UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS TOXIGÉNICAS DEL GÉNERO

Fusarium MEDIANTE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR

TESIS DOCTORAL

Eyder Daniel Gómez López

Valencia, 2008
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
Área de Microbiología

Dña. ROSA MARÍA MONTES ESTELLÉS, Profesora Titular de Universidad y D.

GONZALO CUESTA AMAT, Profesor Contratado Doctor, pertenecientes al
Departamento de Biotecnología ─ Área Microbiología ─ de la Universidad Politécnica
de Valencia,

CERTIFICAN: Que la tesis doctoral titulada “CARACTERIZACIÓN DE CEPAS

TOXIGÉNICAS DEL GÉNERO Fusarium MEDIANTE TÉCNICAS
DE BIOLOGÍA MOLECULAR”, que presenta Eyder Daniel Gómez
López para optar al grado de Doctor Ingeniero Agrónomo, ha sido
realizada en el Departamento de Biotecnología de la Universidad
Politécnica de Valencia bajo nuestra dirección, reúne los requisitos
adecuados para ser presentada y defendida como Tesis Doctoral
ante el tribunal correspondiente.

Y para que conste a los efectos oportunos, firman el presente

certificado, Valencia, de Junio de 2008

Fdo.: Dña. Rosa Mª Montes Estellés Fdo.: D. Gonzalo Cuesta Amat

La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiación recibida del
siguiente Proyecto de Investigación:

PREVENCION Y CONTROL DE MICOTOXINAS EMERGENTES EN CEREALES,

FRUTAS Y DERIVADOS. Ministerio de Ciencia y Tecnología. AGL2004-07549-
C05-04. Diciembre 2004- Diciembre2007
 A Marina Sánchez y Nancy Barrera M.
Por enseñarme a volar y no volar en mi vuelo.

A mis padres Adolfo y Elba María

mis hermanos y sobrinos
 Agradecimientos

Son muchas cosas las que te pasan por la mente cuando emprendes un viaje a un país
que no es el tuyo, a comenzar con una nueva etapa en tu vida, todos los sentimientos se
mezclan y estás entre la alegría y la nostalgia, después de un tiempo las cosas se van
tornado de otro color, como dice el poema de Jorge Luis Borges, uno aprende que
realmente puede aguantar, que uno realmente es fuerte, que uno realmente vale, y uno
aprende y aprende y con cada día uno aprende. Es por ello que quiero expresar mi
agradecimiento mezclando sin ningún respeto, advierto, lo profesional con lo personal a
las personas que más han influido en mí en este período; en este país que no me ha
costado nada quererlo.

En primer lugar me gustaría dar las gracias a mis directores de tesis, la Dra. Rosa Mª
Montes quien me brindo la oportunidad de formar parte de su equipo de trabajo en el
laboratorio de microbiología, por su comprensión, paciencia y soportarme durante la
escritura de esta tesis. Y como no, al Dr. Gonzalo Cuesta Amat por su apoyo incondicional
en los momentos más críticos de mi vida, tanto en lo académico como en lo personal, no
tengo palabras para agradecer todo lo que hiciste por mí, un millón de gracias. Si existe el
cielo, sin duda hay un sitio para vosotros en él.

A la Dra. María Antonia Ferrús, a quien le tengo una gran admiración tanto profesional
como personal, cuando se me vino el mundo encima, consiguió con sus palabras que no
perdiera mi cabeza y poder tener un poco de lucidez en mis decisiones, que a mi parecer
fueron las más acertadas, por eso y mil cosas más, gracias.

Qué decir del Dr. Enrique Hernández, todo un profesor en el sentido estricto de la
palabra, siempre con su apoyo y buena voluntad. A Dr. Luis Roig, director del
departamento, por su constante disposición. A Dr. Javier Hernández, siempre muy afable
conmigo, al Dr. Manuel Hernández “Manolo” por darme animo constantemente. A Dra.
Salut Botella por muchas cosas, entre ellas enseñarme un “poquet” de valenciano, a la
Dra. Ana Jiménez compañera de despacho por un tiempo y por los “dulces”, a la Dra.
María Ángeles Castillo por ser como es, una buena persona, a la Dra. Yolanda Moreno,
dispuesta a darme una mano siempre con una sonrisa, a la Dra. Ana González la que más
y mucho más, a la Dra. Mª Carmen, compañera en mis primeros inicios de mi doctorado,
a Rosa Garrido ¡qué buena eres!, siempre queriendo hacerte sentir bien, al Dr. Ramón
Segarra por haber colaborado con su sapiencia en lo que respecta a cromatografía, y por
supuesto a Nancy Serra, tu paciencia y colaboración en el laboratorio fueron claves, a
Claudia Milena por darme animo y poder cotillear un poco y, al Dr. Rafael Sirera, el último
en llegar hasta el momento a microbiología por compartir momentos cotidianos.

A mis “chicas del maíz” Sonia Marcos, Paula David, María Tortosa, por ser tan currantes,
sin vosotras no hubiera sido posible este trabajo, como también a Laura Marti y a Carmen
Montalvà, mil y mil gracias. A los del CAMA, Irene, Jorge, Patricia, Teresa, Domingo,
gracias por compartir nuestros agobios y uno que otro café, y a los de microbiología,
Liliana, Gloria, Raquel, Ferran, Adriana, Laura, Jordi, Albert, Myriam, Rocío, ¡chicos sin
vosotros nada habría sido igual!. ….Y como sabemos que “de cualquier valla sale un ratón
cualquiera,” como olvidarlo, si estaba en toda parte.

A Liliana, Josep, Ivano, David, Irache, Rosita, Derek, Ralf, por hacerme pasar momentos
inolvidables, los recordare por siempre.
¡Bueno! a la peña del bar: Marina, Pepe, Rubiela, Juanita, Manolo, Enna, Rafael, gracias
por tenerme en cuenta en todo acontecimiento.

A Gildardo, Sneider y Pablo “familia Tigreros Rodríguez”, al primero por ser mi

compañero de trabajo y haberme dado la oportunidad de recorrer por decir algo, toda la
geografía española, ¿cuantos kilómetros hemos recorrido? .…muchísimos; gracias a ello mi
economía no se vino a pique. A él, su esposa e hijo mi eterna gratitud.

A Carmen Rosa, Nelson y Rosita, Martín, María Elena, Marcela, Noralba, Marzory, Gloria
“la negra”, Nubia, Dra. Francia, mis amigos de Colombia por estar siempre pendientes de
mí, cosa que se agradece cuando se está lejos.

A Ester Julia Lloreda, Yesid Carvajal, Alexander Roa, mis primeros compañeros de piso,
gracias por abrirme las puertas de su hogar. A mi prima Lucelly por ser mi apoyo
familiar más cercano aquí en el otro lado del charco. A Yolanda Beltrán y Zulma Salazar
por estar siempre allí, muy pendientes.

A Nubia Murcia mi compañera de piso por tantos años, casi toda mi estancia, fue para mí
un placer compartir contigo, siento que te tragaras todos mis agobios y por haberme
soportado durante mi estado predoctoral.

A Jorge y Gloria toda mi gratitud, son y serán mis hermanos adoptivos o más que eso,
fueron muchos los momentos compartidos, estoy seguro que no se me olvidaran. A mi
nuevo sobrino Felipe y a Orión.

A mi maestra, Marina Sánchez por creer siempre en mí y a Nancy Barrera por apoyarme
en todo, no en vano comparten la dedicatoria de esta tesis con mi familia.

Ya casi al final (pero ustedes saben que no son los últimos) los amigos de fuera del
laboratorio: del lado de caminos y otros lares, a los que les adeudo la paciencia, mis
espinas agudas, los arrebatos de humor, la negligencia, las vanidades, los temores y las
dudas: Alba, Ángel, Claudia, Delba, Diana Lucia, Chiara (la que más me soportó, gracias),
Miquel, Ángela, José; pero oye, muchas bodeguitas conocimos, ¿eh? y lo bien que la
pasamos.

A mis hermanos, Julio, Adolfo, Gloria Damaris, mis cuñadas Graciela y Dorian y sobrinos
Paola, Yaneth, Julián, Adolfo y Daniel, y como olvidar a Lucila, porque fueron ellos los
que estuvieron pendientes durante mi tiempo de ausencia de los seres que más amo en
este mundo, mis padres, para cumplir mis metas y a ellos por comprender que el mundo
ya es pequeño, que las distancias ya no son tan largas y que yo regreso, si Dios lo quiere.

A todos lo que hicieron posible que esta tesis llegara a su final que su Dios y mi Dios los
proteja, siempre deseándoles Paz y Bien.
ÍNDICE DE MATERIAS
 Índice de materias

ÍNDICE DE MATERIAS I

ÍNDICE DE FIGURAS VII

ÍNDICE DE TABLAS IX

ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS XI

LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS XIII

RESUMEN XV

I. INTRODUCCIÓN 1

1. REVISIÓN HISTÓRICA DE Fusarium spp. 3

1.1. Situación taxonomía actual del género Fusarium 7
1.2. El concepto de especie en hongos 11
1.3. Especies de Fusarium 12
1.3.1. Fusarium graminearum Schwabe (Telemorfo Gibberella zeae) 12
1.3.2. Fusarium verticillioides (Saccardo) Nirenberg. (Telemorfo Gibberella moniliformis
(Wineland)) 13
1.3.3. Fusarium equiseti (Corda) Saccardo 15
1.3.4. Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg. (Telemorfo Gibberella intermedia
(Kuhlman)) 15
1.3.5. Fusarium culmorum (W.G. Smith) Saccardo 16
1.3.6. Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder and Hansen 16

2. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN 17
2.1. Identificación y caracterización de las especies del género Fusarium 17
2.2. Estructuras que se tienen en cuenta para la identificación morfológica en especies del género
Fusarium 18
2.3. Técnicas fisiológicas y bioquímicas 21
2.3.1. Metabolitos secundarios 21
2.3.2. Ubiquinonas (coenzima Q) 22
2.3.3. Composición de ácidos grasos 22
2.3.4. Composición de la pared de celular 23
2.3.5. Composición proteica 23

I
Índice de materias

3. TÉCNICAS MOLECULARES 23
3.1. ADN ribosómico 24
3.1.1. Región Espaciadora Transcriptora Interna (ITS) y Región Espaciadora Intergénica IGS 25
3.1.2. Análisis de polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción amplificados por
PCR (Restriction Fragment Lenght Polymorphism (PCR-RFLP)) 27
3.1.3. Secuenciación de nucleótidos 29

4. MICOTOXINAS 30
4.1. Historia de la Micotoxicosis 30

5. MICOTOXINAS MÁS FRECUENTES PRODUCIDAS POR Fusarium spp. 32

5.1. Tricotecenos 32
5.1.1. Estructura química de los tricotecenos 34
5.1.2. Propiedades físico-químicas de los tricotecenos 35
5.1.3. Toxicidad de los Tricotecenos 36
5.1.4. Deoxinivalenol (DON) 36
5.1.5. Nivalenol (NIV) 39
5.1.6. 3-Acetildeoxinivalenol (3-AcDON) 40
5.1.7. 15-Acetildeoxinivalenol (15-AcDON) 41
5.1.8. Fusarenon X (FUS X) 41
5.1.9. Neosolaniol (NEO) 41

6. BIOSÍNTESIS DE TRICOTECENOS 42
6.1. Genes involucrados en la biosíntesis de tricotecenos (Genes Tri) 43
6.2. Especies micotoxigénicas de Fusarium 45

7. FACTORES DETERMINANTES EN LA PRODUCCIÓN DE MICOTOXINAS POR HONGOS DEL

GÉNERO Fusarium 48
7.1. Actividad del agua (aw) y contenido de agua 48
7.2. Temperatura 49
7.3. pH 49
7.4. Niveles de oxígeno (O2) y dioxido de carbono (CO2) 50
7.5. Composición del substrato 50
7.6. Interacción con otros microorganismos 51
7.7. Insectos 51

II
 Índice de materias

8. ANÁLISIS DE MICOTOXINAS 52
8.1. Métodos químicos 52
8.1.1. Muestreo 52
8.1.2. Extracción 53
8.1.3. Purificación 53
8.1.4. Técnicas cromatográficas 54
8.1.5. Detección y cuantificación 54
8.1.6. Métodos cromatográficos 54

II. OBJETIVOS 59

III. MATERIAL Y METODOS 63

1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Fusarium spp., PROCEDENTES DE MAÍZ 63

1.1. Procedencia de las Muestras de maíz 63
1.2. Medios de cultivo 64
1.3. Obtención de aislados de Fusarium spp. 64
1.4. Cultivo puro de hongos pertenecientes al género Fusarium, identificación y conservación 66
1.4.1. Nomenclatura de las placas 66
1.5. Cepas de referencia 67

2. MÉTODO DE EXTRACCIÓN DEL ADN DE Fusarium.: Método CTAB 68

2.1. Preparación de los aislados para la extracción de ADN 68
2.1.1. Procedimiento 68
2.1.2. Detección del ADN por electroforesis y visualización del producto de PCR 69
2.1.3. Conservación del ADN 70

3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR) 70

3.1. Preparación del ADN 70
3.2. Oligonucleótidos sintéticos 70
3.3. PCR para el género Fusarium 70
3.4. PCR para F. graminearum 71
3.5. PCR para F. verticillioides 72
3.6. PCR para F. culmorum 73
3.7. PCR para F. oxysporum 73
3.8. PCR múltiple para Fusarium spp. 74
3.9. PCR para detección de aislados productores de tricotecenos 74

III
Índice de materias

3.10. PCR para detección de aislados de Fusarium spp., productores de deoxinivalenol (DON) y
nivalenol (NIV) 77
3.11. PCR para amplificación de la región IGS 77
3.12. PCR para amplificación de la región ITS1- 5.8S – ITS2 y posterior secuenciación 78
3.13. Análisis de polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción amplificados por PCR (PCR-
RFLP) de la región IGS. 78

4. PURIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DE LA REGIÓN

ITS1- 5.8S – ITS2 79

5. MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETECCIÓN DE LAS MICOTOXINAS: Deoxinivalenol, 3-

Acetildeoxinivalenol, 15-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X y Nivalenol 80
5.1. Extracción y purificación 82
5.2. Derivatización de las micotoxinas 82
5.3. Determinación de Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-Acetildeoxinivalenol y
Nivalenol, por cromatografía de gases con detector de masas 83
5.3.1. Condiciones del cromatógrafo y del detector de masas 83
5.3.2. Cuantificación de Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-
Acetildeoxinivalenol y Nivalenol por patrón interno 84
5.4. Estudio de los parámetros analíticos del método 85
5.4.1. Intervalo de linealidad 85
5.4.2. Límite de cuantificación o determinación 86
5.4.3. Exactitud y precisión del método: ensayos de fortificación y recuperación de micotoxina 87

IV. RESULTADOS 93

1. CONTAMINACIÓN FÚNGICA DE LOS GRANOS DE MAÍZ 93

1.1. Maíz almacén 93
1.2. Maíz campo 96
1.3. Maíz experimental 103
1.3.1. Comparación de Fusarium spp. respecto a la microbiota fúngica total, según la variedad de
maíz 104
1.3.2. Comparación de Fusarium spp. respecto a la microbiota fúngica total, según los medios de
cultivo 108

2. AISLADOS DE HONGOS DEL GÉNERO Fusarium DE GRANOS DE MAÍZ 109

IV
 Índice de materias

3. IDENTIFICACIÓN POR PCR 109

3.1. Identificación del género Fusarium 109
3.2. Identificación a nivel de especie 110
3.2.1. PCR para F. graminearum 110
3.2.2. PCR para F. verticillioides 111
3.2.3. PCR para F. culmorum 112
3.2.4. PCR para F. oxysporum 112
3.2.5. PCR múltiple 113

4. IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLADOS POR SECUENCIACIÓN 114

5. ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DE LONGITUD EN LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN

AMPLIFICADOS POR PCR (PCR-RFLP) DE AISLADOS DE Fusarium spp., DE GRANOS DE MAÍZ 120

6. IDENTIFICACIÓN DE AISLADOS DE Fusarium spp., PRODUCTORES DE TRICOTECENOS 131

7. COMPROBACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-

Acetildeoxinivalenol Y Nivalenol EN AISLADOS DEL COMPLEJO F. graminearum POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE MASAS. 135
7.1. Presencia de Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-Acetildeoxinivalenol y
Nivalenol, en los medios de cultivo PDA, Czapeck y YES 136

V. DISCUSIÓN 149

VI. CONCLUSIONES 165

VII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA 169

ANEJOS 189

V
 Índice de figuras

Figura 1. Región Espaciadora intergénica IGS y Región Transcriptora Interna (ITS) 26

Figura 2. Estructura química de los tricotecenos tipo A y B 34
Figura 3. Metabolismo de DON en el sistema digestivo 38
Figura 4. Biosíntesis de tricodeína 43
Figura 5. Genes Tri implicados en la producción de Tricotecenos 44
Figura 6. Toxinas producidas por hongos del género Fusarium 47
Figura 7. Porcentaje de cada género fúngico obtenidos de maíz almacén en los
medios de cultivo PDA-CL y AVM 94
Figura 8. Porcentajes para cada género fúngico de maíz campo obtenidos en medio PDA-Cl 97
Figura 9. Distribución en porcentaje de la contaminación fúngica según el medio de cultivo,
para granos de maíz campo 98
Figura 10. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de Fusarium aislado de
maíz campo en los medios de cultivos 99
Figura 11. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de hongos no
pertenecientes al género Fusarium, aislado de maíz campo en los medios cultivo
PDA-CL y AVM 99
Figura 12. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de Fusarium para las
Comunidades Autónomas 103
Figura 13. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de hongos no Fusarium
para las Comunidades Autónomas 103
Figura 14. Gráfico de medias de Fusarium spp., según la variedad de maíz 107
Figura 15. Gráfico de medias de otros hongos según la variedad de maíz 107
Figura 16. Gráfico de medias de Fusarium spp., según medios de cultivo 108
Figura 17. Gráfico de medias de otros hongos según medios de cultivo 108
Figura 18. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los diferentes aislados de F.
graminearum 117
Figura 19. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los aislados de G. moniliformis
(F. verticilliodes), F. equiseti y F. Proliferatum 118
Figura 20. Dendrograma de similaridad obtenido por UPGMA, utilizando las enzimas de
restricción Mbo l, Xho I, Eco RI, Hin6 I, Hha I, Alu I, Bsu RI, Hind III, HaeIII, en los 18
aislados pertenecientes al complejo F. graminearum. y F. graminearum 2150 de
CECT 124
Figura 21. Dendrograma de similitud de los aislados pertenecientes a F. verticillioides, F.
proliferatum, F. equiseti y Fusarium sp., procedentes de granos de maíz y cepas de
referencia CECT2982, CECT2715, CECT2150, en base a sus perfiles génicos de
amplificación 129
Figura 22. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de los aislados F.
verticillioides procedentes de maíz campo, maíz almacén y maíz experimental y cepa
de referencia CECT 2982 130
Figura 23. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de los aislados de
F. verticillioides procedentes de maíz almacén y cepa de referencia CECT 2982 132
Figura 24. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de F.
verticillioides procedentes de maíz campo y cepa de referencia CECT 2982 132

VII
Índice de figuras

Figura 25. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de F.
verticillioides procedentes de maíz experimental y cepa de referencia CECT 2982 133
Figura 26. Dendrograma generado con 36 aislados de Fusarium spp., procedentes de maíz, por
análisis de restricción de la región IGS y cepa de referencia CECT 2982 134
Figura 27. Cromatograma de iones totales de patrón 4 ppm 143
Figura 28. Cromatograma de iones totales de la muestra P2.9.3(2) en medio de cultivo PDA 144
Figura 29. Cromatograma de iones cuantitativo y cualitativo de DON (parte superior) y espectro
de iones al tiempo de retención de DON (parte inferior) en la muestra P2.9.3(2) en
PDA a los 21 días 144
Figura 30. Cromatograma de iones totales del aislado V.5.1.1(1) Neo: neosolaniol (patrón
interno); DON: deoxinivlenol; 15-AcDON 145
Figura 31. Cromatograma de iones cuantitativo y cualitativo de 15-AcDON (parte superior) y
espectro de iones al tiempo de retención 15-AcDON (parte inferior) del aislado
V.5.1.1(1) 145

VIII
 Índice de tablas

Tabla 1. Eventos relevantes en la investigación de Fusarium spp. (1809-2007) 8

Tabla 2. Estructuras químicas de los sustituyentes R1, R2, R3, R4 y R5 de los tricotecenos Tipo A y Tipo B 35
Tabla 3. Micotoxinas producidas por especies del género Fusarium 46
Tabla 4. Variedad y origen de las muestras de maíz almacén 64
Tabla 5. Procedencia de las muestras analizadas de maíz campo 65
Tabla 6. Cepas de referencia 67
Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en este estudio 75
Tabla 8. Condiciones de temperatura para las reacciones de amplificación 76
Tabla 9. Tiempos de retención e iones característicos de las micotoxinas 86
Tabla 10. Número de granos de maíz almacén contaminados por hongos en los dos medios de cultivo
utilizados PDA-Cl y AVM 94
Tabla 11. Micobiota de granos de maíz de almacén en los dos medios de cultivo utilizados PDA-Cl y AVM 95
Tabla 12. Número y porcentaje de granos de maíz campo contaminados por hongos 96
Tabla 13. Distribución de la contaminación fúngica en granos de maíz campo 97
Tabla 14. Porcentajes de hongos aislados de maíz campo en función de la Comunidad Autónoma
estudiada 102
Tabla 15. Porcentajes de hongos que han crecido en la variedad Panamá 105
Tabla 16. Porcentajes de hongos que han crecido en la variedad Cribor 105
Tabla 17. Porcentajes de hongos que han crecido en la variedad Net 105
Tabla 18. Recuento total de hongos del género Fusarium y otros hongos, según variedad 107
Tabla 19. Identificación a nivel de especie mediante el análisis de secuencia de la región ITS de los
aislados de F. graminearum 116
Tabla 20. Identificación a nivel de especie mediante el análisis de secuencia de la región ITS de los
aislados de Fusarium verticillioides identificados por PCR 119
Tabla 21. Identificación a nivel de especie mediante el análisis de secuencia de la región ITS de los 14
aislados de Fusarium spp., no identificadas por PCR 120
Tabla 22. Exactitud y precisión del método para las diferentes micotoxinas evaluadas 136
Tabla 23. Detección de genes implicados en la producción de tricotecenos y DON y NIV. Resumen de las
cuatro micotoxinas producidas por los aislados del complejo F. graminearum provenientes de
maíz, en los distintos medios de cultivo y distintos tiempos de incubación 137
Tabla 24. Micotoxinas detectadas (µg/kg) por CG-MS a partir de medio de cultivo PDA crecido con cepas
de F. graminearum incubadas durante 7, 15 y 21 días a 20 ºC 140
Tabla 25. Micotoxinas detectadas (µg/kg) por CG-MS a partir de medio de cultivo crecido YES con cepas
de F. graminearum incubadas durante 7, 15 y 21 días a 20 ºC 141
Tabla 26. Micotoxinas detectadas (µg/kg) por CG-MS a partir de medio de cultivo Czapeck crecido con
cepas de F. graminearum incubadas durante 7, 15 y 21 días a 20 ºC 142

IX
Índice de fotografías

Fotografía 1. Estructuras morfológicas del género Fusarium 20

Fotografía 2. Desarrollo de algunas de las especies fúngicas contaminantes en maíz campo 101
Fotografía 3. Micobiota fúngica de maíz experimental 106
Fotografía 4. Identificación de Fusarium spp., mediante PCR 110
Fotografía 5. Amplificación de los aislados de F. graminearum 111
Fotografía 6. Identificación de F. verticillioides mediante PCR 112
Fotografía 7. Identificación de F. oxysporum mediante PCR 113
Fotografía 8. Identificación de F. graminearum, F. culmorum y F. sporotrichioides
mediante PCR múltiple 114
Fotografía 9. Productos de amplificación de la región ITS de los aislados de Fusarium spp. 114
Fotografía 10A. Perfiles generados después de la digestión con las enzimas de restricción
A: Alu I, B: Hha I, en la región IGS, en aislados de F. graminearum 122
Fotografía 10B. Perfiles generados después de la digestión con las enzimas de restricción
C: EcoRI, D: MboI, en la región IGS, en aislados de F. graminearum 123
Fotografía 11A. Perfiles generados por análisis de restricción de la región IGS de los aislados de
F. verticillioides con A: AluI y B: BsuRI 125
Fotografía 11B. Perfiles generados por análisis de restricción de la región IGS de los aislados de
F. verticillioides con C: MboI y D: EcoRI 126
Fotografía 11C. Perfiles generados por análisis de restricción de la región IGS de los aisaldos de
F. verticillioides E: HhaI 127
Fotografía 12. Identificación de aislados productores de tricotecenos mediante PCR 135

XI
 Abreviaturas

Abreviaturas empleadas
A Adenina
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosómico
ARN Ácido ribonucleico
ARNr Ácido ribonucleico ribosómico
AVM Agar Verde Malaquita
aw Actividad del agua
Blast Basic Local Alignement Sequence Tool
C Citosina
CECT Colección Española de Cultivos Tipo
CG Cromatografía de gases
cm Centímetro
CTAB Bromuro de cetil-trimetil-amonio
Cz Czapeck
DAS Diacetoxiscirpenol
dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato
DON Deoxinivalenol
EDTA Ácido etilendiaminotetracético
EST Expressed Sequence Tag
F. Fusarium
FUS X Fusarenon X
g Gramo
G Guanina
gmol-1 Gramos mol
h Hora
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
IDT Ingesta diaria tolerable
IGS Intergenic Spacer
IGS Región espaciadora intergénica
ITS Región espaciadora transcriptora interna
ITS Internal Transcribed Spacer Regions
Kb Kilobases (1000 pb)
kg Kilogramos
DL50 Dosis intraperitoneal o letal
LOAEL Nivel más bajo de la micotoxina al cual se observan efectos tóxicos
LSD Least Significant Differences
m Metro
M Molar
mg Miligramo
Mg2+ Magnesio
min. Minuto
mL Mililitro
mm Milimetros

XIII
Abreviaturas

mM Milimolar
mPCR Multiplex Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa
múltiple)
N2 Nitrógeno
NEO Neosolaniol
ng Nanogramo
NIV Nivalenol
nm Nanómetro
NOAEL Estimación del nivel de la micotoxina al cual no se observan efectos
tóxicos
O2 Oxigeno
ºC Grados centígrados
p/v Peso/ volumen
pb Pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)
PCR-RFLP Análisis de polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción
amplificados por PCR
PDA-Cl Potato Dextrosa Agar-Cloranfenicol
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RIA Radioinmunoensayo
rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecil sulfato sódico
sp. Especie
spp. Especies
subsp. Subespecies
T Tiamina
TAE Tris-acético-EDTA
TE Tris-EDTA
Tm Toneladas
U Unidades
UPGMA Unweighted pair-group method with arithmetic mean
UV Ultravioleta
V Voltios
XAD Resina de amberlita
YES Agar sacarosa extracto de levadura
ZEA Zearalenona
g Microgramos
L Microlitro
M Micromolar
µm Micrómetro
15-AcDON 15-Acetildeoxinivalenol
3-AcDON 3-Acetildeoxinivalenol

XIV
 Resumen

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS TOXIGÉNICAS DEL GÉNERO Fusarium

MEDIANTE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR.

Las micotoxinas son metabolitos producidos por un amplio grupo de hongos,

entre los que se encuentran los pertenecientes al género Fusarium. Se han
detectado como contaminantes naturales en mayor o en menor grado en un gran
número de productos agrícolas y manufacturados y, si llegan a ser consumidas,
pueden causar una gran variedad de efectos tóxicos en humanos y animales.

Dentro de los cereales, el maíz es uno de los más vulnerables a la colonización

por especies del género Fusarium y, por consiguiente, a la contaminación por las
micotoxinas que produce dicho género. Es por ello que en este trabajo se aislaron
estos hongos a partir de granos de maíz destinados al consumo humano y animal.
Estos análisis, además de aportarnos los aislados necesarios para la identificación y
detección de la producción de micotoxinas, sirvieron para el estudio comparativo
entre los medios de cultivo Patata Dextrosa Agar (PDA) y Agar Verde Malaquita,
destacándose este último por su selectividad para el aislamiento de hongos del
género Fusarium frente otros géneros.

Una vez obtenidos los aislados, nos centramos en la identificación por PCR de
especies del género Fusarium procedentes de grano de maíz y la detección de
especies productoras de tricotecenos (deoxinivalenol (DON) y nivalenol (NIV)).
Como controles se utilizaron cepas de referencia: suministradas por la Colección
Española de Cultivos Tipo.

De los hongos obtenidos en la primera parte de este trabajo se seleccionaron

377 pertenecientes al género Fusarium. Estos aislados fueron analizados mediante
PCR utilizando diferentes iniciadores específicos. Con este método se obtuvo la
identificación de las especies F. graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum y F.
verticillioides. La técnica PCR también permitió la detección de cepas productoras de
tricotecenos, así como la de aislados productores de DON.

Para comprobar la especificidad de la identificación por PCR, se realizó la

secuenciación del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 del DNA, con esta técnica se confirmó

XV
Resumen

la identificación por PCR de algunos aislados y se identificaron 43 aislados que no

pudieron ser identificados por PCR. También se analizó la región IGS mediante la
técnica PCR-RFLP de 96 aislados, encontrándose una alta variabilidad intra e
interespecifica.

Se determinó la producción de las micotoxinas deoxinivalenol (DON), 3-

acetildeoxinivalenol (3-ADON), fusarenona X, 15-acetildeoxinivalenol y nivalenol,
mediante cromatografía de gases con detector de masas (GS-MS), a partir de
aislados crecidos en tres medios de cultivo diferentes, a distintos periodos de
incubación. Para ello, se estudiaron 19 aislados de F. graminearum que previamente
habían demostrado poseer los genes implicados en la producción de tricotecenos y
DON. Mediante GC-MS se encontró que todas las cepas producían alguna de las
micotoxinas, DON, 3-AcDON y 15-AcDON. El medio de cultivo donde se obtuvo
mayor producción de micotoxinas fue PDA a los 21 días.

