FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA

SEDE LA SERENA

“Identificación mediante método de PCR de

presencia de Trypanosoma cruzi en Rhipicephalus
sanguineus en cánidos domésticos del sector La
Rinconada, El Sauce en la ciudad de Coquimbo.”

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario.

Alumnas: Marta Fajardo Godoy; Macarena Rojas González.

PROFESOR GUÍA: Mauricio Campillay Hrzic

PROFESOR CORRECTOR: Julián Reyes

La Serena, 2020

1
 Calificación

Nombre estudiante Calificación final

Profesor Guía Profesor Corrector

Director(a) Escuela de Medicina Veterinaria

Decano Facultad de Ciencias Agropecuarias

Fecha de aprobación :

2
 Calificación

Nombre estudiante Calificación final

Profesor Guía Profesor Corrector

Director(a) Escuela de Medicina Veterinaria

Decano Facultad de Ciencias Agropecuarias

Fecha de aprobación :

AGRADECIMIENTOS

3
Macarena Rojas González
Agradezco a mis padres por su apoyo incondicional en esta etapa de mi vida, por
darme fuerzas y ánimos cuando lo necesitaba. Sin duda alguna esto va dedicado
a uds, los amo.
A mis hermanas y sobrino que me brindan su alegría y apoyo para no rendirme.
A mi pareja Sebastián Oliva por alentarme cada día, brindarme su amor y apoyo
en esta etapa.
Finalmente agradezco a todo el equipo royal pets por entregar conocimientos y
todas las herramientas necesarias para seguir creciendo como profesional.
Gracias por la confianza que me han dado.
Marta Fajardo Godoy
Agradezco principalmente a mis padres Orlando y Judith, por darme la
oportunidad de cumplir mis sueños, apoyarme y darme la motivación de continuar
cuando las cosas se ponían difíciles, por no dejar que me rinda y estar ahí siempre
para mi.
A mi familia, hermana, tías y prima por comprenderme en mis días de estrés,
animarme y hacerme la vida universitaria más fácil.
A mis amigos y compañeros de universidad, gracias por su cariño, apoyo y por sus
enseñanzas.
A mis profesores, mis tutores de práctica, y a todo quien se cruzó en mi camino
universitario con el objetivo de inculcar sus conocimientos.
A ustedes, mi fuente de inspiración, por impulsarme a ser lo que siempre quise
ser: Lucas, Akiro, Martín, Kitty, Antonia, Canela, Lúa, Lorenzo y Chica, sin ustedes
este sueño nunca habría tenido sentido. Todo lo que seré y llegaré a ser será para
honrarlos a ustedes.
A Daniel Campillay, por llegar en el momento preciso, ser mi apoyo y mi pilar, y
motivarme a seguir adelante a pesar de las caídas.
Y finalmente a todos y cada uno de quienes conforman el tremendo equipo de
Royal Pets, por abrirle las puertas con total confianza a este polluelo que
comenzaba a dar sus primeros pasos con miedo, y que con sus tremendas
enseñanzas, felicitaciones y también retos, están forjando la profesional que
quiero llegar a ser.
En conjunto queremos agradecer a Cristian Castillo por entregarnos las
herramientas necesarias para realizar este estudio.
A Mauricio e Ignacio Campillay por confiar en nosotras, además de siempre
ayudarnos con nuestras dudas.

4
 ÍNDICE

RESUMEN 8

ABSTRACT 9

I INTRODUCCIÓN 10

II OBJETIVOS 12

OBJETIVO GENERAL 12
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12

III MARCO TEÓRICO 13

3.1 ANTECEDENTES HISTÓRICOS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS 13

3.2 AGENTE ETIOLÓGICO: 16
3.3 CLASIFICACIÓN: 17
3.4 CICLO BIOLÓGICO: 18
3.5 CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE TRIPANOZOMA CRUZI 19
3.5.1 Trypomastigote: 20
3.5.2 Amastigote: 21
3.5.3 Epimastigote 22
3.6 EPIDEMIOLOGÍA: 22
3.7 DIAGNÓSTICO: 24
MÉTODO DIRECTOS: 24
MÉTODO MOLECULAR: 25
MÉTODO INDIRECTO: 25
3.8 ANTECEDENTES GENERALES DE LAS GARRAPATAS 26
3.81 Longevidad y duración del ciclo evolutivo: 27
3.82 Ciclo evolutivo 27
3.83 Clasificación por huésped: 28
3.9 ANTECEDENTES DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS 28
3.10 SITUACIÓN EN CHILE 29
3.11 TAXONOMÍA DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS 30

5
 3.12 CICLO VITAL DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS 30
3.13 SISTEMA DIGESTIVO 31
3.14 IMPORTANCIA MÉDICA Y VETERINARIA DE LAS GARRAPATAS 32

IV MATERIALES Y MÉTODOS 33

4.1 TIPO DE ESTUDIO 33

4.2 UNIVERSO Y ÁREA DE ESTUDIO 33
4.3 POBLACIÓN DE ESTUDIO 34
4.4 SELECCIÓN DE LA MUESTRA 35
4.5 INSTRUMENTO PARA OBTENCIÓN DE MUESTRAS 36
4.6 OBTENCIÓN DE MUESTRA 37
4.6 PROCEDIMIENTO 37
4.7 ANÁLISIS DE DATOS 41

V RESULTADOS 42

VI DISCUSIÓN 46

VIII BIBLIOGRAFÍA 49

IX ANEXO 51

GLOSARIO 51

6
 ÍNDICE DE TABLAS Y GRÁFICOS

G
Gráfico Nº1: gráfico circular en base a la cuantificación de muestras positivas
según género. 43

Gráfico 2: gráfico circular en base a la cuantificación de muestras positivas según

género. 44

Tabla 1. La siguiente tabla detalla el número de individuos, las cantidades de

muestras extraídas de cada individuo y por consiguiente la sub rotulación de
éstas. 36

Tabla 2. Resultados obtenidos que demuestran la presencia de DNA de

Trypanosoma cruzi en Rhipicephalus sanguineus mediante método PCR. 43

Tabla 3. Cuantificación de muestras positivas. 44

Tabla 4.Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales. 45

7
 ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1 CICLO BIOLÓGICO DEL T. CRUZI (MODIFICADO DE CENTERS FOR DISEASE

CONTROL AND PREVENTION,2007) 20

FIGURA 2 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO, TRIPOMASTIGOTE. 21

FIGURA 3 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO, AMASTIGOTE. 22

FIGURA 4 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO, EPIMASTIGOTE. 23

FIGURA 5 Intestino Rhipicephalus sanguineus. 32

FIGURA 6 Mapa de la zona muestreada. 34

FIGURA 7 ALGUNOS CÁNIDOS PERTENECIENTES A LA POBLACIÓN DE INDIVIDUOS

SELECCIONADOS DE FORMA ALEATORIA PARA LA EXTRACCIÓN DE RHIPICEPHALUS

SANGUINEUS. 35

FIGURA 8 EJEMPLO DE OBTENCIÓN Y ALMACENAJE DE MUESTRAS DE RHIPICEPHALUS

SANGUINEUS.

37

FIGURA 9 DISECCIÓN DE MUESTRAS PARA EXTRAER CONTENIDO ABDOMINAL. 39

FIGURA 10 MANTENCIÓN DE MUESTRAS YA HOMOGENEIZADAS MANTENIDAS EN HIELO. 39

FIGURA 11 ADICIÓN DE 3 ΜL DE “RNASE SOLUTION” A LAS MUESTRAS. 39

FIGURA 12 MUESTRAS COLOCADAS ES VORTEX LUEGO DE LA ADICIÓN DE 200 ΜL DE

“PROTEIN PRECIPITATION SOLUTION”. 39

FIGURA 13 PELLET DE DNA SOBRANTE RESULTANTE DE LA centrifugación. 40

FIGURA 14 SECADO DEL PELLET DE DNA. 40

FIGURA 15 DNA A LA ESPERA DE LA OBSERVACIÓN POR ELECTROFORESIS. 40

FIGURA 16.1 PCR EN GEL DE AGAROSA. 42

FIGURA 16.2 PCR EN GEL DE AGAROSA. 42

8
 RESUMEN

La enfermedad de Chagas causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, es una

