestras, esto varía
notablemente entre unas y otras. A continuación detallamos el contenido de ADN en
diferentes muestras biológicas.

Tipo de muestra Cantidad de ADN disponible

Sangre líquida 20 a 40 µg / mL
Manchas de sangre 250 a 500 ng / mL
Semen líquido 150 a 300 µg / mL (1-3 pg / célula)
Semen en frotis postcoital 10 a 3.000 ng / mL
Pelo con bulbo arrancado 1 a 750 ng / bulbo
Saliva 1 a 10 µg / mL
Frotis bucal 1 a 1,5 µg / mL
Orina 1 a 20 ng /mL
Huesos * 3 a 10 ng / mg de hueso
Fluido amniótico 65 ng /mL
Vellosidad corial 8 µg / mg
Hígado 15 µg /mg
Músculo 3 µg / mg

* Dependiendo de las condiciones

En la práctica, las muestras que se obtienen de una escena criminal contienen cantidades
considerablemente menores de ADN. Esto se debe a varios factores que afectan la
disponibilidad del material genético:

1. Cantidad: a pesar de la sensibilidad de la técnica utilizada cuando hay muy poca

muestra hay muy poco ADN.
2. Degradación del ADN: el ADN se puede degradar con facilidad por la exposición
prolongada a malas condiciones ambientales o por contaminación bacteriana o
micótica.
3. Pureza de la muestra: la presencia de suciedad, grasa, impurezas y otros
contaminantes inhiben la amplificación del ADN de la muestra durante la PCR.

Por lo tanto, todas las técnicas empleadas deben orientarse a evitar las situaciones
previamente descritas. Otro factor de interés es resaltar a importancia de que todas las
muestras deben ser transportadas del escenario al laboratorio en el menor tiempo posible.

Vale la pena recordar que cuando se trabaja con cualquier tipo de material biológico
estamos expuestos a posibles infecciones, lo cual nos obliga a seguir con prioridad todas
las PRECAUCIONES UNIVERSALES en la manipulación de sangre y fluidos corporales.
Entre ellas, usar siempre guantes de látex, mascarillas, gafas de protección y mandil.

Las muestras deben ser manipuladas con criterios técnicos adecuadas. Si la muestra no
fue rotulada y etiquetada previa a su recolección puede ser invalidada; por otro lado, si no
se recupera apropiadamente del lugar de los hechos puede existir contaminación cruzada,
y finalmente, si no se preserva de acuerdo a las normas, el ADN puede degradarse.
Todas estas condiciones pueden revertirse en contra del laboratorio en un momento dado
por un Tribunal de Justicia. La calidad y los controles de calidad en Genética Forense son
muy importantes a la hora de hacer un trabajo con profesionalismo y conocimiento.

EL VALOR DE DOCUMENTAR

La documentación de la procedencia de las muestras y de los factores que rodean un acto

delictivo o una investigación civil es una pieza clave en este singular rompecabezas.
Desde el punto de vista legal, forense y ético todas las situaciones deben estar bien
documentadas, ya que en cualquier momento podrían solicitarse estudios adicionales que
requiera la justicia, o en otros casos se podría revertir la carga de las pruebas por errores
de procedimiento.

Nada debería ser procesado hasta la obtención de la información relevante sobre la

condición original o las circunstancias que rodean al hecho. Por ello, muchos países han
creado protocolos y normas a seguir en el escenario del crimen, en las salas de autopsias
y en los laboratorios forenses. Cada laboratorio debe adaptarse a la normativa legal
vigente localmente

Entre las acciones más importantes, a la hora de documentar, están:

1. Fotografiar o grabar en video las muestras antes de ser tocadas, movidas o recogidas,
resaltar la ubicación y condiciones físicas de las mismas. Anotar su relación espacial
con otros objetos. Luego, rotular y embalar con cuidado cada muestra.
2. Verificar las condiciones en que llegan las muestras al llegar al laboratorio forense,
tratando de buscar indicios sobre si se han manipulado, cambiado o alterado las
mismas.
3. Sistematizar todos los procedimientos para manipulación de las muestras:
documentación, selección, recolección, rotulado, embalaje y transporte de las mismas.

RECOLECCION DE MUESTRAS DE INDIVIDUOS VIVOS

Recordad que todas las muestras deben ser extraídas por personal médico calificado y
autorizado para este tipo de trabajo. Podemos obtener material preferentemente de:

Sangre fresca, 5 mL en un tubo con anticoagulante EDTA o en soporte sólidos como el

papel FTA o el papel de filtro común (Whatman ®).
Se puede utilizar pelos con o sin bulbo. De preferencia y cuando se pueda se necesita
obtener un mínimo de 5 pelos para el análisis. Este hecho es relevante en el análisis
del ADN mitocondrial donde podríamos encontrar heteroplasmia.
Frotis de mucosa bucal con hisopos húmedos en solución fisiológica o cepillos, esta
técnica es muy útil en niños. Recordar solicitar 5 hisopos mínimo cuando se utiliza los
cotonetes de algodón común. Los cepillos para frotis bucales son los mejores para
realizar este proceso.
Muy importante, identificar al individuo que se le extrae la muestra mediante firma,
fotografía y huella digital.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE CADAVERES

Se debe seleccionar las muestras cadavéricas en el siguiente orden:

Tejidos blandos, de preferencia el músculo profundo. Los músculos imbricados de la
mano son una buena alternativa, por que se conservan mejor
Médula ósea fresca
Pelos con bulbo
Dientes en especial los del maxilar superior aunque puede ser cualquier otro.
Huesos largos, seleccionar 3 diferentes, entre ellos el fémur.
Considerar que mientras más fresco esté el cadáver es mejor la calidad del ADN que
se pueda obtener.

OBTENCIÓN DE ADN DE RESTOS MUY ANTIGUOS

El análisis del ADN antiguo se utiliza sobre todo en Antropología Molecular para estudios
de linaje y poblaciones. Se utilizan restos óseos que han sobrevivido a las condiciones
ambientales. Aunque se ha demostrado que el ADN deja de ser útil con el paso del
tiempo, algunos estudios han informado que en restos arqueológicos se ha obtenido ADN
en tan sólo el 1 a 2% de todos los huesos estudiados.

CONSERVACION DE MUESTRAS DE INDIVIDUOS VIVOS

Las muestras en papel FTA o papel filtro se deben secar al aire y guardarse a
temperatura ambiente en sobres de papel.
La sangre fresca y el semen deben ser refrigerados a 4°C. Su almacenamiento final
debe ser a -20° C.
Las muestras de tejidos blandos, así como de los frotis húmedos deben secarse al aire
y guardarse a temperatura ambiente.

CONSERVACION DE MUESTRAS DE CADÁVERES

Se debe colocar el material cadavérico semi descompuesto en un tubo Falcon de 50

mL con sal común hasta cubrir los 3/4 del tubo. Esto conserva los tejido por más de 60
días a temperatura ambiente, y muy importante, sin el olor pútrido característico.
Cuando se pueda se deben conservar los cadáveres en cámaras frías a -20°C.
Los huesos y dientes se limpian, secan y se conservan a temperatura ambiente.
En los cadáveres saponificados se deben extraer los tejidos profundos que no se han
deteriorado y conservarlos con sal como dijimos previamente.
Cuando los restos estén quemados, se debe obtener tejidos profundos, con la gran
ventaja que no existirá contaminación bacteriana ni micótica, por cuanto ha sido
destruída por el calor.
Evitar en todos los casos el empleo de fijadores como formol, glicerina o similares
Los protocolos futuros deberán preveer, como requisito que en las autopsias se tome
una muestra directa de sangre del corazón mediante una punción y guardarla. De esta
manera se evitarán en lo posible las exhumaciones.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS DE PATERNIDAD

Se obtiene muestras de sangre fresca del presunto padre, la madre y el hijo. Cuando el
hijo es un niño pequeño se puede realizar frotis de mucosa oral. No olvidar de acompañar
siempre de autorización escrita para realizar los análisis y para eventuales re-
extracciones. La toma de muestras puede ser de forma voluntaria o a petición de un juez

OBTENCIÓN DE MUESTRAS EN CASO DE DELITOS SEXUALES Y/O VIOLACIONES

Se deben obtener tanto muestras de la víctima como del agresor.

Las muestras de la víctima para analizar deben ser obtenidas de cualquiera de estos
sitios, dependiendo cada caso: hisopado vaginal y/o anal, hisopado de la zona
subungeal, el peinado del pubis en búsqueda de pelos del agresor, la ropa interior con
manchas y cualquier otra situación sospechosa.
Las muestras del agresor que deben tomarse son: muestras de sangre fresca, la ropa
interior del agresor y cualquier otra mancha sospechosa

OBTENCIÓN DE MUESTRAS PARA IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVERICOS

Es necesario primeramente que el Patólogo Forense clasifique los restos encontrados

con las técnicas clásicas de antropometría forense, odonto-estomatología forense y
otras utilizadas.
Luego, se debe seleccionar aquellas muestras que podrían ser significativas en la
identificación de un individuo. No se debe analizar todas las muestras encontradas en
el escenario sin un claro indicio que oriente la búsqueda.
Se requiere la participación de familiares cercanos para comparar los resultados e
identificar los restos, por lo tanto, la investigación policial es un aspecto clave.

CONSIDERACIONES DE INTERES

Rotular y etiquetar todos los envases y recipientes que contengan muestras con
marcador indeleble. Luego, almacenarlas en un lugar seguro de acuerdo a las
recomendaciones descritas previamente,
Luego de los análisis genéticos siempre será necesario el tratamiento estadístico de
los resultados.
Cuando se busca la identidad de un individuo se debe combinar toda la información
posible existente sobre el caso.
Si bien los resultados moleculares pueden parecer irrefutables sólo constituyen una
evidencia testimonial para el juez quien será el que dicte la sentencia final

2. Aplicaciones forenses de las técnicas instrumentales citadas en este texto

STRs Autosómicos

Para la práctica forense rutinaria los marcadores más utilizados en la actualidad son los
microsatélites, conformados por secuencias muy cortas de ADN repetitivo de entre 2 a 6
pares de bases, que se encuentran distribuidos ampliamente en el genoma en bloques de
longitud menores a 400 pb. Por ese pequeño tamaño se los denomina Repeticiones
Cortas en Tándem (Short Tandem Repeats–STRs). Son muy importantes en la identificación
humana por su elevado polimorfismo y por tener bajas tasas de mutación.

Un polimorfismo se define por la aparición conjunta en un lugar de dos o más formas

discontinuas de la misma especie, de tal modo que la más rara de ellas no se pueda
mantener simplemente a través de la mutación genética (Ford, 1940). Para que un locus
sea considerado polimórfico, el alelo más común de ese locus debe aparecer con una
frecuencia poblacional menor del 99%. De acuerdo con la ley de Hardy-Weinberg, al
menos el 2% de la población debe ser heterocigoto para ese locus (Hardy, 1908; Weinberg,
1908). A continuación citamos las aplicaciones más importantes de los STRs.

1. Estudios clásicos de paternidad

2. Identificación cadavérica.
3. Quimerismo molecular postrasplante.
4. Estudios de paternidad complejos (Ejemplo: varios padres y una madre).
5. Estudios poblacionales.
6. Formación de Bases de Datos para identificación criminalística.

Los principales loci autosómicos descritos hasta ahora y utilizados en la identificación

humana, están descritos a continuación.

Cromosoma Loci Localización Análisis

1 D1S7 1p36.13-pter RFLP

D1S80 1p36.13-pter PCR
D1S339 1p36.13-pter RFLP
D1S2139 1p36.13-pter PCR
D1S533 1p31 PCR
D1S1656 1 PCR
F13B 1q31-q32.5 PCR
RENA 1q32 PCR
2 D2S44 2p22-p25 RFLP
D2S92 2p12 RFLP
D2S548 2p22 PCR
TPOX 2p25.1-pter PCR
APO B 2p23-p24 PCR
3 D3S1358 3p PCR
D3S1744 3q24 PCR
D3S2386 3 PCR
4 D4S139 4q34 RFLP
D4S163 4q34 RFLP
FGA 4q28 PCR
GYPA 4q28-q31 PCR
GC 4q11-q13 PCR
FABP 4q28-q31 PCR
5 D5S110 5p15.3 RFLP
D5S543 5q21-q22 RFLP
D5S818 5q23.3-q32 PCR
CSF1PO 5q33.3-q34 PCR
6 D6S132 6q27 RFLP
DQA1 6p21.3 RFLP
F13A01 6p24-p25 PCR
ACTBP2 6 PCR
D6S366 6q21-qter PCR
DHFRP2 6 PCR
7 D7S21 7p22 RFLP
D7S22 7q35-qter RFLP
D7S104 7q35-qter RFLP
D7S467 7q35-qter RFLP
D7S820 7q21-q22 PCR
D7S8 7q22-q35.1 PCR
8 D8S306 8 PCR
D8S1179 8q23 PCR
D8S323 8q22.3-q24.3 PCR
D8S344 8q PCR
LPL 8p22 PCR
9 D9S302 9q32-q33 PCR
D9S304 9q13 PCR
10 D10S28 10p14-p15 RFLP
D19S1214 10p11.2 PCR
11 D11S129 11p15 RFLP
TH01 11p15.5 PCR
LDLR 11p13.1-13.3 PCR
HBGG 11p15.5 PCR
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12 D12S11 12q24.3-24.2 RFLP

D12S1090 12q12 PCR
VWA 12q12-pter PCR
CD4 12p12-pter PCR
D12S391 12p PCR
13 D13S317 13q21 PCR
14 D14S1 14q32 RFLP
D14S13 14q31 RFLP
D14S297 14p11.1 PCR
15 FES/FPS 15q25 PCR
16 D16S83 16p13.2-p13.3 PCR
D16S85 16p13.3 RFLP
D16S589 16q24 PCR
17 D17S5 17p13 PCR
D17S26 17q25 RFLP
D17S34 17p13 RFLP
D17S79 17q25 RFLP
D17S1185 17q11.2-q12 PCR
TP53 17p13.1 PCR
18 D18S27 18q22-q23 RFLP
D18S51 18q21.3 PCR
D18S535 18q12-q21 PCR
D18S849 18q21 PCR
MBP-locus A 18q23-pter PCR
MBP-locus B 18q23-pter PCR
19 D19S253 19p13.2-p12 PCR
20 No existen
21 D21S11 21p12 PCR
D21S112 21q22 RFLP
D21S1437 21p11.1 PCR
22 D22S445 22q13 PCR
D22S683 22q13 PCR
PCR: Polimerase Chain Reaction
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

STRs DEL CROMOSOMA Y

Las aplicaciones más importantes son las forenses, la realización de árboles genealógicos
y los estudios evolutivos. A esto añadimos, que son útiles para determinar el componente
masculino sin realizar extracciones diferenciales, así como para establecer patrilíneas.
Los estudios de cromosoma Y requieren una mayor cantidad de estudios poblacionales
para evaluar la diversidad de los haplotipos, y ensayos que fortalezcan la caracterización
de los marcadores citados. En resumen, las aplicaciones de estos marcadores son:

1. Estudio de la paternidad
2. Estudios de paternidad cuando el progenitor está ausente y los supuestos hijos son
varones.
3. En los delitos sexuales identificación del agresor (masculino) sin extracción diferencial.
4. Identificación cadavérica de hombres.
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5. Determinación del sexo en víctimas en masa.

6. Análisis diferencial de ADN espermático vs. células vaginales.
7. Estudios poblacionales (migraciones)
8. Estudios antropológicos (evolución del hombre)

Los principales loci gonosómicos utilizados en la identificación humana y en los estudios

de filiación por ADN, descritos hasta el momento, los describimos a continuación.

X Amelogenina p22.1-p22.3 PCR

HPRTB Xq26 PCR
DXS8174 X PCR
DXS8175 X PCR
Y Amelogenina p11.2 PCR
DYS19 qY PCR
DYS288 Ypter-Yqter PCR
DYS385 qY PCR
DYS388 Y PCR
DYS389 I qY PCR
DYS 389 II qY PCR
DYS390 Ypter-Yqter PCR
DYS391 qY PCR
DYS392 qY PCR
DYS393 qY PCR
SRY Yq13-qter PCR
YCA II qY PCR
PCR: Polimerase Chain Reaction
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

En los últimos años varios autores han descrito nuevos STRs del Cromosoma Y que se
encuentran aún por desarrollar. Ellos son: Y-GATA-A4, Y-GATA-A7.1, Y-GATA-A7.2, Y-
GATA-A8, Y-GATA-A10, Y-GATA-C4, Y-GATA-H4 (Scott White y cols., 1999), y, los
marcadores DYS434, DYS 435, DYS436, DYS 437, DYS438 y DYS 439 (Ayub Q y cols.,
2000),

POLIMORFISMOS DEL ADN MITOCONDRIAL

También analizamos los polimorfismos de secuencia, que se originan por la sustitución de

uno (mutuación puntual) o más nucleótidos en una secuencia de ADN. Entre los más
utilizados tenemos los polimorfismos de la región d-loop del ADN mitocondrial humano
(Anderson y cols., 1981).

