TEMA 32: BIOCATALIZADORES
CONCEPTO DE ENZIMA
Bajo la denominación de Biocatalizadores se conocía o se agrupaba a una serie de
sustancias propias de los seres vivos que tienen un importante papel fisiológico debido a su
extraordinaria actividad química. Estas sustancias activas eran las hormonas, las vitaminas y
los enzimas. Pero en este grupo podemos incluir otras sustancias fisiológicamente importantes
como los neurotransmisores, los neuropéptidos, etc. Sin embargo, este nombre de
biocatalizador ha sido reducido para denominar solamente a los enzimas.
Cualquier metabolito A (sustrato) para transformarse en otro B (producto) necesita la
acción de un enzima o catalizador y que el cambio de energía libre sea negativo (△G ≤ 0).
Un Enzima es un componente celular de naturaleza proteica que acelera la velocidad
de reacción pero que no cambia el equilibrio ni viola las leyes de la termodinámica.
Las Características de los enzimas son las siguientes:
1.- Poseen un enorme poder catalítico, ya que aceleran las reacciones químicas del
metabolismo, multiplicando su velocidad por un millón de veces o más aún. De hecho, la
mayoría de las reacciones en los sistemas biológicos no tienen lugar a velocidades
perceptibles en ausencia de enzimas.
2.- Tienen una altas especificidad, tanto en la reacción que catalizan como en su
selección de las sustancias reaccionantes (sustratos).
3.- Presentan una actividad regulable, con lo que son activos o no dependiendo de la
presencia de reguladores o bien de las condiciones físico-químicas de la célula.
4.- Tienen capacidad para transformar diferentes clases de energía. En muchas
reacciones bioquímicas la energía de las sustancias reaccionantes se convierte en una forma
de energía diferente con una eficiencia muy elevada.
5.- No alteran los equilibrios de reacción. Un enzima es un catalizador y, en
consecuencia, no puede alterar el equilibrio de una reacción química. Esto significa que un
enzima acelera la reacción en un sentido u otro con el mismo factor.
6.- Disminuyen la energía de activación de las reacciones catalizadas por ellos.
La Nomenclatura utilizada es simplemente añadir el sufijo –asa al nombre del sustrato
y a la actividad que realiza, como ureasa o malato deshidrogenasa.
Durante la catálisis, el enzima se une específicamente al sustrato, formándose un
complejo enzima – sustrato que puede adoptar una nueva configuración espacial,
modificándose el compuesto unido, de tal forma que cuando abandona el enzima es un nuevo
compuesto (producto), revirtiendo entonces el enzima a su forma original.
Muchas enzimas, para su funcionamiento, requieren moléculas o iones que se
denominan Cofactores, como el calcio o el magnesio. La unión de estos iones al enzima suele
ser débil, alterando la estructura terciaria, dando al enzima una configuración activa. Sin
embargo, no todos los cofactores son iones metálicos, existiendo un grupo de moléculas
orgánicas pequeñas de naturaleza no proteica que actúan de igual forma. Estas moléculas se
denominan Coenzimas, siendo muchos de ellos vitaminas. Los coenzimas están implicados
en reacciones de transferencia de electrones, protones o grupos de átomos, participando en la
reacción con si fueran sustratos.
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El complejo enzima – cofactor se denomina Holoenzima, y se llama Apoenzima a la
proteína enzimática cuando está separada del cofactor. Cuando el coenzima se halla
íntimamente unido al enzima, no pudiéndose separar, se denomina Grupo Prostético, como el
grupo hemo del citocromo C.
Los enzimas se han Clasificado en seis clases principales, las cuales se dividen en
subclases y que son la siguientes:
1.- Óxido-Reductasas, que participan en reacciones de oxido – reducción.
2.- Transferasas, implicadas en la transferencia de grupos funcionales.
3.- Hidrolasas, que participan en reacciones de hidrólisis.
4.- Liasas, con capacidad de adición a los dobles enlaces.