XVI
 Resum

CARACTERITZACIÓ DE SOQUES TOXIGÈNIQUES DEL GÈNERE Fusarium PER

MITJÀ DE TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR.

Les micotoxines són metabòlits produïts per un ampli grup de fongs, entre els
quals es troben els pertanyents al gènere Fusarium. S’han detectat com a
contaminants naturals en major o en menor grau en un gran nombre de productes
agrícoles i manufacturats i, si arriben a ser consumides, poden causar una gran
varietat d’efectes tòxics en humans i animals.

Dins dels cereals, la dacsa és un dels més vulnerables a la colonització per

espècies del gènere Fusarium i, per consegüent, a la contaminació per les
micotoxines que produeix aquest gènere. És per això que en aquest treball es van
aïllar aquests fongs a partir de grans de dacsa destinada al consum humà i animal.
Aquestes anàlisis, a més d’aportar-nos els aïllats necessaris per a la identificació i
detecció de la producció de micotoxines, van servir per a l’estudi comparatiu entre
els medis de cultiu Potato Dextrosa Agar (PDA) i Agar Verd de Malaquita, en què
destaca aquest últim per la seua selectivitat per a l’aïllament de fongs del gènere
Fusarium enfront d’altres gèneres.

Una vegada obtingudes les soques, ens centràrem en la identificació per PCR
d’espècies del gènere Fusarium procedents de grans de dacsa i la detecció
d’espècies productores de tricotecens –deoxinivalenol (DON) i nivalenol (NIV)–. Com
a controls es van utilitzar ceps de referència subministrats per la Col·lecció
Espanyola de Cultius Tipus.

Dels fongs obtinguts en la primera part d’aquest treball, se’n van seleccionar
377 pertanyents al gènere Fusarium. Les soques van ser analitzades per mitjà de
PCR, utilitzant diferents iniciadors específics. Amb aquest mètode s’obtingué la
identificació de les espècies F. graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum i F.
verticillioides. La tècnica PCR també va permetre la detecció de soques productores
de tricotecens, així com la d’aïllats productors de DON.

Per a comprovar l’especificitat de la identificació per PCR, es va realitzar la

seqüenciació del fragment ITS1-5.8S-ITS2 de l’ADN. Amb aquesta tècnica es va

XVII
Resum

confirmar la identificació per PCR d’algunes soques i se n’identificaren 43 que no

havien pogut ser identificades per PCR. També s’analitzà la regió IGS, per mitjà de
la tècnica PCR-RFLP, de 96 soques, en què es trobà una alta variabilitat intra i
interespecífica.

Es va determinar la producció de les micotoxines deoxinivalenol (DON), 3-

acetildeoxinivalenol (3-AcDON), fusarenon X, 15-acetildeoxinivalenol (15-AcDON) i
nivalenol, per mitjà de cromatografia de gasos amb detector de masses (GS-MS), a
partir de soques crescudes en tres medis de cultiu diferents, a distints períodes
d’incubació. Per a aquest propòsit, es van estudiar 19 soques de F. graminearum
que prèviament havien demostrat tenir els gens implicats en la producció de
tricotecens i DON. Per mitjà de GC-MS es va trobar que tots els ceps produïen
alguna de les micotoxines, DON, 3-AcDON i 15-AcDON. El medi de cultiu on
s’obtingué major producció de micotoxines va ser PDA al cap de 21 dies.

XVIII
 Summary

CHARACTERIZING OF TOXIGENIC STRAINS OF Fusarium BY MOLECULAR

BIOLOGY TECHNIQUES.

Mycotoxins are metabolites produced by a wide group of fungi, including the genus
Fusarium. Mycotoxins have been identified as natural pollutants to a greater or lesser
degree in many agricultural and manufactured products and can cause several toxic
effects in humans and animals if they become eaten.

Maize is one of the most vulnerable cereals to colonization by Fusarium species and
hence the contamination by mycotoxins produced by such genus. In this work we
have isolated Fusarium strains from maize grains for human and animal feed. We
have carried out a comparative study between Potato Dextrose Agar (PDA) and Agar
malachite green (AVM) to isolate Fusarium strains, highlighting the latter for its
selectivity for isolation Fusarium genus.

We focus on the identification by PCR of Fusarium isolates from maize grains and
detection of trichothecenes producing strains (deoxynivalenol (DON) and nivalenol
(NIV)). As controls, were used strains reference provided by the Spanish Type
Culture Collection (CECT).

We have selected 377 isolates belonging to Fusarium genus and subjected to PCR
analysis using different primers specific. With this method we have identified the
species F. graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum and F. verticillioides. The
PCR technique also allowed the detection of the gene that codifies the production of
trichothecenes, as well as isolated producers of DON.

To check the specificity of the identification of Fusarium strains by PCR, sequencing

of the fragment ITS1-5.8S-ITS2 DNA was carried out. With this technique we have
identified 43 isolates that could not be identified by PCR. We have also analyzed the
region IGS through technical PCR-RFLP of 96 isolated, founding a high intra and
interspecific variability.

The production of deoxynivalenol (DON), 3-acetyldeoxynivalenol (3-AcDON),

fusarenon X, 15-acetyldeoxynivalenol (15-AcDON) and nivalenol from isolated

XIX
Summary

strains in three different culture media at different periods of incubation, was

determined by gas chromatography with mass detector (GS-MS). We studied 19
isolated F. graminearum containing the genes involved in the production of
trichothecenes and DON. By GC-MS was found that all strains produced one of the
mycotoxins, DON, 3-AcDON and 15-AcDON. The culture medium in which was
obtained a higher production of mycotoxin PDA was at 21 days.

XX
I. INTRODUCCIÓN
 Introducción

1. REVISIÓN HISTÓRICA DE Fusarium spp.

El género Fusarium fue descrito por primera vez en 1809 por Link, quien lo
definió como especies de forma hialina, con esporas no septadas que nacían en un
estroma, con forma de canoa o banana, el cual era el carácter primario distintivo.
Dicha descripción se hizo basándose en las observaciones de F. roseum, primera
especie descrita, y debido a su falta de especificidad, se podría aplicar al menos a
50 géneros de Hiphomycetes (Marasas et al., 1984; Nelson et al., 1994). Es por ello
que la definición original ha sufrido una serie de modificaciones quedando como:
“especies con macroconidos fusoides, ligeramente curvados, septados y con una
célula basal pedicelada. Con microconidios y clamidosporas terminales o
intercalares, que pueden estar ausentes o presentes” (Nelson et al., 1994).

En 1821, Fries valida este género, incluyéndolo en el orden Tuberculariaceae.

Aunque se ha avanzado considerablemente, todavía existen desacuerdos en la
sistemática de Fusarium, que exhibe un grado notable de variación con respecto a
características morfológicas, culturales, y fisiológicas; variación que se puede
explicar, en parte, por la capacidad de la especie de colonizar lugares ecológicos
diversos en la mayoría de las áreas geográficas del mundo. Sin embargo, esta
variación ha conducido a dificultades considerables en el desarrollo de un sistema
taxonómico estable y extensamente aceptado para el género (Summerell et al.,
2003; Leslie and Summerell, 2006).

Inicialmente se describieron más de 1.000 especies, variedades y formas,

nombradas en base a observaciones superficiales (Toussoun et al., 1975).
Sistemáticamente no se describió el organismo entero y no se hizo ninguna tentativa
de buscar semejanzas o relaciones entre hongos/variedades. La necesidad de
buscar un sistema exacto y fiable de clasificación se produjo cuando especies del
género Fusarium causaron serias enfermedades en muchas plantas, y fue H.W.
Wollenweber quien estudio este género, del cual se publicaron trabajos como
“Studies on the Fusarium problem”, de 1913, o “Identification of species of Fusarium
occurring on the sweet potato”, de 1914, entre otras, en las cuales colaboraron 0.A.
Reinking, C.D. Sherbakoff, H. Johann, and A.A. Bailey. Estudios como “Aliquot
Fusaria tropicalia nova vel revisa”, de 1925 y “Fundamentals for taxonomic studies of

3
Introducción

Fusarium”, de 1925, dieron lugar en 1935 a la publicación “Die Fusarien” en la cual

colaboró 0.A. Reinking, donde se redujeron el número de especies, variedades y
formas de Fusarium a 142, agrupados en 16 secciones (Nelson et al., 1994).

Muchos son los sistemas taxonómicos que han sido propuestos para el género
Fusarium: Raillo en 1935, Snyder y Hansen en 1940-1941-1945, Bilai en 1955-1970,
Gordon 1944-1960, Messiaen y Cassini en 1968, Booth en 1971, Matuo en 1972,
Joffe en 1974, Gerlach y Nirenberg en 1982 y Nelson, P.E., Toussoun, T.A. and
Marasas, W.F.0., en 1983. Sin embargo, todos los sistemas propuestos sobre la
taxonomía de Fusarium están basados en trabajos de Wollenweber y Reinking
publicados desde 1913 a 1935 (Nelson et al., 1994).

Los taxónomos de Fusarium se pueden clasificar en "divisores", los cuales

buscan diferencias y crean nuevas clasificaciones; “agrupadores” que buscan
semejanzas y los asocian en base a las características que tienen en común y los
"moderados”, que son una mezcla de los dos grupos anteriores" (Nelson et al.,
1994).

Dentro de los “divisores” encontramos a Wollenweber y Reinking, cuyo trabajo

de 1935 sobre la taxonomía de Fusarium se ha convertido en referencia estándar en
este tema. El trabajo consistió en organizar aproximadamente 1.000 especies del
género Fusarium en 16 secciones: Eupionnotes, Macroconia, Spicarioides,
Submicrocera, Pseudomicrocera, Arachnites, Sporotrichiella, Roseum,
Arthrosporiella, Gibbosum, Discolor, Lateritium, Liseola, Elegans, Martiella, y
Ventricosum. Estas secciones contenían 65 especies, 55 variedades, y 22 formas.
Pero en estas se encuentran 77 sinónimos para Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc. y
133 sinónimos para Fusarium lateritium Nees y su teleomorfo (Nelson et al., 1994).

El sistema producido es tan complejo que es difícil o imposible utilizarlo para

construir una clave práctica satisfactoria. Los caracteres usados por Wollenweber y
Reinking para separar especie, variedades y formas no son estables y pueden ser
alterados fácilmente por medios de cultivos y bajo diferentes condiciones
ambientales. La variación o la mutación de los cultivos de Fusarium no fue
reconocida por Wollenweber y Reinking, puesto que sus cultivos no fueron

4
 Introducción

monospóricos y algunas de sus especies y muchas de sus variedades y formas

pueden ser mutantes (Nelson et al., 1994; Leslie and Summerell, 2006).

Raillo y Bilai, entre 1950 y 1955, estudiaron los caracteres morfológicos del
género, como forma y longitud del macroconidio, carácter guía en la determinación
de la especie; curvatura de conidios, número de tabiques, y ancho de conidios,
caracteres usados para la separación de subespecie y de variedades; y los
caracteres culturales como pigmento, presencia del esclerocios, y modo de la
formación de la espora, los cuales eran útiles en la separación de formas. Estudiaron
la variabilidad en Fusarium utilizando cultivos monospóricos y encontraron que la
forma de la célula apical, la curvatura de los conidios y número de tabiques seguía
siendo constante en los cultivos desarrollados a partir de cultivos monospóricos,
pero la longitud y la anchura de conidios, número de esclerocios y formación de la
espora variaban considerablemente (Nelson et al., 1994; Leslie and Summerell,
2006).

En 1955 Bilai reconoció la importancia de la variación y/o mutación de los

cultivos en la taxonomía de Fusarium. Estudió la morfogénesis en aislados
provenientes de conidios, prestando atención particular a los efectos de la
temperatura, humedad, período de crecimiento, composición del medio de cultivo,
germinación y envejecimiento de los conidios, y encontró que la variabilidad era
mayor que lo aceptado en la descripción de muchas especies. En base a estos
resultados, revisó la taxonomía del género para incluir solamente nueve secciones,
26 especies, y 29 variedades. Combinó la sección Liseola con la sección Elegans y
la sección Gibbosum con la sección Discolor. Este sistema se utilizó en Rusia, pero
no se ha aceptado en otras partes del mundo (Nelson et al., 1994; Leslie and
Summerell, 2006).

Gerlach y Nirenberg publica en 1982 “The genus Fusarium - a pictorial atlas”, un

trabajo que utiliza fotografías y dibujos de línea excelentes. Éstos utilizaron ocho
medios de cultivos bajo condiciones ambientales que acentúan diferencias. Se
concentraron en las diferencias más que las semejanzas, con el resultado de que
una diferencia leve en la morfología de un cultivo pudo haber sido la base para
señalar una nueva especie o variedad. Las nuevas especies fueron establecidas en

5
Introducción

base a un solo cultivo y, en algunos casos, en un solo cultivo mutante (Nelson et al.,
1994; Leslie and Summerell, 2006).

En 1986, Joffe hace un acercamiento a la taxonomía de Fusarium similar a la

de Wollenweber y Reinking y de Gerlach y Nirenberg (1982). De hecho, su sistema
parece ser simplemente una nueva exposición de las secciones y especies de
Wollenweber y Reinking, con la adición de algunos nombres de Gerlach. En su
monografía “Fusarium species: Their Biology and Toxicology” incluyó 13 secciones,
33 especies y 14 variedades, tomando como base primaria el macroconidio, forma
del microconidio y características del cultivo (Nelson et al., 1994; Leslie and
Summerell, 2006).

Siguiendo en la taxonomía de este género encontramos a los denominados

“agrupadores”, entre los que se encuentran Snyder y Hansen. En los años 40,
publicaron sus resultados en tres publicaciones. Este sistema se basa sobre todo en
la morfología del macroconidio y en un estudio extenso de la naturaleza y
variabilidad de las especies de Fusarium. La base para su trabajo era un análisis de
cultivos monospóricos de las especies de Fusarium bajo condiciones idénticas del
substrato y de condiciones ambientales. Encontraron que los caracteres utilizados
por Wollenweber y Reinking para la identificación de especie eran insuficientes
(Nelson et al., 1994; Leslie and Summerell, 2006).

Dentro de los taxónomos considerados como “moderados”, Gordon, en 1944

propone un sistema taxonómico que es una mezcla entre las propuestas de
Wollenweber y Reinking y Snyder y Hansen, pero con más semejanza al primero.
Booth, en 1971, modificó el sistema de Gordon, agregando resultados de sus
estudios, y amplió la información sobre los estados perfectos. La contribución más
importante fue la información sobre conidióforos y células conidiogénicas, útiles en la
taxonomía de las especies de Fusarium. Demostró el valor de la presencia de
polifiálides y monofiálides en la separación secciones y especie. También demostró
que la longitud y la forma de las células conidiogénicas que producen microconidios
eran caracteres fiables en la separación entre especies (Nelson et al., 1994; Leslie
and Summerell, 2006).

6
 Introducción

En 1983 Nelson, Toussoun y Marasas proponen uno de los sistemas

taxonómicos más utilizados a nivel mundial. La filosofía de estos investigadores es
que no hay un sistema taxonómico totalmente satisfactorio para la identificación de
todas las especies del género Fusarium. Sobre esta base, estos investigadores
seleccionaron lo que consideraban las mejores partes de varios sistemas y
combinaron los resultados de su propia investigación para desarrollar un sistema de
identificación práctica. El sistema incluyó F. oxysporum y F. solani, según lo descrito
por Snyder y Hansen, y la información sobre los conidióforos, según lo descrito por
Booth. Las secciones de Wollenweber y Reinking conteniendo especie toxigénicas,
así como otras secciones fueron conservadas. Sin embargo, el número de especies
fue reducido, y variedades y formas fueron combinadas con la especie apropiada
(Nelson et al.,1983; 1994; Leslie and Summerell, 2006). Los eventos más relevantes
en la investigación del género Fusarium se resumen en la Tabla 1.

1.1. Situación taxonómica actual del género Fusarium

El género Fusarium comprende 70 especies descritas, que a su vez están

agrupadas en 12 secciones. Cada sección es en realidad un conjunto de especies
relacionadas entre sí. Más de la mitad de las especies son parásitas de plantas y
entre ellos se encuentran algunos de los más serios patógenos del mundo agrícola
(Leslie and Summerell, 2006).

Aunque no se conoce nada acerca del origen espontáneo de nuevas razas de

Fusarium en la naturaleza, salvo que surgen irregular e impredeciblemente, se sabe
que pueden producirse por mutagénesis (Booth, 1984). La “forma specialis” (f. sp.)
son cepas morfológicamente similares y se caracterizan por sus adaptaciones a
diferentes hospedadores. Tanto las “forma specialis” como las razas fisiológicas no
son reconocibles morfológicamente, solo la inoculación y su comportamiento frente
al hospedador permiten su identificación. Aunque raza fisiológica y “forma specialis”
no están incluidos en los códigos internacionales de nomenclatura, ayuda a describir
el grado de especificidad de la relación hospedador – patógeno (Taylor et al., 1999).

7
Introducción

Tabla 1. Eventos relevantes en la investigación de Fusarium spp. (1809-2007)

Año Evento
1809 Link describe el género Fusarium
1821 Fries valida este género que lo incluyó en el orden Tuberculariaceae
1822 Fries describe el estado sexual del género Gibberella
1834 Schweinitz describe Gibberella zeae en maíz en los Estados Unidos
1877 Saccardo describe Oospora verticillioides en maíz asociada con pellagra en Italia
1882 Palchevski reporta tóxicos en pan en Siberia
1886 De Bary propone que las toxinas juegan un papel importante en la enfermedad
de las plantas
1901 Buckley and MacCallum asocian la encefalitis de caballos con comida mohosa en
Maryland, Estados Unidos
1904 Peters and Sheldon, correlacionan la consumición de maíz contaminado con F.
monilliforme con toxicosis en animales en Nebrasca
1913 Wollenweber publica “Studies on the Fusarium problem”
1914 Wollenweber publica “Identification of species of Fusarium occurring on the sweet
potato”
1923 Dounin reporta enfermedades causadas por Fusarium “head blight” y pan con
toxinas en Russia
1925 Bailey reporta “Aliquot Fusaria tropicalia nova vel revisa”, “Fundamentals for
taxonomic studies of Fusarium”
1934 Yabuta y colaboradores reportan la estructura de ácido fusarico de especies de
Fusarium
1935 Wollenweber and Reinking publican el primer gran atlas “Die Fusarien”, en Berlin
describen 142 especies del género
1935 Raillo hace la propuesta de un sistema taxonómico
1940 Snyder y Hansen reduce todas las especies de Fusarium a nueve especies
1940s En Rusia se presenta un brote de aleukia en humanos por el consumo de granos
contaminados con especies de Fusarium
1944 Gordon propone un nuevo sistema una mezcla entre la propuesta de
1960 Wollenweber y Reinking y el de Zinder y Hansen
1947 Gäumann aísla un fitotoxico una mezcla de eniatina de especies de Fusarium. Su
estructuras fueron reportadas 20 años más tarde
1955 Bilai propone un nuevo sistema taxonómico reconociendo la importancia de la
1970 variación o de la mutación de los cultivos en la taxonomía de Fusarium
1957 Gäumann reporta que el ácido fusarico es toxico para las plantas causándoles
marchitamiento.
1960 El consumo de alimento contaminado con aflatoxinas es correlacionado con el
brote de la enfermedad X en pavos en Inglaterra
1960s El Consumo de alimento contaminado con F. graminearum es correlacionado con
el brote de síndrome estrogénico en cerdos en el centro de Estados Unidos
1960s Reportan las estructuras de tricotecenos de Fusarium, incluida
diacetoxiscirpenol, deoxinivalenol
1970s Toxina T-2 y nivalenol son reportados en Europa, Japón y Estados Unidos
1966 Urry y colaboradores reportan la estructura de zearalenona de especies de
Fusarium
1968 Messiaen y Cassini en su propuesta taxonómica incluyen variedades botánicas
en vez de cultivares en la subespecie en F. roseum
1969 Hamill y colaboradores reportan la estructura de bauvericina de especies de
Beauveria. En 1991, estas micotoxinas son reportadas en especies de Fusarium
1970s El consumo de granos contaminados con F. graminearum se asocia con el brote
de akakabi-byo en humanos en Japón
1971 Booth modifica la propuesta taxonómica de Gordon añadiendo información sobre
conidióforos y células conidiogénicas
1972 Matuo sigue la propuesta de Snyder y de Hansen y propone una clave para el
sistema entero
1974 Springer y colaboradores reportan la estructura de moniliformina en especies de
Fusarium

8
 Introducción

Continuación Tabla 1.

1974 Joffe en su propuesta incluyó 13 secciones, 33 especies y 14 variedades para

Fusarium
1977 McLaughlin y colaboradores y Ueno, reportan que los tricotecenos inhiben la
síntesis de proteínas
1977 Hidy y colaboradores reportan actividad estrogénica de zearalenonas
1981 El consumo de maíz contaminado con F. verticillioides es correlacionado con una
alta tasa de cáncer de esófago en el sur África
1981 Oficiales del gobierno de Estados Unidos alega el uso de tricotecenos como
agentes de guerra biológicos en el sureste de Asia
1982 Gerlach y Nirenberg publica “The genus Fusarium a pictorial atlas”
1983 Nelson, Toussoun y Marasas, publican “Fusarium species: an illustrated manual
for identification”
1984 Gelderblom y colaboradores reportan actividad mutagénica y la estructura de
fusarina C de especies de Fusarium
1984 Marasas, Nelson, y Toussoun publican “Toxigenic Fusarium Species: identity and
mycotoxicology”
1985-1991 Acuerdos con los oficiales de Estados Unidos, Irak contrata la producción en
gran escala de tricotecenos y otras micotoxinas para el desarrollo de armas
biológicas
1988 Bezuidenhout y colaboradores reportan la estructura de fumonisinas de especies
de Fusarium. Laurent y colaboradores reportan independientemente la
macrofusina en 1989
1988 Marasas y Kellerman y colaboradores causan leukoencefalomalacia en caballos
aplicando fumonisinas por vía intravenosa y en 1990 por dosis oral
1989 Hohn y colaboradores clonan tricodenina sintetasa, primer tricoteceno
biosintético y en 1992 descubren el cluster génico
1989 Desjardins y colaboradores reportan que los tricotecenos son requeridos por F.
sporotrichioides y en 1992 F. sambucinum causa putrefacción en raíces, pero no
la putrefacción seca en tubérculos de patatas
1990s Gobernantes de los países de Europa, norte y sur América y otros, publican
regulaciones para deoxinivalenol, fumonisinas y zearalenonas en alimentos
humanos y comida para animales
1990 Harrison y colaboradores muestran que el edema pulmonar en cerdos se puede
causar aplicando una inyección intravenosa de fumonisina. En 1998, Gumprecht
y colaboradores causan esta enfermedad por dosis por vía oral
1991 Gelderblom y colaboradores demuestran experimentalmente que la ingestión de
fumonisinas puede causar cáncer de hígado en ratas. En 2001 la administración
de alimentos y drogas de Estados Unidos confirman que una dieta que contenga
fumonisinas causa cáncer de hígado y riñón en roedores
1991 Wang y colaboradores descubren que las fumonisinas inhiben la síntesis de
esfingolipidos
1993 La agencia internacional para la investigación contra el cáncer dice que toxinas
producidas por F. moniliforme (F. verticillioides) se catalogan como grupo 2B
carcinógenas (posiblemente carcinogénicas para humanos)
1993 Haese y colaboradores descubren el gen de la eniatina sintetasa
1996 Xu y Leslie publican el mapa genético de F. verticillioides
1996 Hermann y colaboradores reportan que la producción de enlaces eniatinicos que
dan la habilidad a F. avenaceum para causar secamiento de raíz en tomate
1996 Desjardins, Proctor y colaboradores reportan que los enlaces de tricotecenos
dan la habilidad a F. graminearum para causar la enfermedad llamada fusariosis
en trigo
1997 Stevens y Tang descubren que las fumonisinas inhiben el receptor del folate ó
ácido fólico, un posible mecanismo para neutralizar las defensas
1998 Kimura y colaboradores reportan el gen de Fusarium TRI101, que confiere la
resistencia a tricotecenos. Este también es reportado por McCormick y
colaboradores en 1999

9
Introducción

Continuación Tabla 1.

1999 Proctor y colaboradores descubren el cluster génico para la biosíntesis de

fumonisina
2000 Beremand y colaboradores publican una librería génica de F. sporotrichioides
2000 Brandwagt y colaboradores descubren el gen ASC-1, que confiere resistencia a
fumonisinas
2002 Jurgenson y colaboradores publican el mapa genético de F. graminearum.
2003 Se secuencia el genoma completo de F. graminearum
2004 Schmidt, Trail y Song y colaboradores descubren genes para la biosíntesis de
equisetina, fusarina y zearalenonas en especies de Fusarium
2006 Lysøe y colaboradores reportan que el gen PKS4 de F. graminearum es esencial
en la producción de Zearalenona
2006 Leslie y Summerell publican “The Fusarium Laboratory Manual” donde presenta
la descripción de 70 especies del género Fusarium
2007 Brown y colaboradores reportan que en F. verticillioides el clusters génico FUM
codifica a Zn (II) 2Cys6 proteína que afecta la expresión génica para FUM y la
producción fumonisina
* Tabla basada en la propuesta de Anne E. Desjardins. Fusarium. Mycotoxins: chemistry, Genetics
and Biology. 2006

Según de Hoog et al. (2000) y Leslie and Summerell (2006), la clasificación de

Fusarium se ubica en la:

División Ascomycota

Subdivisión Pezizomycotina

Clase Sordariomycetes

Subclase Hypocreomycetidae

Orden Hypocreales

Familia Hypocreaceae

Mitosporic Hypocreales

Género Fusarium

Especies F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti, F. oxysporum, F. solani, F.

verticillioides, F. dimerum, F. chlamydosporum, etc.

Algunas especies tienen un estado sexual reconocido dentro de la familia

Nectriaceae y pertenecen al género Gibberella o Nectria.

10
 Introducción

1.2. El concepto de especie en hongos

En micología, la distinción entre una población y un individuo no es siempre

fácil, y puede crear la confusión en los estudios genéticos (Carlile and Watkinson,
1994). Es por ello que se ha tomado como unidad taxonómica básica a la especie.
Sin embargo diversos micólogos consideran que para ser una especie tiene que
variar extensamente, y hay diversos acercamientos para delinearla. Hay que tener
en cuenta, además, que la base genética para algunos de estos conceptos es en
gran parte desconocida (Taylor et al., 2000).

Varios conceptos han sido utilizados por micólogos para definir la especie
fúngica. El concepto morfológico (fenotípico) es el acercamiento clásico más usado
por micólogos, y se definen en base a características morfológicas y
específicamente por las diferencias entre ellas. El concepto policategórico se basa
en una combinación de caracteres, aunque cada especie no tiene que tener la
misma combinación. El concepto biológico, que fue desarrollado antes del análisis
filogenético moderno, acentúa el intercambio de genes (es decir, reproducción
sexual y parasexual) dentro de la especie y la presencia de las barreras que
previenen el cruce de la especie (Davis, 1995).

Sin embargo, el concepto de especie biológica, basado en la reproducción

sexual, es de difícil aplicación en los microorganismos que no experimentan meiosis
y se utiliza solamente en los hongos en fase sexual. No obstante en hongos en fase
asexual, el intercambio genético por hibridación somática es una posibilidad teórica,
cuando existe compatibilidad vegetativa, aunque es limitado (Carlile and Watkinson,
1994; Seifert et al., 1995; Kurtzman and Robnett, 1997).

Los recientes progresos han influenciado altamente los conceptos tradicionales

de la sistemática. Los acercamientos y la incorporación a la filogenética de las
técnicas de la biología molecular, particularmente el análisis de secuencias de ADN,
han proporcionado nueva información que ha hecho que el concepto de especie
biológica se venga abajo, apareciendo el concepto de la especie filogenética. Este
concepto se ha encontrado particularmente apropiado para los grupos de hongos en

11
Introducción

donde no se ha observado ninguna reproducción sexual (deuteromicetes) (Leslie

and Summerell, 2006).

Uno de los problemas para los especialistas en morfología implica el decidir

cuántas diferencias se requieren para ser considerada una especie. Esto ha sido
solucionado en parte por el concepto de la especie filogenética, especialmente
cuando está basada en el análisis de características moleculares que ofrece
consistencia en la delineación de la especie (Kurtzman and Robnett, 1997).

Sin embargo, la definición del concepto de especie filogenética es también

complejo, y se han propuesto diversas definiciones. El concepto basado en el
carácter, define una especie como grupo de organismos que tienen cualidades o
combinaciones comunes. Por otro lado, el concepto tradicional de especie insiste
que los organismos deben ser relacionados filogenéticamente antes de ser
considerados miembros de especies conocidas (Baum and Donoghue, 1995).

1.3. Especies de Fusarium

1.3.1. F. graminearum Schwabe (Telemorfo Gibberella zeae)

Es una especie cosmopolita y presenta una amplia gama de hospedantes. Las

principales especies de interés económico susceptibles son: trigo, cebada, avena,
centeno, maíz, trébol, alfalfa, batata, arroz (Leslie and Summerell, 2006).

Las principales características que presenta esta especie son: esporodoquios a

menudo escasos, pero cuando están presentes son de color naranja pálido y pueden
estar ocultos bajo el micelio. El macroconidio es relativamente delgado, en forma de
hoz de 2.5 x 35-63 µm, puede contener entre 5 a 6 septos, se caracterizan por
presentar una célula basal con forma de pie bien desarrollada. Las clamidosporas
son globosas, midiendo entre 10 a 12 µm de diámetro, pueden ser simples o en
cadena. Con microconidos ausentes. Es un hongo homotálico y sus peritecios, son
gregarios y de coloración púrpura oscuro a negro. Se forman a partir de un estroma,
de forma ovoide, papilado, con diámetro de 150-350 µm, la temperatura para que se
forme esta estructura está entre 5-35 °C, presentando un óptimo de 29 °C, requiere

12
 Introducción

una alta humedad relativa y baja incidencia de luz ultravioleta. Las ascas pueden
contener 8 esporas hialinas. Estas esporas miden de 3.5 x 17-25 µm, presentan de 0
a 4 septos, normalmente de 4 células. El telemorfo de esta especie es Gibberella
zeae (Marasas et al., 1984; Desjardins, 2006; Leslie and Summerell, 2006).