enfermedad zoonótica parasitaria de carácter inflamatoria e infecciosa
potencialmente mortal, que puede causar problemas cardíacos y digestivos
graves. La importancia de esta enfermedad, es que la mayoría de los pacientes
no presenta síntomas iniciales, por lo tanto no saben que están infectados con el
parásito, sumado a que el curso de la enfermedad es crónico puede tardar entre
10 a 30 años para manifestar signos y síntomas. En condiciones naturales T. cruzi
se transmite por chinches hematófagos de la familia Reduviidae. En Chile la
enfermedad de chagas contiene zonas endémicas que se extienden de la I a la IV
región incluyendo la región metropolitana, siendo las áreas rurales y periurbanas
las más afectadas. T.cruzi puede afectar a una amplia variedad de animales y
estos además pueden servir como reservorios de la enfermedad; siendo los perros
una de las fuentes más probables de parasitación humana producto de la
estrecha relación que existe entre ambos. Debido a que el perro alberga gran
cantidad de garrapatas y éstas desempeñan el papel de transmitir o de actuar
como vectores y reservorios de numerosas enfermedades a los humanos, se ha
estudiado la posibilidad de que Rhipicephalus sanguineus (garrapata marrón del
perro) pueda ser reservorio de Trypanosoma cruzi. El objetivo de este estudio fue
determinar la presencia de Trypanosoma cruzi en Rhipicephalus sanguineus,
provenientes de cánidos domésticos; que deambulaban durante el período de
otoño en el sector La Rinconada, El Sauce durante el año 2018 en la ciudad de
Coquimbo. Para ellos se obtuvieron 15 Rhipicephalus sanguineus de cánidos
encontrados en zonas periurbanas, a las cuales se realizó extracción de ADN y
analizadas mediante ensayos de PCR tiempo final. Se detectaron 9 muestras
positivas a DNA de T. cruzi representando una tasa de 60% de positividad del
estudio. No se encontraron diferencias significativas según sexo de Rhipicephalus
sanguineus encontradas.

Palabras claves: Enfermedad de Chagas, protozoo, Trypanosoma cruzi,

Stercoraria, Rhipicephalus sanguineus.

9
 ABSTRACT

Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a life-threatening,

inflammatory and infectious parasitic zoonotic disease that can cause serious heart
and digestive problems.
The importance of this disease is that most patients do not present initial
symptoms, therefore they do not know that they are infected with the parasite,
added to the fact that the course of the disease is chronic, it can take between 10
to 30 years to manifest signs and symptoms.

In natural conditions T. cruzi is transmitted by hematophagous bugs of the family

Reduviidae. In Chile Chagas disease contains endemic areas ranging from region I
to Region IV, including the Metropolitan Region. Being the rural and peri-urban
areas the most affected.

This has a wide variety of animals that may be affected and serve as reservoirs of
the disease, being the dogs, the most likely source of human parasitism, due to the
close relationship that exists between the two.

Due the dog hosts a large quantities of ticks, and these play the role of transmitting
or acting as vectors and reservoirs of numerous disease to humans, has been
studied the possibility that Rhipicephalus sanguineus (brown tick dog) maybe be
reservoir of T. cruzi

The objective of this study was to determine the presence of Trypanosoma cruzi in
Rhipicephalus sanguineus coming from domestic dogs that wander during the fall
in the Rinconada sector Sauce, city of Coquimbo.For this purpose, 15
Rhipicephalus sanguineus were obtained from canines found in peri-urban areas,
from which DNA was extracted and subsequently and lysed by PCR assays, real
time. 9 positive examples were detected, representing a rate of 60%. No significant
gender differences were found for Rhipicephalus sanguineus.

Key words : Chagas disease, Protozoan, Trypanosoma cruzi, Stercoraria,

Rhipicephalus sanguineus.

10
 I. INTRODUCCIÓN

La tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas) es una zoonosis

parasitaria causada por el protozoo Trypanosoma cruzi (Carrada-Bravo, 2004).
Fue descrita en Minas Gerais (Brasil) en 1909, por Carlos Ribeiro Justiniano
Chagas. Esta zoonosis parasitaria existe en el continente americano desde hace
más de 9.000 años, así se ha documentado la infección chagásica en
comunidades prehistóricas que habitaban el norte de Chile (Apt, y otros, 2008),
hecho comprobado por el hallazgo de segmentos del DNA de T.cruzi en momias
de la cultura Chinchorro (al norte de Chile y al sur del Perú). (Náquira & Cabrera,
2009)

En Chile, la enfermedad de Chagas se extiende de la I a la VI región, incluyendo la

Región metropolitana, siendo más frecuentes en áreas rurales y periurbanas
(Toso, Vial, & Galanti, 2011) Actualmente en Chile 142.000 personas están
infectadas y 1.000.000 están en riesgo de infección. La transmisión de la
enfermedad de Chagas está vinculada con insectos, que desempeñan el papel de
vectores hematófagos; en relación al ciclo doméstico el principal vector de la
enfermedad de Chagas es el Triatoma infestans (Rozas, y otros, 2005), y en
especies silvestres el vector corresponde al género Mepraia.

Las formas más tradicionales de contagio de la enfermedad de Chagas son la

vectorial, la transfusional, la transplacentaria, los trasplantes de órganos
infectados y los accidentes de laboratorio. La transmisión vectorial es causada por
el depósito de deyecciones de triatominos infectados por Trypanosoma cruzi en la
piel de mamíferos al momento de alimentarse. Actualmente, con las efectivas
medidas que se han tomado para el control de los vectores, así como el control de
la sangre para transfusiones y de donantes de órganos, en algunos países (como
Chile), estas formas de transmisión están controladas (Toso, Vial, Galanti, 2011).
En este contexto, otras formas de contagio han tomado importancia, por ejemplo,
uno de cada tres nuevos casos corresponde a la transmisión congénita (World
Health Organization, 2010)

11
Para los animales silvestres, así como para los perros (reservorios de la
enfermedad), la ingestión de vectores infectados es la vía de infección más
frecuente y otras vías menos comunes incluyen transfusión sanguínea, congénita
o ingestión de carne y leche de animales infectados. (Suárez, et al, 2017)

Actualmente sólo se reconoce como vector de transmisión hacia los cánidos a la

vinchuca, pero en el Centro Experimental Oswaldo Cruz en Brasil, se observó que
después de una infestación de garrapatas en perros albergados en perreras
usados para estudios de la patogénesis de la enfermedad de Chagas a largo
plazo, se mostró que si bien las garrapatas podrían infectarse con T. cruzi, sólo
ocurría cuando las garrapatas se alimentaban de la sangre obtenida de perros en
fases agudas de la enfermedad de chagas, sin embargo no hubo evidencia de
desarrollo posterior de parásitos en las garrapatas (Pintos, et al,2007) .

En Irak y en Brasil se ha documentado que Rhipicephalus sanguineus es capaz de

albergar Tripanosomas flagelados (Dantas-Torres, 2007). Dados estos
antecedentes se consideró relevante aportar datos actualizados, debido al papel
que desempeñan las garrapatas en la transmisión de diversas enfermedades a los
seres humanos ya que estas tienen la capacidad de actuar como vectores y
reservorios de numerosas enfermedades zoonóticas, es decir, las garrapatas
mantienen numerosas enfermedades en el ambiente a través de varias
generaciones, por ende, se decidió realizar un estudio similar a los anteriores en la
ciudad de Coquimbo IV Región, Chile con el fin de comprobar si es posible que T.
cruzi pueda encontrarse en las garrapatas de cánidos, en donde la tripanosomiasis
americana es una enfermedad emergente de importancia para la salud pública en
Chile y sobre todo para la zona norte del país.

12
 II. OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar la presencia de DNA de Trypanosoma cruzi a través de método

diagnóstico de PCR, en garrapatas de la especie Rhipicephalus sanguineus,
provenientes de cánidos domésticos.

Objetivos Específicos

Obtener Rhipicephalus sanguineus de cánidos domésticos residentes del sector

La Rinconada, El Sauce en la ciudad de Coquimbo.

Determinar la presencia de DNA de Trypanosoma cruzi en muestras sanguíneas

de Rhipicephalus sanguineus mediante PCR.

Determinar mediante análisis estadísticos, si dentro de los resultados positivos

entre género de Rhipicephalus sanguineus, por características morfológicas,
presenta diferencia significativa.

