Kary Mullis c1983

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html
Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-
65.
 Reacción en cadena de la
polimerasa

Revisión General del PCR

Aplicaciones del PCR
 Que es la PCR?

Método de amplificación rápido versátil y

simple método in Vitro que selectivamente
amplifica una secuencia o región de ADN o
ARN
 Reacción Requerimientos básicos
en Cadena de la Polimerasa

q Molde de DNA or RNA

q 2 oligonucleotidos (primers: FW y RV) complementario a
diferentes regiones del templado.
q DNA polimerasa termo estable.
q 4 nucleótidos (dATP, dGTP, dTTP y dCTP
q Apropiado tampón.
q Aditivos: DMSO, gelatina
Todos los buffer no son iguales

´Sales 10-50 mM Tris pH 8.3

´Catión monovalente 100-150 mM KCl o NaCl

´Catión divalente 1.5uM o > MgCl2+

Mg2+, Mn2+

´ Aditivos DMSO, Glicerol, Gelatina

 Principios Básicos del PCR

1. Cadena de templado DNA (o RNA) son

separados por denaturación por calor.

2. Partidor sentido (Forward Primer) se une a una

hebra del molde y un partidor anti-sentido
(Reverse Primer ) a la otra hebra.

3. DNA polimerasa extiende desde un 3’ OH libre de

cada partidor, copiando el molde.

4. Las etapas 1-2-3 se repiten muchas veces.

DENATURATION
93°C - 95°C
ANNEALING
50°C - 65°C

25-40 CYCLES

DENATURATION EXTENSION
93°C - 95°C 72°C
https://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU
 Fases del PCR

PCR es descrito por la Formula:

N= es el numero de copias en el ciclo n N:  Nox2n

No= en el numero de copias iniciales.
n= es el numero de ciclos ejecutados
 Que equipamiento necesito
Electroforesis
PCR
Agarosa o PAA

3-4 horas

Producto final Visualización UV

Siempre Recordar!

´ PCR es una técnica altamente sensible –

Contaminación con DNA extraño puede ser un
Problema
´ Siempre correr controles
´ negativos

´ Siempre Incluir un control positivo

´ Usar puntas con filtros
´ Áreas separadas y limpias
´ Usar UV Gabinetes
Aplicaciones del PCR

•Clonación de genes o fragmentos génicos

•Diagnostico genético : Detección de mutaciones, test
de partenidad.
•Diagnostico viral en peces, plantas.
•Mutagénesis para detectar función
•Análisis Forenses
•Identificar genes de expresión diferencial : Reverse
transcription (RT)-PCR
•Identificaciones de nuevos genes.
•Control de calidad Industrial
 PCR

´ Que Taq polimersa utilizar

´ Depende para que quiero amplificar:

´ Taq polimersa recombinante

´ Alta fidelidad: Pfu, Platinum ® Pfx DNA

polymerase, Taq, Vent, Deep Vent y UlTma
DNA polymerases, Stratagene’s Pfu DNA
polymerase
 Partida en caliente (hot start PCR):
Taq recombinante modificada
´ DENATURACIÒN LARGA
´ SOBRE 5 MIN
´ Evita amplificaciones ´ TRAS LA DENATURACIÒN
inespecíficas SE AGREGA LA TAQ
POLIMERSA
´ GENOMAS COMPLEJOS
´ Se evita que los primers
´ Alto contenido de GC se puedan unir de forma
inespecífica.
´ DMSO
 Taq polimersa para partida en
caliente
Modificada químicamente

Contienen un anticuerpo

Aplitaq Gold (applied Biosystem)

Taq Platinum Invitrogen

Taq polimerasa

´ Normal:
´ DNA polimerasa carece de actividad 3’-5’
exonucleasa.
´Proofreading
´Adiciona una A en los extremos 3’

´ Pfu:
´ Encontrada en una arquea hipertermofílica :
Pyrococcus furiosus
 Primers
´ Complementaria a la hebra opuesta.
´ 5’a 3’ sense primer
´ 3’a5’ anti-sense primer

´ Características
18-26 nucleótidos
Mezcla de GC y AT
Tm oC= 2(A/T) + 4(G/C)

´ No debe tener un gran contenido de GC y menos repeticiones.

Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F

En donde M es la concentración molar de cationes monovalentes,

XG y XC fracciones molares de G y C en el oligo, L es la longitud de
la cadena, y F es la concentración molar de formamida
Diseño de partidores

´ Primer Melting Temperature: Tm.

´Primers con temperatura de un

rango de 52-58 °C generalmente
produce buenos resultados
 Características

´ GC Content : The GC content (the number of G's and

C's in the primer as a percentage of the total bases) of
primer should be 40-60%.