Estudios en análisis filogenéticos basados en 11 genes nucleares revelan que

F. graminearum consiste en al menos nueve linajes biogeográficamente
estructurados denominados “Complejo F. graminearum” (Fg), que recientemente ha
logrado el estado de especie. Estos linajes son F. austroamericanum (linaje 1), F.
meridionale (linaje 2), F. boothii (linaje 3), F. mesoamericanum (linaje 4), F. acaciae-
mearnsii (linaje 5), F. asiaticum (linaje 6), F. graminearum (linaje 7), F. cortaderiae
(linaje 8) y F. brasilicum (linaje 9) (O'Donnell et al., 2004; Glenn, 2007).

Por muchos años F. graminearum fue ubicado en dos grupos, conocidos como
F. graminearum grupo 1 y F. graminearum grupo 2, morfológicamente son muy
difíciles de diferenciar estos dos grupos, pero hay diferencias ecológicas y
patológicas.

F. graminearum no se asocia directamente como patógeno humano, pero

aislados de esta especie producen tres importantes micotoxinas, zearalenona,
nivalenol y deoxinivalenol, así como aurofusarina, culmorina, fusarina C,
fusarocromanona y esteroides. La distribución geográfica de esta especie es
universal y frecuentemente se asocia con el lugar de origen y temperatura para la
producción de una determinada micotoxina (Desjardins, 2006; Leslie and Summerell,
2006; Lori y Rizzo, 2007).

1.3.2. F. verticillioides (Saccardo) Nirenberg. (Telemorfo Gibberella

moniliformis Wineland)

Esta especie que se encuentra dentro de las especies que pertenecen al

complejo G. fujikuroi, estado perfecto asociado a las especies del género Fusarium
pertenecientes a la sección Liseola y Elegans, cuya taxonomía es altamente
controvertida, y depende del criterio usado. Se distinguen nueve mapas de
poblaciones (MP) designados con las letras A – I: para F. verticillioides (Sacc.) y el

13
Introducción

MP A; F. sacchari (Butler) el MP B; F. fujikuroi, el MP C; F. proliferatum, MP D; F.

subglutinans, el MP E; F. thapsinum, el MP F; F. nygamai, el MP G; F. circinatum, el
MP H y F. konzum, el MP I (Keréngy et al., 1999; Zeller et al., 2003; Leslie et al.,
2004).

La apariencia del macroconidio formado en el esporodoquio, varía desde forma

de hoz a casi recto con el lado dorsal y ventral casi paralelo y con paredes delgadas
y célula basal con forma de pie, con 3 a 5 septos. Con microconidios abundantes,
unicelulares de forma oval a claviforme con una base aplanada. Se forman
apicalmente en cadenas largas sobre monofiálides. Los conidióforos pueden ser
ramificados o no ramificados, monofiálides, y no presenta clamidosporas. La
morfología de la colonia en el medio PDA es de color blanco la cual crece
rápidamente y frecuentemente se tiñe de púrpura. Los esporodoquios pueden estar
presentes o ausentes; cuando están presentes pueden ser de color arena a naranja.
Se pueden desarrollar esclerocios y usualmente son de color azul oscuro los cuales
pueden ser abundantes dando esa coloración a la superficie superior e inferior de la
colonia. La superficie inferior puede variar desde incolora hasta púrpura oscura
(Leslie and Summerell, 2006).

Su distribución geográfica es amplia y con alto un rango de hospedadores

importantes económicamente, como maíz, higo, esparrago, pino, caña de azúcar,
cebada, trigo. Causa diversos síntomas, está asociado con la marchitez, pudrición
de raíz y tallo en sorgo y maíz, en algunos casos produce pudrición de granos y
mazorca (Desjardins, 2006; Leslie and Summerell, 2006).

F. verticillioides es morfológicamente igual a F. thapsinum que no produce

pigmentos amarillos, también es similar a F. proliferatum pero las especies se
distinguen porque éste forma microconidios en cadena desde polifiálides. Lo mismo
sucede con F. andiyazi pero éste no forma pseudoclamidosporas, también es muy
similar en algunos aspectos con F. nygamai (Leslie and Summerell, 2006).

Una de las características de esta especie es que da alergia en humanos y

tiene la capacidad sistemática de producir cáncer. La fumonisina es la micotoxina
más importante que sintetiza esta especie, pero también ácido giberelico,

14
 Introducción

moniliformina, ácido fusarico, beauboricina, y fusaproliferina (Malonek et al., 2005;

Desjardins, 2006).

1.3.3. F. equiseti (Corda) Saccardo

Posee abundante macroconidios formados en esporodoquio de color naranja.

Se usa solamente el macroconidio formado en esporodoquio para su identificación,
la cual posee una curvatura dorsiventral y usualmente con 5 a 7 septos, con una
distintiva célula basal en forma de pie parecido a un látigo. Su tamaño puede variar
entre 25 a >120 µm, los macroconidios pueden ser también producidas por
monofiálides o en conidióforos bifurcados. No produce microconidios, produce
clamidosporas globosas, intercalares, solitarias o en cadenas, lisas o rugosas (Leslie
and Summerell, 2006).

F. equiseti se puede confundir con un gran número de especies del género

Fusarium incluyendo a F. scirpi, F. compactum, y F. semitectum (Leslie and
Summerell, 2006).

Geográficamente F. equiseti es cosmopolita, habitante natural del suelo y

aislado en muchas partes del mundo y puede colonizar raíces de plantas desde los
13 ºC hasta los 30 ºC. Produce una cantidad considerable de la enzima linamarasa y
el ácido ursodeoxicólico. Con lo que respecta a los humanos se conoce como
alergénico, se reconoce como patógeno humano y se asocia a micotoxicosis en
animales y humanos por las micotoxinas que produce las cuales incluyen:
butenolida, beauvericina, tricotecenos como diacetoxiscirpenol, nivalenol, y toxina T-
2, equisetina, fusarocromanona y zearalenona (Marasas et al., 1984; Desjardins,
2006; Leslie and Summerell, 2006).

1.3.4. F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg. (Telemorfo Gibberella

intermedia (Kuhlman))

Su estado sexual es G. intermedia (Kuhlman) Samuels, Nirenberg and Seifer,

su distribución geográfica es mundial y puede colonizar varios sustratos. Causa
enfermedades en maíz, sorgo, mango y esparrago. El macroconidio es el típico que

15
Introducción

se forma en las especies del complejo G. fujikuroi el cual se describió en la especie

F. verticillioides (Desjardins, 2006; Leslie and Summerell, 2006).

Algunos aislados de F. proliferatum producen ácido giberélico y una variedad de

micotoxinas en altos niveles dentro de las que se incluyen beauvericina,
fusaproliferina, ácido fusarico, fusarinas, fumonisina y moniliformina. También puede
producir proteasas y β-glucosidasas, β-xylosidasa, algunas especies producen
enzimas que están involucradas en la biodegradación de lignina (Leslie and
Summerell, 2006).

1.3.5. F. culmorum (W.G. Smith) Saccardo

Se caracteriza por qué forma abundantes macroconidios en el esporodoquio.

Estos son cortos y robustos, con una célula basal en forma de pie poco desarrollada.
Estos también se forma en monofiálides o en conidióforos bifurcados. Contiene entre
3 y 4 septos. Con microconidios ausentes y abundantes clamidosporas las cuales se
pueden formar entre la tercera a quinta semana (Leslie and Summerell, 2006).

Presenta similitudes morfológicas con F. sambucinum y F crookwellense. El

estado sexual de F. culmorum es probablemente heterotálica. Comúnmente se
encuentra en regiones templadas. Está asociado a enfermedades de raíz y tallo en
cereales y contaminación de granos, particularmente en las regiones templadas de
Europa. Produce esteroides y micotoxinas como la moniliformina, deoxinivalenol,
fusarina C, y zeralenona. También produce T-2 y neosolaniol. En humanos se asocia
con dermatitis (Desjardins, 2006; Leslie and Summerell, 2006).

1.3.6. F. oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder and Hansen

Su estado sexual no es conocido, su distribución geográfica es cosmopolita y es

un importante patógeno vascular de muchas plantas y es común en el suelo como
saprofito. Sus características principales es su macroconidio que se forma en
esporodoquio, en conidióforos bifurcados o en monofilides, que usualmente son
abundantes, de paredes delgadas, fusiformes, largas, moderadamente curvadas en
forma de hoz, usualmente con 3 septos transversales, con la célula basal elongada y

16
 Introducción

la célula apical atenuada; con un tamaño que va de 27 a 46 µm de largo por 3 a 4.5

µm de ancho. Los microconidios usualmente no tienen septos, unicelulares, hialinos,
elipsoidales a cilíndricos, rectos o curvados; se forman sobre fiálides laterales,
cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados y son formados
abundantemente en falsas cabezas. Los microconidios tienen 5-12 µm de largo por
2.5-3.5 µm de ancho. Produce abundantes clamidosporas a las 4-6 semanas. Son
más de 100 formas “speciales” o razas que se han descrito de F. oxysporum
(Marasas et al., 1984; Desjardins, 2006; Leslie and Summerell, 2006).

Se ha asociado con varias infecciones en humanos incluyendo infecciones en la

cornea, varios tipos de dermatitis, e infecciones internas. Generalmente esta especie
no produce micotoxinas aunque sintetizan varios poliquetidos en sus metabolitos
secundarios aunque se desconoce su función y toxicidad. Algunos aislados pueden
producir zearalenona y algunos tricotecenos (Leslie and Summerell, 2006).

2. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN

2.1. Identificación y caracterización de las especies del género Fusarium

Como se dijo anteriormente, la marcada variabilidad de Fusarium spp. en

cuanto a sus características fisiológicas y morfológicas, explica su capacidad para
colonizar diversos nichos ecológicos diseminados por todo el mundo. Esto explica la
cantidad de especies descritas por los diversos autores. La mayoría de estas
clasificaciones se basan en las características macro y microscópicas del cultivo y se
considera un género anamórfico dentro de los Ascomicetes (de Hoog et al., 1998;
2000).

La morfología, pigmentación de la colonia y ausencia o presencia de

esporodoquio, esclerocios o estroma en diferentes medios son características que
se tienen en cuenta. En medios habituales las colonias presentan un crecimiento
rápido, que suele ocupar toda la placa (8-9 cm de diámetro en una semana). El color
que desarrollan depende de la especie, y puede ser blanquecino, crema,
anaranjado, rosa, rojizo, púrpura, etc., coloraciones que pueden variar según los

17
Introducción

diferentes medios de cultivo. El micelio aéreo suele ser abundante y de aspecto

algodonoso (de Hoog, 1998; Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006).

Habitualmente los medios de cultivo más utilizados con el propósito de

identificación son: agar extracto de malta (MEA), en el cual se pueden valorar
aspectos morfológicos tanto macroscópicos como microscópicos además de
conseguirse una buena esporulación. Con agar patata dextrosa (PDA) se valora muy
bien el aspecto morfológico y coloración de la colonia, pero su alto contenido en
carbohidratos condiciona un mayor crecimiento en detrimento de la esporulación,
que suele retrasarse, y los conidios pueden ser atípicos. El medio agar harina de
avena (OA) se utiliza para valorar la velocidad de crecimiento, color, aspecto de la
colonia y características microscópicas. Agua agar (WA) es un medio recomendado
para la germinación inicial de conidios de cultivos de Fusarium spp., y suelo agar
(SA), que se usa para formación de clamidosporas, es utilizado para la identificación
de algunas especies de Fusarium (Leslie and Summerell, 2006). Otros medios de
cultivo utilizados son: agar clavel (CLA), Cloruro de potasio agar (AKCl), agar arena,
agar nutriente sintético (SNA), medio de Komada, entre otros.

La temperatura habitual de incubación puede oscilar entre 24 y 28 ºC. La

formación de conidios puede estimularse incubando los diferentes medios bajo luz
negra (300-400 nm) y también alternando luz y temperatura (25 ºC día/20 ºC noche)
(Leslie and Summerell, 2006).

2.2. Estructuras que se tienen en cuenta para la identificación morfológica en

especies del género Fusarium

Las especies del género Fusarium pueden producir tres tipos de esporas
llamadas: macroconidio, microconidio y clamidosporas. Algunas especies producen
los tres tipos de esporas, mientras que otras especies no.

El macroconidio es el órgano principal para la caracterización, no solamente

de la especie si no también del género Fusarium; su forma y tamaño varía según la
especie. Este se puede formar en una estructura especializada llamada
esporodoquio, como también en monofiálides, polifiálides y en el micelio aéreo. Para

18
 Introducción

algunas especies es una característica relativamente constante y estable, pero se

debe utilizar cautelosamente como criterio taxonómico. La presencia de una célula
basal con forma de pie en los macroconidios se considera característica de
Fusarium, pero varios géneros de Coelomycetes también la tienen (Nelson et al.,
1983; Seifert, 2001; Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006).

El microconidio es un carácter primario en taxonomía del género Fusarium y

se considera su presencia o ausencia. Si el microconidio está presente, las
características consideradas son: forma, modo de formación, si está solo, en falsas
cabezas, en cabezas o en cadenas. Estos se forman en el micelio aéreo a partir de
monofiálides o polifiálides pero no en el esporodoquio. Se pueden ver aislados, en
masas o en cadenas. La forma en la que son producidos se observa mejor en un
medio con substrato natural como el agar-clavel (Samson et al., 2004; Leslie and
Summerell, 2006).

Los mesoconidios, anteriormente denominados blastoconidios, son otro tipo

de conidios que tienen forma y tamaño similar a los macroconidios pero les falta la
célula basal en forma de pie, pueden ser rectos, se forman siempre en polifiálides y
son individuales (Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006).

Otras estructuras como los conidióforos, que contienen el microconidio. Es un

carácter taxonómico primario y, dependiendo de la especie, se pueden encontrar en
monofiálides o contener monofiálides y polifiálides produciendo microconidios
(Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006). El esporodoquio es una masa
de conidióforos cortos y estrechamente ramificados que nacen directamente de una
maraña de hifas. Se producen más frecuentemente en la naturaleza que en los
cultivos de laboratorio (Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006).

La presencia o ausencia de clamidosporas es un carácter primario en

taxonomía de Fusarium. Si están presentes, pueden estar solas, en pares, en
grupos, o en cadenas. Su pared puede ser gruesa, rugosa o lisa. Es una espora de
supervivencia ante ambientes adversos que garantiza la propagación y
supervivencia del hongo (Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006).

19
Introducción

También encontramos los esclerocios, que son una masa de células duras
(difícil de aplastar entre porta y cubre) e inactiva bajo condiciones ambientales
desfavorables y el estroma, que es una estructura vegetativa compacta dentro de la
que se desarrollan cuerpos de fructificación.

A B

A D
C

Fotografía 1. Estructuras morfológicas del género Fusarium A y B: conidióforos, C:

Macroconidio, D: macroconidióforo, E: microconidio, F: clamidoesporas
(Fotos: E.D. Gómez L).

20
 Introducción

El acercamiento fenotípico se ha criticado en gran parte por su carencia de

terminología estandarizada, estable y su alta subjetividad. Por otra parte, algunas
características fenotípicas se han considerado inestables y dependiente de
condiciones ambientales, como el crecimiento en cultivos artificiales. Otro problema
notable de la clasificación basado en criterios morfológicos es el sistema dual, sin la
correlación constante entre la taxonomía de los ascomicetes y los deuteromicetos.
Esta es una dificultad importante para establecer las unidades taxonómicas del
hongo en su totalidad (Leslie and Summerell, 2006).

En años recientes, las técnicas morfológicas han sido influenciadas por la

taxonomía numérica, que permite estudios fenotípicos más fiables. La aplicación de
programas informáticos y paquetes estadísticos eficaces al desarrollo de las claves
de identificación, ofrecen algunas soluciones y la posibilidad de un renacimiento de
los estudios morfológicos. Los analizadores de imagen automatizados, el estudio por
microscopía electrónica y la geometría fractal pueden ofrecer mucho en el análisis
de la morfología fúngica (Samson et al., 2004; Leslie and Summerell, 2006).

2.3. Técnicas fisiológicas y bioquímicas

Estas técnicas se han utilizado con éxito en el estudio de las levaduras.

Diversas temperaturas de crecimiento se han utilizado como herramienta
complementaria en la identificación de hongos asexuales y sexuales. El rango de
crecimiento en medios definidos bajo condiciones controladas tienen también valor
en estudios de géneros complejos tales como Fusarium y Penicillium. Los kits
comercialmente disponibles, tales como el sistema API 20 C AUX®, se han utilizado
para identificar hongos filamentosos y levaduras. Paterson et al. (1994) han
publicado una compilación de las técnicas fisiológicas usadas en la identificación de
hongos filamentosos y enumeran una gama de métodos bioquímicos que se
extiendan desde pruebas en agar hasta métodos cromatográficos y electroforéticos
sofisticados (Heard and Fleet, 1990; Deak and Beuchat, 1996)

2.3.1. Metabolitos secundarios. Los metabolitos secundarios son compuestos

no esenciales para el crecimiento y no son parte del metabolismo primario de
organismo, pero probablemente desempeñan cierto papel en la vida de los hongos y

21
Introducción

se encuentran generalmente como mezcla de moléculas relacionadas con una

estructura química peculiar. Los más comunes son esteroides, terpenos, alcaloides,
ciclopeptidos y cumarinas. Algunos de éstos son micotoxigénicos. La producción de
metabolitos secundarios ha estado durante mucho tiempo en uso en la identificación
y la clasificación de líquenes y se ha utilizado menos en la taxonomía de
ascomicetes y basidiomicetes, aunque es bien sabido que estos organismos
producen un número extenso de estos compuestos. En estos órdenes, la especie
individual se puede reconocer a menudo en base a perfiles particulares de
metabolitos (Demain, 1996; Frisvad et al., 1999).

2.3.2. Ubiquinonas (coenzima Q). Estos compuestos son importantes en la

cadena de transporte de electrones en el sistema respiratorio. El número de
unidades del isopreno unidas al núcleo de la quinona varía, y tales diferencias en
estructura de la ubiquinona son indicadores excelentes de la clasificación de
géneros y de taxa subgenérica en bacterias y levaduras. Aunque esta técnica se ha
utilizado en la taxonomía de levaduras, en hongos filamentosos es poco común. Los
resultados proporcionados por estas técnicas se correlacionan a veces con lo
proporcionado por técnicas moleculares, aunque las conclusiones basadas
solamente en la ubiquinona son discutibles, y dependiendo del método usado,
pueden proporcionar datos variables (Yamada et al., 1989; Shiosaki et al., 2001)

2.3.3. Composición de ácidos grasos. El tipo de ácidos grasos presentes en

la célula y su concentración relativa son características útiles para separar taxones,
y se determinan rutinariamente en la sistemática bacteriana. Hasta hace poco
tiempo, estas técnicas eran utilizadas raramente en taxonomía de hongos, pero en la
actualidad estos análisis se utilizan cada vez más para distinguir los hongos. En
comparación con las bacterias pocos son los ácidos grasos producidos por los
hongos. La espectrometría, cromatografía de gases, y los sistemas bifásicos del
polímero acuoso de partición, están entre los métodos usados para determinar estos
compuestos. La cromatografía de gases, combinada con métodos de análisis
estadístico multivariante se ha utilizado con éxito para estudiar ácidos grasos de
numerosos hongos filamentosos, incluyendo oomycetes, zygomycetes,
basidiomicetes, e incluso micelio esterilia. Estas técnicas también han demostrado

22
 Introducción

ser útiles a nivel intraespecífico (Kock and Botha, 1999; Madan et al., 2002;
Lanoiselet et al., 2005).

2.3.4. Composición de la pared de celular. Las diferencias en la estructura y

la composición de la pared celular de hongos se han utilizado en la definición de los
taxones. Por ejemplo, la celulosa es un componente particular de la fracción alcali
insoluble de oomycetes, mientras que los ascomicetes y los basidiomicetes
contienen la quitina y glucano en estas fracciones. Por contraste, los zigomicetos
tienen ácido quitosan y poliglucuronico. Variaciones significativas en la composición
del azúcar de las paredes de célula se han observado en los diversos géneros de
dermatofitos (Phaff, 1998; Roeijmans, 1998; Ahrazem et al., 2006).

2.3.5. Composición proteica. Refleja la organización genética de un

organismo; por lo tanto, el análisis de diferentes perfiles de proteínas se puede
utilizar como sistema de identificación o tipificación. Los patrones producidos por
técnicas electroforeticas (zymogramas) permiten determinar relaciones entre
géneros y distinguir especies. Aparte de la electroforesis, las técnicas inmunológicas
también se pueden usar para la caracterización interespecífica. El análisis proteico
se considera una técnica económica y práctica, aceptada generalmente para hongos
con orígenes genéticos independientes. Los datos de isoenzimas alélicas se utilizan
comúnmente en los estudios filogenéticos (Schulze, 2005).

3. TÉCNICAS MOLECULARES

Las características morfológicas que se distinguen en un hongo se limitan con

frecuencia a permitir su identificación; a ello también se aplican las técnicas
fisiológicas y bioquímicas. Sin embargo, en los hongos filamentosos estos métodos
son laboriosos, variables y costosos. Avances técnicos importantes han estimulado
el uso de técnicas moleculares que son universalmente aplicables, como la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) que ha permitido el análisis molecular de células
fúngicas o aún esporas, material seco, u organismos extintos, como también a la
selección de oligonucleótidos específicos para hongos, que ha proporcionado el
acceso fácil a las secuencias del ADN (Olive and Bean, 1999; Wassenaar and
Newell, 2000; Leslie and Summerell, 2006).

23
Introducción

Teniendo en cuenta lo anteriormente mencionado, los estudios moleculares en

hongos apuntan a: (i) estudios filogenéticos, (ii) estudios taxonómicos, sobre todo a
nivel de géneros y de especies; (iii) usos de diagnóstico; y (iv) epidemiología y
genética de la población. Cada una de estas orientaciones generales y niveles de
diversidad, tiene su propio sistema de técnicas (Crous, 2005).

3.1. ADN ribosómico

La principal razón del uso del ADN ribosomal (ADNr) es que en eucariotas el
ADNr usualmente esta formado por varias cientos de copias repetidas en tándem de
una unidad de transcripción, más varios espacios adyacentes no transcritos. El
número de copias puede variar según el organismo. Además, existen fragmentos
con distinto grado de conservación entre los organismos, como los genes 18S, 5.8S
y 28S, y regiones variables, los espacios intergénicos (IGS) y las regiones internas
que se transcriben (internal transcribed spacers o ITS). Estas regiones son variables
en su composición y tamaño, lo cual sirve como una herramienta en la identificación,
diferenciación y clasificación de hongos, y permite realizar estudios a diferentes
niveles, como discriminar entre géneros, especies o a nivel intraespecífico. Otra
característica que lo hace importante es que las regiones que lo componen poseen
una evolución desigual, es decir, la tasa de sustitución nucleotídica presenta ritmos
diferentes en las distintas regiones (Luque y Herráez, 2002). Además, los ribosomas
están presentes en todos los organismos, con un origen evolutivo común. Hay
secuencias de la molécula de ARNr que se conservan y sirven de referencia para la
divergencia evolutiva (O’Donnell, 1992; Radford, 1993; Tsai et al., 1994).

Para análisis filogenéticos las regiones comúnmente secuenciadas y

comparadas son las porciones del ADNr, incluyendo los ITS1 y ITS2, IGS y el 18S y
28S. Estas regiones están altamente conservadas en una especie y son variables
entre especies (Desjardins, 2006).

Los dominios variables 28S son informativos y permiten comparaciones de altos

niveles taxonómicos, aunque solamente hay un número limitado de posiciones
variables (Hernández, 2005; Martorell, 2006).

24
 Introducción

El gen 18S, se ha utilizado totalmente o en subunidades en estudios

filogenéticos a nivel de órdenes o familias en hongos filamentosos. Bago et al., 1998
señalan la existencia de distintos sitios informativos en este gen que pueden ser
utilizados como "marcadores moleculares" que permitan discriminar y agrupar cepas
a nivel de género (Okada et al., 1997; de Hoog et al., 1998; Bago et al., 1998).

El gen 5.8S ADNr es fácilmente secuenciado por su tamaño (158-164 pb). Su

uso para la realización de estudios filogénicos es limitado debido a la poca
variabilidad e información que aporta el gen, por ello no es válido para estudios de
especies cercanamente relacionadas (Martorell, 2006).

3.1.1. Región Espaciadora Transcriptora Interna (ITS) y Región

Espaciadora Intergénica IGS

La región ITS es una pequeña región espaciadora altamente polimórfica

utilizada para estudios filogenéticos y taxonómicos, que consiste en dos fragmentos
transcritos que se encuentran entre los genes nucleares 18S, 5.8S y 28S que
codifican para el ARNr. Estos fragmentos son altamente variables, por lo cual se
utilizan para estudiar las relaciones a nivel de especies y géneros cercanos, pero
con mayor dificultad a nivel de familias distintas. Además, estos genes generalmente
se encuentran juntos en una o varias series de tándem de una unidad de repetición
(ADNr), que consiste en tres regiones de codificación separadas por espaciadores
intergénicos (IGS).

Entre las secuencias altamente conservadas de esta región se encuentran

también regiones variables, tales como los espaciadores internos ITS1 y ITS2, que
son regiones no codificantes pero que se transcriben dentro de la unidad
transcripcional. Individualmente, los ITS1 y ITS2 poseen un tamaño aproximado de
300 pb y el 5.8S ADNr es pequeño (158-164pb), haciendo la región entera ITS de
700 pb. Aunque ITS1 y ITS2 son parte de la unidad transcriptora ribosomal, estas
secuencias no se incorporan en los ribosomas maduros. Dada la corta longitud y la
naturaleza altamente conservada de los genes ribosomales de la subunidad que
flanquean la región ITS, esta es amplificada fácilmente por la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) (Baldwin, 1992).

25
Introducción

Por otra parte, esta región del ADNr experimenta una evolución relativamente
rápida. Esta característica de la región ITS es la más importante desde el punto de
vista filogenético y permite la reconstrucción exacta de las relaciones de la especie.
Sin embargo, las copias de ADNr no homólogas están de vez en cuando presentes
con mutaciones puntuales y/o con accidentes de inserción/borrado, causando una
pequeña variación entre las copias dentro de una especie (Baldwin et al., 1995).

Se ha comprobado que filogenéticamente, la región ITS1 posee más

información que la región ITS2 en promedio, por poseer alrededor del 29% más
nucleótidos variables. Los árboles filogenéticos basados en ITS1 o ITS2 solamente
pueden indicar relaciones que no pueden ser representadas por el otro espaciador.
Combinando los resultados de ITS1 y de ITS2, resultan árboles filogenéticos más
robustos y más completos (Baldwin, 1992; Baldwin et al., 1995).

Unidad de repetición Tandem

18S 5.8S 28S IGS 18S 5.8S 28S IGS 18S 5.8S 28S

reforzadores
o
promotores SP

Espacio intergénico
18S 5.8S 28S
SSU ITS1 ITS2 LSU

Región ITS

Figura 1. Región Espaciadora intergénica IGS y Región Transcriptora Interna (ITS). Adaptado
de Weider et al., 2005

La región espaciadora IGS incluye dos regiones espaciadoras externas ETS1 y

ETS2 que no codifican, las cuales se pueden o no transcribir. Esta región contiene
altos niveles de variabilidad de secuencia entre especies del mismo género y
permite la diferenciación entre especies cercanas genéticamente relacionadas, en
contraste con la región ITS que no presenta suficientes polimorfismos para permitir

26
 Introducción

el diseño de ensayos de este tipo (Abd-Elsalam et al., 2003; Hatsch et al., 2004;
Jurado et al., 2005; Weider et al., 2005).

Basándose en el análisis de la región IGS, se ha trabajado en la variabilidad

intraespecífica en la producción de fumonisina, analizando el grado de semejanza en
aislamientos dentro de la especie F. verticillioides y la relación de otras poblaciones
estrechamente relacionadas dentro del complejo de especies de Gibberella fujikuroi.
También se han diseñado iniciadores específicos para detectar cepas productoras
de fumonisinas (Patiño et al., 2004, 2006).

Tanto la región IGS como la ITS han sido usadas para la elaboración de árboles
filogenéticos de hongos filamentosos, así como para la identificación de cepas
micotoxigénicas de Fusarium, Aspergillus y Penicillium. Uno de los enfoques
fundamentales que ha dominado en este tipo de estudios ha sido el comparar los
patrones de bandas generados por medio de amplificación de secuencias de ADNr
de las regiones de los espaciadores intragénicos transcritos ITS1 y ITS2 (Yli-Mattila
et al., 2004; González-Salgado et al., 2005; Jurado et al., 2005).

3.1.2. Análisis de polimorfismos de longitud en los fragmentos de

restricción amplificados por PCR (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism (PCR-RFLP))

La técnica PCR-RFLP consiste en la amplificación por PCR de una secuencia

conocida del ADN, utilizando dos iniciadores homólogos en sus regiones extremas.
Las secuencias de ADN amplificadas por PCR son digeridas por los llamados
enzimas de restricción. Estas reconocen una secuencia de ADN y cortan las
cadenas de ADN original en los puntos donde esté dicha secuencia, normalmente
las secuencias son palindrómicas y las enzimas de restricción cortan las dos
cadenas de ADN. Se obtienen fragmentos de diferentes tamaños, los cuales son
visualizados en un gel de agarosa aplicando la técnica de electroforesis, en la que
se genera un desplazamiento de los fragmentos de ADN después de aplicarles una
diferencia de potencial eléctrico. El desplazamiento está en función del tamaño de
los fragmentos, por lo que podemos basarnos en esta medición y en la cantidad de
fragmentos para identificar parcialmente la muestra. Debido a que los patrones de

27
Introducción

restricción se forman con base solamente al tamaño de los fragmentos de ADN

generados y su número, es posible tener patrones de restricción iguales para
hongos diferentes por lo que es necesario utilizar otros enzimas que discriminen
esos hongos generando patrones diferentes (Hausner et al., 2000; Kim et al., 2001).