La mayor variabilidad entre individuos se encuentra en esta región denominada d-loop

(displacement loop o asa de desdoblamiento), que es un fragmento de 1112 pb no
codificante, pero con una tasa de mutación 5 veces mayor que el resto del genoma
mitocondrial. En este fragmento se incluyen al menos tres subregiones muy polimórficas:
las regiones hipervariables I, II y III (Parson y cols., 1998).

El análisis de la secuencia de la región control del ADN mitocondrial es un procedimiento

de alta sensibilidad, alto poder discriminatorio y enorme rendimiento en la identificación
humana. Las aplicaciones forenses más importantes de este polimorfismo están a
continuación.

1. Muestras degradadas en los que el ADN nuclear falla.

2. Estudios de ADN antiguo en restos óseos.
3. Identificación de individuos en grandes catástrofes.
4. Análisis de pelos con o sin bulbo.
5. Análisis de dentina o pulpa dentaria.
6. Identificación de la maternidad.
7. Reconstrucción de linajes maternos.
8. Asociación genética con enfermedades.

3. Algoritmos para el análisis de laboratorio de polimorfismos

Análisis de sistemas uniplex para STRs autosómicos y del Cromosoma Y

Formato Manual Formato Automatizado

Extracción de ADN Extracción de ADN
Amplificación de marcadores autosómicos Amplificación de uniplex autosómicos
Verificación en gel de agarosa Verificación en gel de agarosa
Amplificación de marcadores del Y Amplificación de uniplex del Y
Cuantificación en gel de agarosa Cuantificación en gel de agarosa
Preparación gel de poliacrilamida Preparación del gel de secuenciación
Preparación de muestras para sembrar Preparación de los productos de la PCR
Siembra y electroforesis Corrida de electroforesis en secuenciador
Tinción argéntica Edición y lectura de los resultados
Lectura de resultados

Análisis de sistemas multiplex para STRs

Formato Manual
Extracción de ADN
Amplificación de CTT- FFV-Silver III (Promega)
Cuantificación en gel de agarosa
Preparación del gel de poliacrilamida
Preparación de muestras para sembrar
Siembra y electroforesis
Tinción con Plata
Lectura de resultados

Análisis del d-loop del ADN mitocondrial

Formato Manual Formato Automatizado

Extracción de ADN Extracción de ADN
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1ª. amplificación - región control 1ª. amplificación – región control

Verificación con gel de agarosa Verificación con gel de agarosa
2ª. amplificación de región I 2ª. amplificación de región I
Verificación con gel de agarosa Verificación con gel de agarosa
3ª. amplificación de región II 3ª. amplificación de región II
Verificación con gel de agarosa Verificación con gel de agarosa
Purificación de los fragmentos Purificación de los fragmentos
Verificación con gel de agarosa Verificación con gel de agarosa
Secuenciación por PCR (Silver sequence) Secuenciación por PCR con Kit Fentomol
Preparación gel de poliacrilamida Purificación de las secuencias
Preparación de muestras para siembra Corrida en secuenciador
Siembra y electroforesis Edición y análisis de resultados
Tinción con Plata Comparación con Anderson
Lectura de la secuencia
Comparación con Anderson

CAPITULO 2
EXTRACCIÓN DE ADN

En este capítulo analizaremos la extracción de ADN de:

Fluídos orgánicos con fenol-cloroformo isoamílico

Manchas en tela o papel
Manchas mediante resinas quelantes.
Pelos con bulbo mediante resinas quelantes
Pelos sin bulbo mediante resinas quelantes
Tejido óseo
Médula ósea cadavérica
Tejidos blandos cadavéricos
Piezas dentarias
Tejidos fijados en hematoxilina-eosina
Biopsias histológicas
Tejidos incluidos en bloques de parafina
A partir de fibroblastos
Muestras combindas (semen-sangre-epitelio)
Por el método Wizard
Soportes sólidos (papel FTA)
Aplicadores bucales
Al final del capítulo se podrá consultar la lista de reactivos a utilizar y su respectiva
preparación individual.

Protocolo E1:
EXTRACCION ORGANICA DE ADN GENOMICO CON FENOL CLOROFORMO
(Adaptado de Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1.989)

Tiempo aproximado de extracción: 3 horas. Con sangre fresca se debe extraer el ADN el
mismo día, de las muestras congeladas puede ser otro día cualquiera por cuanto las
muestras congeladas se conservan mejor.

1. Encender la estufa a 60° C (Thermomix™ 1419)

2. Tomar 700 ml de sangre, si está congelada debe estar guardada a - 20° C.
3. Descongelar las muestras en baño 2 minutos a 37° C
4. Centrifugar 2 minutos a 12.500 rpm
5. Descartar el sobrenadante sin perder el pellet
6. Añadir 800 µL de Tampón B y agitar manualmente con pipeta, no usar vórtex.
7. Dividir la muestra en dos tubos de 450 uL en cada uno, rotularlos. Y hacer un tubo sólo
con rectivos como control (Blanco)
8. Añadir 25 µL de SDS al 20%
9. Añadir 6 µL de Proteinasa K (20mg/ml)
10. Incubar durante 1 hora a 60° C y, al final del baño realizar un Spin para llevar el líquido
al fondo del tubo.
11. Añadir 80 µL de Perclorato sódico 5M, mezclar por inversión por varias veces, sin
movimientos bruscos.
12. Colocar 250 µL de Fenol y 250 µL de Cloroformo Isoamílico (24:1).
13. Centrifugar por 10 minutos a 13.000 RPM, luego rescatar el sobrenadante con sumo
cuidado y ponerlo en dos Eppendorfs nuevos. Rotularlos
14. Repetir paso 12 y 13.
15. Añadir 500 µL de Cloroformo Isoamílico (24:1)
16. Mezclar y centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm, luego rescatar sobrenadante
17. Poner 1 ml de Etanol Absoluto a - 20° C
18. Mezclar por inversión, observar que aparece un ovillo de ADN
19. Centrifugar 5 minutos a 12.500 rpm, luego retirar el Etanol por decantación.
20. Poner 500 µl de Etanol al 80% a 4° C.
21. Centrifugar 5 minutos a 13.000 rpm, luego retirar por decantación, apoyar en papel,
secar al aire por 10 minutos.
22. Resuspender en 100 µL de agua destilada estéril (autoclavada)
23. Unir los dos tubos de la misma muestra y, dejarlos en la estufa toda la noche.

Protocolo E2:
EXTRACCION DE ADN DE MANCHAS DE FLUIDOS ORGANICOS (SANGRE,
SALIVA) EN TELA O PAPEL CON FENOL CLOROFORMO
(Adaptado de Valverde y cols. 1.993)

Este procedimiento toma dos días.

PRIMER DIA
1. Cortar 1 cm2 del tejido en pedazos de 2 mm de lado y resuspender en 500 µL de
Tampón DLB
2. Añadir 50 µL de SDS 20% y 5 µL de Proteinasa K (20 mg/ml)
3. Incubar a 56° C durante 18 a 24 horas con agitación suave toda la noche

SEGUNDO DIA
4. Añadir: 20 µL de NaCl 5M + 287.5 µL Fenol + 287.5 µL Cloroformo Isoamílico (24:1)
5. Mezclar con pipeta y centrifugar 3 minutos a 12.500 rpm
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15

6. Pasar la fase acuosa a otro tubo Eppendorf usando una punta delgada (cortar la punta
de una punta de pipeta de 1 mL o usar una punta de 100 µL)
7. Añadir 575 µL de Cloroformo isoamílico (24:1)
8. Centrifugar 5 minutos a 12.500 rpm, luego rescatar el sobrenadante.
9. Añadir 1 ml de Etanol al 96% a -20°C. y refrigerar por 2 horas a -20°C.
10. Centrifugar 15 minutos a 12.500 rpm, directamente del congelador
11. Retirar el Etanol por decantación y secar al aire por 10 minutos.
12. Resuspender en 100 µL de agua estéril
13. Incubar a 56° C entre 2 y 16 horas.
14. Almacenar en la nevera a 4° C.

Se pueden hacer sucesivas extracciones de ADN con solventes orgánicos, fenol /

cloroformo / alcohol isoamílico, para obtener una muestra más pura pero en menor
cantidad. Como máximo se pueden hacer 3 extracciones. Este punto es aplicable a todos
los procedimientos.

Protocolo E3:
EXTRACCION DE MANCHAS DE SANGRE CON RESINA QUELANTE, CHELEX© -100
(Adaptado de Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R, 1.991 y Singer-Sam J y cols. 1989)

1. Hacer manchas en tela de algodón estéril o papel filtro con 500 µL de sangre fresca.
2. Cortar un pedazo de tela de 3 mm de diámetro de lado y colocarla en un tubo de 15
ml, si son varias manchas, utilizar una hoja de bisturí nueva por cada una o una tijera
esterilizada luego de cada corte.
3. Colocar 1 mL de agua desionizada autoclavada
4. Incubar a temperatura ambiente entre 15 a 30º C, por aproximadamente 20 minutos.
Mezclar ocasionalmente por inversión. Mientras tanto hervir más agua.
5. Luego un Spín en microcentrífuga por 3 minutos a 12.500 rpm
6. Desechar el sobrenadante hasta el nivel de la tela
7. Añadir 130 µL de Chelex 5% (Chelex©-100 Resin, BioRad) intentando coger las
microesferas, usar una punta cortada.
8. Mezclar en vórtex a la mayor velocidad por 10 segundos
9. Pinchar la tapa de los tubos con una aguja incandescente para que el contenido no
salte por el calor.
10. Poner los tubos en agua hirviendo por 8 minutos, utilizar tubos de Pharmacia™ de 1.5
ml con rosca para que no se abra ni se contamine
11. Mezclar en vórtex a alta velocidad por 10 segundos
12. Centrifugar por 3 minutos 12.500 rpm
13. Almacenar a 4ºC.
14. Antes de usar las muestras almacenadas se debe centrifugar 3 minutos a 12.500 rpm.

Protocolo No. E4:

EXTRACCION DE ADN N PELO CON BULBO CON RESINA QUELANTE-CHELEX© 100
(Adaptado de Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R, 1.991)

1. Utilizar un escalpelo limpio y cortar una porción de 5 a 10 mm de la raíz del pelo.

2. Añadir al fragmento de pelo 200 µL de Chelex al 5% en un tubo de 1.5 mL
3. Incubar toda la noche a 56ºC, tiempo mínimo de incubación 8 horas

4. Mezclar en un vórtex a alta velocidad por 10 segundos

5. Poner en agua hirviendo durante 8 minutos
6. Mezclar en un vórtex a alta velocidad por 10 segundos
7. Centrifugar por 3 minutos a 12.500 rpm
8. Añadir 40 µL de sobrenadante a la mezcla de la PCR

No olvidar que los pelos con raíz (bulbo) arrancados, frescos, son los mejores para
obtener un ADN de alto peso molecular en grandes cantidades (Higuchi R y cols. 1988)

Protocolo Alternativo A
(Baiquet M y cols.)
1. Introducir la raíz del pelo en un tubo que contenga una solución amortiguadora y
proteinasa K.
2. Calentar la muestra a 60ºC por 30 minutos. Basta hervir 20 minutos para desactivar la
proteinasa K Para la digestión de las proteínas.
3. Se toma una alícuota para realizar la amplificación

Protocolo E5
EXTRACCION DE ADN DE PELO SIN BULBO USANDO RESINA QUELANTE,
CHELEX© -100
(Adaptado de las Técnicas del Laboratorio de Medicina Legal, USC)

1. Utilizar un escalpelo limpio y cortar una porción de 2 a 3 cm del pelo.

2. Añadir al fragmento de pelo 200 µL de Chelex al 5% en un tubo de microcentrifuga de
1.5 mL
3. Incubar a 56º C durante 30 minutos a 1 hora
4. Mezclar en un vórtex a alta velocidad por 5 a 10 segundos
5. Spín en una microcentrífuga durante 10 a 20 segundos a 12.500 rpm
6. Poner en agua hirviendo durante 8 minutos
7. Mezclar en un vórtex a alta velocidad por 5 a 10 segundos
8. Centrifugar por 3 minutos a 12.500 RPM
9. Añadir 20 µL de sobrenadante a la mezcla de la PCR

Protocolo E6:
EXTRACCION DE ADN GENOMICO DE TEJIDO OSEO
(Adaptado de las Técnicas del Laboratorio de Medicina Legal, USC)

Existen varios sistemas para pulverizar partículas, en nuestro laboratorio contamos son el
equipo Freezer Mill 6750 (Glen Creston Ltd., England) que utiliza Nitrógeno líquido para
pulverizar huesos y dientes. Sin embargo, existen otros sistemas manuales y más
económicos que también pueden utilizarse. Recordar, que una vez cortado y lijado un
fragmento de hueso se lo puede pulverizar manualmente en un mortero de acero.

La técnica de extracción se realiza así:

PRIMER DIA
1. Colocar en el tubo de ensayo A (cristal):
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Hueso en polvo, 1g (excepto en el blanco)

EDTA 0.5M (pH 8), 2ml
Proteinasa K, 20 mg/ml, 100 µl
Tween 20, 10 µL
2. Mezclar por vórtex e incubar a 37° C por 12 horas

SEGUNDO DIA
3. Añadir al tubo A 2 ml de Fenol, vórtex y centrifugar 5 minutos a 15.000 rpm.
4. Coger la interfase y pasarla a otro tubo B, la fase superior que queda es el fenol y la
inferior el hueso.
5. Desechar el fenol y repetir este lavado por 3 ocasiones
6. Añadir al tubo B 2 ml de Fenol, vórtex y centrifugar 5 minutos a 15.000 rpm. Rescatar
la fase acuosa superior y pasarla a otro tubo C. Repetir el proceso 2 veces más.
7. Añadir al tubo C 2 ml de Fenol-cloroformo (1:1), vórtex y centrifugar 5 minutos a
15.000 rpm. Rescatar la fase acuosa superior y pasarla a otro tubo D. Repetir 2 veces
más este paso.
8. Añadir al tubo D 2 ml de Cloroformo, vórtex y centrifugar 5 minutos a 15.000 rpm.
Rescatar la fase acuosa superior y pasarla al Centricon®30.
9. Tapar el Centricon®30 con parafilm y centrifugar 30 minutos a 5.000 rpm. Desechar lo
que ha pasado el filtro, poner 500 µL de agua desionizada y centrifugar 5 minutos a
5.000 rpm. Repetir el proceso hasta que el agua que se filtre sea lo más clara posible.
10. El ADN queda en el filtro del Centricon®30. Invertir el Centricon®30 en los tubos
pequeños y centrifugar 1 minuto a máxima velocidad.
11. Tapar el tubo y refrigerar a 4° C.

La mayor parte del ADN en los tejidos óseos compactos se localiza en los osteocitos, los
cuales son remanentes de los osteoblastos, los cuales a su vez han sido autosecretados y
se han empezado a aislar de la matriz extracelular. Hay 20.000 a 26.000 osteocitos por
mm3 en la matriz de un hueso calcificado. Además, la matriz de un hueso calcificado
puede aportar al ADN alguna protección contra la degradación.

El acceso al ADN de los osteocitos puede ser difícil por la constitución de la matriz
calcificada. Por ello, algunos autores recomiendan descalcificar las muestras, mediante la
remoción de los iones de calcio, previamente a la extracción (Hochmeister M y cols., 1991).

Protocolo Alternativo A:
EXTRACCION DE ADN DE TEJIDO OSEO TOTALMENTE REDUCIDO
(Adaptado de Corach D, Sala A, Penacino G, 1.999)

PRIMER DIA
1. Tratar la muestra de hueso en polvo (300 a 500 mg) con 2 ml de la Solución de
Extracción formada por:
EDTA 10 mM
Tris 10 mM
Na Cl 100 mM
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18

SDS 1%
Proteinasa K, (20 mg/ml), 10 a 20 µl

2. Mezclar por vórtex e incubar a 60° C toda la noche

SEGUNDO DIA
3. Realizar tres extracciones orgánicas, como en el protocolo previo:
Fenol
Fenol-cloroformo 1:1
Cloroformo

4. Mezclar la fase acuosa con el solvente orgánico hasta formar una emulsión y
centrifugar 5 minutos a máxima velocidad en una centrífuga tipo ROLCO.
5. Recuperar en cada extracción la fase acuosa superior
6. Purificar con Micropure / MicroconTM (Centricon®30).

Protocolo E7:
OBTENCION DE MATERIAL ÓSEO FRESCO (MÉDULA ÓSEA)

1. Seleccionar un hueso largo.

2. Lavar la pieza con abundante agua (30 minutos), luego añadir Hipoclorito de Sodio al
10% (por 30 minutos). Lavar nuevamente con agua para retirar el Hipoclorito.
3. Lavar el hueso con Etanol (30 minutos). Luego enjuagar con agua autoclavada.
4. Secar el hueso.
5. Cortar longitudinalmente la diáfisis. Raspar con una espátula la médula ósea y
recolectarla en un tubo de 5 mL.
6. Añadir a la muestra la solución de extracción previamente descrita.
7. Continuar con el mismo protocolo anterior.

