Arencibia DF, Rosario LA, Gámez R.
Métodos Generales de Conservación de
Microorganismos.
2008
I Taller Científico de los Laboratorios LIORAD, VI Taller de Colecciones de Cultivos
Microbianos y otros
Materiales Biológicos. Finlay Ediciones, 2008.
ISBN: 978-959-7076-20-9.
(PDF) Métodos generales de conservación de microorganismos. Available from:
[Link]
_de_microorganismos [accessed Oct 18 2018].
Arencibia DF, Rosario LA, Gámez R. Métodos Generales de Conservación de
Microorganismos.
2008
I Taller Científico de los Laboratorios LIORAD, VI Taller de Colecciones de Cultivos
Microbianos y otros
Materiales Biológicos. Finlay Ediciones, 2008.
ISBN: 978-959-7076-20-9.
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Métodos generales de conservación de microorganismos
Autores: Daniel Francisco Arencibia Arrebola1, Luis Alfredo Rosario Fernández2,
Rafael Gámez Menéndez1.
Instituciones: Centro de Productos Naturales (CPN, CNIC)1, Centro de Química
Farmacéutica (CQF)2.
Dirección del Correo Electrónico: cpn@[Link]
Resumen:
En la actualidad las potencialidades de los microorganismos son explotadas en diversos
sectores de la economía y la salud, de ahí la importancia de contar con colecciones bien
conservadas que cumplan las premisas de un buen proceso de conservación; que el cultivo a
conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las
células y que estas células permanezcan genéticamente estables.
Hasta la fecha se han descrito diversos métodos de conservación, con los cuales se trata de
mantener el cultivo viable y con un mínimo de cambios genéticos, lo más cercano posible
al aislamiento original. En este trabajo se discuten los principios, ventajas y desventajas de
cada uno de ellos y las posibilidades de instrumentación en los diferentes laboratorios de
acuerdo a las posibilidades económicas del mismo y a las características del
microorganismo, lo que lo convierte en un material de consulta primaria para el
entrenamiento del personal con escasa o ninguna formación al respecto. Se hace alusión a
los métodos de conservación, tales como métodos de elección o de conservación a largo
plazo, métodos a corto plazo y por último los métodos alternativos, además se realiza un
breve comentario sobre el recobrado de las células.
(PDF) Métodos generales de conservación de microorganismos. Available from:
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_de_microorganismos [accessed Oct 18 2018].
rencibia DF, Rosario LA, Gámez R. Métodos Generales de Conservación de
Microorganismos.
2008
I Taller Científico de los Laboratorios LIORAD, VI Taller de Colecciones de Cultivos
Microbianos y otros
Materiales Biológicos. Finlay Ediciones, 2008.
ISBN: 978-959-7076-20-9.
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Introducción
El uso de los microorganismos ha sido clave en el enfrentamiento y solución de los graves
problemas de la
humanidad en la agricultura y la alimentación de los pueblos, en la salud animal y humana,
en la búsqueda
de nuevas fuentes de energía y en la conservación del medio ambiente.1 El estudio de
microorganismos aún
en laboratorios con escasos recursos, involucra frecuentemente el uso de cultivos vivos.
Estos necesitan ser
viables al menos durante el estudio y los experimentos, y si se prueba su importancia
deberán ser
mantenidos y conservados en una colección de cultivos microbianos para garantizar su
disponibilidad.2
Los microorganismos para su estudio primeramente son aislados de su ambiente natural,
seguidamente son
conservados en colecciones de cultivos donde pasan a constituir el material de trabajo para
estudios futuros,
constituyendo un inestimable fondo genético.3
Los objetivos del trabajo con microorganismos pueden ser variados, y pueden incluir
investigaciones
medioambientales, taxonómicas, agrícolas y biomédicas e industrial.4 La conservación ex
situ de todos los
microorganismos aislados, estudiados y reportados en la literatura científica, es
fundamental para el
progreso de la ciencia. La ambigüedad asociada al reaislamiento subraya la necesidad de
hacer depósitos de
microorganismos en una colección de cultivos, que proporcione servicio de conservación
experimentada,
rápido acceso y la provisión de una cepa de referencia única y conservada. Sin esto, los
científicos
necesitarían llevar a cabo constantemente el costoso proceso de caracterización e
identificación al inicio de
cada nuevo estudio.5
Los cultivos de microorganismos con determinadas características son esenciales para la
mayoría de los ensayos microbiológicos. Los cultivos de referencia o controles son
utilizados en un amplio número de determinaciones, debido a que no pueden obtenerse
resultados válidos si no se trabaja con cultivos de alta calidad. Por todo esto una colección
de cultivos bien mantenida es un requisito indispensable para las buenas prácticas del
laboratorio.4 Los microorganismos tienen una tendencia inherente a mutar en cultivos de
laboratorio, por lo que es muy importante el uso de procedimientos para mantenerlos
viables y genéticamente estables.