Las endonucleasas de restricción son obtenidas principalmente de organismos

procarióticos, que reconocen una secuencia entre 4-8 pb en ADN. El sitio de
reconocimiento se llama sitio o diana de restricción y su principal función es cortar
las dos cadenas de ADN en determinadas secuencias de nucleótidos. Existen más
de 2300 endonucleasas de restricción disponibles para la tipificación (Mirhendi et al.,
2001; Hausner et al., 2000). En hongos las más utilizadas son: AluI, HhaI, HapII,
MboI, EcoRI, PstI ,XhoI, BsuRI ; CfoI, BglII, EcoRV, HaeIII, HincII, HindIII, HinfI,
KpnI, MspI, NruI, PstI, SalI, SacI, Sau3AI, SmaI, SphI, StuI, TaqI, XbaI, Not I, RsaI
(Ferrer et al., 2001; Kim et al., 2001; Mirhendi et al., 2001; Carter et al., 2002; De las
Heras, 2004; Desjardins, 2006; Patiño et al., 2006; Llorens et al., 2006).

La aplicación de esta técnica en la región IGS del ADNr ha permitido agrupar,

con un alto grado de similitud aislados de las especies F. culmorum, F.
graminearum, y F. crookwellense como también para distinguir aislados de G.
fujikuroi en diferentes hospedadores, así mismo en la identificación de especies del
género Fusarium y estudios filogenéticos de F. poae, F. langsethiae, F.
sporotrichioides y F. kyushuense (Mishra et al., 2002; Hinojo et al., 2004;
Konstantinova and Yli-Mattila 2004). Así mismo, Patiño et al. (2006) hacen una
caracterización y estudios filogenéticos de aislados de F. verticillioides analizando
esta misma región. Esta técnica se ha usado también en la construcción del mapa
genético de G. fujikuroi (Xu and Leslie, 1996). Y se ha utilizado con éxito en la
diferenciación de F. equiseti aislados de cereales en Noruega, como también en
variación intraespecifica en poblaciones de F. culmorum (Mishra et al., 2002; Kosiak
et al., 2005).

Se considera una técnica rápida, sencilla, que no requiere de reactivos y

equipamiento excesivamente costosos. Estas características hacen que sea una
técnica de subtipificación muy aceptada (Soll, 2000; Moore et al., 2002).

28
 Introducción

3.1.3. Secuenciación de nucleótidos

La secuenciación es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya

finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) que
conforman una molécula de ADN. La importancia de poseer la secuencia del
genoma de un organismo está relacionada con las posibilidades de manipulación de
su información genética. Pues con la secuencia completa del genoma se tiene, al
menos en teoría, acceso a todas las características que definen a un individuo
(Woese, 2000; Stackebrandt et al., 2002).

Se han desarrollado varios métodos de secuenciación empezando con los

métodos clásicos dentro de los que se encuentran: el método químico de Maxam y
Gilbert y el método enzimático de Sanger. Se ha desarrollado la secuenciación
automática empleando el método enzimático, ya sea con cebadores fluorescentes o
con terminales fluorescentes, también se encuentran los secuenciadores
automáticos que emplean capilares ó geles desnaturalizantes, hasta tal punto que la
secuenciación comparativa de genes homólogos es ahora un procedimiento
estándar en la taxonomía, ya que la clasificación de microorganismos a nivel de
especie, requiere el uso de métodos exactos e informativos, para la determinación
precisa de las secuencias de nucleótidos (Woese, 2000; Stackebrandt et al., 2002).

El concepto de homología sostiene que los análisis filogenéticos, pueden ser

estimados por cambios en la secuencia del nucleótido de los genes homólogos de
cepas representativas (cepas tipo) (Fitch, 2000; Baldauf, 2003). La elección de la
macromolécula para ser secuenciada depende del rango taxonómico en
consideración. Es así, como los genes conservados son usados para establecer
relaciones en niveles taxonómicos más altos, como el género, la familia y orden,
mientras que genes menos conservados o sumamente variables son usados para
comparar organismos a nivel de especie y a niveles subespecíficos (Versalovic et
al., 1994; Gürtler and Mayall, 2001; Ludwig and Klenk, 2001).

29
Introducción

4. MICOTOXINAS

Son productos naturales de bajo peso molecular, producidas como metabolitos

secundarios por hongos, llegando a contaminar cereales y otros productos
alimenticios, produciendo enfermedades y muerte en el hombre y otros vertebrados.
Estos metabolitos secundarios no son necesarios para el crecimiento o reproducción
del hongo en cuestión, a diferencia de los metabolitos primarios. Hasta el momento
no se conoce bien la función biológica de los metabolitos secundarios, sin embargo,
confieren ventajas selectivas, como aumentar la habilidad para competir con otros
microorganismos por el sustrato e incrementar la capacidad parásita para infectar al
hospedador, siendo muy activas frente a plantas (fitotoxinas), animales (micotoxinas)
y microorganismos (antibióticos) inhibiendo su crecimiento e incluso produciendo su
muerte cuando compiten con éstos por los nutrientes y por el hábitat. Por lo tanto,
las micotoxinas se constituyen en factores de riesgo para la sanidad humana y
animal (Bennett and Klich, 2003; Jestoi et al., 2004b).

La mayoría de las micotoxinas de importancia agrícola son producidas

principalmente por cuatro géneros de hongos: Aspergillus, Penicillium, Fusarium y
Alternaria. Estos géneros causan grandes pérdidas económicas en los cultivos de
cereales y en procesos de alimentación. La Organización de las Naciones Unidas
para la Agricultura y Alimentación (FAO) estima que entre el 10-30% de los granos
cosechados se pierden debido a la infección por hongos y que aproximadamente un
25% de los cultivos de cereales del mundo están contaminados por micotoxinas
(Cirillo et al., 2003; Samson et al., 2004). El grado de infección de los hongos que
colonizan cereales en campo dependerá de varios factores, por ejemplo la
temperatura, la humedad, la precipitación durante antesis y poscosecha, el
tratamiento de suelo y la rotación de cultivos (Snijders and Perkowski, 1990;
Mesterhazy et al., 1999).

4.1. Historia de la Micotoxicosis

Las enfermedades producidas por la ingesta de alimentos contaminados con

micotoxinas se denomina micotoxicosis, distinguiéndose dos tipos: micotoxicosis
primaria, producida por el consumo directo de productos directamente contaminados

30
 Introducción

por el hongo y micotoxicosis secundaria, producida por el consumo de productos no

directamente contaminados por el hongo, pero a los que han llegado las micotoxinas
a través de la cadena alimentaria, como la carne y leche (Torondel, 2001; Bennett
and Klich, 2003).

El conocimiento de la existencia de enfermedades en el hombre y animales

domésticos, asociados al crecimiento de hongos en los alimentos, data de siglos
atrás. En los siglos VII y VIII a.C. se instauró el festival de las “Robigalia” en honor al
Dios Robigus, a quien era necesario alabar para proteger el grano y los árboles. Se
celebra el 25 de abril, por esa época del año era más probable que las cosechas
resultaran atacadas por roñas o mildíu (Latorre, 2004).

En la edad media, los brotes de ergotismo, enfermedad asociada al consumo

de alimentos contaminados con el cornezuelo del centeno, alcanzaron proporciones
de epidemia. Se decía que las personas eran consumidas por el fuego sagrado y se
ennegrecían como el carbón, por la inmensa sensación de quemazón que padecían
las personas afectadas, por lo que la enfermedad se denominó “fuego sagrado” o
“fuego de San Antonio”, en honor al beato en cuyo santuario se buscaba la curación
(Zavaleta et al., 2001). Las víctimas del ergotismo estaban expuestas a la dietilamida
del ácido lisérgico (LSD o LSD-25), sustancia alucinógena que se producía durante
el horneado del pan elaborado con trigo contaminado por cornezuelo del centeno y
otras toxinas alucinógenas ergóticas. Alcaloides de la belladona procedentes del
fruto de la mandrágora eran utilizados para tratar el ergotismo (Van Dongen et al.,
1995). Sólo en 1815 fue posible determinar la naturaleza fúngica del parásito del
cornezuelo del centeno y en 1875 se identificaron los componentes tóxicos del
hongo Claviceps purpurea como responsables del ergotismo (Laval, 2004).

Se sugiere que la última plaga, la muerte de los primogénitos mencionada en la

Biblia, pudo deberse al consumo de cereales contaminados en gran medida no por
las micotoxinas del género Claviceps, sino por tricotecenos, y que por razones
culturales consumían en primer lugar los hombres mayores e hijos varones, lo que
dio lugar a hemorragias y muerte (Soriano, 2007).

31
Introducción

Durante la segunda guerra mundial, en 1940, el distrito de Orenburg (antigua

URSS) se vio afectado por una epidemia de aleukia (leucopenia) tóxica alimentaria
(ATA), debido al consumo de mijo contaminado. La enfermedad se caracteriza por
manchas en la piel, angina necrótica, leucopenia extrema, múltiples hemorragias,
agotamiento de la médula ósea y disminución de los glóbulos blancos. Se
produjeron gran número de muertes, llegando hasta el 10 % de la población en
algunas de las comarcas. La micotoxina que produce esta enfermedad fue aislada
de F. sporotrichioides y más tarde de F. poae en trigo y se le denomina toxina T-2
(Laval, 2004; Doi et al., 2006).

En 1960, la aparición de una enfermedad en granjas de pavos en Inglaterra,

que llevó a la muerte a más de 100.000 de ellos, hizo cambiar la actitud adoptada
frente a los hongos en los alimentos humanos y animales. La micotoxicosis fue
denominada “enfermedad X” y el origen se encontró en tortas de prensado de
cacahuetes mezclado en el pienso. Se detectó el hongo responsable, Aspergillus
flavus, y también fueron aislados los metabolitos tóxicos, las aflatoxinas. Pero fue a
partir de 1961, con el aislamiento de dichas micotoxinas, cuando se evidenció la
importancia de los hongos saprofitos en el desarrollo de procesos patológicos en
animales y la posible conexión en la patología humana (Bennett and Klich, 2003).

A raíz de las observaciones anteriores, tanto la medicina humana como la

veterinaria han dado cada vez más importancia a las micotoxinas, sobre todo
después de saber que, cantidades muy pequeñas pueden comprometer no sólo la
salud animal, sino también la salud humana.

5. MICOTOXINAS MÁS FRECUENTES PRODUCIDAS POR Fusarium spp.

5.1. Tricotecenos

Los tricotecenos son metabolitos fúngicos de la familia de los

sesquiterpenoides, caracterizados por un núcleo 12,13-epoxitricotec-9-eno
tetracíclico. Constituyen un grupo de aproximadamente 180 sesquiterpenos,
agrupados en 4 tipos, A, B, C y D en función de los grupos funcionales, que tienen
diferentes constituyentes en las posiciones 3, 4, 7, 8 y 15 de la molécula. Sus

32
 Introducción

estructuras químicas varían en función de la posición y número de grupos hidroxilos

así como del número, posición y complejidad de las esterificaciones. El anillo 12, 13
epoxitricotec, el C-9 y 10 se consideran importantes para su toxicidad (Desjardins et
al., 1993; Eriksen and Pettersson, 2004).

El primer miembro conocido de este grupo fue la “tricotecina”, aislada de

Trichothecium roseum en 1948 por Freeman y Morison, originalmente descubierta
como antifúngico. Su estructura química no se determinó hasta quince años después
(Josephs et al., 2004; Eriksen et al., 2004). Hoy en día se sabe que los tricotecenos
más comunes son: el deoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV), 3-acetildeoxinivalenol,
15-acetildeoxinivalenol, toxina HT-2, toxina T-2 y diacetoxiscirpenol (DAS). Aunque
se han identificado más de 45 compuestos de tricotecenos relacionados
estructuralmente, los estudios toxicológicos más importantes han sido realizados con
toxina HT-2, toxina T-2, deoxinivalenol (DON) y diacetoxiscirpenol (DAS) (Krska et
al., 2001; Desjardins, 2006).

Se ha demostrado que la contaminación por tricotecenos se produce

generalmente en cereales como el maíz, trigo, cebada, avena, arroz, y productos
derivados de éstos (cereales de desayuno, aperitivos, cerveza, etc.) y los materiales
ricos en celulosa como son la paja y el heno ( Al-Julaifi and Al- Falih, 2001). También
son conocidas la aparición en sorgo, patatas, bananas y semillas de girasol, entre
otros. Dentro de los cereales existen cultivos más propensos a sufrir el ataque de
determinadas especies de Fusarium, tal es el caso de la fuerte afinidad por parte de
F. graminearum hacia el cultivo del maíz. Una de las razones de esta afinidad podría
recaer en la mayor estabilidad física de los tallos del maíz, en oposición a las cañas
de cultivos como el trigo o similares (Obst et al., 1997).

Este tipo micotoxinas no solamente es producido por hongos del género

Fusarium, que son los principales productores de tricotecenos, sino por una diferente
gama de hongos, entre los que se encuentran los géneros Myrothecium,
Trichothecium, Trichoderma, Cylindrocarpon, Cephalosporium, Verticimonosporium y
Stachybotrys (Ueno, 1983; Ehrlich and Daigle, 1987; Gledhill et al., 1991).

33
Introducción

5.1.1. Estructura química de los tricotecenos

Los tricotecenos son divididos en cuatro categorías según el grupo funcional,

los no macrocíclicos son: tipo A, B y C, y el macrocíclico tipo D (Ueno, 1977; 1985).
El Tipo A tiene un hidrógeno, hidroxilo o una función éster en el carbono 8. Este es
el grupo más grande e incluye toxinas como: toxina T-2, toxina HT-2,
diacetoxiscirpenol DAS y neosolaniol (NEO). Se encuentran sobre todo, en cereales
y derivados contaminados por cepas del género Fusarium, principalmente F.
sporotrichioides, F. equiseti y F. poae. El tipo B contiene una función carbonilo en el
carbono 8 e incluye tricotecenos como deoxinivalenol (DON) el más extendido,
nivalenol (NIV), toxinas como 3-acetildeoxinivalenol, 15-acetildeoxinivalenol y
fusarenon X. Producidos por cepas del género Fusarium, principalmente F.
graminearum, F. culmorum y F. crookwellense (Logrieco et al., 2003), la tercera
categoría Tipo C posee un grupo funcional epóxido entre los carbones 7, 8 ó 9, 10.
Generalmente son producidos por los géneros Acremonium y Tricothecium. La
cuarta categoría o Tipo D contienen un anillo macrocíclico entre el carbono 4 y 15
con dos acoplamientos éster, y son producidos por hongos del género Myrothecium,
Stachybotrys y Trichothecium (Desjardins, 2006; Desjardins et al., 2008) Tabla 2.

Tipo A Tipo B

H H H
CH3 O H H H
R1 CH3 O
O R1
H
O
H
R5 O H
R4 CH3 R2
CH2 R4 CH3 R2
CH2

R3
R3

Figura 2. Estructura química de los tricotecenos tipo A y B

34
 Introducción

Tabla 2. Estructuras químicas de los sustituyentes R1, R2, R3, R4 y R5 de los tricotecenos Tipo A
y Tipo B

Tricoteceno Sustituyentes en
Tipo A C-3 (R1) C-4 (R2) C-15 (R3) C-7 (R4) C-8 (R5)
Toxina T-2 OH OAc OAc H OCOCH2CH(CH3)2
Toxina HT-2 OH OH OAc H OCOCH2CH(CH3)2
Acetyl T-2 toxina OAc OAc OAc H O-Isoval
T-2 triol OH OH OH H O-Isoval
T-2 tetraol OH OH OH H OH
8-acetoxineosolaniol OH OAc OAc H OAc
Acuminatina OH OH OAc H OAc
Tetracetoxy T-2 tetraol OAc OAc OAc H OAc
Neosolaniol OH OAc OAc H OH
4,8-diacetoxy T-2 tetraol OH Oac OH H OAc
Diacetoxiscirpenol OH OAc OAc H H
Tipo B
Fusarenon-X OH OAc OH OH =O
Nivalenol OH OH OH OH =O
Deoxinivalenol OH H OH OH =O
15-acetyldeoxinivalenol OH H OAc OH =O
3-acetyldeoxinivalenol OAc H OH OH =O
Ueno, 1977; Forsell and Pestka, 1985; Betina, 1989; Feinberg and Mclaughlin, 1989; Weidenbörner,
2001

5.1.2. Propiedades Físico-Químicas de los tricotecenos

Los tricotecenos son incoloros, cristalinos, químicamente estables (Ueno, 1983)

y con actividad óptica. Los de tipo A (T-2, HT-2, DAS), B (DON, NIV y fusarenon X) y
C no tienen propiedades de absorción ultravioleta, por tanto no se observa
fluorescencia bajo lámpara de 366 nm.

No son volátiles y por ello es necesaria su derivatización para poder detectarlos

en cromatografía de gases. Son las micotoxinas más activas bioquímicamente, muy
solubles en agua y pueden hallarse en forma de aerosoles en el medio ambiente. En
solución diluida son estables bajo la acción de la luz, al contrario de las aflatoxinas,
que se degradan (Cossette et al., 1992). Son estables en el medio ambiente, se
sabe que son resistentes a la presión, calor de cocción, autoclavado 120 ºC (Hughes
et al., 1999; Lauren and Smith, 2001), a la molienda y a otros procesos a los que son
sometidos los sustratos contaminados para la elaboración de productos derivados
como piensos (Lori y Rizzo, 2007).

35
Introducción

La toxina T-2 y el DAS son solubles en solventes no polares (acetil acetato y

dietil éter), mientras que el DON y el NIV son solubles en solventes polares tales
como acetonitrilo, metanol, acetato de etilo y ligeramente solubles en agua y agua
con cloroformo (Alonso et al., 2002).

5.1.3. Toxicidad de los Tricotecenos

En general los tricotecenos provocan una amplia variedad de efectos tóxicos en

animales y humanos, incluyendo mortalidad, irritación, necrosis gastrointestinal y de
piel, desordenes hematológicos (inicialmente leucocitosis seguida de leucopenia),
diarreas, vómitos, pérdida de apetito, dolores de cabeza, vértigos, pérdida de
coordinación muscular y letargo (D’Mello et al., 1999; Josephs et al., 2004). Con un
consumo continuado de alimentos contaminados, los tricotecenos pueden suprimir la
función inmune, provocando la pérdida de resistencia frente a enfermedades,
hipersensibilidad y otras alteraciones inmunológicas (Scott, 1989; IARC, 1993; Rotter
et al, 1996; JECFA, 2001a).

Bioquímicamente, son altamente tóxicos a nivel subcelular, celular y orgánico.

Son citotóxicos sobre células eucariotas, causando lisis celular e inhibición de
mitosis. Las principales propiedades tóxicas están atribuidas a la presencia del
grupo 12,13-epóxido que se une irreversiblemente a la subunidad ribosomal 60S en
mamíferos, originando una inhibición de la síntesis de proteínas. Los tricotecenos
son especialmente tóxicos en tejidos con un alto ratio de división celular, provocando
lesiones en células del timo, bazo, médula ósea, ovarios, ganglios linfáticos y
mucosa intestinal (Eriksen and Pettersson, 2004).

Además de su toxicidad en vertebrados, los tricotecenos han estado implicados

en factores de virulencia en algunas enfermedades de plantas (Desjardins et al.,
1993).

5.1.4. Deoxinivalenol (DON)

Químicamente se denomina 12,13-epoxi-3α,7β,15-trihidroxitricotec-9-ene-8-

ona. Su peso molecular es de 296.3 gmol-1 y corresponde a la formula molecular

36
 Introducción

C15H20O6. Cristaliza como agujas sin color con un punto de fusión de 151-153 ºC.
Fue aislado y caracterizado de hongos procedentes de maíz en Japón (Yoshizawa
and Morooka, 1975). Posee dos derivados acetilados, 3-acetildesoxinivalenol (3-
AcDON) 3α-acetoxi-7α,15-dihidroxi-12,13-epoxitricotec-9-ene-8-one un compuesto
de formula molecular C17H22O7 y punto de fusión entre 185-187 °C y 15-
acetildesoxinivalenol (15-AcDON) 15-acetoxi-3α,7α-dihidroxi-12,13epoxitricotec-9-
en-8-one, cuya fórmula molecular es C17H22O7 y puntos de fusión entre 138-140 °C.
Ambos metabolitos son solventes en metabolitos orgánicos polares como el
acetonitrilo, metanol y acetato de etilo, ligeramente solubles en agua y cloroformo
(Eriksen and Alexander, 1998; Wolf-Hall et al., 1999; Eriksen et al., 2004).

Es producido principalmente por F. graminearum y F. culmorum. El ultimo tiene

un crecimiento óptimo a 21 ºC y se encuentra principalmente en Escandinavia y
Norte de Europa, mientras que F. graminearum tiene un crecimiento óptimo a 25 ºC
y es más extendido en climas más cálidos, por ejemplo Norte América, China y
Japón (Scott, 1989; Placinta et al., 1999; JECFA, 2001a).

El deoxinivalenol, es probablemente la micotoxina más común producida por

algunas especies de Fusarium, contamina diversos cereales como el maíz, trigo,
arroz, centeno, cebada y granos procesados como cereales de desayuno, aperitivos
extrusionados y fritos, malta, cerveza y pan, tanto en países desarrollados como en
desarrollo (European Commission, 1999).

Debido a los brotes de síndromes eméticos en el ganado ocasionados por la

presencia de deoxinivalenol en los piensos, se conoce vulgarmente como vomitoxina
(Omurtag and Beyoglu, 2003). Químicamente pertenece a los tricotecenos no
macrocíclicos y en concreto a los de tipo B, que se caracterizan por tener un
carbonilo en el carbono 8. Es un componente muy estable durante el
almacenamiento, molienda y procesado para la obtención de alimentos, es estable a
121 ºC, moderadamente estable a 180 ºC y parcialmente estable a 210 ºC. Se logra
una completa inactivación a 370 ºC por 10 min., o a 205 ºC por 30 min. Se mantiene
estable bajo condiciones lijeramente ácidas y la inactivación química se logra con

37
Introducción

una solución de hipoclorito de sodio al 3-5% (Ehling et al., 1997; Cirillo et al., 2003b;
Hazel and Patel, 2004; Lori y Rizzo, 2007).

El deoxinivalenol inhibe la síntesis de ADN, ARN y la síntesis de proteínas a

nivel ribosomal. La toxina tiene un efecto hemolítico en eritrocitos. A altas dosis
puede inducir émesis (vómitos) en cerdos, mientras que bajas concentraciones en la
dieta reducen el crecimiento y el consumo de alimentos (anorexia) (Trenholm et al.,
1989) Fig. 3.

Figura 3. Metabolismo de DON en el sistema digestivo (Yoshizawa et al., 1983)

Datos de la Comisión Europea (1999) indican que la toxicidad oral aguda del
deoxinivalenol se estudia mediante experimentos realizados sobre diversos
animales. Así pues, se estiman valores de DL50 (dosis de micotoxina a la cual muere
el 50% de los individuos expuestos) entre 46 y 78 mg/kg peso corporal para ratones.
Para los cerdos, la mínima dosis que provoca efectos eméticos oscila entre 0.05-0.2
mg/kg peso corporal. Los efectos críticos que produce esta micotoxina se basan en
el índice NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level / estimación del nivel de
micotoxina al cual no se observan efectos tóxicos) cuyos valores se encuentran
entre 0.04-0.375 mg/kg peso corporal/día, en ratones y cerdos.

Con respecto a la toxicidad en humanos, la infección de trigo en la India en el

año 1989, afectó a 50.000 personas. En ese momento se estimó un NOAEL de 0.44
µg/kg peso corporal, usando una media de consumo en trigo de 67 g y un peso
corporal medio de 53 kg. También es conocido que los granos de cereales

38
 Introducción

contaminados con deoxinivalenol a niveles entre 3 y 93 mg/kg han sido relacionados

con micotoxicosis agudas en Japón, India y China con un cuadro sintomático de
nauseas, vómitos, trastornos gastrointestinales, vértigos y dolor de cabeza (Anadón
et al., 2005). Otros síntomas descritos en humanos incluyen dolor abdominal,
vértigo, dolor de cabeza, diarrea e irritación de garganta entre otros.

La presencia de DON en alimentos ha sido sujeto de varias revisiones (Scott,

1989; Placinta et al., 1999). Una compilación exhaustiva de DON en cereales ha sido
preparada por JECFA (2001a) donde en un promedio mundial, este tricoteceno ha
sido encontrado en el 57 % de las muestras de trigo, el 40% de las muestras de
maíz, el 68 % de las muestras de avena, el 59% de muestras de cebada, el 49 % de
muestras de centeno y el 27 % de las muestras de arroz. DON también fue
encontrado en productos de trigo y maíz, por ejemplo harina, pan y cereales de
desayuno. Las concentraciones de DON en muestras de cereal mostraron grandes
variaciones anuales, concentraciones en los límites de detección (5-50 μg/kg) a más
de 30 mg/kg (JECFA, 2001a). Según Trucksess et al., (1995), aproximadamente el
40 % de las muestras de trigo y el 57 % de las muestras de cebada de la cosecha
1993 en EE. UU contenía DON que excedían los niveles para el consumo humano.

5.1.5. Nivalenol (NIV)

Es otra de las moléculas pertenecientes a los tricotecenos B y junto con DON

constituyen dos compuestos altamente tóxicos. Químicamente se denomina tricotec-
9-en8-one,12,13-epoxi-3,4,7,15-tetahidroxi-,(3-α,4-β,7-α), su formula molecular es
C15H20O7 y su punto de fusión se encuentra entre 222- 223 °C.

F. crookwellense y F. poae son los principales productores de nivalenol,

aunque también lo producen otras especies como F. culmorum y F. graminearum
(Eriksen and Alexander, 1998). El nivalenol fue aislado de F. nivale Fn2B, que
posteriormente se reclasifico como de F. tricinctum. Las especies de Fusarium antes
mencionados afectan comúnmente a varios cereales (trigo, maíz, cebada, avena y
arroz) y alimentos procesados (malta, cerveza, pan, cereales de desayuno y
aperitivos) (European Comisión, 2000).

39
Introducción

Se han llevado a cabo pocos estudios para poder elaborar los mecanismos de
toxicidad del nivalenol. Es conocido que inhibe in vitro la síntesis de proteínas en
conejos, con una DL50 de 2,5 µg/mL, probablemente por interferir en la función
ribosomal. También inhibe la síntesis de ácidos nucleicos in vitro (Ueno and
Fukushima, 1968).

Los efectos críticos producidos por nivalenol se basan en el índice de toxicidad

LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level/ Nivel más bajo de micotoxina al
cual se observan efectos tóxicos). Un ejemplo son los estudios realizados por
Ohtsubo et al., (1989) en ratones alimentados durante 2 años con dicha micotoxina,
muestran leucopenia y retardo en el crecimiento con un LOAEL de 0.7 mg/kg peso
corporal/día. Sólo los índices LOAEL son válidos a la hora de valorar los efectos
tóxicos que afectan a la reproductividad del individuo afectado a largo plazo.

La información sobre la genotoxicidad provocada por el nivalenol es muy

limitada y lo concerniente a los humanos es prácticamente nula, pero sumando los
resultados de experimentos en animales, los factores críticos de dicha micotoxina
son la inmunotoxicidad y la hematotoxicidad (Bretz et al., 2005). Se sabe que F.
poae es el productor principal de nivalenol en Suecia (Pettersson et al., 1995). Esta
toxina es más común en Europa, Australia y Asia que en América, donde la
presencia de NIV es limitada. Pero su presencia es más bajas con respecto a DON
hasta en los países nórdicos y Europa (Eriksen y Alexander, 1998). NIV puede
encontrarse junto con fusarenon X (FUS X), el C4 acetilado derivado de NIV, y otras
toxinas producidas por hongos del género Fusarium. En contraste con DON, NIV se
encuentra más con frecuencia durante años con períodos secos y calientes
(Pettersson, 1995; Pronk et al., 2002).

5.1.6. 3-Acetildeoxinivalenol (3-AcDON)

El tricoteceno 3-acetildeoxinivalenol es sintetizado por las especies F. roseum,

F. culmorum y F. graminearum (Betina, 1989). Químicamente, el 3-
acetildeoxinivalenol, pertenece a los tricotecenos no macrocíclicos y en concreto a
los de Tipo B (Krska et al., 2001; Zhang et al., 2007).

40
 Introducción

El 3-acetildeoxinivalenol cristaliza como agujas. Su fórmula química es C17H2207

y su punto de fusión está en el intervalo 135-136 ºC. Su estructura se presenta en
Fig. 2 y Tabla 2. La dosis intraperitoneal (DL50) es de 49.4 y 49.9 mg/kg en macho y
hembra de ratón, respectivamente (Betina, 1989).

5.1.7. 15-Acetildeoxinivalenol (15-AcDON)

El 15-acetildeoxinivalenol es producido principalmente por F. graminearum y F.

culmorum. Químicamente, el 15-acetildeoxinivalenol, pertenece a los tricotecenos no
macrocíclicos y a los de Tipo B (Krska et al., 2001; Zhang et al., 2007).

Su estructura se presenta en Fig. 2 y Tabla 2. La fórmula molecular es C17H22O7

y sus puntos de fusión se encuentran en el intervalo 138-140 °C. Esta micotoxina es
soluble en disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo, metanol y acetato de
etilo y ligeramente solubles en agua y cloroformo (Eriksen y Alexander, 1998).

5.1.8. Fusarenon X (FUS X)

La micotoxina fusarenon X (4-acetil-nivalenol) fue aislada a partir de F. nivale,

F. graminearum, F. equiseti, F. solani, F. lateritium, F. avenaceum, F. episphaeria, F.
oxysporum y Giberella zeae (Betina, 1989). Químicamente se denomina 3α,7α,15-
trihidroxi-4β-acetoxi-8-oxo-12-13-epoxi-tricotec-9-ona, su formula química es
C17H22O8 y su peso molecular 354.35178 g/mol, se cristaliza como transparentes
bipirámides, su punto de fusión está en el intervalo 91-92 ºC. Químicamente,
pertenece a los tricotecenos no macrocíclicos de Tipo B. Es una toxina citotóxica,
emética, inmunosupresiva, carcinogénica, origina diarrea e hipotermia. La dosis
intraperitoneal (DL50) es de 3.3 mg/kg en machos de ratón. Se detectó irritación de la
piel y vómitos en conejos, porcinos y ratones (Larsen et al., 2004; Tóth et al., 2005).