Protocolo E8:
AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE TEJIDOS BLANDOS (material cadavérico)
(Adaptado de Corach D y cols., 1.994)

1. Seleccionar un fragmento del material a analizar (1 a 2 gs), evitar las partes ricas en
tejido graso. Utilizar la capa muscular profunda, retirando previamente la piel, el TCS y
la aponeurosis. No utilizar fibras tendinosas.
2. Disgregar el tejido sobre una placa Petri, hasta reducirlo a pequeños fragmentos .
3. Agregar 2 ml de la Solución de Extracción CTAB (Bromuro de Cetil Trimetil Amonio) y
colocarla en un tubo de 5 ml.
4. Añadir 10 µL de Proteinasa K (20 mg/mL) e incubar a 60° C con agitación durante toda
la noche.
5. Recuperar la fase acuosa en un tubo nuevo dejando decantar el tejido.
6. Agregar 2 mL de una solución de CH3Cl:alcohol isoamilico (24:1), agitar
vigorosamente hasta que se forme la emulsión.
7. Centrifugar a máxima velocidad po 5 minutos y recuperar la fase acuosa superior.
8. Realizar 2 extracciones orgánicas sucesivas más.
9. Poner 1 ml de Etanol Absoluto a - 20° C

10. Mezclar por inversión, observar que aparece un ovillo de ADN

11. Centrifugar 5 minutos a 12.500 rpm, luego retirar el Etanol por decantación.
12. Poner 500 ul de Etanol al 80% a 4° C.
13. Centrifugar 5 minutos a 13.000 rpm, luego retirar por decantación, apoyar en papel,
secar al aire por 10 minutos.
14. Resuspender en 100 uL de agua destilada estéril (autoclavada)

Cantidades de ADN que se pueden recuperar de los tejidos postmortem no está

disponible por igual en todos los órganos. Hasta 3 semanas del período postmortal se
puede obtener ADN en grandes cantidades de nódulos linfáticos, corteza cerebral y
músculo psoas. La sangre provee ADN en cantidad variable dependiendo de la presencia
de coágulos, que aumentan la disponibilidad del material genéticos, por eso es necesario
buscar siempre muestras más homogéneas de sangre. La degradación del ADN de alto
peso molecular está directamente relacionado con la duración del período postmortal. Las
altas temperaturas ambientales, como la presencia de infecciones previas en el individuo
son factores importantes en la autolisis que se efectúa con mayor rapidez (Bar W y cols.,
1988).

Protocolo E9:
AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE PIEZAS DENTARIAS
(Adaptado de Corach D, Sala A, Penacino G, 1.999)

1. Seleccionar la pieza dentaria a analizar, de preferencia utilizar los dientes del maxilar
superior que son los que mejor se conservan.
2. Lavar la pieza seleccionada con un cepillo y abundante agua, secar a 37° C en estufa
3. Disgregar el diente con el equipo Freezer Mill 6750 (Glen Creston Ltd., England), en
presencia de Nitrógeno Líquido mediante un fuerte impacto mecánico. También se
puede pulverizar el diente en un mortero de acero o utilizar un rotor con una fresa
delgada de dentista, para obtener polvo dental.
4. Tratar el material con 2 ml de solución de extracción: EDTA 10 mM, Tris 10 mM y NaCl
100 mM, más 1% de SDS y 10-20 µl de Proteinasa K. Continuar con el protocolo
descrito para extracción de ADN a partir de restos óseos reducidos.
5. Purificar el ADN.

Protocolo E10:
EXTRACCION DE ADN PREPARACIONES FIJADAS EN
TINCION DE HEMATOXILINA - EOSINA
(Adaptado de McPherson MJ y cols., 1.995)

EXTRACCION POR INCUBACION EN PROTEINASA K

1. Dejar en remojo con Xyleno Cianol los portaobjetos, 24 a 48 horas para placas con
hematoxilina-eosina (HE) y, 3 a 5 horas para preparaciones de citología exfoliativa.
2. Retirar el cubreobjetos con un bisturí nuevo con el fin de evitar la contaminación.
3. Raspar la sección o las células y movilizar dentro de un tubo de microcentrífuga.
4. Añadir un Tampón de Digestión de (añadir 1.2 ml/100 mg de tejido ó 325 µL / sección
de tejido) que contenga:
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20

NaCl 100 mM
Tris HCl 10mM
EDTA 25mM
SDS 0.5%, pH8
Proteinasa K 0,1 mg/ml

5. Incubar en un vaso (Lacunar Cell Mixer CH100) 1 hora a 37° C las preparaciones
frescas, e incubar por 5 días las almacenadas.
6. Colocar un volumen igual de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25:24:1). Mezclar
bien por inversión.
7. Separar las fases por centrifugación, rescatar la fase acuosa superior con una punta
de pipeteo de boca ancha.
8. Repetir el paso 6 y 7.
9. Añadir un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico (24:1). Mezclar bien.
10. Separar las fases por centrifugación, rescatar la fase acuosa superior con punta de
boca ancha.
11. Añadir 2 volúmenes de Etanol absoluto frío y, 0.1 volúmenes de Acetato de Sodio 3M
(pH 5,2).
12. Dejar que precipite el DNA al menos 1 hora a -20° C.
13. Centrifugar 10 minutos a 13.000 rpm, y luego decantar el etanol
14. Secar el pellet de DNA en secador de vacío por 30 minutos.
15. Resuspender el DNA en agua destilada, al menos 24 horas a temperatura ambiente.

Protocolo alternativo A:

1. Raspar 5 mm2 de la muestra y ponerlos en Eppendorf Luego 2 lavados con Xylol.

2. Centrifugar 1 minuto 12.000 rpm, o 30 minutos con agitación manual a temperatura
ambiente. Luego 2 lavados con Etanol. Centrifugar 1 minuto, 12.000 rpm o 30 minutos
manual.
3. Añadir Tampón: 50 µL de Tampón 10 STR sin Cl2Mg a 1 vol + 2 ul de Proteinasa K
4. Incubar a 56° C durante toda la noche
5. Centrifugar 2 a 3 minutos a 12.000 RPM. Luego hervir 5 minutos
6. Utilizar 2 µL de este ADN, en 25 µL de volumen final para la PCR

Protocolo E11:
AISLAMIENTO DE DNA TOTAL A PARTIR DE BIOPSIAS
(Músculo, hígado o cerebro)

1. Pulverizar la biopsia (100 µg a 1 mg) en un mortero de porcelana o con el equipo

Freezer Mill 6750 (Glen Creston Ltd., England). Las muestras deben guardarse en
hielo, o congeladas y deben ser procesadas tan pronto como sea posible.

2. Transferir el polvo obtenido a un tubo Eppendorf en donde se resuspende con el

Tampón TEC 1X, 0.3 a 1 ml, formado por:
Tris HCl 10 mM, pH7.4
NaCl 10 mM

EDTA 25 mM

3. Añadir 20 µL de SDS 25% para lisar las células (concentración final 1%).
4. Añadir 1 µL de Proteinasa K (20 mg/ml)
5. Incubar 3 horas a 50
6. Extraer el ADN con Fenol/ cloroformo/ alcohol isoamílico (1:1:1), agitar y mezclar por 1
minuto.
7. Centrifugar 5 minutos a 12.000 rpm
8. Rescatar la fase acuosa y agregar 20 µl de NaCl 5M (hasta una concentración de 0,2
M) y 1 ml de Etanol (2 volúmenes). Luego aparece la hebra de ADN.
9. Mantener a -20° C. Durante toda la noche o a -70° C. Por 1 hora.
10. Centrifugar a 4° C, 30 minutos a 13.000 rpm
11. Eliminar el etanol y resuspender en Tampón TE 10:1 (Tris HCl 10mM + EDTA Na
1 mM, pH: 7.5)

Protocolo E12:
EXTRACCION DE ADN TOTAL A PARTIR DE TEJIDOS
INCLUIDOS EN BLOQUES DE PARAFINA
(Adaptado de Crespillo M, y cols. – Instituto de Toxicología, Barcelona)

1. Cortar 2 secciones de tejido de aproximadamente 5 mm de espesor con el uso de un

microtomo. Cortar las secciones hasta convertirlas en un fino macerado, con la ayuda
de un bisturí.
2. Pasar el macerado a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.

DESPARAFINADO
3. Añadir 200 uL de Digest Buffer compuesto por:
Tris HCl 50 mL, pH: 8.5
EDTA 1 mM
Tween 20 0,5%

4. Pasar a un microondas, una vez tapados los tubos, se lo enciende a 500 w durante 30
a 60 segundos, en lapsos de 30 segundos.
5. Centrifugar 10 minutos a 12.000 rpm
6. Eliminar la capa superior de parafina

EXTRACCIÓN

7. Añadir 2.5 µL de Proteinasa K (16.5 mg/ml)

8. Incubar a 42° C durante toda la noche
9. Centrifugar 5 minutos a 6.000 rpm.
10. Tomar el sobrenadante y pasarlo a un tubo de
11. Purificar con un volúmen de Fenol/ cloroformo/ alcohol isoamílico (25:24:1)
12. Precipitar y concentrar el ADN en una columna de Centricon®-100.

El material en el cual se fija los tejidos influye notablemente en el análisis del ADN. Los
tejidos fijados en Etanol al 95% y en Acetona son aquellos que dan mejores resultados
durante la amplificación por PCR, luego de los 30 días de procesados. El retardo en el
procesamiento del tejido lleva a una degradación significativa del ADN, volviendo inútil al
material para los estudios genéticos. Algunos métodos de fijación causan daño en el ADN
y durante la PCR producen errores de replicación así como puntos de mutación. La
recolección de las muestras en Etanol provee una enorme ventaja para la conservación y
almacenamiento de muestras, y es útil en particular, en aquellos lugares donde la
tecnología esté limitada (Greer C y cols., 1991)

Protocolo Alternativo A:
(Adaptado de Banegees y cols.,1.995)

DESPARAFINADO

1. Colocar a la muestra 1 ml de Xylol, agitar por 30 minutos. El Xylol deshace la parafina.

2. Centrifugar 1 minuto a 10.000 rpm, 2 veces todo.
3. Añadir 1 mL de Etanol Absoluto, agitar por 30 minutos. El Etanol extrae el Xylol.
4. Centrifugar 2 minutos a 12.000 rpm, 2 ocasiones todo.

EXTRACCIÓN

5. Añadir TE 200 µL + Proteinasa K 200 µg + Tween 20 al 0,5% 1 µL.

6. Spin para llevar todo el contenido al fondo del tubo
7. Incubar a 56° C durante toda la noche.
8. Hervir por 5 minutos y luego centrifugar 5 minutos a 12.000 rpm

Protocolo alternativo B
(Baiquet, Galleno y Tizziano):

Recientemente se ha descrito una técnica en la que no hace falta la previa

desparafinación de la muestra con Xylol. Tan sólo es necesario aumentar el tiempo de
incubación con Proteinasa K de 24 horas a 5 días, la cantidad de ADN que se obtiene es
óptima y de un tamaño que puede alcanzar las 5 Kb.

Protocolo Alternativo C:
(Adaptado de Alonso A, 1997 – Instituto de Toxicología Madrid)

DESPARAFINADO

1. Poner Xylol, hacer 2 lavados de 10 minutos a 56° C

2. Hacer un lavado con Etanol absoluto.
3. Homogeneizar el tejido en el Etanol mediante vórtex.
4. Centrifugar y desechar el sobrenadante.

EXTRACCIÓN

5. Hacer un lavado en Tampón de Digestión, con Acetato Sódico 0.2 M o cualquier otro a
base de Tris que se utilice de rutina.
6. Añadir una solución de Digestión Proteolítica formada por:
AcNa 0,2M 500 µL
Proteinasa K 30 a 50 µL (concentración 10 mg/ml)
DTT 1 M 20 µL (3,08 gs DTT + 20 mL de agua destilada, hacer alícuotas
de 1 mL, guardar a - 20° C).
SDS al 10% 35 µL

7. Dejar la solución precedente durante 16 a 24 horas, entre 37 y 56° C, hasta que se

digiera completamente el tejido. En algunos casos es necesario añadir a las varias
horas más Proteinasa K.
8. Extraer con Fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (1:1)
9. Purificar mediante ultrafiltración. Realizar tres lavados de la fase acuosa con TE 1X
utilizando Centricon®-100. Se obtiene un volumen final del extracto de 40 a 100 µL.

Protocolo E13:
AISLAMIENTO DE ADN TOTAL A PARTIR DE FIBROBLASTOS

1. Los fibroblastos congelados después de lavarlos con suero fisiológico, se dejan

descongelar en frío (hielo)
2. Resuspender en Tampón TE 10:1 0,3 a 1 mL.
3. Añadir Tampón de Extracción, en una proporción de 10 ml / ml de fibroblastos
resuspendidos, se prepara con:

Tris 10 mM, pH 8
EDTA - Na 0,1 M
RNAss 20 µL/ml
SDS al 0,5%

4. Incubar a 37 por 1 hora

5. Añadir Proteinasa K en proporción de 100 µg/ml
6. Extracción con Fenol/cloroformo-isoamílico (1:1), agitar un minuto.
7. Centrifugar 5 minutos a 12.000 rpm
8. Recoger la fase acuosa superior
9. Añadir 2 volumenes de Acetato Amónico 10 M, para facilitar la precipitación.
10. Añadir 2 volumenes de Etanol Absoluto, 1 mL
11. Centrifugar 5 minutos a 12.000 rpm
12. Retirar el etanol y secar al aire por 10 minutos.

Protocolo E14:
EXTRACCION DIFERENCIAL DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS COMBINADAS
(SEMEN-SANGRE; SEMEN- CÉLULAS DE DESCAMACIÓN)
Técnicas Instrumentales en Genética Forense | Fabricio González Andrade & Begoña Martínez Jarreta ©
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(Adaptado de Corach D, Sala A, Penacino G, 1.999)

1. Colocar una porción de la mancha de 25 mm2, en 1 ml de agua destilada, incubar a

37° C por 1 hora, agitando periódicamente mediante vórtex.
2. Retirar la tela con un tip o un palillos de dientes autoclavado y centrifugar a 13.000
rpm, recuperar el sobrenadante que tiene las células.
3. Digestión del material de la víctima con Proteinasa K/ SDS/ TEC e incubación durante
2 horas a 56° C. La solución se prepara con: EDTA 10 mM, Tris 10 mM, NaCl 100 mM,
a ésta añadir SDS al 1% y 10 a 20 µL de Proteinasa K.
4. Se centrifuga a 13.000 RPM durante 10 minutos y se retira el sobrenadante que
contiene el ADN de la víctima.
5. El precipitado del paso anterior contiene los espermatozoides del agresor. Se
resuspende nuevamente en pK / SDS / TEC.
6. Añadir 10 µl de DTT e incubar durante 12 horas a 56° C.
7. Luego con los dos líquidos se procede a las extracciones con solventes orgánicos
(Fenol/ cloroformo-isoamílico) y precipitar el ADN de ambos con Etanol absoluto.
8. En caso de tratarse sólo de muestras de semen no se realiza la separación del
material de la víctima.

Protocolo Alternativo A:
EXTRACCION ORGANICA Y SEPARACION DE ADN DE CELULAS ESPERMATICAS
Y CELULAS VAGINALES
(Adaptado de Budowle B et al, 2000)

1. Colocar la muestra problema con semen en un tubo de 1.5 mL (pedazo de hisopo de

algodón, o tejido manchado cortado).
2. Añadir la Solución de Separación A (SSA)

400 µL de Tris/EDTA/NaCl
25 µL de Sarkosyl
75 µL de agua
5 µL de Proteinasa K (20 mg/mL)

3. Mezclar el contenido del tubo con agitación suave e incubar a 37° C por 2 horas.
4. Hacer un agujero en la tapa del tubo (liberar gases). Transferir el material dentro del
tubo y centrifugar por 5 minutos a 12.000 rpm.
5. Retirar el sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de 1.5 mL. Esta es la fracción
que contiene el ADN de las células lisadas (denominarla Fracción Femenina).
6. Retirar el susbstrato que queda y colocarlo en otro tubo. Ser cuidadoso de no tocar el
pellet que queda en el fondo del tubo original.
7. Añadir al pellet (Fracción Masculina) en el tubo original la Solución de Separación B
(SSB):
150 µL de Tris/EDTA/NaCl
50 µL de Sarkosyl al 20%
40 µL de DTT 0.39 M
150 µL de agua
10 µL de Proteinasa K (20 mg/mL)

8. Mezclar suavemente el contenido del tubo e incubar por 2 horas a 37° C.

9. Agregar al pellet 500 µL de Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1), realice el
paso dentro de una campana de extracción de gases.

