INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIÓLOGICAS

LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

PRACTICA 5: TRANSFORMACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PLÁSMIDOS

RECOMBINANTES BACTERIANOS

INTEGRANTES: 6QM3 EQUIPO 2 SECCIÓN 1

- Garibay Montañez Giulianna Mariane
- Galindo Cruz Luis Ángel

OBJETIVO GENERAL
Introducir al proceso de transformación artificial utilizando y caracterizando plásmidos recombinantes
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
a) Identificar las diferencias moleculares y de restricción entre vectores recombinantes y no
recombinantes
b) Identificar las clonas recombinantes y no recombinantes por el fenotipo que les confiere el vector

Figura 1. Mapa de los plásmidos pRSETmCherry y pRSET-NS1. En ellos resaltan los sitios de restrcción para las enzimas BamHI y HindIII.
RESULTADOS
Tabla 1. Testigos de células competentes utilizadas en proceso de transformación

Medio LB sin Ampicilina Medio LB + Ampicilina

Tabla 2. Células transformadas con los vectores, pertenecientes al equipo 2 sección 1

Células transformadas con pRSET-mCherry Células transformadas con pRSET-NS1

Tabla 3. Registro de las colonias correspondientes a células transformadas con los diferentes plásmidos
(pRSET-mCherry y pRSET-NS1).

Equipo pRSET-mCherry pRSET-NS1

1 ‒ ++++
2 + ++
3 + ‒
4 ‒ +
5 ‒ ‒
6 ++++ ‒
Medio LB Medio LB + A
Testigo
+ ‒

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

M 1kb Eq1 Eq2 Eq3 Eq4 Eq5 Eq6

Figura 2. Electroforesis de las digestiones de pRSET-NS1 y pRSET-mCherry con la enzimas BamHI y HindIII. Se
enlistan las digestiones realizadas por cada equipo con la enzima o mezcla de enzimas correspondiente.
DISCUSIÓN
El proceso de transformación surge cuando la célula en estado de competencia capta el DNA desnudo que
está presente en el medio. Mediante la utilización de un método químico se consiguió poner en
competencia a células que por naturaleza no son competentes, como es el caso de la cepa usada
Escherichia coli DH10B. El método usado consiste en agregar iones que nos permitirán neutralizar las
cargas entre el DNA transformante y los fosfatos presentes en las cabezas de los fosfolípidos de la
membrana, la neutralización de estas cargas elimina la repulsión natural, lo que permite que el DNA
transformante se mueva más cerca de la célula. Después se induce a un choque térmico afectando sobre
la fluidez de la membrana y generando puntos de adhesión, mejorando la entrada del DNA exógeno.
Una forma de comprobar si la transformación fue efectiva es mediante el uso de genes de selección. Con
ello nos permite identificar y seleccionar a las clonas transformantes, en nuestro caso fue el gen AmpR
contenido en ambos vectores empleados, este le confiere resistencia a ampicilina en aquellas células
donde el vector logro ser interiorizado. La cepa utilizada fue Escherichia coli DH10B la cual no posee
resistencia intrínseca a la ampicilina, gracias a esto se logró identificar a aquellas que incorporaron los
plásmidos, hecho que se confirma con el testigo, ya que las células en las que no se llevó a cabo la
transformación, no crecieron en el medio LB al cual se le adicionó ampicilina. Si bien se obtuvieron
resultados positivos, se observó un patrón en la mayoría de los equipos en el cual se obtuvieron
transformantes para uno sólo de los plásmidos, es decir, transformantes para pRSET-mCherry pero no
para pRSET-NS1 y viceversa (Tabla 3). Este fenómeno puede explicase a errores en la manipulación de las
células competentes tales como el no mantener la cadena fría a lo largo de la metodología de
transformación, así como después del choque térmico, también se puede atribuir a una mala técnica de
siembra, debido a la contaminación presente en varias placas de diferentes equipos.
Ahora bien, la selección de las clonas recombinantes también se pudo realizar por la expresión de las
proteínas mCherry y NS1, sin embargo, se utilizó un método en el cual se caracterizó a los vectores
mediante una digestión enzimática. Para ello primeramente se realizó una obtención de DNA plasmídico
por lisis alcalina y posteriormente la digestión con enzimas de restricción BamHI y HindIII. Las enzimas de
restricción son nucleasas que cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia
específico, generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción. Al terminar la
digestión, se realizó una electroforesis para poner en evidencia el tamaño (pb) de los fragmentos
obtenidos (figura 1). El tamaño de los fragmentos que se obtienen depende de si la digestión se llevó por
una o ambas enzimas, y del tamaño del vector recombinante. En ambos vectores, cuando el proceso se
lleva con 1 enzima, solo se linealiza, debido a que solo existe un sitio de corte para ambas enzimas, siendo
espedos entonces la presencia de bandas correspondientes a 3520 pb para pRSET-mCherry y 3959 pb para
pRSET-NS1, bandas encontradas en los carriles de los equipos 1,2,4 y 5. Por otra parte al realizar la
digestión con ambas enzimas se esperaba la obtención de dos fragmentos, de 724 pb y de 2856 pb para
el caso de pRSET-mCherry, lo que se puede comprobar con las bandas encontradas en los carriles 6 y 12.
De igual forma se esperaban dos fragmentos para pRSET-NS1, pero esta vez uno de 1103 pb y otro de
2856pb, lo cual se vio reflejado en los carriles 7 y 13. La estimación del tamaño de los fragmentos se
realizó mediante el cálculo de acuerdo al sitio de corte de la enzimas BamHI y HindIII en cada uno de los
plásmidos (Figura1).
La presencia de bandas externas a las de los fragmentos obtenidos, se sospecha que puede ser
contaminación de DNA cromosomal degradado ya que se encuentran por encima del tamaño de los
plásmidos o a las isoformas que el plásmido se presenta, siendo circular, superenrollado y lineal.
Dependiendo de la isoforma en que se presenta
CONCLUSIONES
• Las colonias presentes en las placas con medio LB adicionado de ampicilina, son formadas por las
células transformantes.
• La utilización individualmente da las enzimas HindIII y BamHI para la digestión da como resultado
la linealización de los plásmidos
• Los fragmentos de restricción de pRSET-Cherry al utilizar HindIII y BamHI son de 2856 pb y 724 pb
• Los fragmentos de restricción de pRSET-NS1 al utilizar HindIII y BamHI son de 2856 pb y 1103 pb
• La caracterización de los plásmidos fue de utilidad para seleccionar a las clonas recombinantes.