La conservación de microorganismo de interés industrial es una técnica básica en todo el
proceso. La conservación ha de estar encaminada al mantenimiento de las cepas altamente
productivas durante largos períodos de tiempo sin que se produzcan cambios fenotípicos,
especialmente en las características relacionadas con la producción de los metabolitos
secundarios de interés.6
Para lograr estas condiciones se han establecido varios métodos de preservación con los
cuales se trata de mantener el cultivo viable y con un mínimo de cambios genéticos, lo más
cercano posible al aislamiento original. La mayoría de los métodos de preservación logran
reducir el ritmo metabólico de los organismos
por retención de nutrientes, agua y oxígeno; por reducción de la temperatura de
conservación; o por
combinación de ambos.7
Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas
en los
laboratorios de microbiología son: que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se
produzcan
contaminaciones durante el proceso de conservación; que durante el tiempo de
conservación sobrevivan al
menos el 70-80% de las células, y por último, que estas células permanezcan genéticamente
estables. Los
dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica
microbiológica,
pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios
métodos de
conservación para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilización general.8
Debido al alto costo de las cepas de referencia y de los equipos utilizados en la
conservación de
microorganismos es necesario que cada laboratorio entrene a su personal para desarrollar
sus propias
colecciones de forma que estas cumplan con los principios de conservación planteados
anteriormente. Esta
revisión pretende ser un material de consulta primaria que permita determinar a los
investigadores que
métodos de conservación utilizar en función de las características del microorganismo y las
posibilidades
económicas del laboratorio, siendo utilizado por lo general en los laboratorios de
Microbiología,
Toxicología etc.
Desarrollo
Los métodos de conservación para microorganismos se agrupan atendiendo a los factores
tiempo y
características fisiológicas de la cepa en tres grandes grupos:
Métodos a largo y corto plazo y métodos alternativos.
1. Métodos de conservación a largo plazo.
Estos métodos garantizan al máximo la estabilidad genética, al evitar la aparición de
generaciones sucesivas
y por tanto son los más utilizados en microorganismos que han sido sujetos a
manipulaciones genéticas las
cuales los hacen diferentes de las cepas de origen y permiten mediante ellas evaluar
medicamentos con alto
potencial genotóxico y carcinogénico, a partir de la teoría bien abundada sobre las
mutaciones,
clasificándose como cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son transmitidos a las
generaciones
siguientes. Dentro de esta evaluaciones se encuentra el test de Ames, en el cual se utilizan
una serie de cepas
his- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a nivel genético-molecular,
donde se evalúa el
crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones.9 Por lo tanto es de vital
importancia que el
investigador conozca las limitaciones de cada método para que de esta forma pueda obtener
resultados
reales de gran veracidad investigativa. Entre estos métodos se encuentran la congelación y
la liofilización,
siendo los más aplicables en cualquier laboratorio.
Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se
guardan a temperaturas
inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no
disponer las células
de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se
recuperan subiendo la temperatura.10 Este es el mejor método de conservación desde todos
los puntos de
vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y además existe el peligro
de que algún
fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el
almacenamiento.11 También
resulta ser el método más molesto para realizar el envío de las cepas. Los cuatro factores
que influyen en la
viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes:
- Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del
inicio de la fase
estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten
en su ciclo vital
algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible
alcanzar este estado.
Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e
incluso en algunos
más sencillos.12
- Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación
bien estandarizados
para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la
temperatura sean
rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar
conviene poner
las células a 37ºC.13
- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos
cerrados o
sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene
una temperatura
de –195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –
140ºC.14
En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los más
aconsejables son los
que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC. Aquellos que sólo alcanzan temperaturas
entre –20ºC y –
40ºC, como ocurre con la mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a
la gran
concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja.
El daño que se
produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y
descongelaciones. Si se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se
reduce la
cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica.15
Para la conservación en armarios congeladores, las células se almacenan en criotubos
(tubos de plástico
esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes de
varios tubos
para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta
manera se evita
que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto también se puede evitar
empleando tubos con
criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la solución celular a congelar), ya
que para tomar
una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto.16
Este método no
se debe emplear para la conservación de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el
género
bacteriano Clostridium, ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto
con el oxígeno y
puede afectarse la viabilidad.17
- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda
producir en las células
microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden
utilizar como
crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración
del 15 al 20%.