10. Mezclar con vórtex por 20 segundos hasta que la emulsión se vuelva "lechosa". Al final
un Spin a gran velocidad por 2 minutos en una microcentrifuga.
11. Se pueden realizar más extracciones orgánicas sucesivas para purificar la muestra,
hasta un máximo de tres veces.
12. Retirar el estrato acuoso (Fracción Masculina) del tubo inicial y colocarlo en un nuevo
Eppendorf de 1.5 mL. Tratar de no remover la capa proteica desnaturalizada que se
formó en la interfase entre el agua y las capas orgánicas.
13. Añadir a la capa acuosa 10 mL de Etanol Absoluto a -20° C .
14. Mezclar manualmente y colocar el tubo a -20° C por 30 minutos.
15. Centrifugar por 15 minutos a 12.000 rpm.
16. Decantar y eliminar el alcohol.
17. Lavar el pellet con 1 mL de Etanol al 70% a temperatura ambiente.
18. Centrifugar por 5 minutos.
19. Decantar y eliminar el alcohol. Retire el alcohol remanente con una micropipeta.
20. Centrifugar nuevamente por 30 minutos, luego retirar el alcohol remanente.
21. Resolubilizar el ADN en 36 µL de TBE a 56° C por al menos 2 horas. Se puede dejar
el ADN durante toda la noche a 56° C.
22. El ADN extraído pertenece a la Fracción Masculina.

Protocolo Alternativo B:
EXTRACCION PREFERENCIAL DE ADN ESPERMATICO
(Adaptado de Gill P, 1.992)

DIGESTIÓN DEL MATERIAL CONTAMINANTE

1. Colocar una porción de la mancha de 25 mm2 con una Solución de Extracción, incubar
a 37° C por 30 minutos, agitando periódicamente mediante vórtex.
2. Preparar la solución con:
Tampón de Extracción + SDS al 2% + Proteinasa K 30 µL (20mg/ml).

3. Preparar el Tampón con:

Tris 0.01 M 1.21 g/L
EDTA disódica 0.01 M 3.72 g/L
Na Cl 0.1 M 5.84 g/L
SDS al 2%, p/v, pH 8

4. Preparar el tampón cada semana y guardarlo a temperatura ambiente.

5. Después de esta corta incubación, perforar el fondo del tubo con una aguja caliente y
centrifugar la mezcla con un Spín corto. Todas las muestras deben estar en tubos
Eppendorfs etiquetados. Asegurase de perforar la tapa del tubo primero para prevenir
que el contenido sea expulsado por el fondo del tubo por la presión ejercida por los
gases.
6. Centrifugar de nuevo por 5 minutos a 14.000 rpm en una microcentrifuga.
7. Retirar el sobrenadante del extracto y lavar el pellet 3 veces en SDS/Tampón de
Extracción. Luego centrifugar con un spin a 14.000 rpm El sobrenadante contiene el
material de la víctima, el pellet el ADN del sospechoso.

8. Tomar la precaución de guardar todos los tubos utilizados en una bolsa y congelar a -
20° C, puede ser que se requiera nuevamente su uso ya que contienen residuos del
material extraído.
9. Añadir la Solución de Extracción nuevamente al pellet, como se describió antes, e
incubar toda la noche a 37° C. El pellert contiene el ADN del sospechoso.

PURIFICACION CON FENOL/CLOROFORMO

Esta es la técnica estándar de extracción de ADN de sangre.

10. Retirar con una pinza estéril autoclavada los tejidos (ropa) u otros materiales que
contenga el tubo. Se puede utilizar palillos de dientes autoclavados para evitar
contaminación.
11. Hacer un agujero en el fondo del tubo con aguja desechable caliente; hacer lo
mismo con la tapa (con el objeto de liberar la acumulación de gases de la noche).
Se puede perder una parte del extracto durante la perforación.
12. Numerar un segundo set de tubos Eppendorf. Colocar firmemente el tubo perforado
dentro del nuevo tubo. Siempre adopte el procedimiento: perforar el tubo, colocarlo
en el tubo receptor, colocar la pareja en la centrífuga y entonces centrifugar.
13. Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm
14. Colocar los tubos con el extracto en una gradilla. Tomar otra gradilla para colocar
los tubos con Fenol/cloroformo. Añadir 200 µL de solución de F/c a los tubos con el
extracto, cierre cuidadosamente cada tubo. Mezclar con vortex.
15. Se pude preparar caseramente (in house) la solución de F/c o adquirir preparciones
comerciales listas. Citamos aquí como reparar la Solución de fenol/cloroformo con:

Fenol sólido 500 g

Cloroformo 500 mL
Alcohol isoamílico 20 mL
8- Hdroxiquinolina 0.5 g

Dejar toda la noche a temperatura ambiente para disolver. Añadir suficiente

Tris/HcL 0.1M (pH 8) hasta el filo del contenedor y agitar suavemente para
equilibrar el Fenol. Permitir que las capas se separen. Retirar la capa acuosa
superior y descartar. Lavar dos veces más con Tris/HCl. Medir el pH del
sobrenadante, debe estar entre 7.5 y 8. Si no es así continuar lavando hasta
alcanzar el pH necesario.

16. Verificar que el contenido del extracto con la solución de f/c esté bien mezclado.
Puede utilizar un agitador a velocidad máxima por unos 30 minutos. Lo importante es
obtener una emulsión de las capas acuosa/orgánica que facilitará la eliminación de
proteínas contaminantes. Se puede realizar agitaciones de forma manual con períodos
de 30 segundos.
17. Centrifugar los tubos por 5 minutos a 14.000 rpm. Retirar la capa acuosa superior y
colocarla en otro tubo Eppendorf rotulado. Cuidar de no llevar el estrato orgánico.
18. En ocasiones, cuando la muestra en estudio proviene de escenarios muy
contaminados, es difícil realizar el paso anterior porque la solución siguiente a la
interfase es muy viscosa, probablemente sean complejos proteicos de ADN. No
descartar esta fase.
19. Se pueden realizar hasta 3 lavados con f/c, pero bastan 2 veces para encontrar una
cantidad aceptable de producto. Considerar que con cada extracción hay una pérdida
irrecuperable de ADN.

RECUPERACIÓN DEL ADN

20. Si existe alguna razón para creer que la cantidad de ADN es muy pequeña (entre 1 µg
y 10 pg/mL), agregar 1 µL (20 µg) de Glicógeno (Boheringer, Cat. 901393), por cada
tubo Eppendorf que contenga un volumen aproximado de la muestra de 500 µL.
Mezclar con una pipeta suavemente.
21. Luego añadir 2.5 volúmenes de Etanol absoluto. Congelar la mezcla y después seguir
con el protocolo normal. Considerar que la Recuperación del ADN por el Glicógeno
sólo se logra en conjunto con la precipitación por Etanol absoluto.

Protocolo E15:
PURIFICACION DEL ADN GENOMICO POR METODO WIZARD© Promega Corporation
(Basado en las técnicas de Miller y cols., 1988)

Tiempo de extracción: 45 minutos.

Se obtienen de 5 a 15 µg de ADN a partir de 300 µL de sangre, mayor o igual a 50 Kb.

La extracción de DNA de doble cadena a partir de leucocitos se realiza en 4 pasos:

1. Lisis de eritrocitos con Solución de Lisis Celular (SLC), los leucocitos quedan intactos
2. Lisis de leucocitos y sus núcleos con Solución de Lisis Nuclear (SLN). Opcional
podemos tener otro paso para destruir el RNA con una RNAsa.
3. Precipitación en sales que atraen a las proteínas celulares y deja el ADN de mayor PM
en solución, con Solución de Precipitación Proteica (SPP).
4. El ADN genómico es desalinizado, y concentrado al precipitar con Isopropanol. Luego
se lo hidrata con la Solución de Hidratación (SH).

PASO A:
1. Añadir 900 µL de SLC. a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, estéril.
2. Balancear el tubo de sangre hasta que esté totalmente mezclado y transferir 300 µL de
sangre al tubo con la SLC. Invertir el tubo 5 o 6 veces para mezclar.
3. Incubar la mezcla 10 minutos a temperatura ambiente, invertir 2 o 3 veces durante la
incubación para lisar los eritrocitos. Centrifugar 20 segundos a 13.000 - 16.000 rpm.
Poner los tubos con la bisagra de la tapa hacia fuera siempre en la microcentrífuga.
4. Retirar tanto sobrenadante como sea posible sin mover el pellet blanco visible. Deben
guardar unos 10 a 20 µL del líquido residual. Pueden quedar visibles algunas células
rojas o restos de éstas. Añadir 300 µL de SLS y repetir los pasos 3 y 4.

5. Vórtex el tubo enérgicamente hasta que los leucocitos estén suspendidos (10 a 15
segundos), Para que la lisis sea eficiente es esencial que los eritrocitos estén
suspendidos.

PASO B:
6. Añadir 300 µL de SLN al tubo con células suspendidas. Pipetear la solución 5 o 6
veces para lisar los leucocitos. La solución se volverá muy viscosa. Si tras la mezcla
son visibles grupos celulares, incubar a 37° C hasta que se deshagan. Si aún son
visibles tras una hora añadir 100 µL de SLN y repetir la incubación.

PASO OPCIONAL:
7. Añadir 1.5 µL de Solución RNAsa al lisado nuclear y mezclar por inversión 25 veces.
Incubar la mezcla a 37° C por 15 minutos. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente
para continuar.

PASO C:
8. Añadir 100 µL de SSP al lisado nuclear. Vórtex enérgicamente 10 a 20 segundos.
Pequeños grumos de proteínas pueden ser visibles después del vórtex. Si fuese
necesario usar más SLN en el paso 6, agregar 130 µL de SPP.
9. Centrifugar 3 minutos a 13.000-16.000 RPM a temperatura ambiente. Debe hacerse
visible un "pozo proteico" marrón oscuro.

PASO D:
10. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf limpio de 1.5 ml con 300 µL de
Isopropanolol (desaliniza y concentra). Puede quedar algo de sobrenadante en el tubo
original con el pellet proteico. Dejar este líquido residual en el tubo para evitar
contaminar la solución de ADN con el precipitado proteico.
11. Mezclar la solución por inversión hasta que las hebras blancas de ADN formen una
masa visible.
12. Centrifugar 1 minuto a 13.000-16.000 RPM a temperatura ambiente. El ADN se hará
visible como un pequeño pozo blanco.

PASO E:
13. Descartar el sobrenadante. Agregar 300 µL de Etanol al 70% a temperatura ambiente.
Invertir varias veces al tubo para limpiar el paso de ADN a las paredes del tubo.
Centrifugar un minuto a 14.500 rpm (13.000 a 16.000) a temperatura ambiente.
14. Con cuidado aspirar el Etanol usando una pipeta Pasteur o una pipeta de precisión. El
pozo de ADN está muy suelto en este punto y se debe tener cuidado, evitando aspirar
el pellet con la pipeta. Invertir el tubo sobre papel secante limpio y secar al aire 10 o 15
minutos.
15. Añadir 100 µL de SH de ADN (10 mM Tris HCL/ 1mM EDTA, pH: 7.4). Incubar 1 hora a
65° C o toda la noche a temperatura ambiente. Periódicamente mezclar la solución
dando golpecitos al tubo.
16. Guardar a 4° C (2 a 8° C).

RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS PRESENTES EN EL METODO WIZARD©

1. Cóagulo de sangre en la muestra.

PROBLEMA: tubos mal almacenados, sangre no se mezcla en el fondo, uso de tubos

inapropiados para extraer sangre
SOLUCION: desechar la sangre coagulada y extraer nuevas muestras en tubos con
EDTA.

2. No pellet o pozo proteico.

PROBLEMA 1: la muestra no se ha enfriado a temperatura ambiente antes de añadir

la solución de precipitación proteica.
SOLUCION: enfriar la muestra a temperatura ambiente, luego vórtex 20 segundos,
centrifugar 3 minutos a 13000 - 16000 rpm, y continuar con el protocolo.
PROBLEMA 2: la solución de lisado proteico no se mezcló a fondo con el lisado
nuclear.
SOLUCION: siempre mezclar el lisado nuclear con la solución de precipitación proteica
completa.

3. Pellet de ADN difícil de disolver.

PROBLEMA 1: muestras muy secas

SOLUCION: rehidratar el ADN incubándolo 1 hora a 65 °C y dejarlo a temperatura
ambiente toda la noche.
PROBLEMA 2: las muestras no se mezclan en el paso de hidratación.
SOLUCION: recordar mezclar periódicamente durante la rehidratación.

4. Pobre rendimiento del ADN

PROBLEMA 1: las muestras tienen muy pocas células blancas.

SOLUCION: extraer nuevas muestras de sangre
PROBLEMA 2: el pellet de leucocitos no ha resuspendido a fondo en el proceso.
SOLUCION: vórtex enérgico del pellet
PROBLEMA 3: el pellet de DNA se perdió en algún paso.
SOLUCION: poner mayor cuidado al retirar el sobrenadante y cuidar el pellet.
PROBLEMA 4: la muestra es muy vieja
SOLUCION: los mejores rendimientos se obtienen con sangre fresca. Muestras
almacenadas por más de 5 días a 4°C suelen dar bajo rendimiento.

5. ADN degradado ( <50 kb)

PROBLEMA: recogida y almacenamiento incorrecto de las muestras de sangre.

SOLUCION: obtener una nueva muestra bajo las condiciones anotadas.

Protocolo E16:
COLECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS EN SOPORTE SOLIDO
(PAPEL FTA – Whatman Biosciences®)

¿Qué hace el papel FTA?

Destruye los patógenos al contacto, inmoviliza el ADN dentro de la matriz, protege de la

degradación, permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente, facilita la
purificación y amplificación ya que el ADN está pegado a la matriz, facilita la preparación
de la muestra para la PCR manual o automatizada. El papel FTA se debe utilizar para
coleccionar, transportar y almacenar las muestras de sangre, así como posiblemente,
algunos otros fluidos biológicos

¿Qué es el papel FTA?

Una mezcla química única compuesta por tampones fuertes, denaturantes proteicos,
agentes quelantes y un absorbente de luz UV que atrapa los radicales libres. Todo esto
impregnado dentro de una matriz de papel filtro a base de celulosa (Whatman BFC 180
paper).

¿Cuáles son las utilidades?

Se puede hacer una tipificación correcta con este papel, pero pueden ocurrir en la
secuenciación perfiles balanceados / desbalanceados, la amplificación sobre un soporte
poroso puede causar también perfiles desbalanceados. Este sistema puede usar sangre o
saliva. Facilita el trabajo por lo que en un futuro será una herramienta en la
automatización de los procesos.

El procedimiento a seguir es:

1. Depositar la sangre directamente desde el dedo puncionado con una lanceta, o tomar
con una pipeta la sangre recolectada en el tubo vacutainer y colocarla sobre el papel.
Utilizar entre 5 a 100 µL.
2. Perforar eL papel FTA en fragmentos de 3 mm de diámetro, utilizar un sacabocados o
perforadora. Se puede utilizar la perforadora Harris Micropunch®.
3. Cuidar que los discos perforados provengan del centro de la mancha de sangre
4. Colocar los fragmentos en un tubo de 0.2 mL con tapa para PCR.
5. Agregar 200 µL de tampón de extracción (FTA Purification Reagent®) y luego un vórtex
vigoroso.
6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, agitando la solucion al comienzo, a
la mitad y al final del proceso.
7. Descartar el líquido con una pipeta, se puede utilizar pipetas desechables.
8. Repetir los pasos 7 y 8 por 2 ocasiones más.
9. Repetir el proceso pero usando tampón TE por 3 ocasiones más.
10. Descartar la mayor cantidad de líquido posible y secar al ambiente por 1 hora.
11. Almacenar si se requiere a temperatura ambiente en un sobre de papel. Refrigerar o
congelar si lo desea.
12. Para la PCR añadir los reactivos al mismo tubo que contiene los discos perforados.
Realizar la PCR a 25 o 27 ciclos, dependiendo de la posición de la cual deriva el disco
perforado.
13. El papel FTA viene en varias presentaciones. El FTA Classic Card® trae dibujados
cuatro círculos, uno para cada muestra a analizar. Optimizar el papel cortando
longitudinalmente el mismo en 6 u 8 tiras largas.
14. Para muestras recalcitrantes que no pueden ser lavadas eficientemente a través del
papel se recomienda usarel sistema GenPrep®, del mismo fabricante. Ver las
instrucciones de uso.
15. Para el análisis del ADN mitocondrial este sistema puede ser muy útil.
Ventajas: estable, versátil, portátil, seguro, rápido, fácil, purifica el ADN, reproducible,
efectivo para la automatización.

Limitaciones: requiere durante el proceso 6 lavado, no se puede cuantificar el ADN, la

cantidad de templado es escasa, hay veces que los discos perforados no llevan
suficiente muestra.

Protocolo E17:
COLECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DE FROTIS BUCALES

1. Se puede utilizar hisopos de algodón normales, los Cepillos para Frotis (CEP SwabTM -
Life Technologies) o los Aplicadores para Frotis (Gene Guard SwabTM, Life
Technologies).
2. Realizar un raspado firme con el hisopo alrededor de la mejilla izquierda, utilizando
ambos lados del hisopo.
3. Secar al ambiente el hisopo por 2 minutos o colocarlo en un tubo con alcohol
isopropílico.
4. Repetir el procedimiento con la mejilla del lado contrario.
5. Si el aplicador tiene una sola carilla (Gene Guard SwabTM), utilizar solo el lado con la
esponja.
6. Presionar firmemente el contenido del aplicador sobre el papel FTA, mientras aún este
húmedo el aplicador o realizar una extracción normal con fenol-cloroformo isoamílico.
7. El papel FTA se almacena a temperatura ambiente.