5.1.9. Neosolaniol (NEO)

El neosolaniol es producido por cepas de F. culmorum, F. solani, F. poae, F.

sporotrichioides, F. lateritium, F. equiseti, F. avenaceum, F. tricinctum y F.
rigidiusculum (McCormick et al., 1996; McCormick and Alexander, 2002).

41
Introducción

Su fórmula química es C19H2608 y su punto de fusión está en el intervalo 171-

172 ºC. Su estructura se presenta en Fig. 2 y Tabla 2.

La dosis intraperitoneal (DL50) es de 14.5 mg/kg en ratones y de 5 µg por huevo

en test de embrión de pollo; La DL50 para la síntesis de proteínas en eritrocitos de
conejos (células intactas) y para un sistema de célula libre de hígado de rata es 0.25
y 20 µg/mL, respectivamente. La DL50 para Tetrahymena pyriformis es de 0.5 µg/mL.
La dosis mínima causante de irritación de la piel en conejos es de 1 µg. Además, se
han detectado ciertos problemas ambientales (Ueno, 1983).

6. BIOSÍNTESIS DE TRICOTECENOS

El primer paso en biosíntesis es la formación de isopentenilpirofosfato (IPP): del

Acetyl-CoA. Éste es sintetizado por el organismo o del piruvato vía glucosa o por
otras vías de cambio de material primario. El piruvato es intercambiado por una
reacción de oxidación empleando la coenzima A y NAD+ en Acetyl-CoA (Desjardins,
2006).

Sin embargo el organismo puede ganar Acetyl-CoA también directamente

mediante el desdoblamiento del ácido graso. Dos moléculas Acetyl-CoA se
condensan y forman el Acetoacetyl-CoA. Luego el Acetoacetyl-CoA reacciona con
otra molécula Acetyl-CoA y agua lo que da origen al 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-
CoA. Que luego es catalizado por una reductasa a mevalonato y esa transformación
es irreversible (Ehrlich and Daigle, 1987; Desjardins et al., 1993; Desjardins, 2006).

El mevalonato es intercambiado por tres reacciones dependientes en 3-

Isopentenilpirofosfato. En el último paso tiene lugar la descarboxilación donde nace
C5-Isopreno. Dos de estas unidades C5 se condensan a una subunidad C10. Tras
una isomerización se forma el Dimetilalilpirofosfato y con la adición del
Isopentenilpirofosfato se obtiene el Geranilpirofosfato. Este paso se repite y nace
una unidad C15, farnesil pirofosfato (FPP) (Stryer, 1996).

Por la reacción intramolecular del anillo, que se hace por medio de la enzima
catalizadora tricodeno sintetasa la cual necesita iones de Mg2+ como cofactor, surge

42
 Introducción

el farnesil pirofosfato tricodeina, el primer paso del tricoteceno. La biosíntesis

siguiente a tricotecenos más complejos se debe a una serie de oxigenaciones,
isomeraciones, ciclaciones y esterificaciones (Desjardins et al., 1993; Desjardins,
2006) Fig.4.

Figura 4. Biosíntesis de tricodeína (Stryer, 1996)

6.1. Genes involucrados en la biosíntesis de tricotecenos (Genes Tri)

Los tricotecenos son biosintetizados por un complejo que incluyen una serie de
pasos como oxigenación, isomerización y esterificación. Pero para que suceda todo
esto, se debe tener la información genética necesaria. Hasta el momento se sabe
que muchos de los genes de biosíntesis de tricotecenos están localizados en un
grupo génico de al menos 10 genes, los cuales se incluyen los de tricodieno
sintetasa (Tri5), Fig. 2, aunque su presencia no asegura la producción de DON, su
ausencia imposibilita la producción, P450 oxigenasa (Tri4 y Tri11), acetiltransferasa
(Tri3 y Tri7), factores de trascripción (Tri6 y Tri10), más de seis genes involucrados
en la síntesis de tricotecenos (Tri3, Tri7, Tri8, Tri9, Tri11, y Tri12) los cuales son
regulados por Tri10, una toxina transporte (Tri12), dos proteínas hipotéticamente no
identificadas (Tri8 y Tri9), otra acetiltransferasa (Tri101) (Hohn et al., 1995;
Desjardins et al., 1996; Lee et al., 2001; Schnerr et al., 2001; 2002; Brown et al.,
2002.; Peplow et al., 2003; Covarelli et al., 2004; Niessen et al., 2004; Desjardins,
2006) Fig. 5.

43
Introducción

Figura 5. Genes Tri implicados en la producción de Tricotecenos (Desjardins et al., 1993;

Desjardins, 2006)

44
 Introducción

En trabajos realizados por Lee et al. (2001; 2002) y Brown et al. (2001) han
identificado los genes Tri13 y Tri7 de la biosíntesis de tricotecenos en Fusarium los
cuales son los responsables de la conversión de DON a NIV por el gen Tri13 y la
acetilación de NIV a 4-acetil-nivalenol (4-AcNIV) por el gen Tri7. La secuenciación de
estos genes en F. graminearum reveló que la inserción 11 del nucleótido esta
repetida dentro de un intrón del gen Tri7, interrumpiendo la función génica en la
producción de DON (Lee et al., 2001) y tres delecciones dentro de la secuencia
génica de Tri13 en productores de DON (Brown et al., 2002).

6.2. Especies micotoxigénicas de Fusarium

Como se mencionó anteriormente, muchas de las especies de Fusarium

poseen la capacidad de producir metabolitos tóxicos como micotoxinas, lo que
supone un riesgo para la salud, tanto del hombre como de los animales (Li et al.,
2000; Bluhm et al., 2002; Larsen et al., 2004). Este género, además, juega un papel
importante en la industria microbiológica, ya que puede ser explotado como fuente
de metabolitos y de proteínas microbianas, útiles en algunos casos como fungicidas,
insecticidas, enzimas, acaricidas o antibióticos, entre otros (Rodríguez et al., 2006).

El género Fusarium es conocido por producir un gran número de compuestos

volátiles, pero sin lugar a dudas, es su capacidad de sintetizar metabolitos tóxicos lo
que va a repercutir en la calidad del alimento. Dentro de este concepto se ha
encontrado los siguientes metabolitos contaminantes en especies del género
Fusarium: Nivalenol (NIV), Zearalenona (ZEA), Deoxinivalenol (DON), 3-
Acetildeoxinivalenol (3-AcDON), Toxina T-2 (T-2), Fusarenon X (FUS X),
Diacetoxiscirpenol (DAS), Monoacetoxiscirpenol (MAS), Escirpenol (SCR), 4,15-
diacetoxiscirpenol (4,15 DAS), Aurofusarina (AUF), Moniliformina (MON), Equisetina,
Toxina HT-2 (HT-2), Fumonisina B1 (FB1), Fumonisina B2 (FB2), Beauvericina
(BEA), Ácido Fusarico (FUSA), Zearalenol (ZOL), Neosolaniol (NEOS), Tricotecenos
A y B, Butenolida, Eniatina B (EB), Fusarocromanona (FUSCHR), Aurofusarina
(AUF), Fusarina C (FUS-C), 15-Acetildeoxinivalenol (15-AcDON), Fumonisina (FUM),
Wortmannin (WOR), Calonectrina (Marasas et al., 1984; Thrane and Hansen, 1995;
Niessen and Vogel, 1998; Eriksen and Alexander, 1998; Morrison et al., 2002;

45
Introducción

Logrieco et al., 2002; Thrane et al., 2004; Kosiak et al., 2005; McCormick et al.,
2002; 2006; Patiño et al., 2006) Fig. 6, Tabla 3.

Tabla 3. Micotoxinas producidas por especies del género Fusarium (Marasas et al., 1984;
Thrane and Hansen, 1995 ; Niessen and Vogel, 1998; Eriksen and Alexander, 1998. ;
Morrison et al., 2002; Logrieco et al., 2002 ;Thrane et al., 2004 ; Kosiak et al., 2005 ;
McCormick et al., 2002 ; 2006 ; Patiño et al., 2006; Desjardins, 2006 )

Sección Especie Micotoxina

Discolor F. crookwellense NIV, ZEA, ZOL, FUS X, FUS C
(F. cerealis)
F. culmorum DON, ZEA, T-2, NIV, 15–AcDON,
FUS X, FUS C
F. flocciferum
F. graminearum DON, ZEA, NIV, FUS X, 15-AcDON,
3-AcDON; Butenolida,
F. heterosporum ZEA, ZOL
F. lunulosporum
F. reticulatum
F. robustum
F. sambucinum DAS, T-2, NEOS, EB, Butenolida,
MAS
F. sulphureum
F. trichotehecioides
F. tumidum NEOS
F. venenatum DAS, E B
Sporotrichiella F. sporotrichioides T-2, HT-2, NEOS, Butenolida, 4,15
DAS, FUS-C, AUF
F. chlamydosporum MON
F. poae T-2, DAS, HT-2, NEOS, AUF, FUS-C,
monoacetoxiscirpenol, SCR, NIV,
FUS X, MAS, BEA
F. tricinctum FUS C
Roseum [Link] MON, FUS C
Arthrosporiella F. camptoceras NEOS
F. semitectum ZEA, DAS, MAS, Butenolida
F. semitectum Butenolida, DAS, ZEA
Gibbosum F. equiseti Butenolida, DAS, ZEA, equisetina,
tricotecenos A y B, FUSCHR, ZOH,
MAS, NIV, BEA
F. acuminatum EB, T-2, HT-2, DAS, MAS MON, NEO
([Link])
Liseola F. verticillioides FB1, MON, BEA, FB2, FUM, FUS C
syn.: F. moniliforme
F. proliferatum FB1, MON, FUM, BEA, FUP, FB2
F. subglutinans FUSA, MON, BEA

Elegans F. oxysporum MON

F. torulosum WOR, Antibiotic Y

46
 Introducción

Figura 6. Toxinas producidas por hongos del género Fusarium (Desjardins, 2006)

47
Introducción

7. FACTORES DETERMINANTES EN LA PRODUCCIÓN DE MICOTOXINAS POR

HONGOS DEL GÉNERO Fusarium

Son muchos los estudios realizados que tratan de determinar las condiciones
ambientales que favorecen la contaminación fúngica y la biosíntesis de micotoxinas
producidas por el género Fusarium, tanto en campo como durante el
almacenamiento de productos agroalimentarios, ya que su producción está
influenciada en gran parte por factores ambientales entre los que se encuentran la
actividad del agua (aw), temperatura, pH y composición gaseosa de la atmósfera
(niveles de oxigeno y dióxido de carbono), otros factores como la composición del
sustrato, interacciones microbianas, vectores invertebrados y las condiciones físicas
del grano (Magan and Lacey, 1984; Mateo et al., 2002; Larsen et al., 2004).

Aunque el crecimiento fúngico y biosíntesis de micotoxinas son el resultado de

la interacción de los factores anteriormente citados, el entendimiento de cada factor
es esencial para la comprensión del proceso global, lo que facilita su predicción y
prevención de la producción de micotoxinas.

7.1. Actividad del agua (aw) y contenido de agua

El agua es quizás el factor más determinante y limitante de la colonización

fúngica de un determinado sustrato, y aún más para el crecimiento de las especies
del género Fusarium, que necesitan un mayor contenido de agua libre. La
disponibilidad de agua para el hongo determina si las esporas fúngicas podrían o no
germinar, la velocidad conque lo harán y su tasa respiratoria. Desde el punto de
vista microbiológico el término más adecuado para expresar el agua del substrato
es la actividad del agua (aw), término que contempla únicamente el agua libre en
equilibrio con la humedad relativa ambiental. De ese modo la aw mínima para el
desarrollo de la mayoría de las especies fúngicas que colonizan los granos de
cereales está sobre 0.70. Así, los valores óptimos de aw para la producción de
toxinas por parte de este género oscila entre 0.93 y 0.98, no detectándose toxinas
por debajo de un valor de 0.71. Muchos estudios efectuados han demostrado que la
producción de micotoxinas como fumonisinas, zearalenona y tricotecenos aumentan
con la actividad del agua, siendo óptima a 0.97, 0.98 y 0.99, respectivamente (Lacey

48
 Introducción

and Magan, 1991; Marín et al., 1999; Velluti et al., 2000; Mateo et al., 2002; Doohan
et al., 2003; Soriano and Dragacci, 2004).

7.2. Temperatura

Como ocurre con el agua, cada especie fúngica tiene una temperatura mínima
optima y máxima para su crecimiento. Los hongos en general crecen en un amplio
rango de temperaturas, que pueden ir desde -4 °C hasta una temperatura máxima
de 50 °C. Diversos estudios han determinado que la mayoría de los hongos que
producen toxinas lo hacen a unos valores entre 12-42 ºC, produciendo el máximo
entre 25-32 ºC según el sustrato. Además, los ciclos de temperatura favorecen la
síntesis de toxinas (Marín et al., 2001; Llorens et al., 2004; Bellí et al., 2005).

En el caso de las especies del género Fusarium, para la producción de

micotoxinas la temperatura óptima es de 20-26 ºC, aunque el crecimiento y la
esporulación de los hongos se ven favorecidos a una temperatura de 30 ºC. No
obstante, muchos estudios tratan de determinar qué temperaturas favorecen la
producción de micotoxinas específicas, con el fin de evitarlas. Por ejemplo, la
producción de tricotecenos y zearalenona, se ve favorecida a temperaturas inferiores
a 28 ºC y superiores de 15 ºC, temperaturas medias frecuentes en las áreas de
cultivo y en los almacenes de cereales (Velluti et al., 2000; Mateo et al., 2002;
Jiménez et al., 2005; Llorens et al., 2006). Otro ejemplo, es el caso de la producción
de fumonisinas, favorecida en el intervalo de 15-30 ºC (Marín et al., 1999; Soriano
and Dragacci, 2004).

7.3. pH

El pH no influye marcadamente sobre el crecimiento de los hongos, pues éstos

toleran amplios rangos de pH. Ejemplo de ello es el caso de F. verticillioides, que
tolera valores desde 3 a 9.5, aunque el pH óptimo de casi todas las especies
contaminantes de vegetales es aproximadamente de 5.6. La capacidad de poder
desarrollarse a pH ácidos evita la competencia con bacterias. En cambio, la
formación de micotoxinas se ve favorecida por valores de pH que oscilen entre 3.4 y
5.5. En ocasiones, el crecimiento de los hongos toxigénicos puede provocar una

49
Introducción

disminución en la acidez del medio, favoreciendo la síntesis de micotoxinas (Carrillo,

2003; Bennett and Klich, 2003; Doohan et al., 2003; Soriano and Dragacci, 2004;
Benítez et al., 2006).

7.4. Niveles de oxígeno (O2) y dióxido de carbono (CO2)

Los hongos toxigénicos, en general, son microorganismos aerobios. Por ello, en

condiciones anaeróbicas no crecen, aunque F. oxysporum puede crecer incluso en
estas condiciones. Se sabe que la mayoría de los hongos que contaminan granos se
ven influenciados por las concentraciones de O2, CO2 y en menor grado nitrógeno
(N2). La cantidad de O2 también influye en la síntesis de micotoxinas, por ejemplo, la
producción de aflatoxinas fue restringida a una concentración de O2 de menos del
1% (Narasaiah et al., 2006). Por otra parte, si la atmósfera se suplementa con CO2,
se produce un descenso, tanto en el crecimiento del hongo como en la producción
de micotoxinas. De igual modo, el N2 también puede inhibir el crecimiento de
hongos, pero este efecto sólo se consigue cuando prácticamente todo el O2 del aire
es sustituido por N2. En general, el crecimiento fúngico puede controlarse
manteniendo niveles altos de CO2 y baja concentración de O2. Sin embargo el
control más efectivo se lleva a cabo cuando además de lo anterior hay una
disminución de la aw del grano (Munkvold, 2003; Samson et al., 2004; Soriano and
Dragacci, 2004).

7.5. Composición del substrato

La composición química y física del substrato influye de forma determinante en

su susceptibilidad para la producción micotoxinas, tanto en lo que se refiere a la
naturaleza como a la cantidad de metabolitos tóxicos que se producen y en
consecuencia que se acumulen en el mismo. Es así como medios ricos en hidratos
de carbono y relativamente pobres en proteínas y grasas son más apropiados para
la producción de micotoxinas por parte de hongos del género Fusarium. Este es el
caso de los granos de maíz, trigo, cebada, avena y sorgo, que toman los
carbohidratos proporcionados por el almidón y la celulosa (Madhyastha et al., 1990;
Anadón et al., 2005).

50
 Introducción

Otros parámetros físicos que influyen es la aw intrínseca del substrato, o un

determinado tratamiento, resistencia mecánica al embalaje, lo que determina su
integridad y aire residual y por ende la disponibilidad de oxigeno y la conductividad
térmica (Anadón et al., 2005; Soriano and Dragacci, 2004).

7.6. Interacción con otros microorganismos

La producción de metabolitos secundarios se ve afectada drásticamente cuando

otras especies comparten el mismo nicho ecológico (Marín et al., 2001).
Generalmente, en los alimentos, las especies toxigénicas coexisten con bacterias y
con otras especies fúngicas (incluyendo levaduras), cuya presencia puede inhibir o
favorecer la producción de micotoxinas. Estas interacciones puede ser intra e
interespecíficas. Por ejemplo, la producción de fumonisinas en presencia de A.
flavus, A. niger, A. ochraceus y P. implicatum, es inhibida, excepto a altas
actividades de agua (0.98) donde se ve estimulada. Por otra parte, la producción de
zearalenona disminuye cuando crece con A. flavus a 16 ºC, pero no a 25 ºC.
Además, la producción de ZEA por F. graminearum no se ve afectada por F.
verticillioides ni por F. proliferatum, sin embargo, la producción de fumonisinas por
estas especies disminuye en presencia de F. graminearum, excepto a 25 ºC y entre
0,95-0,98 aw donde la producción de fumonisinas aumenta por que se estimula F.
verticillioides (Sanchis et al., 2000; Velluti et al., 2000; Soriano and Dragacci, 2004).

7.7. Insectos

Es uno de los principales factores de deterioro de granos, antes, durante y

después de la cosecha, ya que producen daño mecánico, estropeando y alterando la
integridad de la cubierta de la semilla. Interaccionan con la microbiota presente en el
grano de diferentes formas, ya que puede causar un ambiente propicio para el
crecimiento de hongos debido al calentamiento y liberación de agua como
consecuencia de su actividad metabólica y respiración. Cuando la larva se desarrolla
en el interior del grano, pueden actuar como vectores, ya que pueden trasportar
esporas fúngicas ya sea en sus pelos, boca e intestino, contaminando el producto
(Edwards, 2004; Aldred and Magan, 2004; Neethirajan et al., 2007).

51
Introducción

Por su parte, los hongos pueden atraer o inhibir la presencia de insectos a

través de compuestos volátiles o micotoxinas e incluso pueden servir como alimento
para ellos (Aldred and Magan, 2004).

8. ANÁLISIS DE MICOTOXINAS

El análisis de las micotoxinas puede realizarse por métodos químicos,

biológicos e inmunológicos. Los métodos biológicos aprovechan las propiedades de
las micotoxinas, tales como: irritación cutánea, actividad fungicida, fitotóxica,
citotóxica e inhibición de la síntesis proteica. Éstos se han empleado para la
detección y aislamiento de nuevas micotoxinas mientras que los métodos químicos
se emplean para su posterior caracterización, por ser fácilmente cuantificables y más
sensibles.

Los métodos químicos se prefieren cuando la micotoxina ya está caracterizada

y se dispone de patrones de referencia. Son también rápidos, específicos y muy
reproducibles que los bioensayos.

Actualmente también se emplean los inmunoensayos como el método ELISA, el

radioinmunoensayo (RIA) y la cromatografía de inmunoafinidad, todos ellos tienen la
ventaja de ser técnicas de fácil realización y aplicables a la determinación de
micotoxinas en cereales y alimentos.

8.1. Métodos químicos

8.1.1. Muestreo

Debido a la heterogeneidad en la distribución de la micotoxina en las muestras,

se debe tomar una muestra lo suficientemente grande para que sea representativa.
La principal fuente de variación existente en un método analítico la ofrece el proceso
de muestreo, mientras que el sub-muestreo y el análisis, poseen variabilidades que
son más o menos independientes de la concentración de la micotoxina (Freese et
al., 2000).

52
 Introducción

8.1.2. Extracción

Consiste en la agitación o mezclado de la muestra con la solución de

extracción, con el fin de separar las micotoxinas del resto de componentes de la
matriz.

El comportamiento en solubilidad de las micotoxinas cristalizadas,

químicamente puras, es muy diferente al de las propias micotoxinas presentes en
cualquier contaminación natural, por lo que los disolventes utilizados deben ser los
adecuados para ser capaces de realizar una extracción completa en un alimento.
Por ello es necesario el empleo de disolventes orgánicos con diferente grado de
polaridad, dado que las micotoxinas presentan solubilidades desiguales en los
diversos disolventes. En la práctica, se usan el cloroformo, acetonitrilo, acetona,
metanol, etanol y diclorometano, bien solos, mezclados entre sí o, más
frecuentemente, con agua y/o pequeñas cantidades de ácido. La presencia de agua
en la solución de extracción permite una mayor penetración de la misma en los
medios hidrofilicos, y potencia la extracción de la toxina.

La extracción se realiza agitando la mezcla muestra-disolvente durante un

periodo que puede variar entre 30-90 min., ó 1-3 min., si se utilizan
homogeneizadores de alta velocidad.

8.1.3. Purificación

Tras la extracción, junto con las micotoxinas, es de suponer que en el extracto

se encuentren muchas sustancias que por su propia naturaleza pueden interferir en
la detección, por lo tanto es necesario eliminarlas antes de continuar con las
siguientes etapas del proceso de análisis. La purificación separa las micotoxinas de
aquellos compuestos químicos que han sido extraídos junto con ellas. Actualmente
podemos distinguir diferentes técnicas de purificación: líquido-líquido, adsorción
física, tecnología de membranas y técnicas cromatográficas. Nos centraremos en
este último grupo de técnicas, ya que es al que pertenecen las que utilizaremos en el
presente estudio.

53
Introducción

8.1.4. Técnicas cromatográficas

Mediante el uso de columnas cromatográficas o más recientemente, cartuchos

rellenos de florisil, silica gel, sílice enlazada con grupos octadecilo (comúnmente
conocido como C18), resina de amberlita XAD. Algunos métodos para la
determinación de deoxinivalenol en cereales de desayuno mediante cromatografía
de gases, incluyen una columna con alúmina-carbón-celita y un cartucho C18 para
eliminar la gran cantidad de azúcares que contienen (Gilbert, 1993). Actualmente se
dispone de cartuchos de extracción en fase sólida comerciales con gran variedad de
rellenos para pequeños volúmenes de muestra, que permiten una mayor rapidez y
automatización en el desarrollo del método, como por ejemplo los cartuchos
MycoSep®.

También se ha incrementado el uso de columnas de inmunoafinidad, que

ofrecen una gran selectividad, son fáciles de manejar y su aplicación en la
purificación de muestras contaminadas con diversas micotoxinas ha sido muy bien
investigada (European Mycotoxin Awareness Network, 2005).

8.1.5. Detección y cuantificación

Para la detección y cuantificación de micotoxinas existen dos tipos principales

de metodologías, los métodos inmunológicos (ELISA, RIA, inmunoafinidad) y los
cromatográficos (cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución
y cromatografía de gases).

8.1.6. Métodos cromatográficos

Dirigidos a la separación de dos o más sustancias. Se consigue mediante la

distribución de los componentes de una mezcla entre una fase fija (fase
estacionaria) y otra que se desplaza (fase móvil). La separación entre dos
sustancias empieza cuando una es retenida más fuertemente por la fase
estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más rápidamente por la fase
móvil.

54
 Introducción

El procedimiento más común usado para la determinación de tricotecenos es la

cromatografía de gases (CG) con detector de ionización de llama (FID), detector de
captura de electrones (ECD) o detector de espectrometría de masas (MS). Para los
tricotecenos, el análisis por CG tiene mayor sensibilidad y especificidad que la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Gilbert, 1993).

Después de la derivatización de los grupos hidroxilo libres de las micotoxinas a

formas trimetilsilil éteres (TMS), heptafluorobutiril ésteres (HFB), pentafluoropropionil
y trifluoroacetil ésteres, éstas llegan a ser lo suficientemente volátiles para el análisis
por cromatografía de gases.

El detector de ionización de llama (FID) tiene mayor sensibilidad que la

cromatografía en capa fina, sin embargo es poco específico, presentándose
problemas en la identificación de los picos como pertenecientes a una micotoxina,
sobretodo en matrices complejas como las de los cereales. Por lo general, es
resistente y fácil de utilizar. Responde a compuestos que producen iones cuando se
queman en una llama aire-hidrógeno. Esto incluye a todos los compuestos
orgánicos, aunque unos pocos (por ejemplo el ácido fórmico, acetaldehído) exhiben
poca sensibilidad.

El detector de captura de electrones (ECD), mejora la sensibilidad frente al FID

para los tricotecenos. El sistema se basa en la electronegatividad de las sustancias
eluídas, y su habilidad para formar iones negativos por captura de electrones. Es un
detector muy selectivo, y es sensible a la presencia de moléculas con grupos
electronegativos como halógenos, peróxidos, quinonas, y grupos nitro. Otros grupos
como el alcohol, amina e hidrocarburos no dan señal. Se aplica en la detección de
moléculas que contienen halógenos, principalmente cloro, de ahí que sea importante
en ensayos medioambientales para la detección y determinación de insecticidas
clorados.

El detector de captura de electrones tiene la ventaja de no alterar la muestra de

manera significativa (a diferencia del detector de llama). En el caso de los
tricotecenos, objetos de este estudio, hay que decir que no son compuestos

55
Introducción

volátiles, por lo que para realizar un análisis de ellos por CG/ECD y CG/FID han de
ser previamente derivatizados.

El detector de espectrometría de masas (MS) es un instrumento que permite

analizar con una gran precisión la composición de diferentes elementos químicos e
isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-
carga (m/z).

En términos generales, moléculas diferentes tienen masas distintas, hecho

utilizado por un espectrómetro de masas para determinar qué moléculas están
presentes en una muestra. En el caso de una micotoxina, se vaporiza y se analizan
los iones en la primera parte del espectrómetro de masa. Estos iones tienen pesos
moleculares específicos. También tienen una carga, que significa que debido a ella
tendrán movimiento bajo la influencia de un determinado campo eléctrico. Los iones
se envían en un compartimiento de aceleración y se pasan a través de una lámina
metálica. Se aplica un campo magnético a un lado del compartimiento que atrae a
cada uno de los iones con la misma fuerza (suponiendo carga idéntica) y los desvía
sobre un detector. Naturalmente, los iones más ligeros se desviarán más que los
iones pesados ya que tienen menos masa. El detector mide exactamente cuan lejos
se ha desviado cada ion y dependiendo de esto, se calcula el "cociente masa por
unidad de carga (m/z)”. Con esta información es posible determinar con un alto nivel
de la probabilidad cuál era la composición química de la muestra original.

El acoplamiento técnico cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-

MS) ha revolucionado el análisis de muestras complejas, ya que las características
del alto poder de resolución que da la cromatografía de gases con la alta
sensibilidad suministrada por el espectrómetro de masas, convierte a este
acoplamiento GC-MS en un método altamente poderoso para la identificación y
cuantificación de moléculas orgánicas volátiles (Gámiz, 2006).

56
II. OBJETIVOS
 Objetivos

II. OBJETIVOS

Las micotoxinas suponen un riesgo potencial para la salud humana y animal,

motivo por el cual muchos estudios tratan de establecer medidas de control y
prevención de su presencia en alimentos. Entre estas medidas se encuentra el
desarrollo de métodos que permitan la detección de cepas micotoxigénicas en los
alimentos con anterioridad a su crecimiento y consiguiente producción de
micotoxinas.

Uno de los principales géneros productores de micotoxinas es Fusarium que

sintetiza, entre otras, las micotoxinas denominadas tricotecenos. Éstos pueden
hallarse comúnmente en cereales como el maíz y sus productos. Con un consumo
continuado de alimentos contaminados, los tricotecenos pueden suprimir la función
inmune, provocando la pérdida de resistencia frente a enfermedades,
hipersensibilidad y otras alteraciones inmunológicas.

Por tanto, este trabajo de investigación se centrará en el estudio de la

contaminación fúngica en maíz cultivado o comercializado en España, así como en
el aislamiento e identificación de cepas pertenecientes al género Fusarium
potencialmente micotoxigénicas. Sus objetivos serán:

- Estudio de la contaminación fúngica y de la incidencia de cepas

pertenecientes al género Fusarium en maíz de distintos orígenes y
atendiendo a su distribución geográfica.

- Evaluación estadística de la efectividad de diversos medios de cultivo para

el aislamiento de Fusarium spp., a partir de granos de maíz.

- Aislamiento de Fusarium spp., a partir de distintos tipos de maíz, e

identificación macroscópica, microscópica y molecular de las mismas.

59
Objetivos

Caracterización molecular de los aislados de Fusarium spp., encontrados

en este trabajo, empleando técnicas de biología molecular como PCR,
PCR-RFLPs y secuenciación.

- Aplicación de técnicas moleculares a la detección de aislados de Fusarium

spp., productores de tricotecenos.

- Desarrollo y puesta a punto de un método para la comprobación de la

producción de tricotecenos por aislados de Fusarium spp., potencialmente
toxigénicos, directamente a partir del medio de cultivo.

- Evaluación de la efectividad de diversos medios sólidos de cultivo para

detectar la producción de tricotecenos por aislados de Fusarium spp.,
potencialmente toxigénicas.

60
III. MATERIAL Y MÉTODOS
 Material y Métodos

II. MATERIAL Y MÉTODOS

1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Fusarium spp., PROCEDENTES DE

MAÍZ

1.1. Procedencia de las muestras de maíz

El maíz utilizado para el presente estudio procedió de diferentes comunidades

de España y se agrupó en tres grandes grupos: El primero corresponde a 10
muestras de granos de maíz seco (Zea mays L.), 9 de las cuales pertenecen a la
variedad identata y una de ellas a la variedad everta. Todas ellas fueron obtenidas
de diversos comercios de piensos de la Comunidad Valenciana. En este trabajo de
investigación, a este grupo de muestras se le designará con el nombre de “maíz
almacén”. La variedad y origen de las muestras de maíz se presentan en la Tabla 4.