13
 III. MARCO TEÓRICO

3.1 Antecedentes históricos de la Enfermedad de Chagas

La enfermedad de chagas es una zoonosis causada por Trypanosoma cruzi y

transmitida principalmente por insectos triatomíneos. Es un importante problema
de salud pública, debido a que inicialmente esta enfermedad solo se limitaba a
áreas silvestres, pero en los últimos decenios ha aumentado el contagio por la
mayor movilidad de la población de zonas rurales a urbanas, además de la
construcción de viviendas en zonas rurales, invadiendo el terreno de los
triatominos. Es por ello, que los insectos triatominos que transmiten la enfermedad
de Chagas, se adaptaron a las viviendas humanas; así aumentaron la
distribución y cambiaron la epidemiología de la enfermedad de Chagas. En
América Latina, donde aproximadamente 11 millones de personas podrían estar
infectadas con Trypanosoma cruzi (Diaz J. , 2006). La mayoría no sabe que están
infectadas, por ende, la enfermedad no es tratada y puede ser potencialmente
mortal. Los perros y gatos domésticos, las zarigüeyas y los roedores desempeñan
un papel importante en la ecología y la epidemiología de la enfermedad de
Chagas, dado que estos animales tanto domésticos como silvestres se consideran
reservorio de la Tripanosomiasis Americana de forma natural y amplificadores de
la enfermedad. Los perros están involucrados en los ciclos de transmisión
domésticos de Trypanosoma cruzi desde la zona sur de EEUU, a lo largo de
América (Eisen, Odgen, & Beard, 2016). En los países del Cono Sur, donde
Triatoma infestans es el principal o único vector domiciliario, la prevalencia de
perros y gatos con Trypanosoma cruzi se situó en el rango de 8-50% ya a menudo
excediendo a los encontrados en las respectivas poblaciones humanas que
fluctúan entre el 1,2% (Uruguay) y 18,2% (Bolivia). (Orellana, Nancy, & Arriza-
Torres, 2010)

La importancia de una especie huésped como reservorio de un patógeno

transmitido por vectores depende principalmente de la prevalencia de infección, la

14
capacidad del huésped para infectar a los insectos y de la tasa de contacto
huésped-vector (Gurtler, et al, 2007).

Debido a que los perros son considerados como un importante reservorio

parasitario de T. cruzi en el ciclo doméstico, y por su proximidad a los seres
humanos, representan un factor de riesgo para la población humana. Los perros
clínicamente infectados pueden desarrollar las fases aguda y crónica de la
enfermedad, similar a las formas humanas; es por esto que son utilizados como
modelo experimental para la infección chagásica en humanos. (Blandenier
Bossom & Lopez-Loyo, 2017).

En la enfermedad de Chagas se conocen dos fases: (Atías, 1998):

- Fase aguda: Ocurre la penetración e invasión de los parásitos en los

diferentes tejidos y órganos, la alta parasitemia, la respuesta local, la
destrucción de las células nerviosas y musculares conducen a procesos
degenerativos de grado variable, con reemplazo de estas células por tejido
fibroso. (Atías, 1998). Sólo se presenta entre el 1 y 2% de los pacientes,
tiene una duración de 2 a 3 meses. Aquellos que presentan síntomas son
leves o poco característicos, principalmente fiebre, dolor de cabeza, falta de
apetito, dolores musculares, vómitos, diarreas y aumento del tamaño de
hígado y bazo. Al tener contacto el parásito con la piel puede presentar
lesiones denominadas “chagoma” y se caracterizan por una lesión de
aspecto duro, con calor local, indolora y pequeña, puede adoptar un color
violáceo. Si el parásito tiene contacto con los ojos, se produce una lesión
llamada “signo de Romaña”, que corresponde a una inflamación del tejido
conjuntival, córnea y saco lagrimal. También puede presentar aumento de
los ganglios periféricos. (Ministerio de Salud, 2020)

Esta se presenta generalmente en niños y jóvenes. La muerte puede ocurrir

de 2 a 4 semanas después de la aparición de los síntomas, o puede
resolverse en la forma crónica de la enfermedad (Soulsby, 1988).

15
- Fase crónica: Esta fase se divide en dos, la fase asintomática y la
sintomática:

1. Fase crónica asintomática: Representa entre el 50% y 70% de todos

los pacientes chagásicos. Se caracteriza por la ausencia de
síntomas cardíacos y digestivos. Los pacientes tienen parasitemia y
serología positiva (títulos de IgG bajos), pero otros exámenes de
laboratorio son normales, tales como: electrocardiograma y
radiografías. Esta forma persiste, por lo menos en 30% de los
chagásicos, durante toda su vida. El resto puede evolucionar a una
forma crónica determinada, en un lapso de 10 a 30 años. En Chile,
2% de los pacientes podrían anualmente pasar de forma crónica
indeterminada a cardiopatía crónica. En Brasil, este porcentaje es
menor (Ministerio de Salud, 2020).

2. Fase crónica sintomática: Es principalmente la cardiopatía, colopatía

y la esofagopatía. El compromiso de otros órganos es infrecuente,
tales como estómago, duodeno, vejiga, uréteres. Estas formas de
presentación pueden ocurrir separadamente o coexistir en un mismo
enfermo. En esta etapa existe una parasitemia baja, con títulos
elevados de anticuerpos (si el paciente es inmunocompetente). Se
estima que 30% de los chagásicos tendrían manifestaciones de la
etapa crónica, lo que podría aumentar al emplear métodos
diagnósticos más sensibles.

Cardiopatía chagásica crónica (CCC). Se presenta en 10 a 30% de estos

pacientes, en Chile y Brasil son el 30% de los casos. Se caracteriza por su
gravedad y representa la principal causa de muerte de estos enfermos. Los
síntomas más frecuentes son palpitaciones y disnea de esfuerzo. La

16
 cardiopatía evoluciona a la insuficiencia cardíaca. Las arritmias son
frecuentes y variadas, todos signos de mal pronóstico. El bloqueo A-V, más
el bloqueo completo de rama derecha, con o sin hemibloqueo anterior
izquierdo, son sugerentes de esta patología. Puede haber bloqueo AV
completo, fibrilación auricular, bloqueo completo de rama izquierda y
extrasístoles ventriculares. En corazones dilatados, se presentan
fenómenos tromboembólicos que pueden ocasionar infartos pulmonares y
cerebrales. Existe fibrosis cardíaca que originan microaneurismas de la
punta del ventrículo izquierdo. (Werner et al., 2008)

3.2 Agente etiológico:

Trypanosoma cruzi: Es un protozoo flagelado que evoluciona en el tubo digestivo

de los insectos específicamente en la parte posterior, es por ello que pertenece a
la sección Stercoraria. Causante de la tripanosomiasis humana americana o
enfermedad de Chagas en América del sur.

Es un parásito que se encuentra en vertebrados y artrópodos; su desarrollo

incluye las etapas de trypomastigote, epimastigote, y amastigote.

En la sangre presenta una estructura monomórfica, mide 16-20 μm de longitud, y

presenta forma de cuarto creciente con un extremo posterior puntiagudo. El
kinetoplasto es grande y subterminal, ocupando la totalidad de esta porción del
cuerpo. El núcleo es central, con membrana ondulante moderadamente
desarrollada y flagelo libre. Las divisiones ocurren en la fase amastigote, y no en
la trypomastigote. Las formas en división aparecen como cuerpos de 1.5-4 μm de
diámetro en músculo y otras células, especialmente en las del músculo cardíaco.
(Soulsby, 1988)

17
3.3 Clasificación:

Trypanosoma: Del griego trypain (perforar) o trépanos (taladro) + soma (cuerpo).

Este género fue creado por Gruby en 1843 para designar a los “flagelados
hemáticos de cuerpo aguzado y con movimientos ondulantes y espiralados”.

T. cruzi. Es la especie dedicada por Carlos Chagas al médico brasileño Oswaldo

Cruz (1871-1917) en 1909 (Chagas, 1909). La ubicación sistemática del
Trypanosoma cruzi es la siguiente (Maudlin & Holmes, 2004):

Reino: Protista

Phylum: Sarcomastigophora: Su locomoción se realiza por medio de flagelos y/o

pseudopodios. Poseen un único tipo de núcleo.

Sub-phylum: Mastigophora: Presentan un pequeño número de flagelos, se

reproducen por fisión binaria y en algunos grupos por reproducción sexual.

Clase: Zoomastigophorea: Sin cloroplastos, con uno o varios flagelos,

reproducción sexual conocida en pocos grupos, grupo prolífico.

Orden: Kinetoplastida: Tienen de a uno a cuatro flagelos que emergen de una

depresión, una única mitocondria que se extiende por toda la célula semejando un
tubo o una red de tubos y generalmente poseen una organela autorreplicante que
es en realidad una prolongación capsular de la mitocondria, denominada
kinetoplasto. El aparato de Golgi está ubicado en la zona de la depresión flagelar.
Hay especies parásitas y otras de vida libre.

Suborden: Trypanosomatina: Poseen un solo flagelo, libre o con membrana

ondulante, el kinetoplasto es pequeño y compacto. Son todos parásitos.

Famila: Trypanosomatidae: En esta familia encontramos varíos miembros

monogenéticos (con un sólo huésped) todos parásitos de invertebrados y otros
digenéticos (con más de un huésped) que alternan huéspedes vertebrados e
invertebrados.

Género: Trypanosoma: Se dividen en dos grandes grupos según el sitio de

producción de tripomastigotes metacíclicos en el insecto vector y el consecuente
18
método de infección en el huésped vertebrado (Maudlin & Holmes, 2004).
Sección: Estercoraria: Incluye tripanosomas cuyo ciclo de desarrollo en el vector
invertebrado se completa en la región del tubo digestivo del mismo. Se transmiten
por contaminación a través de las heces del insecto.

Especie: Trypanosoma cruzi [Chagas, 1909].