PREPARACION DE REACTIVOS PARA EXTRACCION

CHELEX 5% (Bio Rad Laboratories, Ref. 143-1832)

Viene en frascos de 100 y 200 mL.
Se prepara con Chellation resin 5 gs. + Agua destilada
estéril 100ml. Conservar a temperatura ambiente.

Cloroformo-isoamílico (24:1) Es un disolvente orgánico que precipita proteínas. Se lo

prepara Cloroformo 240 mL + Alcohol isoamílico 10 mL

Cloruro de Sodio (Sigma Chemical, Ref. S3014), PM 58.44 g

Colocar 29.22 gramos de NaCl en 70 ml de agua
destilada. Ajustar el volumen a 100 mL. Autoclavar y
conservar a temperatura ambiente.

DTT (Sigma Chemical, Ref. D9779)

Ditiotreitol 1M, frasco de 10 mL, C4H10O2S2

Dodecil sulfato sódico SDS al 20%, (Sigma Chemical, Ref. L7390)

Es un detergente aniónico, tampón de lisis de leucocitos.

Agua destilada estéril 80 mL + Lauryl sulfato 20 gs.
Puede calentarse la solución para facilitar su disolución.
Conservar a temperatura ambiente

EDTA 0.5 M pH 8 186.1 g EDTA (sal tetrasódica) + 800 mL de agua

destilada. Ajustar el pH a 8 con NaOH 5N, autoclavar y
guardar a temperatura ambiente.

Etanol al 80% Etanol absoluto 80 mL +Agua destilada estéril 20 mL

Fenol (Gibco, Ref. 15513-013). Se lo compra al distribuidor.

FTA Classic Card (Wathman Bioscience, Ref. wb 120205)

FTA Purification Reagent (Wathman Bioscience, Ref. wb 120204)

Perclorato sódico 5M Perclorato sódico 0,7 gs + Agua destilada estéril 1 mL

Proteinasa K (AMRESCO, Ref. E195-25)

Es útil para la digestión enzimática y fragmentación de
proteínas, además libera el DNA nuclear del medio.

Disolver en el mismo frasco los 100 mg de proteinasa K

liofilizada con 5 ml de agua destilada estéril. Se debe
utilizar en alícuotas de volúmenes pequeños y se usa tan
sólo por una ocasión.
Agua destilada estéril 1 mL + Proteinasa K 0,020 gs.

Sarkosyl 20% (Sigma Chemical, Ref. 402866)

N- Laurilsarcosina 100 mL, C15H28NO3Na.
Añadir 20 gs de N-Laurilsarcosina a 80 mL de agua
filtrada purificada. Llevar a un volúmen final de 100 mL y
autoclavar o filtrar.

Solución de Extracción CTAB CTAB 2% (p/v)

Bromuro de Cetil Trimetil Amonio NaCl 1.4 M
EDTA 25 mM (pH 8)
Tris HCl 100 mM
b-Mercaptoetanol 0.5%

Solución de Extracción EDTA 10 mM

(hueso) Tris-HCl 10 mM
Na Cl 100 mM
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SDS 1%
Proteinasa K (20 mg/ml) 10 a 20 µl

Solución de Extracción EDTA 0.5M (pH 8) 2 ml

alternativa (hueso) Proteinasa K (20 mg/ml) 100 µl
Tween 20 10 µL

Solución de Separación A
(SSA) para semen 400 µL de Tris/EDTA/NaCl
25 µL de Sarkosyl
75 µL de agua
5 µL de Proteinasa K (20 mg/mL)

Solución de Separación B
(SSB) para semen 150 µL de Tris/EDTA/NaCl
50 µL de Sarkosyl al 20%
40 µL de DTT 0.39 M
150 µL de agua
10 µL de Proteinasa K (20 mg/mL)

Tampón B Se prepara 100 mL a pH 8 con

Tris HCl 50 mM 0,6057 gs. +
NaCl 150 mM 0,876 gs. +
EDTA 100 mM 3,722 gs.
Se lo puede hacer de dos formas:
A. Mezclar Tris + NaCl + EDTA con agua autoclavada y
ajustar el pH con HCl o;
B. Haciendo 3 diluciones diferentes, se autoclava cada
una y luego se mezclan.

Tampón DLB Se prepara 1litro con

Tris HCl 1M pH 7.4 10 mL
NaCl 5M 2 mL +
EDTA 0.5 M pH 8 20 mL +
Agua destilada 968 mL

Tampón de Digestión Tris HCl 50 mL, pH: 8.5

(desparafinado) EDTA 1 mM
Tween 20 0,5%

Tampón de Digestión AcNa 0,2M 500 µL

Proteolítica (en parafina) Proteinasa K 30 a 50 µL (concentración 10 mg/ml)
DTT 1 M 20 µL (3,08 ds DTT + 20 mL de agua
destilada, hacer alícuotas de 1 mL,
guardar a - 20° C).
SDS al 10% 35 µL
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Tampón de Digestión NaCl 100 mM

(hematoxilina - eosina) Tris HCl 10 mM
EDTA 25 mM
SDS 0.5%, pH8
Proteinasa K 0,1 mg/ml

Tampón de extracción Tris 10 mM, pH 8

para fibroblastos EDTA - Na 0,1 M
RNAss 20 µL/ml
SDS l 0,5%

Tampón TE 10:1 Tris HCl 10mM + EDTA Na 1 mM, pH: 7.5

Tampón TEC 1X (0.3-1 mL) Tris HCl 10 mM, pH7.4

NaCl 10 mM
EDTA 25 mM

TRIS BASE (Sigma Chemical, Ref. T-8524)

TRIZMA BASE© hidroxy (metil) amino metano.

Tris - HCl Tris Hidroclorídico. 1.0 M, pH 8, 1 LTRIZMA BASE©

1.21 gramos de Tris base + 80 ml agua purificada y
filtrada, llevar la solución a 100 mL. Ajustar el pH a 8
con HCl concentrado. Ajustar el volumen final a 1 litro
con agua destilada estéril y guardar en una botella
transparente.

CAPITULO 3.
CUANTIFICACION DEL ADN
En este capítulo revisaremos los siguientes aspectos:

Cuantificación del ADN por espectrofotometria

Preparación de minigeles de agarosa
Preparación de geles de poliacrilamida
Revelado y tinción con Plata
Purificación del ADN extraído

Protocolo C1:
CUANTIFICACION DEL ADN POR ESPECTROFOTOMETRIA

Luego de la extracción se debe evaluar la cantidad y la calidad del ADN extraído. Para
ello, existen varios métodos entre los cuáles tenemos la espectrofotometría cuya técnica
describiremos a continuación.

1. Encender el espectrofotómetro (Gene Quant II DNA/RNA Calculator- Pharmacia ©)

2. Programar y seleccionar los valores de medición: longitud de proyecto de la celda,

factor, bases, longitud de oligonucleótidos, PM, razón, concentración de proteínas.
Basta una sola vez para que el equipo esté listo (ver Instrucciones de Manejo).

3. Tomar una lectura de referencia, poner agua destilada 980 uL en la cubeta de cuarzo
(pulse set ref), la misma que se almacenará y se usará como lectura base para todas
las medidas de la muestra. El display mostrará absorbancia de 260 nm - 0.000 AU.

4. Medir la muestra problema, usar la tecla sample. Añadir a la cubeta de cuarzo que ya
contiene agua destilada, 20 ul de ADN. Asegúrese que el ADN esté bien disuelto. El
display mostrará todos los resultados. Preparar la disolución problema siempre a una
concentración de 1/50 (980 µL de agua + 20 µL de muestra).

5. Anotar siempre la fecha de extracción y el volumen final de resuspensión de cada

muestra, es decir, el volumen total de TE en que se ha resuspendido.

INTERPRETACION

(a) ABSORBANCIA: se la mide en unidades de densidad óptica (OD). Una OD es la

capacidad de una sustancia disuelta en 1 mL de solución que dé una lectura de 1,00
con 1 cm de longitud de onda. El rango de luz UV para ADN es 260 nm, y para
proteínas 280 nm. Si la absorvancia da un valor negativo (-) la medición no es válida
porque el haz de luz no pasa por el nivel de la medida de la muestra. Valores de
referencia: 257 a 262 nm.

(b) RATIO: relación entre las absorvancias del DNA y las proteínas. A260 / A280. . Valores
mínimos A260 / A280 va entre 1.7 y 2. Si es menor de 1.7 sospechar que puede haber
contaminación con proteínas, si es mayor que 2 contaminación con ARN.

(c) DNA/RNA: concentración de DNA y RNA, dado en ug/ml. Se calcula considerando

que un ADN de doble cadena a 50 ug/ml presenta 1 OD a 260 nm. Pueden
seleccionarse otras concentraciones de unidades. Valores mínimos: 1 µg / mL. La
concentración de la muestra se calcula según la siguiente relación:

[ADN µg/mL]= (Abs 260 nm) x (50 µg/mL) x (50/1) x (1 mL/100 µL)
[ADN µg/mL]= (Abs 260 nm) x 250 µg/µL

(d) PUREZA: determina la calidad del ADN. Se obtiene por el cociente de las
observancias a 260 y 280 nm, se calcula en porcentajes con una escala de 0 a 150%.
Valores mínimos: entre 85 a 95% de pureza.

(e) PROTEINAS: concentración de proteínas en mg/ml. Escala de 0 a 600. Valores

mínimos: no tener proteínas.

(f) [ X ] : concentración de moléculas / ml, variable que depende del peso molecular y
longitud de oligonucleótidos preparados. Valores mínimos: en función de la
cantidad de moléculas de ADN.

(g) Tm: temperatura de fusión.

(h) Recovery: porcentaje de recuperación de oligonucleótidos (pmol/uL) comparando la

concentración observada con la esperada.

USOS DEL ESPECTROFOTOMETRO

(a) Medir la concentración de RNA, de DNA de cadena simple (ssDNA), de DNA de doble
cadena (dsDNA) en unidades de peso, fracción molar, moles de fosfato y moléculas
totales.
(b) Medir la concentración de proteínas.
(c) Determina la recuperación de oligonucleótidos.
(d) Pureza de ácidos nucleicos.
(e) Temperatura de fusión
(f) Razón A260 / A 280.

Protocolo C2:
CUALI - CUANTIFICACION DEL ADN
PREPARACIÓN DE MINIGELES DE AGAROSA
(Adaptado de Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989)

La Agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6 anhidrogalactosa. Este es un gel no

desnaturalizante (dsDNA).

La migración de las partículas depende del tamaño molecular, de su conformación interna

y, del voltaje. La concentración de agarosa en el agar regulará el rango óptimo de
separación del ADN y nos dará el poder de resolución, así:

Concentración de Agarosa (%) Rango de separación (Kb)

0.3 60 a 5
0.6 20 a 1
0.7 10 a 0.8
0.9 7 a 0.5
1.2 6 a 0.4
1.5 4 a 0.2
2.0 3 a 0.1
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La separación de fragmentos de ADN depende también del tipo de agarosa, por ejemplo,
el gel de agarosa estándar recoge fragmentos de 70 pb si está al 3% hasta fragmentos de
80.000 si está al 0.1%. El gel de agarosa NuSieve© recoge fragmentos de 10 a 1000 pb.

A continuación detallamos el protocolo.

1. PREPARACIÓN INICIAL. Preparar en un bote obscuro 1 litro de 1xTAE Buffer + 20 µl

de Bromuro de Etidio (BrEt a 0.5 mg/ml). Agitar. Luego guardar en la nevera a 4°C en un
bote forrado con papel aluminio.

2. ADECUACION DE LA CUBETA. Poner papel celofan (cinta adhesiva) a los lados,

nivelar el peine para que la profundidad de los pocillos sea igual.

3. PREPARACIÓN DEL GEL.

(a) En un frasco pequeño con tapa colocar 2 gs. de Agarosa (SeaKem©, FMC Bioproducts
USA)+ 100 ml de mezcla del Buffer 1x TBE.
(b) Poner en el microondas, sin tapar el bote, por 6 minutos hasta que aparezcan burbujas
que indican que se ha disuelto la Agarosa. También se puede disolver en baño de
agua hirviendo o sobre un calefactor o a fuego sobre una plancha de amianto, con
agitación. La agarosa se disolverá entre 55 a 60°C.
(c) Añadir 20 µL de Bromuro de Etidio, si no se agregó en la preparación inicial.
(d) Esperar 20 a 30 minutos para que gelifique la Agarosa. Se puede colocar la
preparación en la campana de extracción para que los vapores tóxicos sean
absorbidos por el flitro de la cámara. Verificar si la cámara posee filtros para todo tipo
de vapores.
(e) Volcar en el molde preparado con el peine, hasta ¾ de altura.
(f) Sembrar las muestras a cuantificar como se describe posteriormente.
(g) Sumergir en la cuba de electroforesis horizontal (BioRad) con 500 mL de 1xTBE que
deben cubrir al gel.

4. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ELECTROFORESIS

(a) Tomar 8 uL de la muestra problema + 2,5 uL de Solución de Carga (Stop Mix). Utilizar
puntas delgadas.

(b) Preparar la Solución de Carga (Stop Mix) con:

Ficoll-400® al 5%, + Azul de bromofenol 0.1% + Xileno Cianol 0.1% +

EDTA 100 mM + Tris-HCl 10mM a pH 7.5

(c) Depositar las muestras dentro de los pocillos correspondientes, intercalando de forma
secuencial muestras control de ADN de concentración conocida (marcador de peso
molecular DRIgest III, 0.5 µg/µL de Pharmacia). Sirven para comprobar y confirmar
visualmente la bondad en la estimación espectrofotométrica.

5. ESTABLECER LAS CONDICIONES DE ELECTROFORESIS:

Voltaje: 80 voltios (V)

Intensidad: 37 miliamperios (mA)
Potencia: 10 vatios (W)
Tiempo: 20 minutos

6. EVALUAR LOS RESULTADOS

Leer en la cámara obscura con luz UV de un Transiluminador (Bio-Rad Laboratories,

Richmond, Ca) luego de 10 minutos de la electroforesis. El BrEt presenta una
fluorescencia color naranja. Precaución: usar protección ocular.

Luego se puede fotografiar el gel (cámara polaroid MP-4 land camera o con cámara
digital), para realizar comparaciones posteriores con patrones “standard” adecuados, los
cuales nos proporcionan una estimación de la concentración de ADN.

Este método nos permite:

i. Semicuantificar el ADN
ii. Inferir sobre la integridad del ADN
iii. Observar si existe contaminación bacteriana.

FACTORES QUE AFECTAN LA MOVILIDAD DEL ADN EN LOS GELES DE AGAROSA

1. Concentración de agarosa y tamaño del ADN. Concentraciones bajas de agarosa del

0,3 al 0,5% separan fragmentos largos (20 a 60 kb). Concentraciones elevadas de 1 a
1,5% separan fragmentos pequeños (0,2 a 0,5 kb). La migración es inversamente
proporcional al tamaño de la muestra (pb).

2. Voltaje. Los fragmentos migran a una velocidad proporcional al voltaje aplicado. La

capacidad de separación en geles de agarosa disminuye conforme se aumenta el voltaje.
Para obtener una máxima resolución de fragmentos de ADN (mayor a 2 kb) el voltaje
debe ser menor o igual a 5 voltios / cm.

3. Composición de bases y temperatura. Las moléculas de ADN con el mismo tamaño

pueden mostrar diferente movilidad en función de la composición de nucleótidos que
constituyen estas moléculas.

4. Composición y fuerza iónica de solución amortiguadora. En ausencia de iones con

conductancia eléctrica mínima el ADN migra muy despacio. La fuerza iónica elevada y el
exceso de calor pueden llegar a derretir el gel inclusive.

Protocolo C3:
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACION
PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA

La Poliacrilamida es un polímero de monómeros de acrilamida. Este es un gel

desnaturalizante (ssDNA). La migración de partículas dependerá del tamaño del poro, el
cual a su vez está en relación a la concentración de acrilamida y a la razón entre
acrilamida:bisacrilamida.

Concentración (% P/V) Rango separación (pb) Tamaño de comigración pb

Azul Bromofenol Xileno cianol
3.5 100-1000 100 460
5.0 80-500 65 260
8.0 60-400 45 160
12 40-200 20 70
20 6-100 12 45

1. La separación de fragmentos se realiza mediante electroforesis en geles submarinos.

Utilizar de preferencia cubetas verticales. Usamos 2 placas de vidrio templado que
sirven de soporte al gel, la una tendrá solución adherente y la otra repelente.

2. Tratar una de las placas de cristal con Silicona (SigmaCote, Gel Slick® u otros),
utilizando toallas de papel (Kinwipes®). Secar cuidadosamente. Se puede usar también
Bind Silane y Repel Silane (Pharmacia,). Sobre la segunda superficie no se adhiere
el gel de poliacrilamida lo que permite la separación de los cristales.

3. Preparar el gel con: Úrea 7M 25,2 gs (Promega) + agua destilada 32 mL +TBE 1Ox
Buffer 3 mL. Se debe disolver con calentamiento suave y colocar en una probeta de
100 mL. Añadir luego 6 mL de Acrilamida:bisacrilamida(19:1) al 40%. Concentración
final al 4%.