5.- Isomerasas, implicadas en reacciones de isomerización.
6.- Ligasas, capaces de formar enlaces con ruptura de ATP.
EL CENTRO ACTIVO
La base fundamental de la acción enzimática es la formación del complejo enzima –
sustrato, el cual se forma con una gran precisión de acoplamiento. Consecuencia de ello es la
gran especificidad de un enzima por su sustrato correspondiente. Sin embargo, hay enzimas
poco específicos, capaces de actuar sobre una gama de compuestos que poseen características
estructurales comunes.
Se ha observado que al unirse el sustrato se producen modificaciones
conformacionales en el enzima, lo que indica que el ensamblaje enzima-sustrato será inducido
por la presencia del enzima y no tendría el enzima una estructura previa para el perfecto
acoplamiento del sustrato al enzima.
Al lugar específico donde se une el sustrato al enzima responsable de la actividad
catalítica se denomina Centro Activo. Este sitio activo es el resultado del plegamiento de la
cadena peptídica para dar una estructura tridimensional determinada, ya que los aminoácidos
que conforman el centro activo suelen estar separados en la secuencia de la proteína
enzimática.
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Sin embargo, la especificidad del enzima no es debida solamente a la estructura del
centro activo, sino que depende así mismo de otras regiones del enzima, las cuales evitarían
combinaciones enzima – sustrato improductivas y la unión de otros sustratos distintos,
perdiendo así su especificidad.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Una reacción química tiene lugar porque una fracción de moléculas de los sustratos
reaccionantes, en un instante dado, posee mucha más energía que el resto, lo que las permite
alcanzar una Estado Activado en el que puede romperse o establecerse un enlace químico
necesario para formar los productos.
Se define como Energía de Activación a la cantidad de energía, medida en calorías,
necesaria para llevar todas las moléculas de 1 mol de una sustancia desde una temperatura
dada hasta el estado activado.
Por otra parte, en toda reacción encontramos un Estado de Transición, siendo éste un
estado rico en energía delas moléculas interactuantes en la cima de la barrera de activación.
Pues bien, la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de moléculas de
sustrato en el estado de transición. Si elevamos la temperatura, al incrementar el movimiento
y la energía, aumenta el número de moléculas capaces de entrar en el estado de transición.
Al igual que los catalizadores más sencillos, el efecto de los enzimas es aumentar la
velocidad de la reacción. Al no poder alterar la constante de equilibrio, no puede alterar el
cambio de energía libre, pero reduce la energía de activación a un nivel fácilmente alcanzable
por las moléculas del sustrato.
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Una característica fundamental de la actividad enzimática es que la velocidad de
reacción aumenta al incrementarse la concentración del sustrato, hasta que alcanza un valor
constante, originando el fenómeno de Saturación del enzima. Bajo estas condiciones,
solamente aumentará la velocidad de la reacción si aumenta la concentración de enzima.
Con objeto de explicar el efecto de la saturación, Michaelis y Menten propusieron que
los enzimas participan en las reacciones según la ecuación:
E + S E-S E + P
En el esquema, E representa el enzima, S al sustrato y P al producto. E-S es el
denominado Complejo Enzima-Sustrato, en el que el enzima y el sustrato se han combinado
íntimamente. Este complejo puede disociarse para originar los productos o bien dar de nuevo
el enzima y el sustrato independientes. La formación del complejo a partir de los productos
puede desecharse, a menos que se permita que se acumulen los productos finales de la
reacción.
El punto de saturación se alcanza cuando la concentración de sustrato es lo
suficientemente alta como para asegurar virtualmente que todo el enzima es convertido en E-
S. Así mismo, la ecuación anterior explica la forma de actuar el enzima sobre la energía de
activación, ya que la reacción, en realidad, sigue un camino diferente, puesto que se forma el
complejo E-S. De esta forma, el enzima mantiene al sustrato o sustratos en íntimo contacto
con los centros catalíticos, permitiendo que la energía de activación sea menor ya que el
complejo requiere menos energía para alcanzar el estado de transición que la necesaria en la
reacción no catalizada. Igualmente, el complejo E-S explica la alta especificidad del enzima
por el sustrato, ya que la estructura de ambos debe de ser totalmente complementaria, lo que
solamente puede suceder con un número limitado de moléculas.