3.4 Ciclo Biológico:

En condiciones naturales, T. cruzi se transmite por chinches hematófagos de la

familia Reduviidae, ocurriendo su desarrollo en la porción intestinal posterior. Los
tripanosomas metacíclicos pasan a las heces de las chinches parasitadas a los 8-
10 o más días del comienzo de la infección. El hospedador humano, o mamífero,
se infecta cuando las heces con los tripanosomas metacíclicos son restregadas
sobre la herida practicada por el insecto, en otras lesiones de la piel o través de
membranas mucosas. Los redúvidos (chinches besuconas) suelen defecar
después de alimentarse, y frecuentemente se alimentan en piel fina próxima a los
ojos y a los labios. Por tanto , el material infectante se introduce fácilmente, al
rascarse el hospedador las picaduras, en las membranas mucosas y las heridas
producidas (figura 1). Los animales también pueden infectarse al lamer las heces
de las chinches o al ingerir los chinches contaminados. En el hombre es frecuente
la transmisión por transfusiones de sangre y vía transplacentaria, de la madre al
feto. (Soulsby, 1988)

Tras la contaminación de una herida con trypanosoma metacíclicos, los

organismos penetran en los histiocitos de la zona y proliferan como formas
amastigotes. Se produce una reacción inflamatoria local y, más tarde, hay una
encapsulación por tejido fibroso, que determina el bloqueo de los linfáticos locales
y la producción de edema en la zona implicada. Los amastigotes pasan de la
primera localización a los ganglios linfáticos más próximos, y después, a través del
sistema linfático, se distribuyen por todo el cuerpo. Hígado, pulmones, bazo,
médula ósea, musculatura cardíaca y cerebro son los órganos más afectados. En

19
estos órganos, los parásitos se multiplican como amastigotes. En la ruptura de
células hospedadoras se liberan formas tripomastigote que pasan a la sangre
asociándose el proceso con la aparición de fiebre (Soulsby, 1988)

Este ciclo de circulación sanguínea y de invasión celular se repite numerosas

veces, completando el ciclo biológico cuando los tripomastigotes son ingeridos por
otros triatominos. (Atias,1998).

Figura 1. Ciclo biológico del T. cruzi (Modificado de Centers for disease control
and prevention,2007)

3.5 Características estructurales de Tripanozoma cruzi

La superficie celular de T. cruzi se compone de la membrana celular, la bicapa

lipídica, típica de cualquier membrana biológica, y una serie de componentes
azucarados asociados a la membrana hacia el medio extracelular, formando el
glicocálix del parásito. Este glicocalix se compone de poli azúcares (glicolípidos) y
glicoproteínas unidas a GPI que recubren la parte externa superficial del parásito.
Posee un organelo similar a las mitocondrias de las células de los mamíferos,
llamados kinetoplasto, el que posee una red enrollada de ADN, el ADNk, que
20
constituye el 20-25% del total de ADN del parásito. Por microscopía electrónica se
ha evidenciado que estas moléculas de ADN están organizadas en maxicírculos y
minicírculos; cada kinetoplasto posee entre 20.000 a 25.000 minicirculos con
alrededor de 1.400 pares de bases cada uno y 20 a 25 moléculas de maxi
círculos. (Wormser et al, 2006)

Trypanosoma cruzi puede presentar tres aspectos morfológicos fundamentales:

tripomastigotes, epimastigote y amastigote (Atías, 1998)

3.5.1 Tripomastigote:
Se encuentra en el contenido rectal del vector y en la sangre de los mamíferos
infectados.

Como se observa en la Figura 2, su aspecto es fusiforme de 16-20μm de largo y 2-

4μm de ancho. Posee núcleo ovalado ubicado en el tercio medio del cuerpo, y
posterior a él se encuentra el kinetoplasto, del cual sale un flagelo que recorre la
parte externa del parásito, como una membrana ondulante exteriorizando en la
parte anterior.

Figura 2: Microscopía electrónica de barrido, Tripomastigote. (Universidad Federal

de São Paulo,2007).

21
3.5.2 Amastigote:
En la figura 3 se observa su forma esférica, de 2-5μm de diámetro, poseen un
núcleo redondo, un kinetoplasto en forma de barra, y no presentan flagelo visible.
Su localización es exclusivamente dentro de las células del mamífero infectado, en
las cuales se multiplica. Estas inicialmente son células del sistema fagocitivo
mononuclear, y posteriormente células musculares, cardiacas, intestinales y
esqueleticas.

Figura 3. Microscopía electrónica de barrido, Amastigote.(Tomado de Procopio et

al, 1999)

3.5.3 Epimastigote

En la figura 4, la forma de multiplicación en el intestino del vector, son alargados y

miden 10-15μm de largo y 1-3μm de ancho, su núcleo es ovalado y por delante de
él se encuentra el kinetoplasto, del cual sale un flagelo con una corta membrana
ondulante que pronto se hace libre en el extremo anterior.

22
Figura 4. Microscopía electrónica de barrido, Epimastigote. (Tomado de Procopio
et al, 1999)

3.6 Epidemiología:

La enfermedad de Chagas constituye uno de los principales problemas de salud

pública en diversos países latinoamericanos, dado que su distribución se
consideraba rural, sin embargo la migración de nuestras poblaciones rurales (junto
a sus animales y pertenencias) a centros urbanos ha determinado que esta
infección cobre mayor importancia en la salud pública es por eso que en los inicios
de los años 90 esta enfermedad fue clasificada de carácter seria y de gran
impacto socioeconómico (Arista, 2007). De acuerdo con la OMS existirían
alrededor de 24 millones de personas infectadas en el continente. Los triatomas
que transmiten la infección por T.cruzi, pueden vivir y reproducirse en lugares con
temperatura entre 20 a 30 °C y con humedad relativa de 70 a 80 %, en clima
cálidos, templados y secos, con predilección por el interior de viviendas precarias
de adobe, barro, caña y techo de hojas de palmera o de paja, pués estas ofrecen
condiciones ideales para la colonización de los triatominos (Garzón et al., 2002;
Gorla et al., 2005; Grijalva et al. 2003). Es por ello que se distribuyen en un área
que se extiende desde el paralelo 43ª de latitud norte (sur de California), hasta el
paralelo 49ª latitud sur (región central de Argentina) extendiéndose hasta los
países más norteños (Soulsby, 1988)

23
En esta extensa región, prevalecen las condiciones ecológicas favorables para la
transmisión y la mantención de la parasitosis (Atías, 1998).

En Chile, el área de endemia se extiende desde el paralelo 18ª en el norte (I

región), hasta el paralelo 34ª (VI región). El principal vector en el hombre es el T.
Infestans, cuyo biotipo es característico del paisaje agreste y su hábitat es
domiciliario y peridomiciliario, infestando la vivienda campesina y alimentándose
con la sangre del hombre y de los animales domésticos y silvestres. Desde esta
situación eminentemente rural, el insecto ha invadido los alrededores de las zonas
urbanas, las cuales constituyen los centros de atracción industrial, con emigración
de gente en busca de mejores expectativas económicas (Atias, 2011).

Según estudios en las zonas de endemia, un tercio de los triatomas está infectado
con T. cruzi, en algunas zonas rurales del norte de nuestro país, se encuentra el
vector Mepraia spinolai, responsable de la mantención de un ciclo de infección
silvestre, pero con poca trascendencia para la transmisión de T. cruzi al hombre.
La prevalencia de la infección en este, determinada mediante la aplicación del
xenodiagnóstico, varía entre 8 y 11 %, pero aumenta a 18% al emplearse pruebas
serológicas (HV, Ehrenfeld, & P, 1996). En Chile las formas crónicas la cardiópata
y principalmente las malformaciones digestivas son frecuentes; en cambio las
formas agudas son excepcionales, salvo las congénitas (López, 2001).

3.7 Diagnóstico:

El diagnóstico de laboratorio de la infección de T. cruzi, puede realizarse por

métodos directos, el cual comprueba la presencia del parásito de la muestra;
métodos moleculares, el cual pretende identificar la presencia de material genético
del parásito en la muestra y métodos indirectos que detectan la presencia de
anticuerpos específicos contra el parásito en la muestra (Minsal, 2011).

24
Método directos:

Observación microscópica al fresco identifica la presencia de

tripomastigotes de T. cruzi, por observación directa, en una muestra de
sangre fresca u otro fluido (Plasencia y Puente, 2010).

Gota gruesa: Permite la concentración de la muestra de sangre. Se

colocan 3 a 4 gotas de sangre sin anticoagulante en un portaobjeto, las que
luego se desfibrinan para posteriormente teñirse y ser observadas al
microscopio en busca de tripomastigotes de T. cruzi (Plasencia y Puente,
2010).