El segundo grupo corresponde a 100 muestras de maíz dulce (Zea mays L.

subsp. saccharata). Las mazorcas, que procedían de distintas regiones de España y
cultivadas convencionalmente para el consumo humano, fueron proporcionadas por
una empresa agroalimentaria de la Comunidad Valenciana. Se emplearon 63
muestras procedentes de Castilla la Mancha, 5 de Extremadura, 8 de Murcia, 11 de
Madrid y 13 de la Comunidad Valenciana. A este grupo de muestras se les
designará como “maíz campo” (Tabla 5).

Por último, el tercer grupo corresponde a tres variedades comerciales de maíz

(Zea mays L. subsp. indentata): Panamá, Cridor y Net, facilitadas por una casa
comercial. El cultivo se realizó en parcelas en la Universidad Politécnica de Valencia
y sólo recibió las prácticas culturales de desyerbe, sin que se utilizaran fertilizantes
ni fungicidas. Se realizaron un total de 16 muestreos; en cada uno de ellos se
cogieron 2 mazorcas de cada variedad, de las dos líneas centrales, escogiendo
aleatoriamente la mazorca superior o inferior de cada planta (en caso de que
hubiera dos mazorcas). El número total de mazorcas recolectadas fue de 96 y se les
designó con el nombre de “maíz experimental”.

63
Material y Métodos

Tabla 4. Variedad y origen de las muestras de maíz almacén

Nombre de Variedad de Comprada en Origen Destinada a
la muestra Maíz consumo
1 identata Castellar Desconocido Animal
2 identata Valencia Desconocido Animal
3 everta Valencia Desconocido Humano
4 identata Gandia Albacete Animal
5 identata Gandia Almussafes Animal
6 identata Algemesí Jaén Animal
7 identata Carcaixent Desconocido Animal
8 identata Catarrosa C. Valenciana Animal
9 identata Picassent C. Valenciana Animal
10 identata La Pobla Llarga Andalucía Animal

1.2. Medios de cultivo

Para el cultivo y aislamiento de hongos del género Fusarium se emplearon

distintos medios de cultivo: Patata Dextrosa Agar (PDA) con y sin cloramfenicol y
Agar Verde de Malaquita (AVM) (medio selectivo para Fusarium spp.). También se
utilizaron agar Czapeck (Cz) y agar sacarosa extracto de levadura (YES) (Burgess
et al., 1994; Castella et al., 1997) Anejo 1.

1.3. Obtención de aislados de Fusarium spp.

De cada muestra de maíz almacén se seleccionaron 100 granos de forma

aleatoria. Para desinfectar los granos, éstos se llevaron a una disolución de
hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto y después se lavaron dos veces con
agua estéril durante periodos de un minuto. Para realizar todas estas operaciones se
utilizaron gasas y pinzas estériles.

Tras la desinfección, se depositaron 50 granos de maíz en la superficie de 10

placas de Petri con medio de cultivo PDA-CL (cinco granos por placa). De igual
forma se procedió con el medio de cultivo Agar Verde de Malaquita, para obtener un
total de 100 granos.

64
 Material y Métodos

Tabla 5. Procedencia de las muestras analizadas de maíz campo

Muestra Origen Muestra Origen Muestra Origen Muestra Origen

1 C. Mancha 27 C. Mancha 52 C. Mancha 77 Madrid

2 C. Mancha 28 C. Mancha 53 C. Mancha 78 Madrid
3 Extremadura 29 Valencia 54 C. Mancha 79 C. Mancha
4 Extremadura 30 Valencia 55 Valencia 80 C. Mancha
5 Extremadura 31 C. Mancha 56 Valencia 81 C. Mancha
6 Extremadura 32 C. Mancha 57 C. Mancha 82 Valencia
7 Murcia 33 C. Mancha 58 C. Mancha 83 C. Mancha
8 Murcia 34 C. Mancha 59 C. Mancha 84 C. Mancha
9 Extremadura 35 C. Mancha 60 C. Mancha 85 C. Mancha
10 Murcia 36 C. Mancha 61 C. Mancha 86 C. Mancha
11 Murcia 37 C. Mancha 62 C. Mancha 87 C. Mancha
12 C. Mancha 38 C. Mancha 63 C. Mancha 88 C. Mancha
13 Valencia 39 Valencia 64 C. Mancha 89 C. Mancha
14 C. Mancha 40 Valencia 65 Madrid 90 C. Mancha
15 C. Mancha 41 C. Mancha 66 Valencia 91 C. Mancha
16 Valencia 42 C. Mancha 67 Madrid 92 C. Mancha
17 Valencia 43 C. Mancha 68 Madrid 93 C. Mancha
19 C. Mancha 44 C. Mancha 69 Madrid 94 C. Mancha
20 Murcia 45 Valencia 70 Madrid 95 C. Mancha
21 Murcia 46 C. Mancha 71 C. Mancha 96 C. Mancha
22 Murcia 47 C. Mancha 72 C. Mancha 97 C. Mancha
23 C. Mancha 48 C. Mancha 73 Madrid 98 C. Mancha
24 Murcia 49 C. Mancha 74 Madrid 99 C. Mancha
25 Valencia 50 C. Mancha 75 Madrid 100 C. Mancha
26 C. Mancha 51 C. Mancha 76 Madrid 101 C. Mancha
* La muestra 18 se excluyó el estudio por no tratarse de maíz dulce

Los granos procedentes de mazorcas de maíz campo se seleccionaron de

forma aleatoria, tomando 50 granos por muestra. En cada una de las mazorcas se
realizó un corte rectangular a lo largo de las mismas con ayuda de un bisturí estéril,
dejando al descubierto los granos de maíz. Posteriormente, se extrajeron los granos
con ayuda de unas pinzas estériles y, sin realizar ningún tipo de lavado, se
colocaron de 5 en 5 sobre la superficie de las placas con medio de cultivo. De los 50
granos extraídos por muestra, 25 se colocaron en placas con agar PDA-CL y los
otros 25, en las placas con medio AVM, obteniendo por tanto 10 placas de cada
muestra (5 en PDA-CL y 5 en AVM), con 5 granos cada una.

65
Material y Métodos

Para el maíz experimental (variedades Panamá, Cridor y Net), se utilizó la

metodología descrita anteriormente en el análisis de maíz campo. De cada mazorca
se utilizaron 50 granos: 25 granos se depositaron en 5 placas con PDA-CL y 25
granos en 5 placas con AVM (5 granos por cada placa). En total, se utilizaron 20
placas (10 placas por mazorca), 100 granos por muestreo y variedad.

Todas las placas se incubaron a 28 ºC de 7 a 10 días.

1.4. Cultivo puro de hongos pertenecientes al género Fusarium, identificación

y conservación

Los hongos obtenidos se sembraron individualmente en dos placas, una con

medio PDA-CL y otra con medio AVM, incubándolas a 28 ºC de 7 a 10 días, hasta
que el crecimiento de cada aislado fuera completo, y asegurando que se hubiera
logrado un cultivo puro. Una vez crecidos los aislados, se hizo una selección visual y
al microscopio, para identificar los hongos del género Fusarium según los criterios
propuestos por Nelson et al. (1983), Samson et al. (2004) y Leslie and Summerell,
(2006).

Con los aislados pertenecientes al género Fusarium se obtuvieron cultivos

monospóricos en el medio de cultivo PDA que se conservaron a 4 ºC y en crioviales
con caldo nutritivo con 20% de glicerina a -80 ºC. Para cada aislado se tuvo en
cuenta su procedencia, número de placa y número de grano de donde se aisló el
hongo, definiendo la nomenclatura que se indica a continuación:

1.4.1. Nomenclatura de las placas

Para cada uno de los aislados obtenidos del maíz almacén se utilizo un código
que consta de una letra P o V, según el medio utilizado para el crecimiento de los
hongos sea PDA-CL (P) o AVM (V) y de tres números, que van del 1 al 10. El
primero hace referencia a la muestra, el segundo a la placa donde se aisló y el
tercero al grano de maíz.

66
 Material y Métodos

Para nombrar cada uno de los aislados obtenidos de las mazorcas

provenientes de maíz campo se utilizó un código que consta de la letra F seguida
del número correspondiente a la muestra, la letra P o V, según el medio utilizado
para el crecimiento de los hongos sea PDA-CL (P) o AVM (V), y de dos números,
que van del 1 al 5. El primero hace referencia a la placa y el segundo, al grano de
maíz. Algunos de los aislados llevan al final de su código una letra minúscula, a o b;
ésta hace referencia a que en el mismo grano habían dos hongos diferentes,
pudiendo ser ambos identificados como Fusarium sp.

Para los aislados procedentes del maíz experimental se utilizó la siguiente

nomenclatura, indicando: Variedad/ Nº de mazorca/ Medio de cultivo/ Nº de siembra/
Nº de placa

1.5. Cepas de referencia

En este trabajo se utilizaron un total de 10 cepas de referencia suministradas

por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), tal y como se indica en la Tabla
6. Estas cepas se emplearon para la identificación macroscópica de las especies del
género Fusarium, y su ADN se empleó como control positivo en las reacciones de
PCR.

Las cepas se sembraron en medio PDA y se incubaron a 28 ºC de 7 a 10 días,

dependiendo del crecimiento de la cepa. A continuación se conservaron a -80 ºC en
crioviales con caldo nutritivo con 20% de glicerol.

Tabla 6. Cepas de referencia

Referencia Especie
CECT 2150 G. zeae
CECT 2148 F. culmorum
CECT 2715 F. oxysporum
CECT 20166 F. sporotrichioides
CECT 2982 F. verticillioides
CECT 20165 F. poae
CECT 2218 F. roseum
CECT 20232 F. solani
CECT 20150 F. tricinctum
CECT 2149 F. equiseti

67
Material y Métodos

2. MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE Fusarium: Método CTAB

2.1. Preparación de los aislados para la extracción de ADN

Todos los aislados seleccionados provenientes de cultivos monospóricos se

sembraron en placa con medio PDA en cámara de flujo laminar vertical. Una vez
sembrados se sellan las placas con Parafilm y se incubaron a 28 ºC durante unos 7-
10 días hasta que el desarrollo del hongo es completo.

2.1.1. Procedimiento

El procedimiento utilizado para la extracción del ADN cromosómico fue el

descrito por Wilson, (1987) con algunas modificaciones, como se explica a
continuación.

Para la extracción de ADN, se recogió el micelio del aislado de Fusarium sp.,

con una espátula metálica estéril, depositándolo en un mortero de porcelana
previamente esterilizado; se añadió nitrógeno líquido e inmediatamente se molió
hasta obtener un polvo fino. Este micelio molido se colocó en un microtubo
Eppendorf de 2 mL al que se añadió 750 L de la solución tampón (250 mL Tris-
HCl 100mM pH 7.2; 250 mL EDTA 100mM y 250 mL dodecil sulfato sódico (SDS) al
10%, se agitó y se mantuvo todo en frío. Después, se añadió 3 L de una solución
de proteinasa K (20 mg/mL), se agitó y se incubó a 37 ºC durante 1 h.

A continuación se añadieron 100 L de NaCl 5M con el fin de proporcionar la

concentración salina necesaria para que el Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
(CTAB) no se acompleje con el ADN. Se adicionó 80 L de solución CTAB/NaCl
(CTAB al 10% en NaCl 0.7 M), de nuevo se agitó en homogenizador vortex y se
incubó a 65 ºC durante 10 min.

Para la purificación del ADN se añadió 700 L de cloroformo/alcohol isoamílico

(24:1), se agitó y se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min., para eliminar los
complejos formados por el CTAB. El sobrenadante se transfirió a un nuevo

68
 Material y Métodos

microtubo, al que se le añadió un volumen equivalente (entre 600-700 L) de

fenol/cloroformo/alcohol isoamílico ([Link]), agitándolo después. El fenol
desnaturaliza las proteínas y las precipita, separándose del ADN que se mantiene
disuelto. A continuación la mezcla se centrifugó a 12000 rpm durante 5 min., para
eliminar los restos del complejo CTAB, repitiéndolo si es necesario. Las proteínas
quedan en la interfase y los ácidos nucleicos en la fase superior acuosa.

El sobrenadante (500-700 L), que contiene los ácidos nucleicos, se transfirió a

otro microtubo al que se le añadió entre 500-600 L de isopropanol para precipitar el
ADN; se agitó suavemente y se centrífugo a 12000 rpm durante 10 min. Se eliminó
el isopropanol y se añadió 500 L de etanol frío al 70%; se agitó y se centrifugó
durante 5 min. Transcurrido este tiempo, se elimina el etanol y se seca la muestra al
vacío.

Finalmente, se resuspende el ADN en 50 L de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA

1mM, pH 8) y se añaden 3 L de RNAsa (25 mg/mL) para eliminar los restos de
RNA, dejando el ADN extraído a 5 ºC durante 24 h.

2.1.2. Detección del ADN por electroforesis y visualización del producto de

PCR

Para comprobar que la extracción ha sido correcta se realizó la electroforesis

en un gel de agarosa al 1.2 % (p/v) en tampón TAE 1X, a 90 voltios, durante 30 min.
El ADN extraído (5 L de ADN) se carga en el gel después de mezclarlo con 1 L de
tampón de carga (Loading Dye Solution). Acabada la electroforesis, se tiñe el gel
con bromuro de etidio (0.5 g/mL) durante 10-12 min. Tras la tinción se visualiza el
gel en un transiluminador de luz UV.

Esta misma metodología sirve para visualizar el producto de PCR, utilizando un

volumen de muestra de 5 L previamente mezclado con 2 L de tampón de carga.
En los geles se incluye uno o varios marcadores de pesos moleculares (Gene
Ruler 100 pb ADN Ladder Plus, Gene Ruler 50 pb ADN Ladder Plus) como
referencia para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN amplificados.

69
Material y Métodos

Finalmente, los fragmentos se visualizan en un transiluminador de luz UV tras teñir

el gel con bromuro de etidio.

2.1.3. Conservación del ADN

El ADN extraído se conserva en los microtubos a –20 ºC durante varios meses,

o durante varios días a 4 ºC.

3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

3.1. Preparación del ADN

La valoración del ADN total obtenido se realizó mediante espectrofotometría

(BioPhotometer de Eppendorf). Para ello se tomaron varias medidas de
absorbancia, obteniéndose el valor medio. En el momento de la utilización del ADN
todas las muestras de ADN se llevaron a una concentración de 100-180 ng/L.

3.2. Oligonucleótidos sintéticos

Los oligonucleótidos utilizados como iniciadores en la reacción de PCR fueron

proporcionados por las empresas Ecogen (Barcelona, España), y Thermo Electron
Corporation (Alemania). En la Tabla 7 y 8 se encuentran recogidas las secuencias
de los oligonucleótidos, así como las condiciones para la amplificación.

3.3. PCR para el género Fusarium

La identificación a nivel de género de los aislados se realizó mediante la

amplificación de un fragmento específico del género Fusarium de 389 pb de la
región ITS del 28S ADNr, utilizando los iniciadores ITS-Fu-f y ITS-Fu-r (Abd-
Elsalam, et al., 2003, Gómez et al., 2006).

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de la mezcla de reacción que contenía, 5 L de tampón 10x (500

70
 Material y Métodos

mM KCl, 100 mM Tris HCl pH 9.0, 1% Triton X-100), 3 L de MgCl2 a una

concentración de 50 mM, 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM
en total, 2.5 unidades de Taq ADN polimerasa (Eppendorf) y 0.5 L de una solución
20 M de cada iniciador, ITS-Fu-f y ITS-Fu-r y 3 L de ADN a una concentración
entre 100 y 180 ng/L.

Cada reacción de amplificación incluyó un control negativo, en el que el ADN se

reemplazó por agua ultrapura estéril y un control positivo con ADN de las cepas de
referencia antes mencionadas. El proceso de amplificación se llevo a cabo en un
termociclador modelo PTC-100 Peltier Termal Cycler (MJ Research), según los
ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.4. PCR para F. graminearum

La identificación de la especie F. graminearum se llevó a cabo mediante el

empleo de los iniciadores 217Fg y 170Fg (Hye-Seon and Lee, 2003), que amplifican
un fragmento específico para dicha especie de 600 pb del gen Tri5.

La amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L, conteniendo 47

L de mezcla de reacción y 3 L de ADN a una concentración entre 100 y 180 ng,
incluyendo un control negativo y un control positivo con el ADN de la cepa CECT
2150 (G. zeae). La mezcla de reacción contenía 5 L de tampón 10x (500 mM KCl,
100 mM Tris HCl pH 9, 1% Triton X-100), 3L MgCl2 a una concentración de 50 mM,
0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 2 unidades de Taq
ADN polimerasa (Ecogen) y 0.4 L de cada iniciador a una concentración de 20 M.

El proceso de amplificación se llevó a cabo en un termociclador Eppendorf-AG,

según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

También se utilizaron para la identificación de la especie F. graminearum los

iniciadores Fgr-F y Fgc-R (Jurado et al. 2005) que amplifican un fragmento de la
región IGS de 500 pb.

71
Material y Métodos

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de mezcla de reacción con 5 L de tampón 10x (500 mM KCl,
100 mM Tris HCl (pH 9.0), 1% Triton X-100), 3 L MgCl2 a una concentración de 50
mM, 0,4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 2.5 unidades
de Taq ADN polimerasa (Ecogen) y 0.5 L de cada iniciador a una concentración de
20 M. Añadiendo 3 L de ADN a una concentración entre 100 y 180 ng. Se incluyó
un control negativo y un control positivo con el ADN de la cepa CECT 2150 (G.
zeae).

El proceso de amplificación se llevo a cabo en un termociclador modelo

Eppendorf-AG, según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.5. PCR para F. verticillioides

Para identificar la especie F. verticillioides se emplearon los iniciadores VER1 y

VER2 que amplifican un fragmento de 578 pb de la secuencia del gen calmodulina
específico para dicha especie (Mulé et al., 2004 b). Este gen codifica la proteína
calmodulina.

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de mezcla de reacción con 5 µL de 10x tampón (500 mM KCl,
100 mM Tris HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 1.5 L MgCl2 a una concentración de 50
mM, 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 2.5 unidades
de Taq ADN polimerasa (Ecogen) y 0.4 L de 20 M de cada iniciador VER1/ VER2.
Añadiendo 3 L de ADN a una concentración entre 100 y 180 ng. Se incluyó un
control negativo y un control positivo con el ADN de la cepa CECT 2982 (F.
verticillioides). El proceso de amplificación se llevó a cabo en un termociclador
modelo Eppendorf-AG, según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

72
 Material y Métodos

3.6. PCR para F. culmorum

Los iniciadores Fcu-F y Fgc-R fueron utilizados para la identificación de la

especie F. culmorum, que amplifican un fragmento específico de 200 pb de la región
IGS del ADNr localizado en los genes 28S y 18S (Jurado et al., 2005).

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de mezcla de reacción con 5 L de 10x tampón (500 mM KCl,
100 mM Tris HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 3 L MgCl2 a una concentración de 50
mM, 0.2 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 3 unidades de
Taq ADN polimerasa (Ecogen) y 0.4 L de 20 M de cada iniciador Fcu-F / Fgc-R.
Añadiendo 3 L de ADN molde concentración entre 100 y 180 ng. Se incluyó un
control negativo y un control positivo con el ADN de la cepa CECT 2148 (F.
culmorum). El proceso de amplificación se llevo a cabo en un termociclador modelo
Eppendorf-AG, según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.7. PCR para F. oxysporum

Para la identificación de la F. oxysporum se utilizaron los iniciadores Clox1 y

Clox2, que amplifican un fragmento específico de 534 pb de la secuencia del gen
que codifica para la proteína calmodulina (Mulé et al., 2004 a).

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de mezcla de reacción y 3 L de ADN a una concentración entre
100 y 180 ng., incluyendo un control negativo y un control positivo con el ADN de la
cepa F. oxysporum CECT 2715. La mezcla de reacción contenía 5 L de 10x PCR
tampón (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 3 L MgCl2 a una
concentración de 50 mM, 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100mM en
total, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Ecogen) y 0.4 L de 20 M de cada
iniciador Clox1/Clox2. El proceso de amplificación se llevo a cabo en un
termociclador Eppendorf-AG, según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla
8.

73
Material y Métodos

3.8. PCR múltiple para Fusarium spp.

Para la identificación simultánea las especies F. graminearum, F. culmorum y

F. sporotrichioides, se utilizaron tres pares de iniciadores en la misma reacción de
PCR, Fg16F/Fg16R, para F. graminearum; FC01F/FC01R, para F. culmorum y
AF330109CF/AF330109CR, para F. sporotrichioides, de los cuales se obtienen
bandas de 570, 450, 332 pb respectivamente Demeke et al. (2005).

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de mezcla de reacción y 3 L de ADN a una concentración entre
100 y 180 ng, incluyendo un control negativo y un control positivo con el ADN de
cada cepa. La mezcla de reacción contenía 5 L de 10x PCR tampón (500 mM KCl,
100 mM Tris HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 1 L MgCl2 a una concentración de 50
mM, 1.3 L de KCl, 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total,
2 unidades de Taq ADN polimerasa (Ecogen) y 0.4 L de 20 M de cada iniciador.
El proceso de amplificación se llevó a cabo en un termociclador Eppendorf - AG,
según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.9. PCR para detección de aislados productores de tricotecenos

Una vez identificados los aislados pertenecientes al género Fusarium, se llevó

a cabo la detección de aislados productores de tricotecenos. Para ello, se utilizaron
los iniciadores Tox5-1 y Tox5-2, que amplifican un fragmento de 650 pb de la región
del gen Tri5 (Bakan et al., 2002), gen que codifica el tricodieno sintetasa, enzima
que cataliza el primer paso en la biosíntesis de tricotecenos.

La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 50 L,

conteniendo 47 L de mezcla de reacción, con 5 µL de 10x PCR tampón (500 mM
KCl, 100 mM Tris HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 3L MgCl2 a una concentración de
50 mM, 3 L (NH4)2SO4 , 3 L KCl, 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de
100 mM en total, 2.5 unidades de Taq ADN polimerasa (Eppendorf) y 0.5 L de 20
M de cada iniciador Tox5-1 y Tox5-2 y 3 L de ADN a una concentración entre 100
y 180 ng., se incluyó un control negativo y dos controles positivos con el ADN de las

74
 Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en este estudio
Iniciador Zona amplificada Secuencia del iniciador Medida del
producto (pb)
Género Fusarium ITS-Fu-f ITS 5´-CAA CTC CCA AAC CCC TGT GA-3´ 389
ITS-Fu-r 28S
5´-GCG ACG ATT ACC AGT AAC GA-3´
F. graminearum 217Fg Tri5 5´-CAGAGTGATCTCATGGCAGG-3´ 600
170Fg 5´-GGCATGGTTGTATACAGC-3´
F. graminearum Fgr-F. IGS 5`-GTTGATGGGTAAAAGTGTG-3` 500
Fgc-R 5`-CTCTCATATACCCTCCG-3
F. verticillioides Ver1 Calmodulina 5´-CTTCCTGCGATGTTTCTCC-3´ 578
Ver2 5´-ATTGGCCATTGGTATTATATATCTA-3´
F. culmorum Fcu-F 28S y 18S 5'-GACTATCATTATGCTTGCGAGAG-3' 200
Fgc-R 5'-CTCTCATATACCCTCCG-3'
F. oxysporum CLOX1 Calmodulina 5´-AGCAAAGCATCAGACCACTATAACTC-3´ 534
CLOX2 5´-CTTGTCAGTAACTGGACGTTGGTACT-3´
Tricotecenos Tox5-1 Tri5 5´-GCTGCTCATCACTTTGCTCAG-3´ 658
Tox5-2 5´-CTGATCTGGTCACGCTCATC-3´
DON - NIV ToxP1 Tri5- Tri6 5´-GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA-3´ 300 -DON
ToxP2 5´-TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA-3´ 360 -NIV
PCR-RFLPs CNL12 IGS 5’-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3` 2800/2600
CNS1 5`-GAGACAAGCATATGACTACTG-3´
Secuenciación ITS1 ITS1-5.8S-ITS2 5 - TTCGTAGGTGAACCTGCGG-3 550-570
ITS4
5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´
PCR Multiple FC01F 5'-ATGGTGAACTCGTCGTGGC-3' 570pb
FC01R 5'-CCCTTCTTACGCCAATCTCG-3'

Fg16F ITS 5'-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3' 450pb

Fg16R 5'-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3

Material y Métodos
AF330109CF 5'-AAAAGCCCAAATTGCTGATG-3' 332pb
AF330109CR 5'-TGGCATGTTCATTGTCACCT-3'
75
 Material y Métodos
76

Tabla 8. Condiciones de temperatura para las reacciones de amplificación

Iniciadores Desnaturalización Ciclos Segunda Primer Extensión Extensión Final
inicial desnaturalización alineamiento ADN ADN
ITS-Fu-f/ITS-Fu-r 95 °C 2 min. 30 94 °C 1 min. 61 °C 30 seg 72 °C 1 min. 72 °C 5 min.
217Fg/170Fg 94 °C 2 min. 30 94 °C 30 seg 53 °C 30 seg 72 °C 1 min. 72 °C 10 min.
Fgr-F/Fgc-R 94 °C 120 seg 25 95 °C 35 seg 53.2 °C 30 seg 72 °C 30 seg 72 °C 5 min.
VER1/ VER2 94 °C 3 min. 35 94 °C 50 seg 57 °C 50 seg 72 °C 1 min. 72 °C 7 min.
Fcu-F/Fgc-R 94 °C 85 seg 30 95 °C 35 seg 54 °C 30 seg 72 °C 30seg 72 °C 5 min.
CLOX1/CLOX2 94 °C 5 min. 35 94 °C 50 seg 61 °C 1 min. 72 °C 1 min. 72 °C 7 min.
Tox5-1/ Tox5-2 95 °C 2 min. 35 95 °C 1 min. 63 °C 51 seg 72 °C 1 min. 72 °C 5 min.
ToxP1/ToxP2 95 °C 5 min. 30 94 °C 1 min. 54 °C 1 min. 72 °C 50 seg 72 °C 6 min.
CNL12/CNS1 94 °C 85 seg 35 95 °C 35 seg 58 °C 55 seg 72 °C 120 seg 72 °C 10 min.
ITS1/ITS4 95 ºC 60 seg 35 95 ºC 30 seg 55 ºC 60 seg 72 ºC 60 seg 72 ºC 6 min.
PCR Múltiple 95 ºC 3 min. 38 95 ºC 30 seg 61.6 ºC 20 seg 72 ºC 45 seg 72 ºC 5 min.
 Material y Métodos

cepas CECT 2150 (G. zeae) y la CECT 2148 (F. culmorum), por ser cepas
productoras de tricotecenos.

El proceso de amplificación se llevo a cabo en un termociclador modelo PTC-

100 Peltier Termal Cycler (MJ Research), según los ciclos de temperatura
descritos en la Tabla 8.

3.10. PCR para detección de aislados de Fusarium spp., productores de

deoxinivalenol (DON) y nivalenol (NIV)

Se utilizaron los iniciadores ToxP1 y ToxP2 para amplificar la secuencia

intergénica de los genes Tri5 - Tri6, involucrados en la producción de micotoxinas,
detectando simultáneamente dos fragmentos: uno de 300 pb para el quimiotipo de
F. graminearum productor de deoxinivalenol (DON) y otro fragmento de 360 pb para
el quimiotipo de F. graminearum productor de nivalenol (NIV) (He-Ping et al., 2005).
La mezcla de reacción consistió en un volumen final de 50 L, que contenía
47L de mezcla de reacción con 5 L de 10x PCR tampón (500 mM KCl, 100 mM
Tris HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 2 L MgCl2 a una concentración de 50 mM, 0.4
L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 2 unidades de Taq
ADN polimerasa (Ecogen) y 0.5 L de 20 M de cada iniciador ToxP1/ToxP2.
Añadiendo 3 L de ADN molde concentración entre 100 y 180 ng. Se incluyó un
control negativo y un control positivo con el ADN de la cepa CECT 2150 (G. zeae).
El proceso de amplificación se llevó a cabo en un termociclador modelo Eppendorf-
AG, según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.11. PCR para amplificación de la región IGS

La región IGS del ADNr fue amplificada con los iniciadores universales CNL12
y CNS1 (Anderson and Stasovski, 1992). Para la amplificación se realizó una
mezcla de 50µl que contenía 5 µL de 10x PCR tampón (500 mM KCl, 100 mM Tris
HCl (pH 9), 1% Triton X-100), 25 mM MgCl2, 2 µL de ADN a una concentración entre
100 y 180 ng, 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 2.5

77
Material y Métodos

unidades de Taq ADN polimerasa (Ecogen) y 6 µL de 20 M de cada iniciador,

CNL12 y CNS1.

El proceso de amplificación se lleva a cabo en un termociclador Eppendorf-AG,

según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.12. PCR para amplificación de la región ITS1- 5.8S - ITS2 y posterior

secuenciación

La región ITS del ADNr fue amplificada con los iniciadores universales ITS1 y
ITS4 (White et al., 1990). La mezcla para la amplificación se realizó en un volumen
de 50 L que contenía 5 L de 10x PCR tampón (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl (pH
9), 1% Triton X-100), 3 L de 50 mM MgCl2, 3 L de ADN a una concentración entre
100 y 180 ng., 0.4 L de cada dNTP’s a una concentración de 100 mM en total, 2.5
unidades de Taq ADN polimerasa (Eppendorf) y 1 L de 20 M de cada iniciador,
ITS1/ITS4. Se realizaron tres repeticiones de cada reacción de PCR para obtener un
volumen de 150 L ya que se necesitan al menos 100 L de producto amplificado
para purificar previo a la secuenciación.

El proceso de amplificación se lleva a cabo en un termociclador Eppendorf-AG,

según los ciclos de temperatura descritos en la Tabla 8.