4. Se puede filtrar la solución de acrilamida a través de un filtro de 0.2 micrones

(opcional).

5. Agregar los catalizadores: 360 uL de Persulfato de Amonio al 10% (usar alícuotas de 1

g de Persulfato en 10 ml de agua) + 36 uL de TEMED (tetrametilendiamida) y mezclar
suavemente.

6. Volcar en los cristales antes de los 2 minutos, de forma inclinada, usar una punta
delgada. Gelifica a los 30 minutos.

7. Retirar el celofan, el peine y luego limpiar los pocillos con agua destilada.

8. Hacer un precorrido (prerunning) a 200 voltios por 10 minutos.

9. Limpiar los pocillos y rellenar 2 mm con agua hasta que todos estén a la misma altura.

10. Preparar las muestras:

nombrar los tubos
poner 2.5 µL de muestras + 1 gota de Aceite mineral.
desnaturalizar 5 minutos a 95ºC.
poner en gradillas refrigerantes y añadir 2.5 µL de solución de carga
(STR 2X Loading Solution).

11. Preparar los láders:

nombrar los tubos
poner 2,5 µL de láder + 2.5 µL de STR 2X Loading Solution +
1 gota de Aceite mineral

12. Agregar a cada muestra con 4 µL de ADN amplificado y 4 µL de colorante de siembra

(Xilencianol + Azul de bromofenol, 1 mg de cada uno en 10 ml de Formamida al 95% y
agua al 5%).

13. Introducimos el gel en la cubeta de electroforesis que tiene como tampón una solución
0,5X TBE, la solución debe cubrir al gel.

14. Sembrar las muestras. Cada peine de 20 pocillos sirve para 15 muestras y 5 láders.
Se intercala un láder alélido cada 3 o 4 muestras. Colocar 3 µL de cada muestra en el
canal respectivo. Correr hasta que el colorante celeste llegue a unos centímetros del
borde inferior del gel (el tiempo de corrida dependerá del tamaño de fragmentos
amplificados).

15. Establecer las condiciones de electroforesis:

Voltaje: 1000 voltios (V)

Intensidad: 42 miliamperios (mA)
Potencia: 45 vatios (W)
Tiempo: 4 horas

Este método nos permitirá:

i. La purificación de oligonucleótidos de síntesis y eliminación de nucleótidos libres tras

su marcaje radioactivo.
ii. Determinación de secuencias de ADN.
iii. Separación de fragmentos de ADN menores a 500 pb.
Protocolo C4:
REVELADO Y TINCION CON PLATA
(Basado en el Método de Bassam y cols., 1991)

1. Después de la electroforesis, vaciar las cámaras del buffer y cuidadosamente retirar

las placas de vidrio del aparato.
2. Colocar la placa con el gel en una superficie seca. Remover con cuidado las dos tapas
y sepárelas, puede usar una espátula de plástico. El gel debería estar muy unido a la
placa de vidrio más pequeña (la tratada con Bind Silane).
3. Colocar la placa con el gel adherido en un agitador mecánico 100 rpm.
4. Añadir sobre las placas Metanol al 40% por 10 minutos, mantener agitación suave.
5. Lavar con agua desionizada, por lo menos 2 litros en cada paso.
6. Colocar Ácido Nítrico 0,16 M por 6 minutos.
7. Lavar con agua desionizada
8. Colocar la placa en agua destilada 5 minutos.
9. Añadir Nitrato de Plata 12 mM por 20 a 25 minutos.
10. Lavar con agua desionizada.
11. Poner en agua destilada por 5 minutos.
12. Añadir Bicarbonato sódico 0,28 M + Formaldehído (500 µL al 37%) por 30 minutos.

13. Poner Solución Stop (Ácido Cítrico 0.1M) por 5 minutos y agua desionizada por 2
minutos.
14. Para reutilizar las placas se las debe limpiar dl gel y dejarlas por 1 hora en una
solución de Hidróxido de Sodio 2.5M al 10%, luego lavarlas con abundante agua
desionizada y secarlas con papel.
15. Proceder a la lectura de la placa

PROTOCOLO ALTERNATIVO – TINCION CON PLATA

(Adaptado de Corach D y cols. 1999)

Revelado:

1. Separar las placas, observando que el gel se adhiere a una de ellas ( la más corta).
2. Colocarla en 1 litro de Solución Detenedora, con 20 minutos de agitación.
3. Lavar 3 veces con agua bidestilada (2 minutos cada uno), escurriendo bien cada vez.
4. Agregar la Solución de Tinción, agitando durante 30 minutos.
5. Lavar el gel muy brevemente, durante no más de 5 segundos, con agua bidestilada y
agregar la mitad de la Solución Reveladora.
6. Agitar hasta que las bandas comiencen a hacerse visibles.
7. Descartar el líquido y agregar la otra mitad de la Solución Reveladora. Dejar 2 ó 3
minutos y descartar.
8. Lavar con agua bidestilada 2 minutos y agregar 1 litro de la Solución Detenedora.
9. Lavar el gel dos veces con agua bidestilada 2 minutos y secar.
10. Fotocopiar con láser color, fotografiar o tomar un scanner para almacenar los
resultados.

LECTURA DE LAS PLACAS

Tras el revelado se observan un conjunto de dobles bandas correspondientes a los

láderes alélicos y a las muestras analizadas.
La lectura de los alelos en las muestras amplificadas se realiza por comparación visual
con los láderes alélicos.
Las muestras pueden expresar una doble banda (homocigotos para ese marcador) o 2
bandas dobles (heterocigotos).
Comprobar que el control negativo no ha amplificado y por lo tanto, no aparece en su
calle de migración ningún tipo de banda, caso contrario, se tratará de contaminación.
Verificar que el control positivo se corresponda con el esperado.
Recordar que en cada placa existirán carriles con las muestras de estudio, con los
láderes alélicos (escaleras de alelos), con los marcadores de peso molecular y con los
controles internos y externos.

OJO! INSERTAR GRAFICO 1

Protocolo C5:
PURIFICACION DEL ADN EXTRAIDO
Técnicas Instrumentales en Genética Forense | Fabricio González Andrade & Begoña Martínez Jarreta ©
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Existen varios métodos utilizados:

1. Filtración a través de membranas (Micropure), seguido de un sistema de diálisis

inversa (Microcon TM).
2. Se basa en la fijación de ADN a una resina (Tiocianato de Guanidina), la limpieza con
Isopropanol y la posterior elusión con agua (Clean Up)
3. Sucesivas extracciones del ADN en disolventes orgánicos (fenol, cloroformo, alcohol
isoamílico).

MICROPURE / MICROCON TM

1. Colocar la fase acuosa en el reservorio del Micropure y centrifugar 10 minutos a

13.000 rpm. Recuperar el filtrado y continuar hasta filtrar toda la fase acuosa. Este
sistema retiene las partículas de alto PM, filtrando el ADN.
2. Colocar el filtrado en el reservorio del Microcon, centrifugar 20 minutos a 2.800 rpm,
descartando la fase acuosa, pasar el total del volumen por el Microcon.
3. Lavar el ADN con agua 3 o 4 veces, centrifugar 10 minutos a 2.800 rpm.
4. Resuspender el ADN: colocar 20 a 30 ul de agua en el reservorio del Microcon e
invertirlo en un tubo limpio, centrifugar 10 minutos a 2.800 rpm.

CLEAN-UP© (Promega Corporation)

1. Armar el dispositivo de purificación: ensamblar la Minicolumna con la jeringa y luego

insertarlo en el sistema de vacío.
2. Mezclar la muestra (50 a 500 ul) con 1 ml de la resina, agitar bien.
3. Colocar la mezcla en la jeringa y aplicar vacío, hasta que se distribuya en la
Minicolumna, luego interrumpir el vacío.
4. Lavar la Minicolumna con 2 ml de Isopropanol, aplicando vacío, hasta que se seque.
Evitar que la columna se seque por más de 30 segundos.
5. Colocar la Minicolumna en un Eppendorf limpio de 1,5 ml y descartar la jeringa.
Centrifugar la columna por 2 minutos a 10.000 rpm, para eliminar el exceso de
Isopropanol de la columna.
6. Colocar la Minicolumna en un tubo limpio de 1,5 ml y agregar 5º uL de agua
precalentada a 65-70°C, esperar 1 minuto. Centrifugar la Minicolumna por 20
segundos a 10.000rpm.

MICROSPIN

1. Columnas en vórtex, con plata en vórtex

2. Retirar el seguro (culete), luego abrir el tapón sin quitarlo. Poner el Eppendorf con la
muestra en su interior.
3. Centrifugar 1 minuto a 3.000 rpm.
4. Cambiar a nuevo Eppendorf y poner toda la muestra encima de la recina.
5. Centrifugar 2 minutos a 3000 rpm sin tapar.
6. La muestra purificada es la que obtenemos en el Eppendorf.

CENTRICON® (Amicon, Inc.)

1. Poner la muestra en la columna, sellar con parafilm. Centrifugar 5 minutos a 5.000

rpm. Vaciar la parte inferior.
2. Poner 500 ul de agua y volver a centrifugar. Hacer 2 a 3 veces este paso.
3. Dar la vuelta, encajar el tubo Eppendorf en la columna y ponerlo 1 minuto a la
velocidad máxima. Luego tapar el tubo pequeño.
4. Diluir a 5 ng/ml y cuantificar.

Guardar todos los productos amplificados en los procesos a - 20°C a oscuras, caso
contrario se producirán productos de degradación.

PREPARACION DE REACTIVOS PARA CUANTIFICACION Y PURIFICACION

Tampón de electroforesis Geles de Agarosa

Tris + ácido acético + EDTA (TAE)

Tampón TAE 1X 20 ml de TAE 50 X + 980 ml de agua destilada

Tampón TAE 50X 242 gs. Tris base + 57,1 ml de ácido acético
glacial + 100 ml de EDTA stock, pH 8. Se debe
añadir Tris base y EDTA con 500 ml de agua
destilada, luego poner ácido acético y llevar a un
litro de disolución.

Tampón de electroforesis Geles de acrilamida

Tris + ácido bórico + EDTA (Buffer 10 x TBE), a
pH 8.3.

Tampón TBE 10X Tris Base 0,089 M

Acido Bórico 0,089 M
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EDTA 0,002 M
Disolver 107.8 gs. de Tris Base, y 7,44 gs. de
EDTA en 800 ml de agua desionizada.
Lentamente añadir el Acido Bórico (55 gs) hasta
conseguir un pH de 8.3. Llevar el volumen final
hasta 1000 mL, conservar a temperatura
ambiente.

Metanol al 40% 200 mL de Metanol + 300 mL de agua destilada

Ácido Nítrico 0,16M 5,5 mL de Ac. Nítrico + 495 mL de agua destilada

Nitrato de Plata 12 mM 1,5 g AgNO3 + 500 mL de agua destilada

Bicarbonato Sódico 0,28 M 15 g Na2CO3 + 500 mL de agua destilada, añadir

50 uL de Formaldehído al final.

Sosa caústica 100 gs de Sosa en 1 L de agua común.

Solución Stop Ácido acético 0,1 M (10%, 10 litros)

Ácido acético 0,1M 21 g de ácido (20 mL) + 1000 mL de agua

destilada.

SOLUCION DETENEDORA Ácido acético al 10%. Agregar 200 ml de ácido acético

glacial a 1800 mL de agua didestilada.

SOLUCION DE TINCION Disolver 1 g de Nitrato de Plata y 3 mL de Formaldehído

en 2 litros de agua bidestilada.

SOLUCION REVELADORA Disolver 60 gs de Carbonato de Sodio anhidro en 2 litros

de agua bidestilada y enfriar en la nevera.
Inmediatamente antes del uso, agregar 3 mL de
Formaldehído y 400 µL de Tiosulfato de Sodio (10
mg/mL). Preparar el Tiosulfato a partir de droga sólida en
el día, y descartar el remanente.

Solución de Carga (Stop Mix) Ficoll-400 al 5%, + Azul de bromofenol 0.1% + Xileno
Cianol 0.1% + EDTA 100 mM + Tris-HCl 10mM a pH 7.5

CAPITULO 4
AMPLIFICACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA PCR
En esta sección hablaremos sobre:

Amplificación de marcadores autosómicos monoplex (uniplex) para

secuenciación automática con ALF Express
Amplificación de marcadores en multiplex para tinción con Plata.
Amplificación para secuenciación automática de marcadores uniplex de
Cromosoma Y para secuenciador ALF Express
Amplificación para secuenciación automática de ADN mitocondrial para
secuenciación automática con ALF Express

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un proceso de amplificación selectiva y

enzimática, “in vitro”, de una secuencia de ADN de hasta 3 kb. La capacidad de
amplificación alcanza hasta más de 10+6 veces la secuencia original. Esta técnica descrita
por Kary Mullis en 1983, permite de forma teórica, la detección de una sola molécula de
ADN en la muestra problema a pesar de estar mezclada con otras moléculas de ADN
diferentes.

Es una técnica de gran especificidad y sensibilidad, pero a su vez puede dar origen a
falsos negativos, si no se tiene cuidado en el desarrollo de la técnica, al contaminarse la
muestra frecuentemente con ADN de amplificaciones anteriores.

Este proceso puede resumirse en varias etapas:

Desnaturalización de la doble hélice de ADN, mediante la aplicación de calor

Hibridación de las cadenas por separado con los cebadores.
Extensión del complejo cebador-ADN mediante la acción de la polimerasa.
Repetición de los ciclos de extensión hasta que se alcance la dimensión que se había
pautado.

Protocolo A1:
Amplificación de marcadores autosómicos monoplex para secuenciación
automática con ALF Express (Pharmacia®)

1. Marcadores autosómicos uniplex utilizados en el Laboratorio de Biología Forense de la

Universidad de Zaragoza:

Marcador Localización Descrito por

HUMTH01 11p15.5 Polymeropoulos y cols., 1991
HUMTPOX 2p25-2p24 Anker y cols., 1992
HUMvWA 12p13.3 Kimpton y cols., 1992
D18S535 18 Lareau y cols., 1998
D1S1656 1 Lareau y cols., 1998
D12S391 12p Lareau y cols., 1996

Existen otros muchos marcadores que se pueden analizar, el escogerlos dependerá de

cada laboratorio y de la facilidad para realizarlos. La lista de marcadores está descrita en
el capítulo 1.

2. Reactivos a utilizarse:

Solución Tampón: 10x Thermophilic Buffer que contiene 50 mM KCl (pH 9.0 a
25°C) 1% Triton X-100
MgCL2, 25 mM
dNTPs (Pharmacia): dATP, dGTP, dCTP, dTTP [100 mM]. Se preparan alícuotas
con 5 µL de cada dNTP a las que se añade 380 µL de agua desionizada.
Taq ADN polimerasa: Thermus aquaticus strain YT1 [5000 U / mL].

3. Preparación del Master Mix

5 µL ADN [25 ng].

2.5 µL Tampón
1.5 µM MgCL2
1 µL Primer 1 [0.25 mM] Ver concentración específica.
1 µL Primer 2 [0.25 mM]
4 µL dNTPs [200 µM]
1.25 µL Taq DNA polimerasa
8.75 µL Agua
25 µL Volumen de reacción total

Cada componente se multiplica por el número de muestras a procesar (n), se suma lo

equivalente a una muestra adicional del tubo control – blanco (b), y una muestra adicional
para equilibrar los errores de pipeteo al tomar cantidades tan pequeñas (e); asi:

Master Mix x n + b + e = volumen total a preparar

Dependiendo de la cantidad de la muestra se puede utilizar hasta 10 µL de ADN, para lo

cual habrá que ajustar la cantidad de agua a utilizarse.

4. Concentraciones de los Cebadores (primers)

Marcador Primer 1 Primer 2

HUMTH01 0.25 µM 0.28 µM
HUMTPOX 0.25 µM 0.28 µM
HUMvWA 0.25 µM 0.28 µM
D18S535 0.25 µM 0.25 µM
D1S1656 0.25 µM 0.25 µM
D12S391 0.25 µM 0.25 µM

5. Preparación de reactivos
Preparar los dNTP (1:80). Tomar 5 µL de cada nucleótido (A,T,G,C) + 380 µL de agua
destilada autoclavada, nos da un volumen final de 400 µL. Cada dNTP viene a una
concentracióm de 100 mM, se debe diluír a 1:80, quedará a 1,25 mM. Para amplificar
tomar 8 µL de la dilución 1.25 mM y la diluímos en 50 µL de agua, lo que nos dará una
dilución de 50:8:6,25, que dividirá la dilución inicial en 1.25 mM:6.25 = 0,2 mM ó 200 µM.

Preparar los Primers. Diluir el polvo liofilizado en 1 mL de agua destilada estéril y según
los nM sabremos la concentración de la disolución madre. Siguiendo un razonamiento
matemático similar al final tomamos 2 µL del Primer 1 en 50 µL de dilución final. La
concentración final deberá ser de 25 µM . Aplicar la fórmula

Concentración de X = 25/1 = 0,25 µM,

Concentración de X = 0,25 x 25 = 6.25.