También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como
glucosa, lactosa,
sacarosa, inositol, etc. En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera
conservar.18
La temperatura de almacenamiento seleccionada depende de las facilidades disponibles,
pero las
temperaturas más bajas favorecen la viabilidad y la estabilidad genética.19 La mayoría de
los
microorganismos (bacterias, hongos, virus, bacteriófagos) sobreviven largos períodos el
almacenamiento en
estado de congelación por la reducción marcada de su ritmo metabólico. Algunos
protozoos, algas y células
humanas también pueden ser preservados por este método. Existen muchos factores que
pueden afectar la
viabilidad y estabilidad de los cultivos durante el proceso de congelación, por lo que deben
realizarse
pruebas de ajustes del grado de enfriamiento y calentamiento, además de la adición de
crioprotectores a la
suspensión celular.20
El almacenamiento de microorganismos por el método de congelación a temperaturas
extremadamente bajas
es muy simple y se ha logrado estandarizar para la preservación de un amplio rango de
microorganismos.
Con él se obtiene la más reducida pérdida de viabilidad, un alto grado de estabilidad y
períodos de
sobrevivencia de más de 30 años. El costo inicial del equipamiento puede ser alto pero la
seguridad de este
método justifica su costo, sobre todo en cultivos difíciles de preservar por otros métodos.21
Sin embargo, el
nivel de nitrógeno líquido de los contenedores debe chequearse diariamente y mantenerse
constante la
distribución del mismo en todo el recipiente.
Este tipo de método se hace difícil y costoso; y la penetración de nitrógeno líquido en
ámpulas mal selladas
puede provocar explosiones cuando se trasladen del contenedor a otro lugar, por lo que se
recomienda
utilizar recipientes de plástico o almacenamiento en la fase de vapor del nitrógeno. Cuando
se utiliza este
método debe utilizarse protector para la cara, bata y guantes de laboratorio como medidas
de seguridad
contra las salpicaduras y derrames de nitrógeno líquido y la explosión de las ámpulas de
vidrio.2
Conservación por liofilización.
La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por
sublimación del hielo
bajo vacío. Este proceso consta de tres etapas, la precongelación del producto para asegurar
una estructura
completamente congelada; el secado primario con el que se elimina la mayor parte del agua
por
sublimación; y el secado secundario con el que se remueve el agua que queda ligada.23
En las células conservadas por este método no hay crecimiento puesto que la actividad de
agua es cero igual
que en la congelación pero a diferencia de la primera, los liófilos no tienen agua en el
medio debido a la
sublimación. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los
que hay muchos
modelos en el mercado. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su
comodidad para el
almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden
almacenarse a
una temperatura ambiente de 18ºC-20ºC.24
El medio de preservación es esencial para proteger las células de los daños producto de los
procesos de
congelación y sobresecado. La elección del medio depende del microorganismo de manera
que se logre
mantener la viabilidad y permitir un buen recobrado posterior al proceso de liofilización.25
Usualmente el
medio de preservación contiene altos niveles de suero, proteínas, aminoácidos (ej:
glutamato monosódico),
carbohidratos (ej: glucosa, sacarosa) o leche descremada.26 Entre los crioprotectores
recomendados se
encuentran el inositol, para la mayoría de las bacterias; la leche descremada para hongos y
actinomicetos,
pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores,
como por ejemplo el
glutámico-glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o
chopped meat (sin
carne) para bacterias anaerobias, etc.27
El éxito de la liofilización para la preservación de los microorganismos no sólo depende de
los pasos de esta
técnica (congelación y deshidratación) sino también de las características físico-químicas
del medio de
suspensión, el tipo de microorganismo, el estado fisiológico del cultivo, las condiciones del
cultivo, la
concentración de los microorganismos, entre otros.28
Los factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de
conservación
son: 29
1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microorganismos que no resisten la liofilización y
lógicamente
serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos hongos filamentosos,
especialmente los
no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos.
2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una
concentración del orden de
108-109 células/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de hongos
filamentosos y
levaduras, debido a que siempre se pierde alrededor de 102 unidades formadoras de colonia
(UFC)
durante el proceso
. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de
–50ºC.
4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la
concentración de solutos
puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial.
5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al
vacío para
evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el
oxígeno que puede
dañar a las células.
6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a
18ºC y sin bajar
de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad.
