REACTIVOS
JUEGO DE REACTIVOS PARA AMILASA (Las concentraciones se refieren al reactivo constituido): p-Nitrofenol
Para la determinación cuantitativa de amilasa en suero y orina. D-Maltosido 0.9 mM, Glucoxidasa 25,00 U/L. Glucoamilasa 10,000,
Cloruro de Sodio 50 nM, Cloruro de Calcio 5 nM, Buffer 50 nM, pH
INTRODUCCION 6.9 + -0.1.
La amilasa fue primeramente medida cuantitativamente por el método
iodométrico por Wohlegemuth en 1908. Sogogyi introdujo un método PRECAUCIONES
en 1938 que estandarizaba las cantidades de almidón de yodo. Este Estos reactivos son para diagnóstico IN VITRO
trabajo fue la base de los ampliamente utilizados métodos
amminoclásticos y sacarogénicos introducidos en 1956 y 1960 PREPARACION DEL REACTIVO
respectivamente. Las desventajas de éstos métodos es que incluían 1. Reconstituya el reactivo con el volumen de agua destilada establecido
largos tiempos de incubación. La interferencia de la glucosa endógena y en la etiqueta del frasco.
las inestables reacciones de color, dando por resultados una pobre 2. No pipetee el agua con al boca para evitar la contaminación de
reproducibilidad y confiabilidad. amilasa salivar.
Rinderknet y colaboradores introdujeron un método de cromógeno ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO
acoplado al almidón que era relativamente simple de realizar. Sin 1. Mantenga el reactivo seco entre 2 – 8°C.
embargo, el procedimiento utilizaba un substrato insoluble, perdía 2. El reactivo constituido es estable por lo menos durante 10 días a
linealidad y además requería centrifugación o filtrado. temperatura ambiente (18 – 25°C), y por lo menos durante 30 días en
refrigeración (2 – 8°C).
Los procedimientos turbidimétricos que han sido introducidos son
relativamente rápidos pero requieren de instrumentos especiales y RECOLECCION DE LA MUESTRA Y ALMACENAMIENTO
tienen dificultad para reproducir estabilidad en las soluciones de 1. La muestra adecuada es el suero no bemolizado.
almidón. 2. Puede utilizarse plasma heparinizado.
3. Otros anticoagulantes, como el citrato y el EDTA se unen al calcio,
Se han propuestos varios métodos enzimáticos, incluyendo uno que un ión que es necesario para la actividad de la amilasa.
utiliza el substrato definido de maltotetraosa. Estos métodos representan 4. El pH de las muestras de orina deben ajustarse a pH 7 y mantenerse
un significativo desarrollo en las mediciones de amilasa pero aún están refrigeradas hasta que se vayan a analizar.
sujetos a largos tiempos de incubación, posible interferencia de la 5. La amilasa en suero y orina se mantiene estable por una semana a
glucosa endógena y una serie de otras interferencias potenciales con la temperatura ambiente (18 – 25°C) y por varios meses cuando se
formación de NADH. refrigeran entre 2 – 8°C y protegida de la evaporación y la
contaminación bacteriana.
PRINCIPIO
INTERFERENCIAS
Young y colaboradores han publicado una lista de medicamentos que
PNPGY -------------- > PNPG3 + Maltotetraosa. afectan la determinación de la amilasa.
MATERIALES PROVISTOS
PNPG3 --------------- > PNPG1 + Glucosa Reactivo de amilasa
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS
PNPG1 --------------- > p-Nitrofenol + Glucosa 1. Pipeta de precisión.
2. Tubos de ensayo y portatubos.
La amilasa hidroliza el p-Nitrofenil D-maltoheptosido (PNPG7) en 3. Reloj.
p-Nitrofenil-maltoriosa (PNPG3) y Maltotetraosa. 4. Bloque térmico (37°C)
5. Espectrofotómetro capaz de leer a 405 nm (400 – 420 nm). El sistema
de cubetas debe tener una temperatura controlada para mantener la
SIGNIFICACION CLINICA temperatura a 30°C durante el examen.
La determinación de la actividad de la amilasa en el suero y en la orina
es el método más generalizado en el diagnóstico de la pancreatitis PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO
aguda. En la pancreatitis aguda los niveles de amilasa se elevan por Vea las instrucciones del instrumento a utilizarse.
períodos mayores en la orina que en el suero. Por consiguiente, la
determinación del rango de la amilasa y el aclaramiento de la creatinina PROCEDIMIENTO MANUAL
es importante en el seguimiento del curso de la pancreatitis. 1. Reconstituya el reactivo de acuerdo a las instrucciones.
2. Pipetee 1.0 ml de reactivo en tubos rotulados: paciente, control, etc.
3. Incube los tubos a 37°C durante 5 minutos.
4. Ajuste el espectrofotómetro con agua a 405 nm.
5. Agregue 0.25 mL (25 ul) de muestra y lea inmediatamente.
6. Continúe leyendo cada 30 segundos por 2 minutos.
7. Determine el valor promedio de absorbancia por minuto
(Delta-Abs./7 min.).
8. Multiplique la delta-abs./min por 4824 (factor) para obtener el
resultado en U/L.
CALIBRACIÓN
El procedimiento es estandarizado en función de la absorbancia
milimolar del nitrofenol, esl cual es 8.5 a 405 nm en las condiciones de
técnica descritas.
CONTROL DE CALIDAD
La validez de la reaccion debe ser monitoreada por el uso de un suero
control con valores conocidos en rango normal y anormal.
CALCULOS
Abs/min = Diferencia de absorbancia por minuto.
T.V. = Volumen total del examen (1.025)
1000 = Conversión de U/mL a U/L.
MMA = Absorbancia milimolar de p-Nitofenol (8.5)
S.V. = Volumen de la muestra (0.025 ml)
L.P. = Paso de la luz (1 cm)
[Link].x 1.025 x 1000 = Abs/min x 4824
Multiplique el valor U/L por 16.67.
Para convertir a unidades internacionales realice la multiplicación
anterior.
VALORES ESPERADOS
Suero : Hasta 96/ IU/L
Orina : 18 – 330 IU/L
Puesto que los valores son afectados por la edad, sexo, dieta,
localización geográfica, etc. cada laboratorio debe establecer su propio
rango de referencia por este procedimiento.
COMPARACION
Se realizó un estudio comparativo entre éste método y otro método
comercial de igual procedimiento. Se analizaron 76 muestras con un
rango de actividad de amilasa entre 34 y 2589 U/L El coeficiente de
correlacion fue de 0.999 y la ecuación de regresión de y = 1.01 x -2.1.
PRECISION
Dentro de la corrida
Valor D.S. C.V.%
40 1.5 3.8
364 4.5 1.2
De corrida a corrida
Valor D.S. C.V.%
40 1.3 3.3
353 10.7 3.0