A partir de la disolución madre del Primer 1 tengo que hacer una dilución que dé como
resultado una concentración de 6,25 µM (porque al tomar 1 µL de esta disolución en 25
µL de volumen final dejaré al Primer 1 a una concentración de 0.25 µM).

La dilución es X = dilución madre/ 6,25.

Ejemplo: TH01 P1 30 µM. X = 30/6,25 = 4,8. Por lo tanto, tomamos 10 µl de P1 + 38 µL de

agua destilada, lo que nos dará un volumen final de 48 µL.

6.Condiciones de Amplificación. En nuestro laboratorio usamos un termociclador

GeneAmp System 2400® (PE Biosystems, USA) pero se puede utilizar generaciones
mayores de termocicladores.

Pre No. Desnaturalización Acoplamiento Extensión

desnaturalización Ciclos (calentar a...) (enfriar a...) (Incubar a...)
94°C por 2 minutos 30 94°C por 45 segundos 60°C por 1 minuto 72°C por 1 minuto
Conservación final hasta su procesamiento a 4° C.

7. Los productos de la amplificación se observan en el programa de análisis de

fragmentos del secuenciador automático ALF Express (Pharmacia®)

Protocolo A2
Amplificación de marcadores multiplex para secuenciación manual y tinción con
Plata (Promega®).

1. Marcadores autosómicos Multiplex utilizados en el Laboratorio de Biología Forense de

la Universidad de Zaragoza:

Sistema Marcadores
CTT triplex HUMCSF1PO – HUMTPOX – HUMTH01
FFV triplex HUMF13A01 – HUMFES/FPS – HUMvWFA31
Silver STR triplex D16S539 – D13S317 – D7S820

Marcador Localización Descrito por:

HUMCSF1PO 5q33.3-5q34 Edwards y cols., 1991
HUMTH01 11p15.5 Polymeropoulos y cols., 1991
HUMTPOX 2p25-2p24 Anker y cols., 1992
HUMF13A01 6p24-25 Polymeropoulos y cols., 1991
HUMFES/FPS 15q25-qter Polymeropoulos y cols., 1991
HUMvWA 12p13.3 Kimpton y cols., 1992
D7S820 7q11.21-q22 Green y cols., 1991
D13S317 13q22-q31 Hudson y cols., 1995
D16S539 16q24-qter Garofano y cols.,1998; Entrala y cols., 1999
Recordar que la tasa de mutuación paterna de algunos marcadores puede afectar los
resultados. Citamos algunas de ellas (Baird M, 2000):

Marcador Tasa (%)

VWA 0.378
D7S820 0.192
D13S317 0.174
D18S535 0.076
FES/FPS 0.069
TPOX 0.049
TH01 0.026

2. Preparación del Master Mix

5 µL ADN [25 ng].
2.5 µL Tampón STR 10 X

2.5 µL Cebador locus especiífico 10x

0.15 µL Taq DNA polimerasa [5 U/µL].
17.35 µL Agua estéril
22.5 L Volumen de reacción total

Cada componente se multiplica por el número de muestras a procesar (n), se suma lo

equivalente a una muestra adicional del tubo control – blanco (b), y una muestra adicional
para equilibrar los errores de pipeteo al tomar cantidades tan pequeñas (e); asi:

Master Mix x n + b + e = volumen total a preparar

Dependiendo de la cantidad de la muestra se puede utilizar hasta 10 µL de ADN, para lo

cual habrá que ajustar la cantidad de agua a utilizarse.

4. Condiciones de Amplificación. Utilizar un termociclador GeneAmp System 2400® (PE

Biosystems, USA) o versiones mayores.
CTT Triplex
Pre desnaturalización No. Desnaturalización Acoplamiento Extensión
Ciclos (calentar a...) (enfriar a...) (Incubar a...)
96°C por 2 minutos 10 94°C por 1 minuto 64°C por 1 minuto 70°C por 90 segundos
20 90°C por 1 minuto 64°C por 1 minuto 70°C por 90 segundos

FFV Triplex
96°C por 2 minutos 10 94°C por 1 minuto 64°C por 1 minuto 70°C por 90 segundos
20 90°C por 1 minuto 64°C por 1 minuto 70°C por 90 segundos

Silver STR Triplex

96°C por 2 10 default ramp 94°C por 68 seg a 60°C 30 seg 50 seg a70°C 90 seg
minutos 30 segundos
20 default ramp 90°C por 60 seg a 60°C 30 seg 50 seg a 70°C 45 seg
30 segundos
Extensión final 60°C por 30 minutos

5. Lectura de productos. Realizar electroforesis en geles de poliacrilamida y tinción con

Plata, para luego proceder a la valoración de los alelos amplificados y coloreados.

Protocolo A3:
Amplificación de marcadores gonosómicos del Cromosoma Y, uniplex para
secuenciación automática con ALF Express (Pharmacia®).

1. Marcadores autosómicos uniplex utilizados en el Laboratorio de Biología Forense de la

Universidad de Zaragoza:

Marcador Localización Descrito por

DYS19 pY Roewer y cols., 1992
DYS385 qY Kayser y cols., 1997; Schneider y cols., 1998
DYS388 qY Deka y cols., 1996

DYS389 I y II qY De Kniff y cols., 1997

DYS390 qY De Kniff y cols., 1997
DYS391 qY De Kniff y cols., 1997
DYS392 qY De Kniff y cols., 1997
DYS393 qY De Kniff y cols., 1997

Para que los marcadores puedan alcanzar un poder discriminativo de 0.99 se requiere el
análisis de mínimo 9 STRs, como los que analizamos. (Ricci U y cols., 2000)

2. Reactivos a utilizarse:

Solución Tampón: 10x Thermophilic Buffer que contiene 500 mM KCl y 1% Triton
X-100
MgCL2, 25 mM
dNTPs [200 µM]: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 100 mM en agua. Se preparan
alícuotas con 5 µL de cada dNTP a las que se añade 380 µL de agua desionizada.
Taq ADN polimerasa: Thermus acuaticus strain YT1 [5000 U / mL].

3. Preparación del Master Mix

5 µL ADN [25 ng].

2.5 µL Tampón
1.5 µL MgCL2
1 µL Primer [0.25 µM] Ver concentración específica para cada uno.
4 µL dNTPs [200 µM]
0.65 UL Taq DNA polimerasa
9.75 µL Agua
25 µL Volumen de reacción total

Cada componente se multiplica por el número de muestras a procesar (n), se suma lo

equivalente a una muestra adicional del tubo control – blanco (b), y una muestra adicional
para equilibrar los errores de pipeteo al tomar cantidades tan pequeñas, como
describimos previamente.

4. Concentraciones del Cebador (primer) y de la Taq DNA polimerasa

Marcador Primer Taq Polimerasa

DYS19 0.50 µM 2U
DYS385 0.25 µM 1U
DYS388 0.20 µM 0.65 U
DYS389 0.50 µM 1U
DYS390 0.25µM 0.65 U
DYS391 0.20 µM 0.65 U
DYS392 0.25 µM 0.65 U
DYS393 0.25 µM 0.65 U

5. Condiciones de Amplificación

Utilizar un termociclador GeneAmp System 2400® (PE Biosystems, USA) o versiones

mayores, ver cuadro A3

6. Productos de la amplificación: se observan en el programa de análisis de fragmentos

del secuenciador automático ALF Express (Pharmacia®).

Varios autores han descrito ensayos con múltiples marcadores. A continuación citamos
algunos de ellos como fuente de consulta y por si hay interés en aplicarlos.

Ensayo Marcadores Autores

Quadruplex DYS19, DYS389 I, DYS389 II, DYS 390 Prinz y cols.,1997
Triplex DYS391, DYS392, DYS393 Kayser y cols., 1997
Quadruplex DYS390, DYS391, DYS393, DYS394 Redd y cols., 1997
Quintuplex DYS19, DYS389 I y II, DYS390, DYS 393 Gusmao y cols., 1997
6 – plex DYS434, 435, 436, 437,438, 439 Ayub y cols., 2000

Protocolo A4:
Amplificación del d-loop del ADN mitocondrial

Las regiones que se amplifican son:

Región control desde el nucleótido L-15996 hasta H-408 (Vigilant y cols., 1989)
HV I desde L-15996 hasta H-16401 (Vigilant y cols. 1989)
HV II desde L-29 hasta H-408 (Wilson y cols., 1993)

Reactivos a utilizarse:

Solución Tampón: Tris HCl 10 mM (pH 8.3)

MgCL2, 1.5 mM
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KCl 50 mM
5 pmol de cada Primer (0.2 µM)
4 µg de BSA (Sigma)
dNTPs [200 µM]: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 100 mM en agua. Se preparan
alícuotas con 5 µL de cada dNTP a las que se añade 380 µL de agua desionizada
estéril.
5U Taq ADN polimerasa: Thermus acuaticus strain YT1 [5000 U / mL].
1 µL de ADN extraído. En muestras difíciles se puede utilizar entre 7 a 9 µL por
muestra.

1ª. Amplificación – región control, desde el nucleótido L-15996 hasta H-408

Master Mix

5 µL ADN [5 ng/mL].
2.5 µL Tampón
1.5 µL MgCL2
1 µL Primer 1 (1 pmol/µL)
1 µL Primer 2 (1 pmol/µL)
1 µL dNTPs [200 µM] dilución 1:60
0.5 µL Taq DNA polimerasa
12.5 µL Agua
25 µL Volumen de reacción total

Llevar al termociclador. Utilizar un termociclador GeneAmp System 2400® (PE

Biosystems, USA) o versiones mayores.

No. Ciclos Desnaturalización Acoplamiento Extensión

32 Calentar 95º C por 1 minuto Enfriar a 55º C por 1 Incubar a 72º C por 1 minuto
minuto

Verificar la PCR con un gel de agarosa.

2ª. Amplificación.

Desde el nucleótido L-15997 hasta H-16401. Este último va marcado con Cy5*.

Master Mix

1 µL ADN (dilución de 1:100)

2.5 µL Tampón
1.5 µL MgCL2
2.5 µL Primer 1 (1 pmol/µL) L15996
2.5 µL Primer 2 (1 pmol/µL) H16401*
1 µL dNTPs [200 µM] dilución 1:60
0.5 µL Taq DNA polimerasa
12.5 µL Agua
25 µL Volumen de reacción total

Llevar al termociclador. Utilizar un termociclador GeneAmp System 2400® (PE

Biosystems, USA) o versiones mayores.

No. Ciclos Desnaturalización Acoplamiento Extensión

32 Calentar 95º C por 1 minuto Enfriar a 60º C por 1 Incubar a 72º C por 1 minuto
minuto

Cuantificar el producto obtenido en un gel de Agarosa.

3ª. Amplificación.

Desde el nucleótido H-408. hasta L-29 Este último va marcado con Cy5*.

El Master Mix es igual al anterior.

Llevar al termociclador. Utilizar un termociclador GeneAmp System 2400® (PE

Biosystems, USA) o versiones mayores.

No. Ciclos Desnaturalización Acoplamiento Extensión

1 Calentar 95º C por 1 minuto
32 Calentar 95º C por 1 minuto Enfriar a 60º C por 1 Incubar a 72º C por 1 minuto
minuto
1 Enfriar a 15º C por 10 minutos

Cuantificar el producto obtenido en un gel de Agarosa.

Se debe purificar con Microspin S-200 antes de secuenciar.

Los productos de la amplificación se observan en el programa de análisis de fragmentos

del secuenciador automático ALF Express (Pharmacia).

CAPITULO 5
SECUENCIACION AUTOMATICA DE FRAGMENTOS DE ADN
En esta sección trataremos dos aspectos:

Detección automática de fragmentos marcados con fluorescencia para

microsatélites autosómicos y gonosómicos
Secuenciación automática del d-loop mitocondrial con el kit Fentomol®
(Promega)
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Protocolo S1:
DETECCIÓN AUTOMÁTICA DE FRAGMENTOS MARCADOS CON FLUORESCEÍNA

El secuenciador automático (ALF DNA Sequencer, Pharmacia Biotech) mide y cuantifica

los STRs (autosómicos o gonosómicos) por detección automática de fluorescencia con el
programa de análisis de fragmentos (Fragment Manager). Se deben utilizar fluorocromos
que marcan los cebadores en su estremo 5´.

PREPARACIÓN DE LAS PLACAS

1. El equipo trae dos placas de vidrio templado, una de ellas es termostática. Según el
tamaño permiten realizar electroforesis con recorridos de 8 a 20 cm.
2. Limpiar cada placa con Etanol, agua desionizada y secar con papel.
3. Colocar una solución adherente fresca en el extremo superior de ambos vidrios, Añadir
la solución a un papel secante (Kinwipe®) y aplicar ésta en los 5 cm superiores de
ambas placas, recorriéndolas de un extremo a otro de las placas.
4. La solución adherente se elabora con: 1 mL de Etanol absoluto, 250 µL de Ácido
Acético al 10% y 3.75 µL de Bind Silane
5. Aclarar con agua destilada y secar con papel secante (Kinwipe®)
6. Pasar un papel por las placas desde la zona no tratada con Bind Silane a la tratada,
tirando el papel.
7. Colocar los separadores sobre las muescas de la placa termoestática. Poner la placa
de vidrio contactando los dos bordes silanizados, los separadores y el peine. Utilizar el
peine de 0.3 a 0.5 mm.

PREPARACIÓN DEL GEL PARA ELECTROFORESIS.

Tenemos 2 alternativas a utilizar:

1. Ready Mix Gel, Pharmacia.

2. ReproGel High Resolution, Pharmacia

Ready Mix Gel, Pharmacia: producto comercial que al añadir Persulfato de Amonio al 10%
(APS) y distribuirlo entre ambas placas polimeriza en 2 horas. La solución de
electroforesis se prepara así:

Acrilamida 5.7%
Bisacrilamida 0.3%
Úrea 7M
Tris-borato 100 mM (pH 8.3)
Na2EDTA 1 mM
Tetrametietildiamida 3mM

ReproGel High Resolution, Pharmacia: trae dos soluciones que al mezclarse y ser
expuestas a la luz UV polimeriza en 10 minutos. Puede ser utilizado si el valor del láser
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permanece estable, por lo que se utilizan placas de 8 cm, con menor recorrido
electroforético.

PREPARACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA PCR

Preparación de marcadores de tamaño fluorescentes basados en M13.

a. El análisis de los fragmentos es una técnica muy extendida y estrechamente ligada al

tamaño de los marcadores utilizados como referencia. Moléculas de ADN con el mismo
tamaño, pueden mostrar diferente movilidad en función de la composición de nucleótidos
que constituyen estas moléculas. Los marcadores de tamaño derivados del M13, permiten
determinar los tamaños de las moléculas de ADN en un amplio rango de tamaño.

b. Para obtener marcadores derivados de M13, se han de generar productos de PCR con
el primer universal directo de M13 marcado con Cy5 y distintos primers reversos no
marcados, en función de los tamaños que se requieren.

c. Preparación de la muestra. Se han de combinar al menos 2 marcadores internos en

cada muestra, sus tamaños han de englobar a los tamaños esperados. Amplificar en
conjunto los productos de la PCR; agregar en cada tubo Eppendorf:

1.5 µL del producto amplificado (muestra o láder)

4 µL de tampón de carga (Stop Solution) formado por azul de dextrano 5 mg/mL en
formamida desionizada
1 µL de marcador interno de peso molecular de 114 pb.
1 µL de marcador interno de peso molecular de 402 pb..

d. Los marcadores internos de peso molecular derivan de una hebra de ADN del
bacteriófago M13mp18 (Pharmacia Biotech). Para amplificar usar 1 ng de M13, 10 pMoles
de cada cebador, en un volumen final de reacción de 50 µL.

e. Amplificar con el siguiente programa:

No. Ciclos Desnaturalización Acoplamiento Extensión

1 95º C por 2 minutos
25 95º C por 50 segundos 55º C por 40 segundos 72º C por 50 segundos
1 4º C hasta procesamiento

f. Antes de cargar en el gel desnaturalizamos conjuntamente los marcadores y la muestra.

g. En la siembra incluir dos calles con marcadores externos de peso molecular (Sizer 50-
500, Pharmacia Biotech). El marcador se prepara así: en un tubo de microcentrifuga,
mezclar 1 a 2 µL de ALFexpress sizer 50-500 y 3 a 4 µL de tampón TE. Luego, añadimos
3 µL de Stop Solution (azul de dextrano 5 mg/mL en formamida desionizada). Calentamos
la mezcla a 90º C, entonces la colocamos en hielo. En este momento esta listo para ser
cargado en el gel.

CONDICIONES DE LA ELECTROFORESIS.

Limpiar la placa en las muescas por donde pasa el APS con agua destilada.
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Poner la placa en el secuenciador.

Llenar los reservorios con 0,6xTBE (120 mL 10xTBE) y enrasar hasta los 2 litros con
agua destilada.
Controlar las condiciones del secuenciador

Voltaje: 1600 voltios (voltio/cm)

Intensidad: 38 mA
Potencia: 45 w
Temperatura: 55º C
Intervalo: 2 segundos
Tiempo: 5 horas en placas grandes

Preparar el ordenador y el equipo.