REFERENCIAS
[1] Liu X, Liu L, Wang Y, Wang X, Ma Y, Li Y. The Study on the factors affecting transformation efficiency of E.
coli competent cells. Pak J Pharm Sci. 2014 May;27(3 Suppl):679-84. PMID: 24816699.

[2] Garcia, G., Ruvalcaba, R., Alvarado, A., Gómez, G., Juárez, J., Espinoza, E., & Espino, E. (2019). Comparación de
la eficiencia de transformación entre diferentes cepas de E. coli. TECNOCIENCIA. https://vocero.uach.mx.
[3] Levitus, G., Enchenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., & Mroginski, L. (s. f.). Herramientas básicas de ingeniería
genética. En Biotecnología y Mejoramiento Vegetal (pp. 43-60).
https://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/BiotecnologiayMejoramientovegetalII.pdf
 PRACTICA 6: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

OBJETIVO GENERAL
Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del DNA de interés clonado en la práctica de
transformación
OBJETIVOS DE APRENDIZAJES
a) Entender los fundamentos básicos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
b) Identificar los diferentes componentes de la PCR y el fundamento de su utilización en la reacción.
c) Deducir las concentraciones y volúmenes a utilizar de cada uno de los reactivos y componentes
de la PCR en volumen de reacción.
d) Entender los fundamentos de la técnica de electroforesis.
e) Identificar algunas de las aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa.

Figura 1. Mapa del plásmido pRSET-NS1. Se observa el fragmento que codifica para la NS1, el cual se amplificara
por técnica de PCR.
 r
l
s

Eq 1 Eq 2 Eq 3 Eq 4 Eq 5 Eq 6 T (-)

Figura 3. Productos de la amplificación del gen NS1 mediante la técnica de PCR. Los amplicones esperados son de
1103 pb, correspondiendo a aquellos que se resaltan con un rectángulo rojo, mientras que las diferente isoformas
del plásmido se resaltan con un rectángulo verde, yendo desde la relajada (r), lineal (l) y superenrollada (s),
respectivamente.

Tabla 4. Iniciadores utilizados para la amplificación del gen NS1

Iniciadores Secuencia
NS1_BamHI-Fw tttggatccGATGTGGGGTGCTCGGTGGAC
NS1_Hind3-Rv tttaagcttaTGCAGTCACCATTGACCTTAC