Este método es uno de los más eficaces para la conservación de muchos tipos de
microorganismos, como:
bacterias, hongos, bacteriófagos y virus; algunos de ellos pueden sobrevivir por períodos de
más de 40
años.30 Es conveniente para la producción y distribución masiva de cultivos, la viabilidad,
pureza y
estabilidad de los cultivos se mantenga por largos períodos de tiempo, no se requiere de una
atención
constante después de almacenarse los cultivos liofilizados y cientos de éstos pueden
guardarse en un
pequeño espacio. Otro método dentro de la liofilización es utilizando capilares de vidrio
mediante el cual se
reduce el espacio de almacenamiento y el costo de la distribución de los cultivos. Sin
embargo, el proceso es
complejo y caro, pues aunque no necesariamente requiere de un equipo sofisticado, se
necesita al menos de
un sistema de vacío, por lo que no se puede aplicar en laboratorios con recursos
limitados.28-30
2. Métodos de conservación a corto plazo.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección,
fundamentalmente por
carecer de los equipos necesarios, porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de
la conservación
por estos métodos o porque las cepas contengan construcciones genéticas trayendo consigo
que estas
pierdan elementos, determinadas características especiales que se utilicen para medir el
efecto del
medicamento o fármaco en la misma, desde el punto de vista tóxico. Conviene tener en
cuenta que nunca se
debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el
microorganismo empleando
varios de estos métodos.
Conservación por transferencia periódica o subcultivo.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que
ha crecido,
consiste en la transferencia del cultivo a un medio de cultivo fresco a intervalos que
aseguren la viabilidad
del mismo. Estos intervalos varían dependiendo de las características del microorganismo
en cuestión,
algunas especies requieren ser transferidas a nuevos medios después de días o semanas, y
otras después de
meses o años. Esta frecuencia puede reducirse con el almacenamiento del subcultivo a
temperaturas
relativamente bajas, en un refrigerador a 40C o en un freezer entre –100C y –200C, bajo
aceite mineral o
agua.30-31
Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo,
porque al seguir
activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el
envejecimiento y
muerte celulares. Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que
al estar las
células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que
se están
guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no
conserven algunas de
sus características.31
Es conocido que el riesgo de contaminación y de cambios genéticos se incrementa a mayor
número de
transferencias; así como el peligro de pérdida del cultivo sobre todo cuando se trabaja con
microorganismos
delicados y la posibilidad de que ocurra deshidratación del medio de cultivo, a estos
inconvenientes se suma
además que cuando hay muchos microorganismos el trabajo es muy intenso y se requiere
un espacio grande
para el almacenamiento.31-32
Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los
periodos entre dos
resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la
cantidad de
inóculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando
en picadura los
microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de
oxígeno es más
rápido y origina productos generalmente tóxicos.33
Este método es muy simple, con él se puede mantener la viabilidad de algunos
microorganismos por
muchos años, y la recuperación de los cultivos activos es relativamente fácil. En el caso de
colecciones
pequeñas, éste puede ser un método económicamente factible en cuanto al equipamiento y
al tiempo que se
invierte.34
Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos
tipos de
microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste
en suspender en
agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en
criotubos de los
anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a
104-105 células/ml
en el caso de bacterias. Los resultados obtenidos en laboratorios de microbiología en la
conservación de
microorganismos por este método muestran altos porcentajes de viabilidad en períodos a
veces superiores a
5 años. La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha
comprobado para
caracteres específicos como la virulencia, el poder fermentativo y la preservación de
transformantes
genéticos.
. Métodos alternativos de conservación.
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es
necesario recurrir a la
hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la
liofilización o la
congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los
cuatro métodos
que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua
disponible para las
células.36 Estos métodos de secado son particularmente útiles para conservar
microorganismos productores
de esporas y su acción se debe a la reducción drásticamente el metabolismo de los mismos.
Sin embargo, no
todos los microorganismos sobreviven a estos métodos de secado, por lo que se hace
necesario añadir
agentes protectores (leche descremada, glutamato sódico al 10%). Una vez secos es
importante mantener el
producto sellado (tapón de rosca, ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son
higroscópicos.35-36
Desecación sobre sustratos inertes.
El método de almacenamiento de microorganismos en estado de secado ha sido aplicado
como un método
de preservación particularmente para bacterias y hongos que consiste en la separación del
agua y la
prevención de la rehidratación. Para el desarrollo de los métodos de desecación se han
empleado como
sustratos inertes: arena, tierra, zeolita, sílica gel, discos y tiras de papel, tapones de algodón,
discos de
gelatina y cuentas de vidrio y de porcelana.37
Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución
muy densa de
células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por
el procedimiento
que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin
que haya habido
congelación previa de las células.38 El vacío producido por el liofilizador deseca las
células, pero hay que
evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición.
Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de
esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método y se sigue el método
anteriormente
descrito.38
Desecación en bolitas de alginato.