Método de concentración Microstrout: Examen microscópico de la fracción

leucoplaquetaria de la sangre total a partir de un capilar de
microhematocrito cargado con sangre del paciente, en búsqueda de las
formas tripomastigotes de T. cruzi (Minsal, 2011).

Xenodiagnóstico: El objetivo del xenodiagnóstico es detectar formas

tripomastigotes de T. cruzi en las deyecciones de triatominos post succión
de sangre infectada, utilizándose para ellos Guías de diagnóstico.

No obstante, actualmente en la práctica no se le emplea, sino sólo para

fines de investigación (CFS, 2009).

Método Molecular:

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés

Polymerase Chain Reaction) es la técnica más importante y revolucionaria
en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de
copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (DNA) a partir de una
sola molécula.

La PCR se basa en la replicación de DNA en la que actúa la polimerasa

para sintetizar dos nuevas hebras de DNA a partir de otra que funciona
como molde (Diaz, Flores, Jaime, & Sierra, s.f).

25
 Es de gran utilidad para ser usada en el diagnóstico de la infección con
Trypanosoma cruzi. Para ello se toma una muestra sanguínea de pacientes
a los cual se les extrae DNA total y se realiza PCR con un cebador para la
amplificación de un gen específico de Trypanosoma cruzi. Este método
sirve como indicador de la presencia de parásito en la sangre y puede
usarse también en tejidos infectados. Esta técnica es utilizada en nuestro
estudio.

Método indirecto:

Hemaglutinación indirecta. Este método se basa en la reacción de glóbulos

rojos sensibilizados con T. cruzi que entran en contacto con anticuerpos
específicos del parásito produciéndose aglutinación (reacción positiva).

Enzima Inmuno Ensayo (ELISA). Placas de poliestireno son sensibilizadas

con antígeno soluble de T. cruzi, los que se unirán a anticuerpos
específicos contra el parásito si están presente en la muestras. Se agrega
conjugado formado por un anticuerpo humano unido a una enzima y se
podrá evidenciar una reacción positivas si al adicionar sustrato especifico
se desarrolla una reaccion de color, que indicaria la presencia de
anticuerpos en la muestra del paciente (Plasencia y puente, 2010).

Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Técnica que permite determinar la

presencia de anticuerpo T. cruzi en diferentes muestras biológicas. Para
estos efectos, se preparan placas de vidrio con pocillos a las que se le
adhieren epimastigotes de T. cruzi (parásito completo) obtenidas de cultivo.
Si el suero del paciente tiene anticuerpos, se produce una reacción
antígeno anticuerpo. Esta reacción se observa posteriormente en un
microscopio de fluorescencia ( MINSAL, 2011).

Wester blot (inmunoelectrotransferencia). Permite detectar la presencia de

anticuerpo anti T. cruzi que han sido separados mediante electroforesis y
luego transferidos a una membrana sobre la cual se realiza una reacción

26
 enzimática, que según sea conjugado empleado. Detecta la presencia de
anticuerpos IgA, IgG o IgG por separado o simultáneamente. Las
reacciones positivas se observan como bandas de precipitación en tiras de
membranas sensibilizadas (Escalante et al 2014).

3.8 Antecedentes generales de las garrapatas

Las garrapatas constituyen junto a los ácaros el orden Acarina, más de 200
familias, 1.700 géneros y, aproximadamente, un millón de especies.

Las garrapatas son parásitos hematofagos probablemente los primeros en

especializarse en esta forma de alimentación. Se fijan firmemente en el huésped y
no pueden ser desprendidas fácilmente.

Los estadios finales de su ciclo evolutivo (ninfas y adultos), son altamente

resistentes al ambiente por poseer gruesas cutículas quitinosas.

Están libres relativamente de enemigos naturales (Atias, 2011).

La mayoría de las especies posee poca especificidad en cuanto a huéspedes.

Sólo muy pocas especies dependen de un único huésped, como es el caso de
Boophilus annulatus y B microplus, que parasitan al ganado bovino, desarrollando
sobre el animal todo su ciclo evolutivo (Atias, 2011).

3.81 Longevidad y duración del ciclo evolutivo:

La duración de la vida de algunas garrapatas puede llegar a varios años,

considerando la gran capacidad de ayuno de algunos estadios (principalmente
ninfas y adultos), y la capacidad de alargar su ciclo evolutivo en casos de
ambientes desfavorables (Atias, 2011).

Considerando estos antecedentes, es evidente la importancia médica y

epidemiológica de las garrapatas. Sin embargo, su capacidad de vector patógeno
se conoció recién a fines del siglo XIX, cuando se descubrió que ellas transmitían
una enfermedad protozoaria (piroplasmosis) del vacuno. Este descubrimiento
27
marcó un hito en la historia de la Entomología Médica, ya que con su
demostración se estableció por primera vez la posibilidad de transmisión de
agentes patógenos por medio de artrópodos. Estos hallazgos construyeron un
estímulo para que otros investigadores abordaran la problemática de las
enfermedades transmitidas por artrópodos en general y por garrapatas en
particular (Atias, 2011).

3.82 Ciclo evolutivo

La multiplicación de garrapatas se realiza por medio de huevos que la hembra,

según la especie, deposita en el suelo, bajo piedras, vegetales, árboles, o bien en
grietas de corrales, palomares, gallineros, viviendas humanas o de animales
(Atías, 1998).

La cantidad y forma de poner los huevos varía según se trate de garrapatas duras
o blandas.

Garrapatas duras: Después de alimentarse por varios días, se dejan caer al suelo
para realizar una sola postura en donde colocan entre dos mil y veinte mil huevos.

Garrapatas blandas: no ponen más de doscientos huevos por vez, pero realizan
varias oviposiciones después de sucesivas comidas de sangre.

Los huevos de ixodoideos después de varias semanas de incubación, originan

larvas hexápodas muy pequeñas (alrededor de 1 mm). Luego las larvas realizan
una muda (cambio cutícula) y se transforman en ninfas octópodos. Estas también
realizan una muda para convertirse en machos y hembras adultas. Todas estas
fases móviles (larvas, ninfas y adultos) se alimentan de sangre se sus
hospedadores por varios días hasta repletarse.

3.83 Clasificación por huésped:

Garrapatas de un huésped: Completan su ciclo de vida en un solo animal. En este

tipo de garrapatas, las larvas y ninfas se alimentan y cambian de cutículas en el

28
cuerpo del mismo animal y sólo las hembras fecundadas por los machos se dejan
caer al suelo para desovar.

Garrapatas de dos huésped: En estas la larvas se alimentan y sin dejarse caer al

suelo mudan en el cuerpo del mismo animal y las ninfas emergentes, luego de
alimentarse, abandonan el huésped para mudar y transformarse en adultos, los
que deben buscar huésped para alimentarse.

Garrapatas de tres huésped: En estas, tanto las larvas como las ninfas, después
de alimentarse se dejan caer al suelo para mudar de modo que las garrapatas en
este último estado después de la muda, deben encontrar un segundo huésped y
las adultas un tercero.

3.9 Antecedentes de Rhipicephalus sanguineus

El primer registro de Rhipicephalus sanguineus fue en el año 1806 por Latreille,

como Ixodes sanguineus (Dantas-Torres., 2007). Esta garrapata es de origen
africano desde donde alcanzó la más amplia distribución en el mundo (González,
et al, 2006), muestran gran adaptabilidad y resistencia a diferentes condiciones
climáticas encontrándose algunas especies en la Antártida, o en países con climas
muy fríos como Islandia o Rusia y también en condiciones más templadas como
los Estados unidos o Europa (Muñoz, 2000).

Es comúnmente llamada garrapata café del perro, garrapata Kennel, o garrapatas

de las perreras. Se encuentra distribuida en Chile en La Región Metropolitana,
Valparaíso, Viña del Mar y algunas localidades del norte y sur del país (Muños &
Casanueva, 2001). Es una garrapata de tres hospedadores, está descrito que
transmiten la piroplasmosis canina (Babesia canis) y la ehrliquiosis canina
(Ehrlichia canis). Las infecciones se transmiten a través de los huevos de la
garrapata. Existe, no obstante, cierta confusión en la bibliografía respecto de los
protozoos, rickettsias, bacterias y virus que pueden ser transmitidos por esta
especie (Soulsby, 1988).

29
3.10 Situación en Chile

Hasta el año 1971 se consideraba a Chile como un país prácticamente libre de

manifestaciones por garrapatas propias de los animales domésticos. No se habían
presentado infestaciones por Rhipicephalus sanguineus, hasta que en 1974 se
encontró un perro de la comuna de La Granja, de la Región Metropolitana,
intensamente parasitado por esta garrapata (Tagle, 1976). Debido al alto potencial
biótico de R. sanguineus, así como la existencia de condiciones ecológicas muy
apropiadas para su desarrollo (temperatura y humedad) y a la ausencia de
medidas de control oportunas, la garrapata logro diseminarse masivamente al
resto de las comunas de la Región Metropolitana de Chile, transformándose en
pocos años en uno de los problemas serios de higiene ambiental (Alcaino, 1985).
Además, actualmente también se ha extendido la infección a otras localidades del
norte y sur del país.