Si en la ecuación anterior asignamos constantes de velocidad, tenemos:
Ya que la formación de E-S a partir de E y P puede despreciarse, no se tomará en
cuenta K4. Por tanto, la velocidad inicial de formación del producto final será V = K 3 E-S.
Aunque E-S no puede medirse directamente, resulta claro que la concentración total del
enzima E será igual a la suma de las concentraciones del complejo E-S más la
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concentración de enzima libre. Por lo que EL = E - E-S. Si suponemos que S es mucho
mayor que E, se puede despreciar la cantidad de sustrato que se encuentra formando el
complejo E-S. Dado que la formación de ES a partir de E y P es despreciable, podemos
calcular:
Velocidad de Formación Complejo = K1 (E - E-S) S
Velocidad de Desdoblamiento Complejo = K2 E-S + K3 E-S
Cuando el proceso global está en régimen permanente, la velocidad de formación de
E-S será igual que la degradación, por que podemos igualar ambas ecuaciones. A partir de
aquí, por un tratamiento matemático, llegaremos a la ecuación que nos permite hallar la E-S.
Una vez conocida la E-S, podemos sustituir esta expresión en la ecuación que
expresa la velocidad de la reacción enzimática, quedando así:
V = K3 x E S / Km + S
La velocidad alcanzará su máximo cuando la S sea suficientemente alta, de tal
manera que todas las moléculas de enzima se encuentren en forma de complejo E-S, y será,
por tanto: Vmáx = K3 E. Sustituyendo esta expresión en la ecuación de la velocidad, se
obtiene finalmente la llamada Ecuación de Michaelis – Menten para la velocidad de las
reacciones enzimáticas:
De esta ecuación, podemos despejar la Km de la ecuación, que nos define la afinidad del
enzima por el sustrato, o lo que es lo mismo, la capacidad que tiene el enzima de unirse al
sustrato para formar el complejo E-S.
Km = S. (Vmáx / V - 1)
La primera ecuación describe la relación cuantitativa entre la velocidad de la reacción
y la concentración de sustrato, que gráficamente tiene la forma de una hipérbola regular.
Resulta obvio que la Km es igual a la concentración de sustrato con la que se obtiene la mitad
de la velocidad máxima.
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Por principio, la constante podría estimarse directamente de la curva que relaciona las
dos variables. Sin embargo, en la práctica, resulta difícil determinar la forma de la curva o
bien obtener el valor exacto de la velocidad máxima. Para resolver estas dificultades,
Lineweaver y Burk hicieron uso de una gráfica de doble recíproca de velocidad y de S, dado
que estas recíprocas están relacionadas de forma lineal.
Si se toman las recíprocas, se obtiene la siguiente ecuación:
1 / V = (Km / Vmáx x 1 / S ) + 1 / Vmáx
que tiene la forma de una recta del tipo y = mx + b, teniendo una pendiente de
Km/Vmáx y siendo 1/Vmáx el corte con el eje y y –1/Km la intersección con el eje x.
Si operamos matemáticamente con la ecuación anterior, obtenemos finalmente una
fórmula para la velocidad: V = - Km . (V / S ) + Vmáx
Esta es la ecuación de Eadie - Hofstee, de tal forma que al representar V frente a
V/S, la gráfica es una línea recta, con una pendiente de –K m, un corte con el eje e igual a
Vmáx y un corte con el eje x de Vmáx/Km.
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FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Los principales factores que afectan negativamente a la actividad enzimática son los
Inhibidores que provocan una inhibición reversible y la temperatura y el pH que provocan
alteraciones irreversibles del enzima debido a su destrucción o a la modificación de sus
grupos funcionales.