DISCUSIÓN
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método in vitro para la amplificación de genes de
interés, aprovechando la actividad enzimática de la DNA polimerasa extraída de Thermus aquaticus
(organismo termófilo), por lo que es termoestable y su mayor actividad enzimática se presenta a 70°C.
Uno de los requerimientos importantes son los primers, secuencias de oligonucleótidos que flanquean y
delimitan la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. (Tamay et al. 2013).
En nuestro caso la amplificación realizada fue del gen NS1, para ello se utilizaron los iniciadores enlistados
en la Tabla 4. Estos iniciadores cuentan con secuencias complementarios a los sitios de restricción de las
enzimas BamHI y HindIII, por lo cual podemos calcular el tamaño del amplicón esperado, que es de 1103
pb. Para ello se utilizó el plásmido pRSET-NS1 extraído en la práctica de transformación. Los resultados
mostraron que la amplificación se realizó de manera exitosa, ya que en el gel de la electroforesis se
encontraron bandas en el tamaño esperado del amplicón (Figura 3). Las intensidad de estas nos habla del
rendimiento en la extracción del DNA plasmídico, ya que recordemos un factor que afecta al número de
copias obtenidas durante la amplificación es la concentración del DNA molde. Por otra parte, pudimos
validar nuestro experimento mediante el uso de un testigo negativo, para este propósito se adicionó el
plásmido pRSET-mCherry a la mezcla de reacción de la PCR, se dice que es un testigo negativo debido a
que los primers que se utilizaron en esta practica no sirven para amplificar algún fragmento de este
plásmido, resultado se encuentra reflejado en el carril 8, en donde no vemos presencia de bandas, con
ello nos aseguramos de que no hubo amplificaciones inespecíficas.
Por otra parte, en los diferentes carriles se pudo observar la aparición de bandas adicionales a los
productos de amplificación, estás poseen un tamaño mayor, por lo cual se encuentran cercanas a los
diferentes pozos. De lo anterior podemos inferir que se trata de las diferentes isoformas del plásmido
pRSET-NS1, esto debido a que no se determinó la concentración del producto de la extracción de DNA
plasmídico, con ello se supone la idea de un excedente que pudo acompañar a producto de amplificación
y la aparición de bandas adicionales al no realizar dilución alguna del DNA molde.

CONCLUSIONES
• Las bandas obtenidas en la electroforesis, cerca de 1000pb, confirman la presencia del amplicon,
confirmando que la PCR fue exitosa.
• La PCR realizada con el plasmido pRSET-mCherry, nos sirve como un control negativo.
• Los primers son especificos para amplificar un fragmento de interés. Por lo tanto, es importante
que el diseño de primers sea eficiente para evitar amplificaciones inespecíficas.
• Los volumenes deben ser exactos para que la técnica se lleve a cabo correctamente, es un paso
crítico.
• La electroforesis nos permite verificar la presencia del amplicon, por el tamaño estimado (pb)
que tendrá.
DISEÑO DE PRIMERS DEL GEN hsp18 PARA LA DETECCIÓN DE Mycobacterium leprae

Se consultó la secuencia del gen hsp18 en GeneBank, código de acceso M19058.1:

121 ccatagcgtt acacaaccta ctgttggtat atcacaaatc ggtattagtt tgcgatagcg
181 ctgcgttgtt gtcttcaagg ttaagcatac gagcaatacc agccagattg ataccggcgt
241 ctaccagcgg actgatgcgc tgcaaccggg ccaaatcgtc ggcactatag cgcgccgggc
301 tccgctgtca cttcgagccg gcctgaatag cccgcagcgt tcatagagcc gcagcgacgg
361 caccgggaac gccggaaagt tcggccgcta ccgatgatgt cgtatacgct gcgttgcagt
421 gccgacgtac ccgtgccggc actacaatcg gtcatgagca atctcctcag ctgttcagac

Primer %G-C Tm Temperatura de Amplicón

alineamiento esperado
5’ ggtatcgcaatgtgttgg 3’ 50% 54⁰ 50⁰
5’ gtctagaacagctgaggag 3’ 360 pb
50% 54⁰ 50⁰

REFRENCIAS
[1] Calderón E, Róger, & Luna C, Carmen. (2006). hsp18 gene amplification for detecting Mycobacterium leprae.
Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica, 23(4), 297-302. Recuperado en 16 de enero de 2023, de
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[2] Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. (2013, agosto).
Medigrafic. Recuperado 16 de enero de 2023, de https://www.medigraphic.com/cgi-
bin/new/publicaciones.cgi?IDREVISTA=279
[3] Cornejo, A., Serrato, A., Rendon, B., & Rocha, M. (2014). Herramientas moleculares aplicadas en ecología:
aspectos teóricos y prácticos. https://www.researchgate.net/profile/Jorge-Ramirez-
Salcedo/publication/296695965_Microarreglos_de_DNA_Fabricacion_Proceso_y_Analisis/links/56d88bc4
08aee73df6ccfd74/Microarreglos-de-DNA-Fabricacion-Proceso-y-Analisis.pdf#page=69
[4] Bolivar, A., Rojas, A., & Lugo, P. (2013). PCR y PCR-Múltiple: parámetros críticos y protocolo de estandarización.
Instituto de Inmunología Clínica, 3. https://www.redalyc.org/pdf/3313/331330398005.pdf