Los sectores de la población más afectados son los de escasos recursos, ya que,
por su condición de pobreza, la mantención de los perros dentro del recinto del
hogar es poco frecuente y la mayoría de ellos circula libremente por las calles,
infectandose o contaminando los terrenos permanentemente con larvas, ninfas o
adultos que se suben o bajan de sus cuerpos.

Las unidades de higiene ambiental de las totalidad de las comunas de la Región

metropolitana, (Alcaino, 1985; Chilet, 1990) se han visto obligadas a realizar
campañas contra la garrapata en los periodos de máxima infestación (primavera,
verano) y los resultados que han obtenidos no han sido del todo satisfactorio.

3.11 Taxonomía de Rhipicephalus sanguineus

Rhipicephalus sanguineus pertenece al Phylum Arthropoda el nombre deriva de

las palabras griegas arthros, articulación, y podos ¨pies¨, y hace referencia al
hecho de que los representantes del phylum tienen apéndices articulados
(Soulsby, 1987), dentro de los artrópodos, las garrapatas constituyen uno de los
más importantes grupos del punto de vista médico veterinario (Souza MF et al,

30
2012). Clase Arachnida, orden Parasitiformes; Familia Ixodidae por pertenecer a
esta familia Rhipicephalus sanguineus presenta tres formas parasitarias dentro del
ciclo de vida: larva, ninfa y adulto, siendo esta última la única con dimorfismos
sexual (Souza MF et al, 2012) género Rhipicephalus.

3.12 Ciclo vital de Rhipicephalus sanguineus

Las garrapatas de Rhipicephalus sanguineus de sexo femenino se alimentan en el

huésped durante cinco a veintiuno días. Una vez que se ha completado el
engordamiento, se separa y luego deja al huésped para digerir su comida de
sangre y poner huevos en un lugar protegido. La oviposición está precedida por un
periodo de preoviposición que oscila entre tres y catorce días. Las hembras
engordadas de R. Sanguineus generalmente ponen alrededor de 400 huevos,
pero pueden depositar 7.273 huevos. La temperatura óptima para la oviposición
de R. sanguineus está entre 20 y 30ºC. Después de que termina de poner sus
huevos, ella muere. Los huevos se depositan en grietas a nivel del suelo y el
periodo de incubación de los huevos oscila entre 6 y 23 días. Luego de la
incubación nacen las pequeñas larvas e inmediatamente comienzan a buscar al
huésped. Estas se alimentan de 3 a 10 días, antes de dejar al huésped para
transformarse en ninfas. El periodo de muda de las larvas oscila entre 5 y 15 días.
Finalmente se transforman en adultos en lo cual se asemejan en forma. (Dantas-
Torres., 2007). Los machos permanecen en el hospedero por varios días o
semanas, donde no realizan la ingurgitación completamente debido a la presencia
de un escudo que recubre su cuerpo, en este periodo puede fecundar a varias
hembras (Souza MF et al, 2012).

3.13 Sistema digestivo

El intestino de la garrapata está formado por una cavidad central, el estómago, y

una serie de divertículos amplios (los ciegos), junto con un pequeño tubo que
dirige los residuos de la digestión de la sangre ingerida hacia el exterior a través
del ano. La mayor parte del intestino está formado por divertículos que se dirigen a

31
todas las direcciones y en los tres planos a partir de la cavidad central. En las
garrapatas en ayunas , estos divertículos aparecen como tubos delgados y finos,
sin embargo, en las hembras ahítas se muestran como grandes sacos dilatados.
(figura 5)

Durante la ingestión de la dieta, el intestino de las garrapatas puede aumentar

varias veces su tamaño para acoger los más de 8 centímetros cúbicos de sangre
que pueden ingerir algunos ixódidos. Los procesos de digestión de las garrapatas
se pueden dividir en:

● Eliminación de exceso de agua de la sangre.

● Lisis de los fragmentos celulares y tisulares: Hemólisis
● Degradación de la hemoglobina y otras proteínas mediante hidrólisis.
● Almacenamiento de la hemoglobina en orgánulos llamados en
cuerpos residuales.

Estos cuerpos residuales son esenciales para la supervivencia de las garrapatas.

(Souza MF et al, 2012)

32
Figura 5. Estructura del intestino, (a) antes y (b) después de la ingestión de sangre
(Peña, 2014).

3.14 Importancia médica y veterinaria de las garrapatas

El daño causado por las garrapatas a sus hospedadores puede deberse a: (a)
heridas producidas por picaduras, que pueden predisponer al hospedador para
que sea atacado por moscardas productoras de distintas larvas y por moscas. (b)
chupando sangre (c) transmitiendo virus, bacterias y protozoos. Tanto los daños
causados por sus picaduras como por acción hematófaga, se han reducido a
consecuencia de la aplicación de medidas encaminadas al control de las
enfermedades transmitidas por garrapatas, pero ambos tipos de agresión son
importantes por sí mismas (Soulsby, 1988).

La piel sufre el trauma producido por los quelíceros cortantes del aparato bucal y
la garrapata se adhiere a la herida por su hipostoma dentado y succionando
sangre. Como consecuencia, se produce la inflamación, con hemorragia y edema
de la piel (Atías, 1998).

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Tipo de estudio

El presente trabajo consistió en un estudio de carácter cualitativo experimental

descriptivo de temporalidad transversal que tuvo por objetivo evaluar la presencia
de Trypanosoma cruzi en Rhipicephalus sanguineus.

4.2 Universo y área de estudio

El área de estudio se ubicó en la Región de Coquimbo, ciudad situada a 470

kilómetros al norte de Santiago, específicamente en los paralelos 29º 54’ 28’’ de
latitud Sur y meridiano 71º 15’ 15’’ de longitud Oeste. Específicamente el estudio
se desarrolló en el sector La Rinconada del Sauce de la presente ciudad. Este

33
sector es de tipo periurbano, como se observa en la figura 6, antiguamente sector
rural de la ciudad pero que ha ido surgiendo gracias al gran desarrollo geográfico y
demográfico que ha experimentado exponencialmente la ciudad de Coquimbo,
teniendo como necesidad utilizar los sectores rurales aledaños a la ciudad para
generar nuevos asentamientos poblacionales.

Figura 6: Ubicación geográfica, zona delimitada corresponde al área de muestreo

y recolección de muestras, sector El Sauce Rinconada, ciudad de Coquimbo,
Cuarta Región, Chile.

4.3 Población de estudio

En el presente estudio, nuestra población abarcó un número de 15 Rhipicephalus

sanguineus de cánidos que circulaban por el sector, con o sin propietarios,
escogidos de manera aleatoria (figura 7)

34
Figura 7 : Algunos cánidos pertenecientes a la población de individuos
seleccionados de forma aleatoria para la extracción de Rhipicephalus sanguineus.

4.4 Selección de la muestra

Las muestras usadas para este estudio, se extrajeron/aislaron Rhipicephalus

sanguineus de manera aleatoria de cánidos, para su posterior rotulación (tabla 1).

INDIVIDUOS CANTIDAD DE NOMBRE DE MACHOS HEMBRAS

CÁNIDOS MUESTRAS MUESTRAS

Individuo nº 1 1 1 1 -

35
Individuo nº 2 2 2A-2B 2A-2B -

Individuo nº 3 3 3A- 3B- 3C 3C 3A-3B

Individuo nº 4 4 4A-4B- 4C- 4D 4A-4B 4C-4D

Individuo nº 5 1 5 - 5

Individuo nº 6 1 6 - 6

Individuo nº 2 7A- 7B 7B 7A
7

Individuo nº 8 1 8 8 -

Tabla 1. La siguiente tabla detalla el número de individuos, las cantidades de

muestras extraídas de cada individuo y por consiguiente la sub rotulación de
éstas.

4.5 Instrumento para obtención de muestras

● Pinzas para extraer garrapatas.(tick twister)

● Guantes de procedimiento.

● Tubos microcentrífuga de 1,5 ml

36
4.6 Obtención de muestra

La extracción de la muestra se realizó con ayuda de pinzas específicas para

extraer garrapatas (tick twister), y el uso de guantes de procedimiento, para luego
almacenarlas en tubos de microcentrífuga de 1,5ml. Cada tubo, fue identificada
con una clave, en la que se especificaron los datos propios de la muestra: lugar y
fecha de captura y el animal a partir del cual se obtuvo (figura 8). Luego fueron
llevadas a la ciudad de Santiago de Chile, en los laboratorios de la Universidad de
Chile perteneciente al Doctor Christian Castillo; días después de haber sido
recolectadas.