3.13. Análisis de polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción

amplificados por PCR (PCR-RFLP) de la región IGS

Los fragmentos amplificados obtenidos de F. graminearum y F. verticillioides,

se digirieron con enzimas de restricción, para poder observar cambios dentro de la
región IGS. Los enzimas elegidos fueron cinco de 4-pb: Mbol, Hin6I, HhaI, AluI,
BsuRI y tres de 6-pb: XhoI, EcoRI, Hind III (Fermentas) (Kim et al., 2001; Ferrer et
al., 2001; Llorens et al., 2006; Patiño et al., 2006). Las digestiones se realizaron
empleando el tampón correspondiente a cada enzima a la concentración de uso, 10
L del amplificado y 2 L de enzima, en un volumen final de 30 L. Se incubaron las
digestiones a 37 ºC toda la noche. Para la electroforesis se emplearon 15 L del

78
 Material y Métodos

volumen de la restricción en un gel de agarosa al 2.5% en tampón TAE 1X, que se

sometió a 60 V durante tres horas y media, y luego fue teñido con bromuro de etidio
para ser visualizado con luz UV. Los pesos moleculares de los fragmentos de ADN
se determinaron por comparación con dos estándares de pesos moleculares de 100
pb ADN y 50 pb ADN (MBI Fermentas).

Una vez calculado el peso molecular de cada banda, para el análisis estadístico
fue computada la presencia (1) o ausencia (0) de cada banda para el cálculo de una
matriz de similitud mediante el coeficiente de Dice (Soll, 2000), que excluye las
dobles ausencias, según la fórmula:

2a

2a+b+c

Donde a indica concordancia y b y c, discordancia. Dicha matriz fue

transformada en un árbol taxonómico basándose en el agrupamiento mediante el
algoritmo UPGMA (Sneath and Sokal, 1973). Todos los cálculos fueron realizados a
través del programa NTSYSpc2.02h (Applied Bioestatistics Inc).

4. PURIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DE LA

REGIÓN ITS1– 5.8S – ITS2

Los productos amplificados de la región ITS1–5.8S–ITS2 de los aislados de F.

graminearum y Fusarium spp., provenientes de maíz se purificaron usando el Kit
GenEludeTM PCR clean-Up (SIGMA). Se conservó el ADN purificado a -20 ºC hasta
su uso. Aproximadamente 2 µL del producto de la PCR purificada fueron requeridos
en cada secuenciación. La secuenciación fue llevada a cabo por la empresa
Sistemas Genómicos S. L. de Valencia (España).

Los productos se analizaron mediante secuenciación de cadena simple. La

reacción de cada secuenciación consistía en aproximadamente 500 a 600
nucleótidos. La secuencia de datos fue proporcionada en formato alfabético como
archivo ABI, mostrando la secuencia completa, y como electroferograma, que es
legible mediante el programa informático CHROMAS versión 1.45 (C. McCarthy,
School o Heath Science, Griffith University, Queensland, Australia). Para obtener la

79
Material y Métodos

secuencia del fragmento completo se ensamblaron manualmente los fragmentos

continuos generados por los iniciadores “forward” y “reverse”, usando el programa
PHYDIT. Los extremos de cada secuencia que contienen datos mal resueltos deben
ser suprimidos antes del ensamblaje. De esta manera se obtiene una secuencia casi
completa.

La identificación más probable o más próxima fue determinada en la base de

datos del National Center for Biotechnology Information, utilizando el programa
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; [Link] Las
secuencias fueron alineadas para generar árboles filogenéticos y matrices de
similitud de nucleótidos usando el programa PHYDIT
([Link] Los árboles filogenéticos fueron elaborados
usando “neighbour-joining” (el vecino más próximo) (Saitou and Nei, 1987), y el
algoritmo utilizado fue el de Jukes and Cantor (1969) el cual es un modelo de
distancia para generar una matriz de distancia evolutiva.

La topología de los arboles filogenéticos fue evaluada por “bootstrap”

(inferencia estadística por remuestreo) (Felsenstein, 1985) basado en el método de
neighbour-joining. Los datos filogenéticos fueron presentados como los árboles
usando el programa TREECON (Van de Peer and DeWachter, 1994). La raíz del
árbol se basó en método “neighbour-joining” usando secuencias de cepas tipo de
Fusarium, el cual permite la detección de la topología interna del árbol (Swofford y
Olsen, 1990).

5. MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETECCIÓN DE LAS MICOTOXINAS:

Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, 15-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon
X y Nivalenol

El método empleado para la determinación de deoxinivalenol, 3-

acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-acetildeoxinivalenol y nivalenol en muestras,
es el desarrollado por Eskola et al. (2000), con una serie de modificaciones
realizadas en el laboratorio de Microbiología de Universidad Politécnica de Valencia.

80
 Material y Métodos

El presente estudio incluyó la creación de una biblioteca de micotoxinas

derivatizadas con Sylon BTZ. Las micotoxinas son deoxinivalenol (DON), 3-
acetildeoxinivalenol (3-AcDON), fusarenon X (FUS X), 15-acetildeoxinivalenol (15-
AcDON) y nivalenol (NIV), las cuales se adquirieron en forma cristalina en viales de
1 mg (Sigma). Los disolventes utilizados fueron acetonitrilo p.a. (Scharlab) y n-
hexano p.a. (Scharlab); los reactivos y productos químicos utilizados fueron:
 filtros Whatman grado 2V
 cartuchos MycoSep® 227 Trich (Romer labs)
 agente derivatizante (Sylon BTZ): mezcla de N, O-bis (trimetilsilil)
 acetamida + trimetilclorosilano + trimetilsilimidazol (BSA + TMCS
+ TMSI) ([Link]), 25 mL) (Sigma)
 Neosolaniol (patrón interno) (Sigma)
 tampón fosfato 1 M, pH = 7
 nitrógeno seco (Abelló Linde, S.A.)

Tanto los disolventes como los reactivos y productos químicos utilizados son de
calidad analítica si no se especifica lo contrario.

El instrumental utilizado se enumera a continuación:

 material de vidrio de laboratorio
 balanza analítica Mettler Toledo XS204
 homogeneizador Ultra-turrax Ika T-25 basic
 cromatógrafo de gases/masas provisto de inyector automático y control de
vacío
 Agilent Technologies 5975 inert mass selective detector; 6890 N network GC
 system ; 7683 B series inyector

Todo el material de vidrio volumétrico utilizado es de clase A.

Para la creación de la biblioteca de micotoxinas, se analizó en el cromatógrafo

de gases con detector de masas, un patrón de cada una de las seis micotoxinas por
separado. Se obtuvo por una parte el cromatograma de iones totales
correspondiente a la inyección de la micotoxina en cuestión, conociendo así su

81
Material y Métodos

tiempo de retención, y por otra, el espectro de la micotoxina, en el cual se observan

las masas de sus iones, tanto el cuantitativo como los cualitativos. Toda esta
información queda archivada para el reconocimiento de las micotoxinas en las
futuras muestras a analizar.

5.1 Extracción y purificación

Se sembraron los aislados de F. graminearum en tres medios de cultivo PDA,

YES y Czapeck. Se analizaron las muestras a los 7, 14 y 21 días de incubación a 20
ºC. Para ello, se pesó 1 g de muestra de la placa en cuestión y se deposito en un
tubo Falcon. A continuación se añadieron 25 ml de mezcla disolvente CH3CN/H2O
(acetonitrilo:agua) 84:16 y se agito durante 3 minutos en un homogeneizador
dispersador ultraturrax a 17500 rpm. Transcurrido ese tiempo se procedió a la
filtración con papel de filtro plegado (Whatman 2V). Del extracto se toman 8 mL que
se purifican a través de cartucho Mycosep® 227, y el extracto purificado obtenido se
recogió en un tubo de ensayo. El cartucho Mycosep® 227 es de nuevo lavado con 8
mL de acetonitrilo puro para incrementar la recuperación de los compuestos más
polares (Jestoi, 2005). El volumen de lavado recogido se une al extracto puro
obtenido previamente. Posteriormente el extracto se evapora a sequedad bajo
corriente suave de nitrógeno seco, en baño termostático a 50 ºC. El extracto seco se
mantiene en congelador hasta su posterior análisis.

5.2. Derivatización de las micotoxinas

Las micotoxinas estudiadas requieren la formación de derivados con el fin de

aumentar su volatilidad y poder ser analizadas por cromatografía de gases/masas.
La derivatización consiste en introducir en las moléculas de deoxinivalenol, 3-
acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-acetildeoxinivalenol y nivalenol, grupos
trimetilsililo (TMS), frecuentemente en sustitución de un hidrógeno activo, lo que
reduce la polaridad del compuesto y disminuye el número de enlaces de hidrógeno.
El derivado sililado es más volátil y mejora la estabilidad térmica del compuesto.

Al residuo seco anterior se añadió 50 L del agente derivatizante Sylon BTZ

(mezcla de N, O-bis (trimetilsilil) acetamida + trimetilclorosilano + trimetilsilimidazol;

82
 Material y Métodos

BSA + TMCS + TMSI [Link]), manteniéndolo a 80 ºC durante 30 min., en un baño

termostatado. Tras la derivación, se deja atemperar. Posteriormente se le añadió
175 L de n-hexano y se agita en vortex 30 seg, para luego adicionar 1mL de
tampón fosfato 1M (pH = 7) y se agitó de nuevo en el homogenizador vortex otros
30 seg. Finalmente se adicionaron 75 L de disolución neosolaniol derivatizado 10
ppm en n-hexano y se homogenizo en agitador vortex. Con dichos volúmenes de
hexano y de neosolaniol obtenemos una concentración de patrón interno
(neosolaniol) de 3 ppm, que es la que se ha considerado adecuada tras un estudio
para la optimización de su concentración. De esta manera se obtuvo la fase
hexánica, que es trasvasada a un vial, rechazándose la fase acuosa. La fase
orgánica así separada se reserva para su posterior inyección en el cromatógrafo.

5.3. Determinación de Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-

Acetildeoxinivalenol y Nivalenol, por Cromatografía de Gases con
Detector de Masas

5.3.1. Condiciones del cromatógrafo y del detector de masas

Las condiciones elegidas para el cromatógrafo y más concretamente para las

temperaturas del detector, inyector y horno fueron optimizadas en el laboratorio de
Micología de la Universidad Politécnica de Valencia, con la finalidad de obtener la
máxima separación posible entre las diferentes micotoxinas a estudiar,
especialmente 3-acetildeoxinivalenol, fusarenon X y 15-acetildeoxinivalenol, ya que
sus tiempos de retención son muy próximos. Las condiciones del cromatógrafo son
las siguientes:
 columna HP5 de 30 m de longitud, 250 µm de diámetro interno y 0.25 m de
espesor de film
 flujo de 1.8 mL/min.
 el gas portador es helio
 volumen de inyección de muestra de 2 L
 programa de temperatura del horno:
80 ºC durante 1 min.
de 80 a 240 ºC a 30 ºC/min.

83
Material y Métodos

de 240 a 280 ºC a 5 ºC/min.

 Columna HP5 30 m x 250 µm x 0.25 m nominal

Las condiciones del detector son las siguientes:

 Temperatura del cuadrupolo: 150 ºC
 Temperatura de la fuente de ionización: 230 ºC

5.3.2. Cuantificación de Deoxinivalenol, 3- Acetildeoxinivalenol, Fusarenon

X, 15-Acetildeoxinivalenol y Nivalenol por patrón interno

Las concentraciones de micotoxina, tanto en los patrones como en los aislados,

se cuantifican mediante la técnica de patrón interno. Un patrón interno es una
sustancia empleada para establecer relaciones matemáticas con los analitos a
determinar, con el objeto de mejorar la precisión del método y del instrumento.
Además, no debe encontrarse en las muestras a analizar, debe ser separable de los
otros componentes de la muestra y no debe reaccionar químicamente ni con los
componentes de la muestra ni con los analitos a determinar (Woodget and Cooper,
1995).

Para poder cuantificar la concentración de micotoxina presente de forma

natural en las muestras se calcula, a partir de una concentración conocida de patrón
de micotoxina, a la que se le añade una concentración constante de patrón interno,
un factor de respuesta (Fr), el cual relaciona las abundancias de ambas sustancias.
La fórmula de cálculo es la siguiente:
C i  A pi
Fr =
A i  C pi

donde: Ci: concentración de micotoxina i

 Ai: abundancia ión de la micotoxina i
 Api: abundancia ión del patrón interno
 Cpi: concentración de patrón interno

Una vez conocido el Fr, podremos cuantificar la concentración de micotoxina

presente en una muestra despejando de la formula anterior:

84
 Material y Métodos

Fr  A x  C pi
Cx 
A pi

donde. Cx: concentración de la micotoxina en la muestra

Ax: abundancia ión de la micotoxina en la muestra

Los iones empleados para la identificación y determinación de las diversas

micotoxinas son de dos tipos: cuantitativos y cualitativos. Los primeros los utilizamos
para cuantificar su abundancia y se eligen por ser los que proporcionan una
respuesta analítica alta y además no son comunes como ión principal al resto de
analitos. Los iones cualitativos se utilizan para confirmar la presencia de la
micotoxina correspondiente. Todos ellos se muestran en la Tabla 9.

5.4. Estudio de los parámetros analíticos del método

5.4.1. Intervalo de linealidad

El estudio de linealidad se llevaron a cabo mediante la elaboración de rectas de

calibrado para cada micotoxina. El intervalo de concentraciones de micotoxina se
eligió teniendo en cuenta:
 la concentración de micotoxina presente de forma natural en las muestras de
estudio
 las concentraciones establecidas como máximos permisibles en las
diferentes legislaciones vigentes

Por último, las concentraciones inferiores del intervalo se eligen cercanas a los
límites de cuantificación.

85
Material y Métodos

Tabla 9. Tiempos de retención e iones característicos de las micotoxinas

Micotoxina Tiempo de retención Ión cuantitativo Iones
aproximado (min.) cualitativos
DON 9.031 235 259 / 295

3-AcDON 9.819 377 295 / 467

FUS X 9.886 480 450

15-AcDON 9.953 392 350 / 407

NIV 10.164 289 349 / 379

NEO 11.119 290 252

DON: deoxinivalenol; 3-AcDON: 3-acetildeoxinivalenol; FUS X: Fusarenon X; 15-AcDON: 15-

acetildeoxinivalenol; NIV: nivalenol; NEO: neosolaniol

El comportamiento lineal debe ser demostrado dentro del intervalo en el cual se

va a trabajar. Debido a ello, y basándonos en datos bibliográficos sobre
deoxinivalenol, 3-acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-acetildeoxinivalenol y
nivalenol, optamos por trabajar en el intervalo de concentraciones de 0.1 a 5 mg/kg
(Jestoi, 2004; 2005).

Para verificar la linealidad de la respuesta del detector de masas con respecto

a la concentración de las micotoxinas se confecciono una curva de calibrado con 6
puntos (0.1, 0.5, 1, 2, 3 y 5 mg de micotoxina/kg), a partir de la cual se hallo la
ecuación de regresión que relaciona las concentraciones de micotoxina con el valor
de la abundancia de ión detectada por el cromatógrafo y el coeficiente de
correlación (r2), parámetro que cuantifica el grado de correlación lineal entre las
variables concentración de micotoxina y abundancia de ión.

5.4.2. Límite de cuantificación o determinación

El límite de cuantificación es la mínima concentración cuantificable con una

precisión y exactitud aceptable. Tomamos como valor de este límite la cantidad de
micotoxina que corresponde al valor medio del ruido de fondo del cromatograma
más 6 veces la desviación estándar.

86
 Material y Métodos

El valor medio del ruido de fondo es proporcionado por el software del equipo,
que evalúa la relación señal/ruido de fondo para los diferentes iones obtenidos para
cada micotoxina. El valor del límite de cuantificación se expreso en µg de
micotoxina/kg de muestra.

5.4.3. Exactitud y precisión del método: ensayos de fortificación y

recuperación de micotoxina

Para evaluar la exactitud y precisión del método analítico se realizaron ensayos

de recuperación de deoxinivalenol, 3-acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-
acetildeoxinivalenol y nivalenol en los cuales se compararon las concentraciones
detectadas de las micotoxinas con las concentraciones teóricas añadidas a las
muestras.

Se toma una muestra de un 1g por cada medio de cultivo analizado (PDA, YES,
Czapeck a la que se adiciona una concentración conocida de deoxinivalenol, 3-
acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-acetildeoxinivalenol y nivalenol. Se fortificaron
tres muestras independientes para cada nivel de concentración de micotoxina y tipo
de matriz. Los niveles de fortificación fueron:

a) 500 µg/kg de cada micotoxina.

b) 50 µg/kg de cada micotoxina.

Las muestras así fortificadas se procesan por el método de extracción,

purificación, detección y cuantificación descrito anteriormente y se hallo el
porcentaje de recuperación en cada uno de los medios de cultivo.

Todas las muestras fueron analizadas previamente para comprobar la ausencia

de micotoxinas. Las muestras sin fortificar se utilizan como control o blanco
negativo.

87
IV. RESULTADOS
 Resultados

IV. RESULTADOS

1. CONTAMINACIÓN FÚNGICA DE LOS GRANOS DE MAÍZ

1.1. Maíz almacén

Después de 7 días de incubación a 28 ºC, se evaluó el crecimiento fúngico de

las 10 muestras de maíz almacén en los medios de cultivo PDA-CL y AVM,
estudiando cualitativa y cuantitativamente los granos donde habían crecido hongos.
El porcentaje de granos contaminados se calculó teniendo en cuenta el total de los
granos sembrados (100 granos de cada muestra). Los granos presentan un nivel
medio de contaminación de 43% en PDA-CL y un 44.4% en AVM. Destacaba una de
las muestras, que alcanzó un nivel de contaminación del 98% de los granos
sembrados en PDA-CL.

Cuando diferenciamos los granos contaminados con Fusarium spp., del resto
de contaminación fúngica (Tabla 10), se observa que el número de granos
contaminados por Fusarium spp., es prácticamente igual en los dos medios, 162
(32.4%) en PDA y 170 (34%) en AVM, y el porcentaje de contaminación para las
distintas muestras varía entre 22 y 70%, en medio PDA-CL y entre 18 y 78% en
medio AVM.

Respecto a la identificación de los hongos aislados, los datos muestran que el

género predominante en estas muestras es Fusarium (Fig. 7, Tabla 11). De 236
hongos aislados en medio PDA, el 12.28% corresponde a Penicillium spp., 3.38% a
Alternaria spp., 6.78% a Aspergillus spp., y el 70% a Fusarium spp. En el medio de
cultivo AVM de 238 hongos aislados, el 8.82% corresponde a Penicillium spp.,
6.72% a Alternaria spp., 8.82% a Aspergillus spp., y un 74.36% a Fusarium spp.

De los 1000 granos analizados encontramos 474 aislados, de los cuales 342
pertenecían al género Fusarium, lo que corresponde al 72% de la contaminación
fúngica.

93
Resultados

Tabla 10. Número de granos de maíz almacén contaminados por hongos en los dos medios de
cultivo utilizados PDA-Cl y AVM

Nº de Nº de granos Nº de granos Nº de granos Nº de granos

contaminados contaminados con contaminados contaminados con
muestra
por algún tipo Fusarium spp., y % por algún tipo Fusarium spp., y %
de hongo y % de hongo y %

PDA-CL PDA-CL AVM AVM

1 38 (76%) 16 (32%) 42 (84%) 25 (50%)

2 49 (98%) 35 (70%) 41 (82%) 39 (78%)

3 0 0 2 (4%) 0

4 34 (68%) 32 (64%) 28 (56%) 25 (50%)

5 31 (62%) 29 (64%) 33 (66%) 33 (66%)

6 2 (4%) 0 5 (10%) 0

7 0 0 0 0

8 13 (26%) 11 (22%) 19 (38%) 9 (18%)

9 13 (26%) 13 (26%) 13 (26%) 13 (26%)

10 35 (70%) 26 (52%) 39 (78%) 26 (52%)

Total 215 (43%) 162 (32.4%) 222 (44.4%) 170 (34%)

AVM
74%

PDA-CL
70%
9%
1% 9% 7%

12%
7% 3%
8%

% Fusarium % Penicillium % Alternaria % Aspergillus Otros hongos

Figura. 7. Porcentaje de cada género fúngico obtenidos de maíz almacén en los

medios de cultivo PDA-CL y AVM

94
 Tabla 11. Micobiota de granos de maíz de almacén en los dos medios de cultivo utilizados PDA-Cl y AVM
PDA-CL AVM
o o o
N . de N . de % % % % N . de % % % %
muestra hongos Penicillium spp. Alternaria spp. Aspergillus spp. Fusarium spp. hongos Penicillium spp. Alternaria spp. Aspergillus spp. Fusarium spp.
1 49 30.6 6.12 20.41 36.76 62 11.11 17.46 25.39 39.70
2 59 11.86 6.78 5.08 57.63 42 4.76 0 0 95.24
3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 100
4 34 2.94 0 0 91.17 27 3.70 0 0 96.30
5 31 3.22 0 0 93.55 33 2.94 0 0 97.06
6 2 100 0 0 0 5 100 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 13 7.69 7.69 0 84.62 15 26.67 6.66 0 60
9 13 0 0 0 100 13 0 0 0 100
10 35 5.71 0 8.57 85.71 39 0 10.26 10.26 79.49
Total 236 12.38 3.38 6.78 70 238 8.82 6.72 8.82 74.36

Resultados
95

95
Resultados

1.2. Maíz campo

Para las 100 muestras de maíz campo se analizaron un total de 5000 granos,
2500 en PDA-Cl y 2500 en AVM, en 500 placas de cada medio. Después de 7 días
de incubación a 28 ºC, se evaluó el nivel de contaminación fúngica en los granos,
estimando su porcentaje. En la Tabla 12 se exponen los valores totales de granos
contaminados y su respectivo porcentaje para cada una de las muestras analizadas.
(Anejo 2).

Tabla 12. Número y porcentaje de granos de maíz campo contaminados por hongos.

PDA-Cl AVM Granos totales

contaminados
Nº granos % Nº granos %
974/2500 38.96 32/2500 29.28 1706/5000

El porcentaje de granos contaminados por algún tipo hongo es del 38.96%.

Básicamente, la micobiota encontrada en el maíz campo se compone de los géneros
Penicillium, Fusarium, Aspergillus, y del grupo de mucorales, principalmente del
género Rhizopus. Otros géneros, como Alternaria, Cladosporium, y Geotrichum, han
aparecido de forma puntual (Anejo 2). El número y porcentaje de los géneros
encontrados para cada medio de cultivo se resume en la Tabla 13. Para el medio
PDA-Cl los porcentajes más altos corresponden a los géneros Penicillium y
Aspergillus, mientras que en el medio AVM destaca el alto porcentaje del género
Fusarium.

En la Fig. 8 se representan los porcentajes obtenidos para cada género en

medio PDA-Cl, ya que este medio es general para el desarrollo de los hongos y
donde se obtuvo el mayor aislamiento de hongos, dando unos valores reales de toda
contaminación fúngica existente en las muestras de maíz campo analizadas. Se
comprueba que los géneros predominantes son Penicillium con un 40%, Fusarium
con un 22% y Aspergillus con un 21%, seguido por el grupo de los mucorales con un
11%.

96
 Resultados

Tabla 13. Distribución de la contaminación fúngica en granos de maíz campo

Géneros PDA-Cl Porcentaje (%) AVM Porcentaje (%) Total

Fusarium 283 22.2 351 40,34 634

Alternaria 47 3.69 21 2.41 68

Aspergillus 263 20.65 141 16.20 404

Cladosporium 12 0.94 0 0 12

Geotrichum 12 0.94 28 3.21 40

Mucorales 142 11.15 94 10.80 236

Penicillium 515 40.45 235 27 750

Nº total hongos 1273 870 2143

4%
40% 21%

1%

1% 22%
11%
Alternaria spp. Aspergillus spp. Cladosporium spp. Fusarium spp.
Geotrichum spp. Mucorales Penicillium spp.

Figura 8. Porcentajes para cada género fúngico de maíz campo obtenidos en medio PDA-Cl

Como se observa en la Fig. 9, en todos los casos el porcentaje obtenido para

cada uno de los géneros fúngicos hallados en los granos de maíz, es superior en el
medio PDA-Cl, excepto para los géneros Geotrichum y Fusarium, cuyos porcentajes
son mayores en AVM.

97
Resultados

45
40.34 40.5
40

35

30 27
25 22.23
20.7
20
16.21
15 11.2 10.8
10
3.69 3.22
5 2.41
0.94 0 0.94
0

al
ia

m
m

m
llu

or
ar

hu

iu
iu

riu
gi

uc
rn

ill
or

ic
sa
er

ic
lt e

sp

tr

en
Fu
sp

eo
A

do

P
A

G
la
C

PDA-Cl VM
Figura 9. Distribución en porcentaje de la contaminación fúngica según el medio de cultivo,
para granos de maíz campo

Se realizó un estudio estadístico basado en el análisis de la varianza, utilizando

el programa Statgraphics versión 5.0. Para ello, se emplearon los datos
correspondientes al número de aislados de Fusarium spp., y al número de aislados
pertenecientes a otros géneros, obtenidas con cada medio de cultivo. Los resultados
indican que no existen diferencias estadísticamente significativas (p> 0.05), para un
nivel de confianza del 95%, entre los valores medios para el género Fusarium
respecto al medio de cultivo empleado ya que se presenta solapamiento en
intervalos LSD (Least Significant Differences), para cada medio de cultivo (Fig. 10).
Sin embargo, sí existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores
medios obtenidos para el resto de hongos, en función al medio de cultivo (p<0.05),
ya que no se presenta solapamiento entre los intervalos LSD correspondientes al
medio PDA-Cl y al AVM (Fig. 11).

En la Fig. 10 se observa que la media obtenida en AVM para el número de

cepas del género Fusarium es ligeramente superior al medio PDA-CL, mientras que
en la Fig. 11, la media obtenida del número de géneros fúngicos es marcadamente
superior en PDA-CL.

98
 Resultados

15

12
Fusarium

0
PDA-Cl AVM
Figura 10. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de Fusarium aislado
Medios de cultivo
de maíz campo en los medios de cultivos

15

12
Hongos (sin Fusarium)

0
PDA-Cl AVM
Medios de cultivo

Figura 11. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de hongos no
pertenecientes al género Fusarium, aislado de maíz campo en los medios
cultivo PDA-CL y AVM

Se determinó si existían diferencias para los géneros de hongos encontrados

dentro de las diferentes Comunidades Autónomas, comparando los resultados
obtenidos en el medio PDA-CL, puesto que es el medio general que no tiene ningún
agente selectivo o inhibidor. En la Tabla 14 se exponen los porcentajes obtenidos
para cada género fúngico estudiado respecto a la Comunidad Autónoma, y se indica
el número de muestras estudiadas en cada una de ellas. Los porcentajes se han
calculado en función al número de hongos obtenidos.

99
Resultados

Los porcentajes obtenidos para cada género fúngico hallado en las muestras
procedentes de la Comunidad Autónoma de Castilla la Mancha, indican que los
géneros predominantes son: Penicillium con 47%, Fusarium con 23.1%, Aspergillus
16.9%, Alternaria 3.8%, Cladosporium 1.48%, Geotrichum 1.2% y mucorales 6.6%.

Dentro de la Comunidad Valenciana, los géneros predominantes son Penicillium

con 46.9%, Aspergillus 26.1%, Fusarium 16.4%, Alternaria 2.6%, y mucorales 8 %.

En la Comunidad de Extremadura el género predominante es Aspergillus con

48%, seguido por el grupo de mucorales que representa un 31%, Fusarium 18.3%,
Geotrichum 2.82%. No se detectaron los géneros Penicillium, Alternaria, ni
Cladosporium.

En la Comunidad de Madrid, los aislados pertenecientes al género Alternaria,

son los predominantes, con un porcentaje del 37%, seguido del género Fusarium, el
grupo de los mucorales, Penicillium y Aspergillus con un 22.2%, 22.2%, 11.1%, 7.4%
respectivamente. En este caso no se hallaron hongos de los géneros Cladosporium
ni Geotrichum.

En la Comunidad de la Región de Murcia, los géneros fúngicos predominantes

son mucorales con un 30.9%, Fusarium 28.7%, Aspergillus 22.8% y Penicillium
17.6%. En este caso, las muestras no registraron ningún aislado perteneciente a los
géneros Geotrichum, Alternaria y Cladosporium.

Los porcentajes obtenidos para el género Fusarium (en PDA-CL) en todas las
Comunidades Autónomas muestran valores similares, comprendidos en un intervalo
de 16.4% a 28.7%, correspondiendo el mayor valor a la región de Murcia y el menor
a la Comunidad Valenciana.

De 100 muestras estudiadas de granos de maíz campo, en 64 de ellas se

encontraron hongos pertenecientes al género Fusarium, con un total de 228
aislados, los cuales se identificaron morfológicamente.

100
 Resultados

Fotografía 2.1. Fusarium sp., y Fotografía 2.2. Aspergillus sp., en

Aspergillus sp., en PDA-Cl medio AVM

Fotografía 2.3. Penicillium sp., en Fotografía 2.4. Fusarium sp., y

PDA-Cl Alternaria sp., en AVM

Fotografía 2.5. Fusarium sp., en PDA-Cl Fotografía 2.6. Fusarium sp., en AVM

Fotografía 2. Desarrollo de algunas de las especies fúngicas contaminantes en maíz campo

101
Resultados

Tabla 14. Porcentajes de hongos aislados de maíz campo en función de la Comunidad

Autónoma estudiada
Comunidades Autónomas

Castilla la C. Valenciana Extremadura Madrid Murcia

Mancha
PDA-CL AVM PDA-CL AVM PDA-CL AVM PDA-CL AVM PDA-CL AVM

Géneros % % % % %

Alternaria 3.8 1.8 2.6 1.4 0 0 37 40.9 0 0

Aspergillus 16.9 10 26.1 20.9 48 57 7.4 0 22.8 25.7

Cladosporium 1.48 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Fusarium 23.1 44.1 16.4 30.2 18.3 26.5 22.2 40.9 28.7 40

Geotrichum 1.2 3.6 0 2.9 2.82 0 0 0 0 3.81

Mucorales 6.6 8.1 8 5.8 31 16.3 22.2 18.2 30.9 27.6

Penicillium 47 32.1 46.9 38.9 0 0 11.1 0 17.6 2.9

Muestras
analizadas 63 13 5 11 8

Se realizó el análisis de varianza para determinar si existían diferencias

significativas con respecto a las comunidades autónomas y el grado de incidencia de
especies del género Fusarium. Para ello, se emplearon los datos correspondientes
al número de aislados de Fusarium spp., y el número de aislados pertenecientes a
otros géneros, obtenidos en cada comunidad autónoma en medio PDA-Cl.