Los enzimas pueden modificarse también positivamente gracias a la actuación de los
Activadores.
a) Inhibición Enzimática. Los tres tipos de inhibición reversible de los enzimas
pueden distinguirse experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor sobre la
cinética de reacción del enzima, la cual puede analizarse mediante la ecuación básica de
velocidad de Michaelis – Menten. Para la validez del análisis cinético, el inhibidor debe
combinarse de forma rápida y reversible con el enzima o con el complejo enzima – sustrato.
Estos tres tipos de inhibición enzimática son los siguientes: Competitiva, Acompetitiva y no
Competitiva.
a.1) Inhibición Competitiva. La característica de la inhibición competitiva es que el
inhibidor puede combinarse con el enzima libre, de tal modo que compite con el sustrato
normal para unirse al centro activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con
el enzima para formar un complejo enzima-inhibidor (E-I) análogo al complejo E-S.
La inhibición competitiva se reconoce experimentalmente con facilidad, debido a que
el porcentaje de inhibición para una concentración de inhibidor constante disminuye al
aumentarse la concentración de sustrato.
La presencia de un inhibidor competitivo incrementa la K m aparente del enzima por el
sustrato, es decir, provoca que se precisen concentraciones de sustrato superiores para que se
alcance la Vmáx. Por otra parte, no afecta al valor de V máx, indicando con ello que no interfiere
con la velocidad de ruptura del complejo enzima-sustrato.
En el caso de una inhibición competitiva, al realizar la representación de los dobles
recíprocos se obtiene la siguiente gráfica:
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a.2) Inhibición Acompetitiva. En la inhibición acompetitiva, el inhibidor no se
combina con el enzima libre ni afecta a su reacción con el sustrato normal. Sin embargo, el
inhibidor se combina con el complejo E-S para formar un complejo inactivo E-S-I, el cual no
experimenta su transformación posterior en el producto habitual de la reacción.
Este tipo de inhibición suele reconocerse con gran facilidad en las representaciones de
1/V frente a 1/S para concentraciones constantes de inhibidor. Lo característico de la
inhibición acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al aumentar la
S, pero la Vmáx decrece y la Km aumenta.
En el caso de la inhibición acompetitiva, al realizar la representación de los dobles
recíprocos se obtiene la siguiente gráfica:
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a.3) Inhibición no Competitiva. En la inhibición no competitiva, el inhibidor puede
combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo con la
acción de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un centro del enzima diferente
del centro activo, a menudo para deformar el enzima, de modo que no puede formarse el
complejo E-S a su velocidad normal y que, una vez formado, no se descomponga a su
velocidad habitual para liberar los productos de reacción. Sus efectos no se anulan al
aumentar la S. En este tipo de inhibición se producen dos formas inactivas del enzima: el
complejo E-I y el complejo E-S-I.
La representación gráfica de 1/V frente a 1/S en presencia del inhibidor no
competitivo comparte el valor de K m pero el enzima inhibido posee un valor de 1/V máx mayor
que para el enzima no inhibido, lo que indica que la V máx decrece en presencia del inhibidor y
no puede establecer su valor a pesar de que la concentración de sustrato sea elevada.
En el caso de la inhibición no competitiva, al realizar la representación de los dobles
recíprocos, se obtiene la siguiente gráfica:
b) Temperatura. Como se sabe, la temperatura, al aumentar, incrementa la velocidad
de una reacción química. Para la mayor parte de las reacciones enzimáticas este efecto se
cumple, pero sólo por debajo de los 40-50ºC. Si la temperatura sube por encima de ese nivel,
la velocidad de la reacción disminuye, debido a que las altas temperaturas distorsionan la
estructura del enzima, alterando su actividad.