Figura 8 : Almacenaje de muestras de Rhipicephalus sanguineus en tubos de

microcentrífuga.

4.6 Procedimiento

Tras su identificación, todos los ejemplares que fueron destinados a la obtención

de ADN se descontaminaron superficialmente por inmersión en etanol al 70%
durante 10 minutos. Posteriormente se lavaron dos veces en agua Milli-Q estéril,
secándose con papel filtro y fueron depositados en tubos de microcentrífuga de
1,5ml. La extracción del ADN de las muestras se llevó a cabo mediante el kit de
extracción WIzard Genomic (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y
del “protocolo de extracción de DNA a partir de explantes por Ana Liempi y
Christian Castillo”. La concentración de DNA de cada muestra se determinó

37
mediante espectrofotometría con el sistema uDropPlate en un lector
VarioskanFlash (Thermoscientidic).

Extracción de DNA: Una vez enumerados nuestros tubos de PCR, se

procedió a la disección de las muestras (garrapatas) con el objetivo de
extraer todo el contenido abdominal de estas, realizando la excepción en
los machos, los cuales dado su inferioridad en tamaño en comparación con
la hembra, solo se retiraron extremidades y la cabeza. Las hembras por
otro lado, se disectaron con un bisturí realizando un corte en la porción
abdominal y en conjunto con la ayuda de una pinza de disección se realizó
un raspado extrayendo sólo el contenido abdominal y eliminando todo lo
que formaba parte del exoesqueleto.(Figura 9). Una vez que se extrajo todo
el contenido, se depositó en los tubos de PCR (previamente identificados y
rotulados) en conjunto con 600 μL de “Nuclei Lysis Solution” y se
homogeneizaron, manteniendo las muestras en hielo. (Figura 10).
Posteriormente se incubaron las muestras por 15 a 30 min a 65ºC. Luego
se adiciono 3 μL de “RNAse solution” al lisado nuclear y se mezcló la
muestra invirtiendo el tubo de 2-5 veces (Figura11). A continuación, se
volvió a incubar las muestras por 15-30 min a 37ºC y se dejó que las
muestras se enfriaron a RT( room temperature por sus siglas en inglés) por
5 min antes de seguir con el siguiente paso (Figura 11). Cuando la muestra
estuvo a RT, se adiciona 200 μL de “Protein Precipitation Solution” y se
agitó vigorosamente en el vortex por 20 segundos (Figura 12). Luego se
dejó enfriar la muestra en hielo por 5 minutos. Posteriormente se centrifugó
por 4 minutos a 13.000-16.000 xg, formándose un pellet duro de color
blanco, el cual correspondía a las proteínas precipitadas. Paso siguiente,
fue remover cuidadosamente el sobrenadante que contenía el DNA,
dejando el pellet en el tubo para transferir el sobrenadante a un tubo
Eppendorf limpio de 1,5 ml el cual contenía 600 μL de isopropanol a RT.
(Era importante dejar el pellet de proteína con algo de líquido residual para

38
evitar el arrastre de proteínas que podrían contaminar la muestra con el
sobrenadante).

Una vez transferido el sobrenadante que contenía el DNA, se mezcló

gentilmente la solución por inversión hasta que se observó una hebra
blanca visible de DNA. Esta posteriormente se centrifugó a 10.000-16.000
xg durante 1 minuto a RT, para luego observarse un pellet de DNA color
blanco (Figura 13). El resto del sobrenadante se descartó cuidadosamente.
Seguido de esto se adiciona 600 μL de etanol al 70% a RT y se invirtió el
tubo gentilmente varias veces para lavar el DNA. Luego se centrifugó
nuevamente por 1 minuto a 13.000-16.000 xg a RT.

Se procedió a aspirar el etanol cuidadosamente utilizando una micropipeta

con mucho cuidado. El pellet de DNA se soltó con facilidad por lo que se
debió tener muchísima precaución de no arrastrarlo en conjunto con el
etanol. Se invirtió el tubo sobre una toalla nova y se dejó secar al aire libre
el pellet durante 20-25 minutos. (Figura 14). Luego de esto, se adicionan
100 μL de “DNA Rehydratation Solution” y se rehidrató el DNA para luego
ser incubado a 65º C por aproximadamente 1 hora. Esto fue mezclado
periódicamente de manera muy suave.

Finalmente el DNA se debió almacenar a una temperatura de 2-8ºC (Figura

15).

Figura 9 : Disección de muestras para extraer contenido abdominal.

39
º
Figura 10. mantención de muestras ya homogeneizadas mantenidas en
hielo.

Figura 11: Adición de 3 μL de “RNAse solution” a las muestras.

Figura 12: Muestras colocadas es vortex luego de la adición de 200 μL de

“Protein Precipitation Solution”

Figura 13: Pellet de DNA sobrante resultante de la centrifugación.

40
Figura 14: Secado del pellet de DNA.

Figuras 15. DNA almacenado a 2ºC de temperatura

Amplificación por PCR: Básicamente el procedimiento a seguir se basó en

lo siguiente:

Se amplificó un fragmento de 384 pares de bases correspondiente a DNA

de minicirculos de T. cruzi. Las secuencias de los partidores fueron:

S35:5'-AAATAATGTACGGGKGAGATGCAT-3';

S36:5'GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT-3'.

Para un volumen total de 50 µL se mezclaron 500 pg de DNA genómico,

25µL de SapphireAmp ® Fast PCR Master Mix (Takara Bio Inc., Japón) y
10 nmol de cada partidor. Los ciclos termales fueron: 2 ciclos de
denaturación de 1 min a 98°C y 2 minutos a 64°C, seguidos de 30 ciclos de

41
 1 minuto a 94°C y 1 minuto a 64°C. La extensión final fue de 10 min a 72°C.
Los amplificaciones de DNA se separaron en geles de agarosa al 1%
preparados en tampón Tris-borato-EDTA y se tiñeron con la tinción de
ácidos nucleícos GelRed® (Biotium, EE.UU.). Los geles se digitalizaron en
un transiluminador UV.

Electroforesis y revelado de los productos: al acabar la reacción, las

amplificaciones de DNA se observaron a través de electroforesis en geles
de agarosa. En el cual estos geles fueron cargados con las muestras y
además con un marcador molecular, facilitando la identificación de las
amplificaciones. Finalmente la visualización de las amplificaciones se llevó
a cabo tomando una fotografía digital al gel de agarosa expuesto a luz UV (
Figura nº 16).

4.7 Análisis de datos

El análisis se realizó en base a construcción de tablas y gráficos en Microsoft

Excel office 2016, que representa los datos obtenidos y variables utilizadas. Se
realizó análisis estadístico, utilizando T de Student para la interpretación de
resultados significativos o no significativos ( todo valor menor a 0.05 es
significativo)

V. RESULTADOS

Los resultados obtenidos se visualizaron mediante el método PCR, en la figura

16.1 y 16.2. Los productos de las amplificaciones están representadas mediantes
bandas de un tamaño específico y se comparan con un marcador de peso
molecular conocido para determinar el peso molecular de la amplificación. Se
observa la detección de DNA parasitario en Rhipicephalus sanguineus mediante
PCR.

42
 400pb

300pb

Figura 16.1 PCR Gel de

agarosa: Amplificación de
ADN de Trypanosoma cruzi
mediante PCR a partir de
DNA de Rhipicephalus
sanguineus. En los carriles
2,3,4,5,6,7,9,11 se detecta DNA parasitario.

43
 400pb

300pb

Figura 16.2 PCR: Carriles MW: marcador de peso molecular; 13 Ausencia de

material genético de T. cruzi 14 y 15 Presencia de material genético de T. cruzi.

Resultados del método diagnóstico PCR para la detección de Trypanosoma

cruzi, en muestras de Rhipicephalus sanguineus, extraídas de cánidos del
Sector la Rinconada, El Sauce, Coquimbo IV Región, Chile, 2018.

El número total de muestras de Rhipicephalus sanguineus obtenidas de los

individuos caninos correspondieron a 15. De las cuales 9 presentaron DNA de
Trypanosoma cruzi considerándose positivas (60%) y 6 no presentaron DNA de
Trypanosoma cruzi considerándose negativas (40%) (Tabla 2)(Figura).

Tabla 2. Resultados obtenidos que demuestran la presencia de DNA de

Trypanosoma cruzi en Rhipicephalus sanguineus.

Individuos Total Positivas a DNA Negativas a DNA

muestras de T de T
cruzi cruzi

Rhipicephalus 15 9 6
sanguineus

44
Gráfico 1: Porcentaje de Rhipicephalus sanguineus positivos/negativos.

Presencia de Trypanosoma cruzi, detectadas en muestras Rhipicephalus

sanguineus, según género; extraídas de cánidos del Sector la Rinconada, El
Sauce, Coquimbo IV Región, Chile, 2018.