1. Encender el equipo e iniciar el ordenador

2. Quitar el peine y limpiar los pocillos.
3. Empezar a cargar cuando la temperatura este a 50º C.
4. Desnaturalizar y cargar las muestras con la misma punta, limpiando en el buffer.
5. Conectar los electrodos y cerrar el equipo.
6. Luego correr el programa.
7. No olvidar que se debe apagar sólo la pantalla y no el equipo
8. Concluída la electroforesis el láser, la fuente de alimentación, la luz y la
termostatización se desconectan automáticamente.
9. Se puede finalizar manualmente seleccionando en el ordenador.

LECTURA DE RESULTADOS
1. El tamaño de los microsatélites se determina automáticamente con el software ALFwin
Fragment Manager® (Pharmacia) que cuantifica el tamaño mediante comparación con
los marcadores de peso molecular.
2. El programa compara los láderes alélicos con los alelos resultantes.
3. El programa permite la visualización de los resultados en tres formas diferentes:
Modo Gel: imagen del recorrido electroforético de la placa.
Modo Curvas: permite visualizar la cantidad del producto amplificado y los alelos
tipados
Modo Tablas: interpretación numérica de los alelos al compararlos con los
marcadores de peso molecular.

Protocolo S2
Secuenciación del d-loop mitocondrial con el kit Fentomol® (Promega)
(Método de Sanger, 1977)

La preparación de las placas y del gel de secuenciación se lo realiza como lo describimos

previamente. Se debe secuenciar la Región Control entre las siguientes secciones::

HV I: H -16401 / L-15997
HV II: H-408 / L-29
HV II: A H-285 / L-45
B H-408 / L –172

1. Preparación de los productos de la PCR. El Master Mix se elabora con:

2 µL del “primer” marcado con fluoresceína

5 µL de DNA sequencing buffer
0.5 µL de Taq DNA polimerasa
4.5 µL de agua destilada
5 µL de ADN purificado
17 µL Total

2. Dividir del total 4 tubos con 4 µL de esta solución, luego agregar 2 µL de cada ddNTP
respectivo (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).

3. Amplificar con el siguiente programa

No. Ciclos Desnaturalización Acoplamiento Extensión

1 95º C por 3 minutos
10 95º C por 30 segundos 55º C por 30 segundos 70º C por 90 segundos
1 95º C por 5 minutos

4. A cada tubo con producto amplificado le añadimos 4 µL de tampón de carga (5 mg/mL

de Dextran Blue/Formamida). La Solución Stop se prepara con. Formamida
desionizada al 95%, Dextran Blue al 0.05% y EDTA 20 mM.
5. Para secuenciar se pueden utilizar los primers H16401 o L15996 marcados con Cy5
en su extremo 5´y/o L29 o H408 con Cy5.
6. Desnaturalizar las muestras por 5 minutos a 95º C. Luego, conservar en hielo hasta
ser cargadas en el gel del secuenciador automático.
7. Controlar las condiciones del secuenciador
Voltaje: 1500 voltios (voltio/cm)
Intensidad: 60 mA
Potencia: 25 w
Temperatura: 55º C
Tiempo: entre 5 y 8 horas en placas grandes

Protocolo alternativo A:
SECUENCIACION PARA HV II del ADN Mitocondrial (Budowle B, FBI, USA)

1. Partir del ADN extraído, cuantificado y diluido a 5 ng/µl.

2. Secuenciar la región HVII en dos partes: secuencia A (L-047 / H-285) y secuencia B

(L-172 / H-408). HVII A es una secuencia de 238 pb y la HVII-B de 236 pb.

3. Programar el termociclador. Hacer una sola amplificación a partir del ADN extraído.

No. Ciclos Desnaturalización Acoplamiento Extensión

1 95º C por 1 minuto
32 95º C por 10 segundos 60º C por 30 segundos 72º C por 30 segundos
1 15º C por 10 minutos

4. Preparar el Master Mix para la amplificación

a) Agua destilada 8,25 µL (huesos 1,25 µL)

b) Cl2 Mg 0,75 µL (50 mM Gibco)
c) Buffer 2,5 µL
d) Primer H 5 µL
e) Primer L 5 µL
f) dNTP 1 µL
g) Taq Polimerasa 0,5 µL (500 U Gibco)
h) ADN muestra 2 µL (huesos 9 µL)
Volumen Total 25 µL

5. Utilizar el mismo ADN para ambas reacciones.

Interpretación de los resultados de la Secuenciación Mitocondrial

RESULTADO INTERPRETACION
Secuencias idénticas Incluir, ambas muestras comparten la
línea materna
Una base heteroplásmica en ambas secuencias Incluir, ambas muestras comparten la
en la misma posición matrilínea
Una base heteroplásmica en una secuencia no Incluir, ambas muestras comparten la
observada en la otra matrilínea
Una base de diferencia, sin evidencia de Resultado no concluyente
heteroplasmia
Dos bases heteroplásmicas en ambas Incluir, ambas muestras comparten la
muestras, en las mismas posiciones matrilínea
Una base heterroplásmica en la misma Incluir, ambas muestras comparten la
posición, una base heteroplásmica en una matrilínea
muestra pero no en la otra, con un nucleótido
común en cada una
Una base heteroplásmica en la misma posición, Resultado no concluyente.
una base diferente a la otra sin evidencia de
heteroplasmia
Dos bases de diferencia, sin evidencia de Se excluye que ambas muestras
heteroplasmia pertenezcan a la misma línea materna

Haplotipo mitocondrial: secuencia completa de bases de las regiones I y II que definen

un linaje materno.

Haplogrupo mitocondrial: conjunto de mutaciones que definen un grupo de individuos que

las comparten.

Heteroplasmía: coexistencia en un mismo individuo de más de un tipo de ADN

mitocondrial.

CAPITULO 6
RECOMENDACIONES FINALES

En este capítulo estudiaremos:

Recomendaciones para evitar la contaminación

Como se prepara las disoluciones
Unidades de peso y sus equivalencias
Precauciones con los reactivos peligrosos
Principales páginas web de consulta

1. Recomendaciones básicas para el control de la contaminación

La CONTAMINACIÓN implica transferencia accidental de un ADN extraño a una muestra

problema. Muestra problema es aquella que pretendemos analizar. Esta situación puede
darse en dos momentos:

a. En el laboratorio donde veremos contaminación cruzada y,

b. Contaminación asociada a la escena del crimen.

La primera ocurre como resultado de transferir un ADN externo a una reacción

determinada, que resulta en una mezcla inexplicable o en un resultado confuso. La
posibilidad de este tipo de contaminación se minimiza al tomar las siguientes medidas:

1 El laboratorio debe tener un diseño interior en el cual exista separación física de los
procedimientos, con al menos 3 áreas separadas: una para la extracción de ADN, la
segunda para amplificación (de preferencia un cuarto aislado) y, una tercera, para el
análisis de los productos de la PCR. Mientras más aparataje mayores son las
necesidades de espacio físico.
2 Todo el personal que trabaje en el laboratorio (técnico, administrativo y
mantenimiento) debe estar genotipificado, de tal manera que se pueda comprobar la
existencia de contaminación por manipulación, en cualquier momento.
3 El personal técnico debe utilizar siempre material de protección como guantes de
látex, mascarilla, gafas de protección y mandil; tanto por evitar riesgo de infecciones
como por proteger las muestras de nuestro propio material genético.
4 Tratar siempre de trabajar con la menor cantidad de instrumental posible, mientras
menos instrumentos y material utilizado, esto incluye simplificar los procesos con
menos pasos, menor es el riesgo de contaminación de las muestras.
5 Durante la extracción de ADN utilizar una cámara de filtración de gases, con el fin de
evitar la contaminación aérea. Además, sirve para proteger al personal de posibles
inhalaciones tóxicas.
6 En todos los procesos realizar TUBOS BLANCO que se corren paralelamente a la
muestra problema, sin el ADN en estudio. Cuando se cuantifique por
espectrofotometría no debe existir presencia de ADN, aunque algunos autores
sugieren que se pueden aceptar cantidades aceptables mínimas de material genético
en el blanco, siempre y cuando no supere el 10% de la cantidad medida. Luego, de
amplificar, es deseable que tampoco exista material genético en los geles de agarosa.
Se recomienda repetir todos los procedimientos cuando sea necesario.
7 Incluir CONTROLES POSITIVOS en los geles. La amplificación positiva debería dar
una banda brillante en el gel de Agarosa. La ausencia de esta banda invalida todas las
muestras asociadas al set de amplificación. Repetir el procedimiento cuando sea
posible.
8 Incluir también CONTROLES NEGATIVOS. Como en el numeral anterior pero no
debe haber amplificación del control. Si se observa una banda no necesariamente se
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invalida el estudio. Se debe secuenciar la muestra para determinar el origen de la

contaminación y evidenciar los posibles errores. Repetir la amplificación cuando sea
necesario.
9 Cuando se amplifica no deben transcurrir más de 30 minutos desde que se prepara el
master mix hasta llevar las muestras al termociclador. Al contrario, todos los procesos
llevan un tiempo determinado, el hacer las cosas muy rápidamente puede
desembocar en errores de contaminación.
10 No trabajar con grandes disoluciones, mientras más pequeñas las cantidades con las
que se trabaje menores riesgos de contaminación.
11 Tratar e evitar los errores de pipeteo, cuando los volúmenes son demasiado pequeños
agrandar el número de muestras.
12 No utilizar toda la muestra original, guardar un poco por si se necesita en lo posterior.

La contaminación asociada al crimen puede ocurrir por dos maneras:

Transferencia pasiva, condición producida por una transferencia accidental de ADN

externo a la muestra problema, que podría estar restringida al período inmediato luego de
suscitado el crimen; un ejemplo, durante la recolección de las muestras por el personal de
investigadores. Este tipo de transferencia puede deberse a la presencia externa de saliva,
estornudos, tos, sudoración, transpiración, manipulación durante su transporte, entre otros
posibles eventos. Es una situación inusual pero que puede ocurrir; se conoce que la
cantidad de ADN transferido es muy bajo.

Transferencia relevante al caso, ocurrida en ese sutil período de tiempo donde se

perpetra un hecho criminal y cuando se está en contacto con el sospechoso, aunque no
necesariamente se restringe tan sólo a esa etapa. En esta situación, durante la tipificación
de perfiles genéticos, y en particular cuando se trata de manchas, podemos obtener un
perfil diferente al sospechoso. Debido a esto necesitamos considerar las implicaciones de
la presencia de una cantidad de ADN desconocido, el cual hace también sospechosa a la
víctima. Tenemos dos posibilidades:

1. Que el ADN que fue transferido durante el curso del crimen sea de un perpetrador
diferente al sospechoso, o
2. Que al ADN fue transferido antes o después del crimen y que por lo tanto, fuera de
otro individuo.

Para resolver este problema inicial podemos tipificar el sustrato como un control negativo.
El SUSTRATO es una zona adyacente al área del crimen, periférica, limitada por un fluido
corporal dado. Al analizar esta zona, que podría ser de algún tipo de tejidos, podríamos
encontrar:

1. Un perfil genético igual al del sospechoso con lo cual resolvemos el problema,

2. En su defecto no encontrar nada que también resuelve el asunto,
3. Por el contrario, encontrar nuevamente un perfil genético distinto al del
sospechoso. En la práctica, nos volvemos a encontrar ante dos condiciones, que
el ADN encontrado sea de un perpetrador desconocido al crimen o, que el perfil
resulte de la transferencia pasiva de cualquier otro individuo desconocido, que será
inocente.

Ante este dilema podemos inferir dos conclusiones: primera, si los resultados han ocurrido
como resultado de una transferencia pasiva entonces la evidencia todavía apoya la
hipótesis que el ADN actualmente originado sea del sospechoso, aún bajo las
Técnicas Instrumentales en Genética Forense | Fabricio González Andrade & Begoña Martínez Jarreta ©
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62

circunstancias asociadas al hecho. Segunda, si la mancha de la muestra problema

analizada ha sido de esperma, sangre o saliva, debemos realizar nuevas pruebas para
reconfirmar cual es el tipo biológico de fluido que estudiamos. De esta manera, al no
coincidir el tipo de fluido de la mancha con el de la muestra problema, descartaríamos al
individuo inocente.

CONCLUSIÓN
Generalizar es siempre difícil porque las circunstancias de cada caso son diferentes. La
evidencia es solamente útil si es relevante al caso. No olvidar que en criminalística
siempre existe la posibilidad de transferencia pasiva o de transferencia de un individuo
ajeno al hecho, y que desde luego será inocente. Simplemente porque el perfil del ADN
concuerda con un sospechoso, no significa que haya sido transferido durante el curso del
crimen.

2. Preparación de Disoluciones

Una disolución se forma por la interposición de las partículas de una sustancia en el seno
de la otra. Así podemos distinguir una fase continua, llamada dispersante o disolvente, y
una fase dispersa o soluto. La extensión en la que se disuelve el soluto en el disolvente
será la solubilidad, de manera que una disolución saturada es aquella en la que nos e
puede disolver más soluto.

La concentración de las disoluciones puede ser expresada como porcentajes de soluto en

el disolvente, expresados en peso, volumen o peso a volumen, molaridad y normalidad.

El porcentaje en peso (p:p) es el número de gramos de soluto por cada 100 gramos de
disolución. El porcentaje en volumen (v:v) es el número de mililitros de soluto en 100 mL
de disolución. El porcentaje mixto, peso a volumen (p:v) es el número de gramos de
soluto en 100 mL de disolución.

La Molaridad de una disolución o su concentración molar (M), se define como el número

de moles de soluto por litro de disolución, así:

M= moles de soluto__
1 litro de disolución

número de moles = gramos de soluto

Peso Moleculat

La Normalidad de una disolución es el número de equivalentes del soluto por litro de

disolución. El número de equivalentes se calcula dividiendo el peso molecular de una
sustancia por su valencia.

La Molalidad se define como el número de moles de soluto en 1000 g de disolvente. Es

independiente de la temperatura. La relación entre molaridad y molalidad viene dada por
la densidad de la disolución.

Molalidad = g / PM____
Kg disolvente

En disoluciones acuosas diluídas la molaridad y la molalidad son aproximadamente

iguales, ya que 1 litro de disolución acuosa será aproximadamente a 1 Kg de agua.

En nuestro trabajo debemos seguir los siguientes pasos:

A. Todos los productos deben ser diluídos a una concentración de 5 ng/µL para poderlos
amplificar según los protocolos.

B. Es importante hacer toda la dilución de una vez para evitar errores y luego alicuotar las
diluciones, de tal manera, que al hacer la primera amplificación si descubrimos que
está contaminada, la desechamos y utilizamos la reserva.
C. Trabajaremos con un volumen suficiente de dilución (200 a 300 µL) para tener
suficiente ADN en todas las amplificaciones. Es importante tomar por lo menos 3 µL de
la muestra original, ya que pudo perderse ADN al pipetear.

D. La fórmula básica para las diluciones es:

ng / µl = µg / mL

E. Tras las diluciones hay que usar el Vórtex (dar golpecitos con los dedos) y luego SPIN
para homogenizar la muestra.

F. En las diluciones hay que utilizar agua desionizada autoclavada.

G. A partir de todas las diluciones hechas se puede tomar 1 uL de ADN que tendrá la
misma concentración siempre, 5 µg / mL.

H. Se puede diluír en dos formas:

- A la concentración original
- A la concentración requerida en el protocolo (5 ug/mL)

I. No se recomienda trabajar con soluciones muy concentradas porque son muy

viscosas, y pueden dar errores de volumen al pipetear.

3. Unidades de peso y sus equivalencias

Recordad las equivalencias de las fracciones las unidades básicas de peso, de acuerdo al
Sistema Internacional de Unidades:

a, atto 1 ag equivale a 10-18

f, femto 1 fg equivale a 10-15
p, pico 1 pg equivale a 10–12
µ, micro 1 µg equivale a 10-6
m, nano 1 ng equivale a 10–9
m, mili 1 mg equivale a 10–3
c, centi 1 cg equivale a 10-2
d, deci 1 dg equivale a 10-1
g, gramo 1 g equivale a 1

3. Reactivos peligrosos en el Laboratorio

Estar muy atento al manejo de los siguientes reactivos, el contacto con ojos, piel y otras
zonas del cuerpo puede ser muy PELIGROSO.

REACTIVO EFECTO
Ácido acético (Solución Stop) Corrosivo, higroscópico
Acrilamida Carcinogénica y tóxica
Persulfato de Amonio Oxidante, corrosivo
Bisacrilamida Tóxico, irritante
Formaldehído Altamente tóxico, carcinogénico
Formamida Irritante, teratogénico
Bind Silane Tóxico, causa hipersensibiidad
Tiosulfato sódico Irritante, higroscópico
TEMED corrosivo, inflamable
Urea Irritante
Xilencianol Irritante

5. Información adicional sobre las Base de Datos.

Portal de Peter de Kniff sobre STRs del cromosoma Y:

http://www.ruly70.medfac.leidenuniv.nl/~fldo/hptekst.html

Base de datos de Haplotipos Y

http://ystr-charite.de

Base de datos de STRs:

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase

Base de datos de ADN mitocondrial

http://mitomap.html

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