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c) pH. El pH a que sucede una reacción enzimática también es muy importante, ya que
la mayor parte de los enzimas muestran un óptimo en su actividad a un pH relativamente
cercano al rango fisiológico de 7-7,5. Cada enzima posee una curva característica que
relaciona la actividad con el pH y, en ciertos casos, el óptimo de actividad corresponde a
ciertos pH lejanos al rango fisiológico. Por ejemplo, la pepsina y la tripsina tienen un pH
óptimo de 2 y de 8 respectivamente.
Cualquier cambio en el pH que afecte a la ionización de los grupos químicos
responsables de la formación del complejo E-S tiene influencia negativa sobre la actividad, al
igual que los cambios que afectan a la estructura tridimensional del enzima. Por eso, a valores
de pH fuera de su rango de actuación, los enzimas dejan de ser funcionales.
d) Activadores. Otra faceta que afecta a la actividad enzimática, pero en grado
positivo, es la presencia de Activadores, que son moléculas diferentes al sustrato y que se
diferencian también de los cofactores. Los activadores no interaccionan con el sitio catalítico,
sino en algún otro lugar del enzima, provocando posiblemente un cambio en la configuración
espacial del enzima que afecta a la catálisis, incrementando así la velocidad de reacción.
ALOSTERISMO
Muchos enzimas están constituidos por varias subunidades de proteína. Estos enzimas
son susceptibles de ver regulada su actividad, por lo que se les conoce como enzimas
reguladores. Esto es fácilmente comprobable porque poseen una dependencia atípica de la
velocidad de reacción respecto a la concentración de sustrato, la cual no se explica fácilmente
aplicando los modelos cinéticos de Michaelis – Menten.
Se conocen tres tipos de enzimas reguladores: Homotrópicos, Heterotrópicos y Homo-
heterotrópicos. En los primeros, la molécula de sustrato es también un modulador que, por lo
común, acelera la actividad catalítica, de acuerdo con su concentración. Los enzimas
heterotrópicos son estimulados o inhibidos por un efecto o modulador específico, distinto del
sustrato. Algunos enzimas son de ambos tipos a la vez, siendo el sustrato uno de los
moduladores a los que responde el enzima. A estos enzimas reguladores se les denomina
también Alostéricos, refiriéndose a que el modulador posee otro lugar en el enzima al que
unirse que no es el centro activo.
Respecto a su comportamiento cinético, los enzimas reguladores presentan una curva
sigmoidal, en lugar de la hiperbólica de Michaelis-Menten. Esta se produce debido a que la
unión de la primera molécula de sustrato al enzima favorece la unión de otra molécula de
sustrato al enzima. Sin embargo, la generalización de la cinética en los enzimas reguladores es
difícil, ya que cada uno posee su propio comportamiento cinético.
La forma en que los moduladores alostéricos provocan la modulación o regulación en
el enzima consiste en que, al unirse a su localización específica, producen un cambio
conformacional de la molécula enzimática, resultando una forma más o menos activa del
enzima, en dependencia del regulador. Este fenómeno se denomina Interacción Cooperativa.
Las características comunes a los enzimas alostéricos son las siguientes:
1.- Las proteínas alostéricas son oligómeros, cuyos protómeros (subunidades) se hallan
asociados de tal forma que ocupan posiciones equivalentes, lo que implica que la molécula de
enzima posee, al menos, un eje de simetría.
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2.- A cada ligando le corresponde un solo punto de unión en cada protómero.
3.- La conformación de cada protómero viene determinada por la asociación con los
otros protómeros.
4.- Los protómeros pueden adoptar reversiblemente dos o más estados, que difieren
por la distribución, la energía o ambos de los enlaces interprotoméricos y, por tanto, por las
tensiones conformacionales impuestas sobre los otros protómeros.
5.- A consecuencia de lo anterior, se altera la afinidad frente al ligando
correspondiente al pasar de un estado a otro.