´ GC Clamp : The presence of G or C bases within the lat

five bases from the 3' end of primers (GC clamp) helps
promote specific binding at the 3' end due to the
stronger bonding of G and C bases.

´ More than 3 G's or C's should be avoided in the last 5

bases at the 3' end of the primer
Primer

´ PRIMER-­PRIMER  (malos)
atcggactatcga ´ Similitud  entre  los  primers,  especialmente  
en  el  3’:  conduce  a  formar  dímeros.  
gctatacttatggcca

atcggactatcga
´ PRIMER-­TARGET  (Bueno)
tagcctgatagctatacttatggcca
´ Idealmente  debe  tener  un  100%  de  
similitud,  para  una  máxima  especificidad.
´ Muchas  veces  no  son  100%  iguales
Primer-Dimer

´ Producto no
deseado.
´ Resulta de un
anillamiento consigo
mismo o con el otro atcggactatcga
primer. gctatacttatggcca

´ primers extendido en
el PCR. atcggactatcgatatgaataccgga
tagcctgatagctatacttatggcca
 Temperatura de
anillamiento del primer
´ Tm es critica

´ Demasiado alta

´ Demasiado baja : Productos inespecíficos.

´ Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (product) – 14.9

Tm(primer) = Melting Temperature of the primers

Tm(product) = Melting temperature of the product

´ Ta= -5 °C del Tm de los partidores

Sitios

´ http://www.changbioscience.com/prim
o/primo.html .

´ http://www.premierbiosoft.com/primerd
esign/index.html

´ http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Mole
cular/seq_anal/primer_design/primer_de
sign.htm

´ http://www.idtdna.com/analyzer/Applic
ations/OligoAnalyzer/Default.aspx
Variantes de la PCR

´ PCR Larga
´ Supera los límites de la PCR convencional
para amplificar con fidelidad:
´Entre 5 a 40 Kb
´Se utiliza una elongasa mas una Taq
(Pfu).
´ PCR anidada
 Semi-Nested PCR

5´ 3´

5´ 3´

Partidores

P1-P2 = 70 – 120 bp
P1 – P3 = 200 – 300 bp
 Nested PCR

5´ 3´

5´ 3´
Técnica de RT-PCR

´ Permite la amplificación de una

cantidad pequeña de moléculas diana
de RNA (tanto mRNA como RNA total),
en forma de cDNA.

´ Consiste en la transcripción reversa del

RNA a un DNA complementario.
Células Bacterias
eucariotas
Requerimientos para el RT

´ RNA
´ Oligo dt
´ partidor específicos, randon primer
´ DTT
´ dNTP
´ Inhibidor de ribunucleasas
´ Transcriptasa reversa
´ Buffer adecuado
´ Baño o termociclador
´ Amplificar un cDNA a partir de RNA

´ útil cuando se dispone de pequeñas cantidades de RNA

´ Se utiliza comúnmente para amplificar genes específicos.

´ Requiere primer “antisense” y una DNA polimerasa

´ dependendinte de RNA.

´ Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA.

´ Se sintetiza el cDNA a partir del templado de RNA.

´ Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el

duplex de cDNA por PCR

´ SE PUEDE CLONAR.
Transcripción Reversa

´ Expresión del DNA y extracción del RNA de interés.

reacción
3- Usando oligo (dT)

´ Para amplificar mRNA

eucariota.
´ El oligo se une y se
sintetiza el cDNA.
Degradación de la cadena de
RNA (actividad de la
transcriptasa).
 PM                                    GAPDH                          RPRM                                  GAPDH                                RPRM  
Muestra                    Muestra                              Blanco                                Blanco

200  pb  

221  pb   197  pb  

38
Retrotranscriptasas

´ M-MLV (Retrotranscriptasa del Virus

de la Leucemia Murina).
´
´ AMV (Retrotranscriptasa del Virus de
la Mieloblastosis Aviar).

´ rTth DNA Polimerasa recombinante

de Thermus thermofilus.
Enzimas de
restricción
Reconocen secuencias especificas
Restriction  Enzymes
• Werner Arber was one of the recipients of the 1978 Nobel Prize in
Physiology or Medicine, an award he earned for his discovery
(with Stuart Linn) of restriction enzymes,
Palindromes in DNA sequences

Genetic palindromes
5 3’
are similar to verbal
’ palindromes.

A palindromic
sequence in DNA is
one in which the 5’ to
3’ 5 3’ base pair sequence
’
is identical on both
strands.
Restriction enzymes recognize
and make a cut within specific
palindromic sequences, known
as restriction sites, in the DNA.
This is usually a 4- or 6 base pair
sequence.
Restriction Endonuclease Types

Type I- multi-subunit, both endonuclease and

methylase activities, cleave at random up to
1000 bp from recognition sequence.