Este es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de
alginato y la
eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y
posterior desecación al
aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se
pueden conservar en
tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar
incluso a –80ºC
debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de
alginato.3
Arencibia DF, Rosario LA, Gámez R. Métodos Generales de Conservación de
Microorganismos.
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Desecación en sal gorda para halobacterias.
Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar
espontáneamente.
Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de
multiplicarse por
ser insuficiente el nivel de agua disponible.
La desecación es un método simple para la preservación de microorganismos, el trabajo no
es muy intenso,
el costo es pequeño y la contaminación de los subcultivos es menos probable que con los
subcultivos
periódicos. Además, puede utilizarse para el almacenamiento de un gran número de
cultivos. A pesar de
esto, resulta difícil evaluar detalladamente su confiabilidad, ya que en la mayoría de los
casos, la
información apropiada no está disponible y en otros está restringida a un número limitado
de
microorganismos.40 De cualquier modo, los cultivos no deben ser preservados solamente
por este método
sin una investigación previa.
Recobrado de las células.
Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las cepas microbianas,
cuando éstas se
recuperan para hacer nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas, se
recomienda no utilizar
directamente las células que se han estado guardando, porque éstas vienen de una situación
de estrés más o
menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son
adecuadas para
ningún tipo de prueba.38 Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas
en un medio no
selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento, y a partir de este
primer crecimiento
ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando sea necesario.40
En la Tabla # 1, se muestran algunos ejemplos de cepas que se encuentran en nuestros
laboratorios así como
el método a utilizar obteniéndose mayores resultados de viabilidad, fortaleza y durabilidad.
Conclusiones
En los últimos años a las colecciones de cultivos microbianos también se les ha dado una
responsabilidad
adicional. De acuerdo con la Convención sobre Biodiversidad (CBD), adoptada en 1992 y
firmada por más
de 170 estados, estas colecciones deben desempeñar un importante papel en la
preservación, comprensión y
utilización de la biodiversidad microbiana del planeta. Teniendo en cuenta la enorme
biodiversidad de los
microorganismos es evidente que el reto de mantener las colecciones bien conservadas es
alto y requerirá de
esfuerzos mancomunados de todas las partes involucradas. Hemos de tener presente que,
dada la enorme
diversidad microbiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de
conservación mejor que
otros, o será necesario tomar precauciones especiales en su conservación, no existe un
método general de
conservación de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más
aconsejable en cada caso.
Todos los métodos de preservación tienen ventajas y desventajas por tanto es necesario
hacer una selección
el método a utilizar haciendo una análisis de las características de cada técnica, factibilidad
de su uso y las
necesidades del usuario. Generalmente la elección depende de la disponibilidad del
equipamiento y de la
competencia del personal, así como de las características del microorganismo a conservar,
es recomendable
utilizar siempre más de un método de preservación y trabajar con réplicas del
microorganismo que se desea
preservar como medida de seguridad.
Tabla # 1. Tipos de cepas y método más eficaz.
Tipo de Cepa
Método Eficaz
Tipo de Cepa
Método Eficaz
Salmonella s.p.p
Liofilización
Klebsiella
pneumoniae
Congelación a
(-20°C)
Salmonella con construcciones
genéticas ej. (TA 97, 98, 100,
102, 1535, etc.)
Liofilización y
Crioconservación a (-80°C)
Proteus mirabilis
Congelación a
(-20°C)
[Link], [Link] Recombinante,
[Link] con construcciones
genéticas.
Liofilización y
Crioconservación a (-80°C)
Shigella flexneri
Congelación a
(-20°C)
Streptomyces s.p.p
Liofilización y luego
conservación a (4°C)
Levaduras
Generales
Métodos Alternativos
Vibrio cholerae
Crioconservación (-80°C)
Kluyveromyces
marxianus
Congelación
(-20°C)
Bacillus cereus
Liofilización
Saccharomyces
cerevisiae
Liofilización con 16 h
de tiempo de
deshidratación.
Bacillus subtilis
Liofilización
Candidans Albicans
Crioconservación
(-70°C) en glicerol.
Bacillus Turingiensis
Liofilización
Alternaria s.p.p
Liofilización
Bacillus Sphaericus
Liofilización
Penicillium s.p.p
Liofilización
Enterobacter sp
Congelación a
(-20°C) y Método Simple a
Temperatura Ambiente
Penicillium
italicum
Liofilización
Enterococcus faecalis
Congelación a
(-20°C) y Método Simple a
Temperatura Ambiente
Aspergillus s.p.p
Liofilización
Pseudomonas aeruginosa
Congelación a (-20°C)
Rhizopus s.p.p
Liofilización
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