Monod y col. propusieron un modelo para justificar las interacciones de los
moduladores o ligandos con los enzimas alostéricos o reguladores. Según ellos, cuando el
enzima pasa a otro estado conserva su simetría molecular, es decir, que todos los protómeros
son simultáneamente activos o inactivos. Por tanto, la unión de un modulador a un protómero
provoca un cambio conformacional que lo transforma de inactivo a activo o viceversa. Dicho
cambio se transmite a los demás protómeros. Es decir, que, en estado activo o inactivo, el
enzima alostérico mantendría la simetría; por ello, al modelo de Monod también se le
denomina Modelo Simétrico.
Koshland y col. propusieron otro modelo, basándose fundamentalmente en que sólo
cambia la subunidad a la que se une el ligando y que este cambio no altera la afinidad por el
sustrato del resto de las subunidades. Por lo tanto, entre el estado simétrico activo e inactivo
habría estados intermedios donde las subunidades están en ambos estados al mismo tiempo.
Debido a ello, el modelo de Koshland también se denomina Modelo Secuencial, siendo de
gran complejidad matemática su desarrollo, pero explica mejor la cooperatividad positiva y
negativa que el modelo anterior.
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ISOENZIMAS
Incluso dentro de una misma célula, algunos enzimas poseen más de una forma
molecular. Estas formas múltiples de un mismo enzima se denominan Isoenzimas y, aunque
no se pueden diferenciar en cuanto a la reacción que catalizan, poseen cadenas polipeptídicas
diferentes.
Hasta ahora, todos los isoenzimas encontrados son oligómeros que tienen sus
subunidades dispuestas en diferentes combinaciones. Un claro ejemplo lo constituye la
deshidrogenasa láctica (LDH) que posee 5 isoenzimas que pueden ser diferenciados por
electroforesis. Todas catalizan la misma reacción, aunque poseen diferentes valores de K m
para el ácido láctico, que es el sustrato.
SISTEMAS MULTIENZIMÁTICOS
Los enzimas suelen trabajar agrupados, en secuencias encadenadas en las que un
producto es el sustrato de la siguiente reacción. Se pueden diferenciar tres niveles de
complejidad en la organización molecular de estos sistemas.
En el primer nivel, los enzimas están en el citoplasma como entidades independientes,
siendo los sustratos, que poseen elevadas velocidades de difusión, los que hallan rápido el
camino de un enzima a otro, como ocurre en la ruta metabólica de la glucólisis.
Un segundo nivel ascendente en complejidad sería el formado por enzimas asociados
físicamente a complejos enzimáticos, como el de la beta – oxidación de los ácidos grados, lo
que les confiere gran ventaja biológica, limitando la distancia a la que han de difundir los
sustratos.
El tercer nivel vendría dado por aquellos enzimas asociados a grandes estructuras
supramoleculares, como los ribosomas o las membranas, como puede ser la cadena de
transporte electrónico tanto de la mitocondria (respiración) como del cloroplasto
(fotosíntesis).
Estos tipos multienzimáticos poseen una gran capacidad de autorregulación, gracias a
la presencia de enzimas reguladores. Existen diversos modos de Regulación:
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1.- Inhibición retroactiva o feed-back. El enzima que cataliza la primera reacción es
inhibido por el producto final de la secuencia, con lo que cuando hay un exceso de producción
del producto se detiene la ruta metabólica.
2.- Activación retroactiva. El primer enzima es activado por un producto de
degradación del metabolito final, el cual se ha consumido y es necesario, por ello, producir
más.
3.- Activación en paralelo. El primer enzima de una secuencia es activado por un
metabolito sintetizado en otra ruta independiente, pero ambos se utilizan juntos, con lo cual se
sincronizan dos rutas metabólicas.
4.- Activación por un precursor. El enzima es activado por un metabolito precursor
más o menos alejado de su sustrato inmediato.
El tipo más sencillo de sistema enzimático regulado es monovalente, teniendo
solamente una molécula reguladora, mientras que es más frecuente encontrar en un sistema
enzimático uno o varios enzimas polivalentes, que responden a más de un efector o
modulador.
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