Type II- most single subunit, cleave DNA within

recognition sequence.

Type III- multi-subunit, endonuclease and

methylase about 25 bp from recognition
sequence
Hae III

HaeIII is a restriction enzyme that

searches the DNA molecule until it
finds this sequence of four nitrogen
bases.

5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’
3’ ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5’
Once the recognition site is found Hae III
will cleave the DNA at that site

5’ TGACGGGTTCGAGGCCAG 3’
3’ ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5’
These cuts produce
“blunt ends”

5’ TGACGGGTTCGAGG CCAG 3’
3’ ACTGCCCAAGGTCC GGTC 5’
 The names for restriction enzymes come from:

´the type of bacteria in which the enzyme is

found
´the order in which the restriction enzyme was
identified and isolated.

EcoRI for  example

R strain  of  E.coli bacteria  
I as  it  is  was  the  first  E.  coli  restriction  enzyme  to  
be  discovered.
“blunt ends” and “sticky ends”
M-MLV

´ Usa como Primer RNAss,

DNA e híbridos DNA-
RNA.
´ Sintetiza cDNA a partir
de RNA
´ Sintetiza la hebra
complementaria cDNA

´ Se extrae del gen (pol)

del virus, clonado en E.
coli.
M-MLV

´ Puede trabajar con nucleótidos marcados

radiactivamente.

´ Tiene baja actividad RNasa H (una alta actividad

disminuye la efectividad).

´ Realiza la transcripción reversa a 37ºC en unos 60

minutos.
AMV

´ Usa como Primer DNA y necesita iones Mn o Mg para

el inicio de su actividad.
´ Sintetiza cDNA a partir de molde de RNA.
´ Puede llevar a cabo la reacción a elevada
temperatura (70ºC)
´ mejora el rendimiento
´ Rompen estructuras secundarias de RNA.
AMV

´ Tiene actividad RNasa, lo que debe tenerse en

cuenta si esta actividad no es deseada.

´ Debe usarse en conjunto con otra polimerasa para la

amplificación.

´ Siempre agregar inhibidor de RNasa

Otras modificadas

´ Mutación que permite inhibir la actividad RNase H

´ M-MuLV Reverse Transcriptase (RNAse H minus).
 Un polimorfismo de un solo
nucleótido o SNP

´ Son la forma más sencilla y más común de polimorfismo genético ya que

consisten en el cambio de un solo nucleótido en el contexto de una secuencia
genética.
´ Se considera que ellos determinan la mayor parte de la variabilidad
genética entre los individuos, causando muchas de las diferencias fenotípicas
(observables) en ellos.

´ Los SNP constituyen hasta el 90% de todas las variaciones genómicas humanas,
´ Frecuencia: hay grandes variaciones según la especie, cromosomas y regiones dentro
de ellos, es de 1 SNP cada 500-­1000 nucleótidos, o quizás menos, de solo uno cada 100–
300 pb (pares de bases) Dos tercios de los SNP corresponden a la sustitución de una
citosina (C) por una timina (T).
´ Estas variaciones en la secuencia del ADN pueden afectar a la respuesta de los
individuos a enfermedades, bacterias, virus, productos químicos, fármacos, etc..
Donde se encuentran
SNPs pueden o no alterar la
estructura de una proteína.
 Técnicas para su detección

´ El tipo de polimorfismo de los SNPs puede detectarse por

varios métodos y dada su gran importancia biológica,
´ Los SNPs pueden aislarse a partir de ADNc, ARN mensajero y
ESTs o secuencias expresadas y marcadas (Expressed
Sequence Tags, ESTs).
´ Los métodos de detección basados en la PCR son los
preferidos por su eficiencia y rapidez. La técnica de SSCP
conocida como polimorfismo conformacional de cadena
simple (Single Strand Conformational Polymorphism, SSCP)

´ Es la tecnica recomendada para detectar los SNPs por su

capacidad para identificar mutaciones puntuales. Esta
técnica se basa en la migración diferencial del ADN y es
capaz de distinguir cambios de pocos nucleótidos en una
secuencia de más de 1 Kb.
SSCP
(Single Strand Conformation polimorphism)

´ Orita et al (1981.
´ SSCP es una técnica de separación
electroforética de ácidos nucleicos de
simple hebra.
´ Se basa en la diferencia en la secuencia.
´ Resulta en una diferente estructura
secundaria.
´ Posee una distinta movilidad
electroforética.
´ Metodología que permite la detección de
polimorfismos de un nucleótido (SNP)
Se  realiza  sobre  fragmentos  pequeños  
de  100  a  300  pb  

•Productos  de  PCR

•Productos  de  digestión  enzimática  

Esquema Técnica SSCP