Dentro de las muestras positivas, 5 corresponden a Rhipicephalus sanguineus de

género masculinos (55,55%), y 4 corresponden a Rhipicephalus sanguineus de
género femenino (44,44%) (Tabla 2).

Tabla 3. Cuantificación de muestras positivas según género

Género Positivos %

Machos 5 55,55%

Hembras 4 44,44%

Total 9 100%

45
Gráfico 2 : Gráfico circular, en base a la cuantificación de muestras positivas
según género.

46
Análisis estadístico de la presencia de Trypanosoma cruzi, detectadas en
muestras Rhipicephalus sanguineus, según género; extraídas de cánidos del
Sector la Rinconada, El Sauce, Coquimbo IV Región, Chile, 2018.

Dentro de los resultados positivos de cada género se realizó el análisis

estadísticos de datos mediante T de student, (P>0,05) entre los dos grupos. Por lo
tanto se determinó que T. cruzi no presentó diferencia estadísticamente
significativa entre género masculino o femenino de Rhipicephalus sanguineus.
Tabla 4.

Variable 1 Variable 2

Media 0,63 0,57

Varianza 0,27 0,29

Observaciones 8,00 7,00

Varianza agrupada 0,28

Diferencia hipotética 0,00

de las medias

Grados de libertad 13,00

Estadístico t 0,20

P(T<=t) (una cola) 0,42

Valor crítico de t (una 1,77

cola)

P(T<=t) (dos colas) 0,846880

47
 Valor crítico de t (dos 2,16
cola)

Hipótesis nula P(T<=t)>0,05 No existe diferencia significativa entre las dos

muestras

Hipótesis alterna P(T<=t)<0,05 Existe diferencia significativa entre las dos

muestras

VI. DISCUSIÓN

El objetivo del siguiente estudio fue determinar la presencia de DNA de

Trypanosoma cruzi en Rhipicephalus sanguineus, provenientes de cánidos
domésticos; que deambulan durante el periodo de otoño en el sector La
Rinconada, El Sauce en la ciudad de Coquimbo. En primera instancia, se detectó
material genético de este parásito en sangre de Rhipicephalus sanguineus
mediante la técnica diagnóstica de PCR tiempo final, hallando un 60%
(correspondiente a 9 muestras positivas de un N total de 15 muestras) de
Rhipicephalus sanguineus infectados. Si bien no se encontraron estudios que
validen la presencia de DNA de T. cruzi en la garrapata marrón del perro, hay
estudios anteriormente realizados que avalan la presencia de protozoos flagelados
en Rhipicephalus sanguineus, donde en 1930 a través de métodos directos
(microscopia y cultivo en LIT/NNNmedium) detectaron la presencia Trypanosoma
y en el año 2005 en Brasil, por medio de la misma técnica detectaron un 2,7%
(correspondiente a 1 muestra positivas de un N total de 37 muestras) de infección
en Rhipicephalus sanguineus. Esta diferencia de las tasas entre nuestro estudio y
el estudio realizado en el año 2005 pudieron deberse a la diferente técnica
diagnóstica utilizada para la detección del parásito; y también al número total de
muestras analizadas en los estudios correspondientes.

48
Algunos autores han señalado que la sensibilidad de PCR tiempo final en
detección de parásitos en Rhipicephalus sanguineus es mucho más sensible y
específicos que otras técnicas de diagnósticos parasitológicos tales como
Xenodiagnóstico y hemocultivo (Rocha, 2006). Es por eso que nuestra tasa de
positividad fue mucho más alta a diferencia de los dos estudios anteriores; Por
ende, se puede inferir que esta diferencia se debió al tamaño de muestra utilizada
en nuestro estudio.

No se encontró literatura disponible referente a la diferenciación de porcentajes de

acuerdo a género; sin embargo, (Dias, Schofield, Machado, & Fernandes, 2005)
realizarón su investigación utilizando sólo el género femenino como sujeto de
prueba, ésto debido a la característica anatómica que presenta la garrapata
hembra, obteniéndose como resultado el 2,7 % de positividad de un N Total de 37;
en comparación en nuestro estudio el género femenino arrojó un resultado de
44.4% de un N total de 15 correspondiente a un número de 4 Rhipicephalus
sanguineus hembras, y en el género masculino 55.6% de un N total de 15
correspondiendo a un número de 5 Rhipicephalus sanguineus machos. Mediante
T de student no se logró demostrar diferencia significativas en este estudio
realizado, dándonos un “p” de 0,70 valor que fue mayor al nivel de significancia
(0,05), indicándonos un riesgo de 5% de concluir que los datos no siguen una
distribución normal,entendiéndose que si el valor p es mayor que el nivel de
significancia la decisión es que no se puede rechazar la hipótesis nula
(Muriel ,2020)

De acuerdo a Diaz y Fernández, (2001) existen varias posibles causales frente a

esta situación, una de ellas es el tamaño muestral, que afecta la probabilidad de
significación estadística a través del error estándar que se hace más pequeño
cuantos más pacientes tenga el estudio. Así pues el valor de "p" es función de la
magnitud de la diferencia entre dos grupos o dos variables y del tamaño de la
muestra. Por esta razón una pequeña diferencia puede ser estadísticamente
significativa si disponemos de un tamaño muestral lo suficientemente grande y por
el contrario un efecto o diferencia relativamente grande puede no alcanzar la
49
significación estadística debido a un pequeño tamaño muestra. Es por estas
razones que los valores de "p" de nuestro estudio deben ser considerados solo
como una guía y no como base de conclusiones definitivas e irrevocables.

El 60% de las presentes muestras de casos positivos de un N total de 15

Rhipicephalus sangineus de nuestro estudio, debería generar una llamada de
atención en el ámbito veterinario y la salud pública de la zona. Debido a que este
es el primer estudio en el que se realiza PCR para la detección de T. cruzi en
Rhipicephalus sanguineus extraídas de cánidos en zonas periurbanas de la región
de Coquimbo. Dado estos resultados positivos en el presente estudio hacemos
un llamado a profundizar aún más este tipo de investigaciones, además de
implementar diferentes tipos de técnicas diagnósticas para determinar si realmente
las garrapatas son solo un reservorio o quizás pueden llegar a ser vectores. Para
esto sería bueno además agregar un estudio para la detección de T. cruzi tanto en
las garrapatas como en los cánidos de los cuales se obtuvieron las muestras
positivas, sin embargo, para estimar si Rhipicephalus sanguineus es vector , se
debe de realizar estudios experimentales de infección a cánidos clínicamente
sanos, lo cual es considerado moralmente poco ético.

50
 VII. CONCLUSIÓN

Existe el 60% (9/15) de las muestras de Rhipicephalus sanguineus positivas con

material genético de T. cruzi a través de método diagnóstico de PCR.

En ambos géneros, se encontró presencia de T. cruzi.

No se encontró diferencia estadísticamente significativa para el género masculino

o femenino de Rhipicephalus sanguineus.

Esta información pone en debate la necesidad de generar nuevos estudios para

determinar vectores emergentes que podrían estar involucrados en posibles
zoonosis a nivel regional e incluso a nivel global.

51
 VIII. BIBLIOGRAFÍA

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IX. ANEXO

GLOSARIO

1. Enfermedad de Chagas: también conocida como tripanosomiasis

americana o Mal de Chagas-Mazza, es una enfermedad parasitaria tropical
desatendida causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. La
enfermedad es una zoonosis que afecta a varios vertebrados salvajes,
desde donde se transmite al ser humano a través de triatominos, tales
como Triatoma infestans, Rhodnius prolixus y Panstrongylus megistus.

2. Garrapatas: son ácaros macroscópicos, parásitos obligados ya que sólo se

alimentan de la sangre de sus hospedadores. Su ciclo vital es complejo,
con varias fases evolutivas, y en el proceso de picadura pueden transmitir
numerosas enfermedades, algunas de ellas extremadamente graves.

3. Transmisión: en medicina, es el mecanismo por el que una enfermedad

transmisible pasa de un hospedero a otro (independientemente de que este
segundo estuviera o no previamente afectado).

55
4. Reservorio: Organismo que aloja virus, bacterias u otros microorganismos
que pueden causar una enfermedad contagiosa y que puede propagarse
hasta producir una epidemia.

5. ADN: es una sigla que corresponde a ácido desoxirribonucleico: el

biopolímero que alberga los datos para la síntesis de las proteínas y que
compone el material de tipo genético que tienen las células.

6. PCR: conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain
reaction), es una técnica de biología molecular y su objetivo es obtener un
gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un
mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original,
o molde.

7. Enfermedad emergente: es la provocada por un agente infeccioso

recientemente identificado y anteriormente desconocido, capaz de causar
problemas de salud pública a nivel local, regional o mundial. Uno de los
ejemplos más característicos es el Síndrome de la Inmunodeficiencia
Adquirida (SIDA) producido por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana
(VIH).

56