Los resultados muestran diferencias significativas para los valores medios de

Fusarium spp., entre Madrid y Murcia; entre el resto de comunidades no existen
diferencias significativas. En la Fig. 12, se presentan los intervalos LSD en el único
caso donde no hay solapamiento (entre las comunidades de Madrid y Murcia).

Para los aislados no pertenecientes al género Fusarium, no existen diferencias

significativas entre ninguna de las Comunidades Autónomas estudiadas, tal y como
se aprecia en la Fig. 13, que representa los intervalos LSD, produciéndose
solapamiento en todos los casos.

102
 Resultados

33

23
Fusarium

13

-7
C. la Mancha [Link] Extremadura Madrid Murcia

Figura 12. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de Fusarium spp., para
las Comunidades Autónomas

33
Hongos (sin Fusarium)

23

13

-7
C. la Mancha [Link] Extremadura Madrid Murcia

Figura 13. Intervalos LDS para la comparación de los valores medios de hongos distintos a
Fusarium spp., para las Comunidades Autónomas

1.3. Maíz experimental

El recuento y aislamiento a partir de estas muestras se realizó en los medios de

cultivo PDA-CL y AVM, especificando el número de hongos que crecieron en cada
grano y los géneros que aparecían en cada placa. Estos datos han servido como
base para evaluar el grado de contaminación del maíz, calculando los porcentajes
de crecimiento de cada hongo (Anejo 2).

103
Resultados

En los muestreos realizados en las variedades de maíz Panamá, Cridor y Net,

se encuentra una micobiota compuesta principalmente por los géneros Aspergillus,
Fusarium, Penicillium, y otros géneros que han aparecido de forma puntual, como
Acremonium, Alternaria, y hongos del orden mucorales. En las Tablas 15, 16, 17 se
recogen el porcentaje de hongos crecidos en los granos de maíz de las variedades
Panamá, Cridor y Net, en el medio PDA-Cl.

En promedio, la contaminación de los granos del maíz experimental fue de un

93%: en la variedad Panamá, con una contaminación del 100% de los granos, los
géneros que predominan son Aspergillus con 38.58%, Fusarium 31.3% y Penicillium
18.9%; para la variedad Cridor, el porcentaje de granos contaminados es del 90% y
sobresale el género Fusarium con un 40.5%, Penicillium con un 26.6% y Aspergillus
con 24.59%; para la variedad Net el género Fusarium, representa un 47.7% del total
de hongos encontrados, el género Penicillium un 31.2% y Aspergillus un 18.42%,
con un total de granos contaminados del 88%.

De un total de 860 placas se obtuvieron 222 aislados pertenecientes al género

Fusarium, de los cuales 83 provienen de la variedad Panamá, 78 de la variedad
Cridor y 61 de la variedad Net. A cada una de ellas se le realizó la comprobación
macroscópica y microscópicamente.

1.3.1. Comparación de Fusarium spp., respecto a la microbiota fúngica

total, según la variedad de maíz

Los datos obtenidos del recuento total de Fusarium spp., por variedades se han
analizado mediante cálculos estadísticos. Los resultados indican que no existen
diferencias estadísticamente significativas (p> 0.05) entre medias de cada variedad,
para un nivel de confianza del 95%, y que los niveles de Fusarium spp., de cada
variedad de maíz son similares (Tabla 18, Fig. 14).

104
 Resultados

Tabla 15. Porcentajes de géneros que han crecido en la variedad Panamá

Variedad Panamá
Muestreo Fusarium Alternaria Aspergillus Penicillium Sin identificar

1 36.40 0.80 16.40 46.40 -

2 9.76 - 65.85 3.66 20.73
3 31.90 - 52.76 2.45 12.88
4 36.87 - 44.95 9.09 9.09
5 26.32 - 52.64 3.16 17.89
6 21.47 - 66.87 11.66 -
7 28.22 - 46.47 12.86 12.45
8 40.31 - 25.20 26.74 7.75
9 39.72 - 51.06 9.22 -
10 8.84 - 25.12 40.93 25.12
11 33.33 - 34.59 12.50 19.58
12 34.07 - 32.29 11.06 22.57
13 47.91 - 24.19 27.91 -
14 34.82 - 31.98 26.72 6.48
% Total 31.26 0.07 38.58 18.93 11.16

Tabla 16. Porcentajes de géneros que han crecido en la variedad Cridor

Variedad Cridor
Muestreo Fusarium Alternaria Aspergillus Penicillium Sin identificar
1 16.67 8.33 41.67 33.33 -
2 6.49 - 87.01 6.49 -
3 31.93 - 60.5 2.52 5.04
4 82.95 - 17.05 - -
5 71.62 - 25 3.38 -
6 71.95 - 26.83 1.22 -
7 31.75 - 33.33 23.81 11.11
8 50.91 - 13.94 20.00 15.15
9 36.82 - 7.1 37.16 18.92
10 47.53 - 31.48 - 20.99
11 30.74 - 19.63 32.59 17.03
12 31.17 - 20.46 47.73 0.65
13 33.83 - 25.56 40.60 -
14 45.87 - 13.76 32.11 8.26
15 25.11 - 28.09 37.87 8.94
16 59.44 - 18.88 21.68 -
% Total 40.53 0.04 24.59 26.60 7.16

Tabla 17. Porcentajes de géneros que han crecido en la variedad Net

Variedad Net
Muestreo Fusarium Alternaria Aspergillus Penicillium Sin identificar
1 56.25 - 41.67 - -
2 27.78 - 87.01 14.44 -
3 71.56 - 60.5 3.67 2.75
4 67.77 - 17.05 22.31 -
5 65.85 - 25 12.20 -
6 64.32 - 26.83 29.19 -
7 24.06 - 33.33 53.38 3.76
8 25.23 - 13.94 57.34 2.29
9 58.86 - 7.1 22.29 -
10 69.43 - 31.48 1.91 21.02
11 59.24 - 19.63 28.26 -
12 36.93 - 20.46 58.89 -
13 38.27 - 13.76 8.02 3.09
% Total 47.65 - 18.42 31.24 1.10

105
Resultados

Fotografía 3.1. Aspergillus spp., Fotografía 3.2 Fusarium spp., en

Penicillium spp., y Fusarium spp., AVM, placa C.1.V.16-4
en PDA, placa C.1.P.16-1

Fotografía 3.3. Aspergillus sp., en Fotografía 3.4. Aspergillus sp., en

PDA, placa C.1.P.1-2 AVM, placa C.1.V.2-4

Fotografía 3.5. Penicillium spp., Fotografía 3.6. Rhizopus sp.

en medio PDA

Fotografía 3. Micobiota fúngica de maíz experimental

106
 Resultados

Tabla 18. Recuento total de hongos del género Fusarium y otros hongos, según variedad
Variedad Fusarium Otros
PANAMÁ 910 2001
CRIDOR 1126 1652
NET 993 1091
Total 3029 4744

Figura 14. Gráfico de medias de Fusarium spp., según la variedad de maíz

Para el resto de hongos que no pertenecen al género Fusarium sí se

encuentran diferencias significativas (p<0.05) entre las medias de las variedades
para un nivel de confianza del 95%: la variedad Panamá sobresale por encima de
las otras dos variedades, y las medias de las variedades Cridor y Net son más
próximas, como se aprecia en la Fig. 15.

Figura 15. Gráfico de medias de otros hongos según la variedad de maíz

107
Resultados

1.3.2. Comparación de Fusarium spp., respecto a la microbiota fúngica total,

según los medios de cultivo

Cuando se analizan mediante cálculos estadísticos, el número de aislados

obtenidos según el medio de cultivo (Anejo 2) indican que hay diferencias
estadísticamente significativas entre los valores medios (para un nivel de confianza
del 95%) obtenidos para los diferentes medios de cultivo (Fig. 16 y 17).

A
A

Figura 16. Gráfico de medias de Fusarium spp., según medios de cultivo

Figura 17. Gráfico de medias de otros hongos según medios de cultivo

108
 Resultados

2. AISLADOS DE HONGOS DEL GÉNERO Fusarium DE GRANOS DE MAÍZ

Una vez identificadas morfológicamente los aislados pertenecientes al género

Fusarium, en cada una de las muestras utilizadas en este estudio, se procedió a la
selección de las mismas: de maíz almacén, 150 de 342 aislados; de maíz campo,
127 de 634 aislados y de maíz experimental se seleccionaron 100 (38 de la variedad
Panamá, 28 de Cridor y 34 de Net) de 222. Los criterios de selección de los aislados
fueron de carácter morfológico. Los 377 aislados seleccionados se resembraron
como cultivo monospórico, y una vez crecidos se utilizaron en los diferentes análisis.

3. IDENTIFICACIÓN POR PCR

Para la detección e identificación rápida y específica de aislados toxigénicos

del género Fusarium se han desarrollado metodologías basadas en el análisis de los
ácidos nucleicos, entre las que destaca la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) por su elevada sensibilidad, especificidad y rapidez. Mediante esta técnica se
ha llevado a cabo la identificación a nivel de género y especie de los aislados de
Fusarium spp., así como la identificación de aislados productores de tricotecenos
(Desjardins, 2006).

3.1. Identificación del género Fusarium

La identificación molecular a nivel de género se efectuó mediante el empleo de

los iniciadores ITS-Fu-f y ITS-Fu-r (Abd-Elsalam et al., 2003), que detectan y
amplifican un fragmento de 389 pb de la región ITS del gen ribosomal ARN 28S
(ADNr) específico para las especies del género Fusarium. Para comprobar la
efectividad de este tipo de PCR se probaron todas las cepas de referencia
empleadas en este trabajo de investigación, procedentes de la Colección Española
de Cultivos Tipo (Tabla 6), obteniéndose en todas ellas la amplificación del
fragmento esperado. También se analizaron 5 aislados pertenecientes a los géneros
fúngicos Acremonium, Penicillium y Aspergillus, que fueron todas negativas. Las 377
aislados analizados en este trabajo fueron positivos para este ensayo. En la
fotografía 4 puede observarse el producto de amplificación obtenido.

109
Resultados

M C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 C+ M

389 pb

Fotografía 4. Identificación de Fusarium spp., mediante PCR. M: marcador; C–: control

negativo Acremonium sp ; 1: F3-P-5-1 , 2: F3-P-5-1, 3: P.1.P.1-2, 4:F8-V-3-1, 5: P
10.4.3, 6: P 10.4.3, 7: P.2.V.2-4, 8: P 4.9.2, 9: P 2.5.1, 10: N.2.P.1-1, 11: F30-P-5-1,
12: P.2.V.2-5, 13: V 10.3.7,14: P 8.6.4, 15: V 2.3.1,16:F35-V-3-2,17:F11-P-1-5,18:
P.1.P.1-5: aislados, C+: control positivo, CECT 2715 (F. oxysporum)

3.2. Identificación a nivel de especie

Con el fin de identificar a qué especies corresponden los aislados de Fusarium

spp., se probaron diversos tipos de PCR para la identificación de especie, que
fueron puestas a punto en nuestro laboratorio mediante el empleo de cepas de
referencia de cada especie.

Para facilitar el trabajo se agruparon los aislados de Fusarium spp., en función a

su origen (maíz almacén, maíz campo y maíz experimental), y cepas de referencia.

3.2.1. PCR para F. graminearum

Para su identificación se han seguido varios protocolos y utilizado diferentes

iniciadores como el 217Fg /170Fg, utilizado por Hye-Seon et al, (2003) con la que se
obtiene una banda de 600 pb del gen Tri 5 y Fgr-F/ Fgc-R utilizada por Jurado et al.
(2005) que amplifica una banda de 500 pb de la región IGS (fotografía 5).

Después de utilizar estos iniciadores, el total de aislados identificados como F.

graminearum fueron 14 de maíz almacén y 5 de maíz campo. En maíz experimental
no se detectó esta especie en particular.

110
 Resultados

_____600 pb

M C- 1 5 8 9 11 14 15 16 17 C+ M

_____500 pb

M C- 1 5 8 9 11 13 14 15 16 17 18 C+ M
Fotografía 5. Amplificación de los aislados de F. graminearum con los iniciadores
217Fg/170Fg (A) y Fgr-F/Fgc-R (B), C- = Acremonium, 1, 5, 8, 9,11, 13, 14,
15, 16, 17, 18: aislados, C+: 2150 CECT, M: marcador

3.2.2. PCR para F. verticillioides

La identificación de la especie F. verticillioides se llevó a cabo mediante el

empleo de los iniciadores VER1 y VER2 (Mulé et al., 2004b), que detectan y
amplifican un fragmento específico para dicha especie de 578 pb localizado en el
gen calmodulin (fotografía 6).

Esta PCR se realizó en las 377 aislados, identificándose como F. verticillioides

un total de 167 aislados: 81 aislados en maíz almacén, 16 aislados en maíz campo y
70 aislados en maíz experimental.

Estos resultados confirmaban la identificación macroscópica, ya que los

aislados crecidos en medio PDA, poseían características similares a la cepa de
referencia F. verticillioides CECT 2982, que de acuerdo con la clave taxonómica
(Samson et al., 2004), presentan un reverso rosa pálido-violeta claro.

111
Resultados

578 pb

M C- 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 C+ M

Fotografía 6. Identificación de F. verticillioides mediante PCR. C-: Control -, 1: F23-V-1-1, 2:

V.4.9.3, 3: C.2.P.3.2, 4: P.2.6.4, 5: C.2.V.3-1, 6: N.2.V.4-5, 7:P4.6.1: cepas, C+: F.
verticillioides CECT 2982, M: marcador

3.2.3. PCR para F. culmorum

La identificación de la especie F. culmorum se llevó a cabo mediante el empleo

de los iniciadores Fcu-F y Fgc-R (Jurado et al., 2005), que amplifican un fragmento
específico para dicha especie de 200 pb de la región IGS del ADNr localizado en los
genes 28S y 18S.

Este tipo de PCR se aplicó a 7 aislados que presentaban características

macroscópicas similares a la cepa de referencia F. culmorum CECT 2148 crecida en
medio PDA, que de acuerdo con la clave taxonómica muestra un reverso rojo-
amarillo. Ninguno de estos aislados dio positivo.

3.2.4. PCR para F. oxysporum

Para la identificación de la especie F. oxysporum se emplearon los iniciadores

Clox1 y Clox2 (Mulé et al., 2004a), que reconoce y amplifica un fragmento específico
para dicha especie de 534 pb localizado en la secuencia del gen calmodulin
(fotografía 7).

Este tipo de PCR se aplicó a los 377 aislados seleccionados, identificándose un

total de 9 aislados; 7 de ellos provenientes del maíz experimental y 2 de maíz
almacén. En maíz campo no se detecto esta especie. Los aislados identificados

112
 Resultados

presentaban un aspecto macroscópico similar a la cepa de referencia F. oxysporum

CECT 2715.

C+ M 1 2 3 C-
C+ M 3P.1.P.1-58 43
34 C-

534 pb

Fotografía 7. Identificación de F. oxysporum mediante PCR. C+: F. oxysporum CECT 2715,

aislados: 1: N.2.V.1-5, 2: V 1.8.4, 3:P.1.P.1-5, C- Penicillium sp., M: marcador

3.2.5. PCR múltiple

Con el fin de identificar a qué especies corresponden los 377 aislados de

Fusarium spp., obtenidos, también se realizó una PCR múltiple siguiendo el
protocolo descrito por Demeke et al. (2005), que detecta de forma simultánea las
especies F. graminearum, F. culmorum y F. sporotrichioides, especies importantes
del género Fusarium productoras de micotoxinas: las dos primeras producen con
mayor frecuencia los tricotecenos tipo B y F. sporotrichioides, los tricotecenos de
tipo A (Mateo et al., 2002). Para ello, se emplearon tres pares de iniciadores en la
misma reacción de PCR, Fg16F/Fg16R, para F. graminearum; FC01F/FC01R, para
F. culmorum y AF330109CF/AF330109CR, para F. sporotrichioides, de los cuales
se obtienen bandas de 570, 450, 332 pb respectivamente (fotografía 8).

Con estos iniciadores se identificaron 19 aislados de F. graminearum, que

corresponden a las mismas identificadas con los iniciadores 217Fg /170Fg, y Fgr-F/
Fgc-R.

Mediante esta técnica, no se detectaron las especies F. culmorum ni F.

sporotrichioides.

113
Resultados

570 pb
450 pb
332 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M

Fotografía 8. Identificación de F. graminearum, F. culmorum y F. sporotrichioides

mediante PCR múltiple. aislados: 1: F48-P-5-2, 2: F6-P-4-.1, 3: P4.6.1,
4: F29-P-3-2, 5:F24-V-2-1, 8: P.8.3.1, 9: N.1.P.5-5, 14: N.2.V.1-5. Cepas
de referencia: 6, 7 F. graminearum, 10, 11 F. culmorum, 12, 13, F.
sporotrichioides

4. IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLADOS POR SECUENCIACIÓN

Tras la identificación de los aislados de Fusarium spp., con iniciadores

específicos para cada especie, se procedió a confirmar la utilidad de la técnica PCR
para la identificación de las especies de este género mediante secuenciación
genómica. Se secuenciaron 14 aislados pertenecientes a F. graminearum, 29 a F.
verticillioides y 14 aislados que no amplificaron con los iniciadores que se utilizaron
en este estudio.

Se secuenciaron los nucleótidos de la región transcriptora interna (ITS), que fue

amplificada por PCR utilizando los iniciadores universales ITS1 y ITS4 (White et al.,
1990) (apartado 3.12. de material y métodos). El producto fue visualizado por
electroforesis en gel de agarosa. Se obtuvo un fragmento de ≈570 pb de cada
aislado, como se puede apreciar en la fotografía 9.

1 2 3 4 5 6 B- M

600 pb

Fotografía 9. Productos de amplificación de la región ITS de los aislados de Fusarium spp., 1:

P.9.1.3 V.2.1.1, 2: P.1.P.4-3, 3: F3-P-5-1, 4: P.9.1.3, 5: P 2.9.3 (2), 6: V 5.5.5 (2)

114
 Resultados

Las secuencias completas se ensamblaron manualmente con ayuda de los

programas informáticos CHROMAS y PHYDIT. Una vez obtenidas las secuencias
completas de cada uno de los aislados (Anejo 3), se determinó la identidad a nivel
de especie de cada uno de ellos mediante el programa BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) obtenida a través del NCBI (Nacional Center for
Biotechnology Information, 2008).

Los resultados de la identificación por secuenciación se muestran en las Tablas

19 y 20. Como se observa en la Tabla 19, una de los 14 aislados identificados por
PCR como F. graminearum resultó ser identificada por secuenciación como F.
equiseti. (F30P51). Se confirmó por esta técnica que los aislados F51-V-3-2(A),
V5.5.5(2), V2.3.5(1), V2.3.5(2), P5.4.1, V5.5.5(1), P 5.1.1, pertenecían a la especie
G. zeae, que es el teleomorfo de F. graminearum. Para los aislados V5.1.1(2),
V5.1.1(1), P2.9.4, P2.9.3(2), P5.5.1, P2.9.3(1), utilizando la misma zona de
secuenciación, se obtuvo mediante BLAST el 100 % de homología con dos especies
del complejo Fg, G. zeae y F. asiaticum.

El aislado F30P51 corresponde a la especie de F. equiseti, la cual pertenece a

la sección Gibbosum. Esta es un aislado atípico, ya que se obtuvo amplificación de
su ADN con diferentes iniciadores específicos de especie, incluyendo los de F.
graminearum.

Con las secuencias de nucleótidos de F. graminearum se construyó un árbol

filogenético (Fig. 18) cuya raíz es G. zeae (F. graminearum) del Genbank accesión
Nº. AY188924. En este gráfico, se agrupan todos los aislados de F. graminearum
linaje 7 en un cluster y en un segundo agrupamiento se encuentran los aislados que
pueden corresponder a la especie F. asiaticum, que se encuentra dentro del
“complejo Fusarium graminearum” como linaje 6. Tanto en el grupo uno como el dos
existe una elevada heterogeneidad intra-especie.

En la Tabla 20 se registran los nombres de los 29 aislados de F. verticillioides

identificadas por secuenciación como G. moniliformis (F. verticillioides).

115
Resultados

Tabla 19. Identificación a nivel de especie mediante el análisis de secuencia de la región ITS de
los aislados de F. graminearum.

No. de Especie % de No. de acceso Genbank

aislado homología
(BLAST)
*V 5.1.1 (2) G. zeae/F. asiaticum 100 AB289553.1 /AB289552.1
*V 5.1.1 (1) G. zeae/F. asiaticum 100 DQ459831.1 /DQ459836.1
*P 5.5.1 G. zeae/F. asiaticum 100 DQ459831.1/DQ459836.1
*P 2.9.3 (1) G. zeae/F. asiaticum 100 AB289553.1 / AB289552.1
*P 2.9.4 G. zeae/F. asiaticum 100 AB289553.1 /AB289552.1
*P 2.9.3 (2) G. zeae/F. asiaticum 100 AB289553.1 /AB289552.1
V 5.5.5 (2) G. zeae 100 EF464165.1
V 2.3.5 (1) G. zeae 100 AY188924.1
V 2.3.5 (2) G. zeae 100 AY188924.1
P 5.4.1 G. zeae 100 DQ453701.1
V 5.5.5 (1) G. zeae 100 AB250414.1
P 5.1.1 G. zeae 99 AY188924.1
F51-V-3-2(A) G. zeae 99 EF464165.1
F30P51 F. equiseti 100 AY147367.1

De los 14 aislados que no amplificaron con los iniciadores utilizados, se

confirmó por secuenciación que 10 de ellas pertenecían a la especie F. proliferatum
de la sección Liseola, que forma parte también del complejo fujikuroi, y los cuatro
aislados restantes pertenecían a la especie F. equiseti de la sección Gibbosum
(Tabla 21).

En la Fig. 19 se muestra el árbol generado por los aislados identificados por

secuenciación, como F. proliferatum, F. equiseti y G. moniliformis (F. verticillioides),
donde se ve que el grupo perteneciente a F. proliferatum presenta un bajo grado de
variabilidad intra-especie. Lo mismo sucede con lo encontrado con los aislados de F.
equiseti, mientras que los aislados de G. moniliformis quedan agrupadas a un 100%
de homología (Tabla 20).

116
 Resultados

0.01

P 5.5.1(2)

P 2.9.3 (1)

V 5.1.1 (1)

P 2.9.4

73 V 5.1.1 (2)

66 P 2.9.3 (2)

V 5.5.5 (1)
92
P 5.1.1(1)

70
V 2.3.5 (1)

V 5.5.5 (2)

100
V 2.3.5 (2)

P 5.4.1

G. zeae (NCBI AY188924)

Figura 18. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los diferentes aislados de F.
graminearum, mediante el programa Treecom versión 1.3b., se indica valores de
“bootstrap” ≥65%

117
Resultados

0.01

F89-P-1-2a
83 F. proliferatum (NCBI EF446290)
82 F8-V-3-1
91 N.1.P.5-5
P.1.P.1-2
P.1.P.4-3
C.1.P.5-3
P.2.V.3-2
V.2.8.1
100 V.10.7.4b
93 P.8.3.1
N.2.V.1-5
100
89 F-81-P-1-1
95 F30-P-5-1
F3-P-5-1
F. equiseti (NCBI AY147367)
P.2.V.4-4
N.2.V.4-5
P.1.V.4-3
V.4.9.3
P.2.6.4
N.1.P.3-4
F82.P.1-3
P.1.1.1a
P.5.2.4
P.1.P.1-1
N.1.P.5-4
V.8.3.1
C.2.V.3-1
C.2.P.3.2
P.4.6.1
F23-V-1-1
V.2.1.1
F24-P-1-1
F81-V-3-1
P.9.1.3
F48-P-5-2b
F95-P-3-2
F29-P-3-2
F24-V-2-1
F30-P-2-2b
F44-P-1-6
F6-P-4-1
100
F51-V-3-2b
F56-P-5-1
G. moniliformis (NCBI AY533376)
Figura 19. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los aislados de G.
moniliformis (F. verticillioides), F. equiseti y F. proliferatum, mediante el programa
Treecom versión 1.3b, se indica valores de “bootstrap” ≥70%

118
 Resultados

Tabla 20. Identificación a nivel de especie mediante el análisis de secuencia de la región ITS de
los aislados de F. verticillioides identificados por PCR

No. de aislado Especie % de Homología No. de acceso Genbank

(BLAST)
F48-P-5-2-b G. moniliformis 99 AY533376.1
N.2.V.4-5 G. moniliformis 100 EU151483.1
F6-P-4-1 G. moniliformis 99 AY898260.1
C.2.V.3-1 G. moniliformis 100 EU151483.1
F56-P-5-1 G. moniliformis 99 AY898260.1
P.2.V.4-4 G. moniliformis 99 EU151483.1
F24-P-1-1 G. moniliformis 99 EU314989.1
F29-P-3-2 G. moniliformis 100 EU314989.1
F30-P-2-2-b G. moniliformis 100 EF556217.1
P4.6.1 G. moniliformis 100 EU151483.1
P.9.1.3 G. moniliformis 99 EU151483.1
V.2.1.1 G. moniliformis 100 EU151483.1
F44-P-1-6 G. moniliformis 99 AY898260.1
F81-V-3-1 G. moniliformis 100 AY533376.1
F24-V-2-1 G. moniliformis 100 EU314989.1
C.2.P.3.2 G. moniliformis 99 EU151483.1
P.2.6.4 G. moniliformis 100 EU151483.1
F82-P-1-3 G. moniliformis 100 EU151483.1
V.8.3.1 G. moniliformis 100 EU151483.1
P.5.2.4 G. moniliformis 100 EU151483.1
N.1.P.5-4 G. moniliformis 100 EU151483.1
N.1.P.3-4 G. moniliformis 100 EU151483.1
P.1.P.1-1 G. moniliformis 100 EU151483.1
P.1.V-4-3 G. moniliformis 100 AY533376.1
F95-P-3-2 G. moniliformis 100 AY533376.1
V.4.9.3 G. moniliformis 100 EU151483.1
F51-V-3-2b G. moniliformis 100 EF556217.1
P.1.1.1.a G. moniliformis 99 EU151483.1
F23-V-1-1 G. moniliformis 99 EU314989.1

119
Resultados

Tabla 21. Identificación a nivel de especie mediante el análisis de secuencia de la región ITS de
los 14 aislados de Fusarium spp., no identificadas por PCR

No. de aislado Especie % de Homología No. de acceso Genbank

(BLAST)
F89-P-1-2-a F. proliferatum 99 EF589878.1
F8-V-3-1 F. proliferatum 100 EF446290.1
V.10.7.4b F. proliferatum 100 EU151490.1
C.1.P.5-3 F. proliferatum 100 EU151490.1
V.2.8.1 F. proliferatum 100 EU151490.1
P.1.P.1-2 F. proliferatum 100 EU151490.1
P.8.3.1 F. proliferatum 100 EU151490.1
P.1.P.4-3 F. proliferatum 100 EU151490.1
N.1.P.5-5 F. proliferatum 99 EU151490.1
P.2.V.3-2 F. proliferatum 100 EU151490.1
N.2.V.1-5 F. equiseti 99 EU326202.1
F30-P-5-1 F. equiseti 100 AY147367.1
F3-P-5-1 F. equiseti 100 DQ026008.1
F81-P-1-1 F. equiseti 99 EU326202.1

5. ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DE LONGITUD EN LOS FRAGMENTOS DE

RESTRICCIÓN AMPLIFICADOS POR PCR (PCR-RFLP) DE AISLADOS DE
Fusarium spp., DE GRANOS DE MAÍZ

Se amplificó la región IGS utilizando los iniciadores CNL12 y CNS1 de 96

aislados de Fusarium spp., obtenidas de las diferentes muestras de maíz, siendo el
producto de la PCR de aproximadamente 2.7 kb. Posteriormente, y por separado, se
hizo la digestión de los aislados utilizando los enzimas de restricción Mbol, XhoI,
EcoRI, HinGI, HhaI, AluI, BsuRI, Hind III, HaeIII; según la endonucleasa y el aislado,
puede tener uno o más cortes en la región IGS, excepto las enzimas XhoI, Hind III y
HaeIII, que no cortaban en esta región para los aislados analizados en este trabajo
(F. graminearum, F. equiseti, F. proliferatum, F. verticillioides) (fotografía 10A y 10B).

Los datos de ausencia o presencia de cada una de las bandas resultantes de la

digestión del IGS de cada uno de los aislados, fueron analizadas numéricamente
mediante una matriz de similaridad basada en el coeficiente de Dice y agrupados
según el algoritmo UPGMA para dar lugar a un árbol taxonómico o dendrograma.

120
 Resultados

El análisis de los 96 aislados se realizó en tres grupos: 18 aislados que fueron

identificados por iniciadores específicos y por secuenciación como F. graminearum;
41 que habían sido identificados por PCR como F. verticillioides, 7 de los cuales
están identificados por secuenciación (aislados: C.2.V.3-1, C.2.P3.2, P.2.V4-4,
N.1.P.5-4, V.8.3.1, P.9.1.3, V.4.9.3) y 37 aislados que no amplificaron para ninguno
de los iniciadores utilizados, de los que cinco se identificaron por secuenciación
como F. proliferatum (V.10.7.4b, V. 2.8.1, P.1.P.1-2, P.8.3.1, P.1.P.4-3) y dos como
F. equiseti (N.2.V.1-5 y F81-P.1-1).

Posteriormente se realizó el análisis de los aislados agrupándolos dependiendo

de donde fueron aisladas.

El dendrograma resultante del análisis numérico de los perfiles de los 18

aislados del complejo F. graminearum (Fig. 20) da como resultado dos grupos
principales a un nivel de similitud del 82%: en el primer grupo quedan agrupadas
junto con la cepa de referencia (F. graminearum CECT 2150) los aislados V5.5.5(2),
V2.3.5(1), F66.V.3-2a, V2.3.5(2), P5.4.1 y F66.V.3.2b. En el mismo grupo,
agrupadas entre ellos a un nivel de homología del 100%, se encuentran los aislados
V5.5.5(1), P5.1.1, F51.V.3-2, F89-V-1-1a, F28.V.2.1. En el segundo grupo se
concentran los aislados V5.1.1 (2), V5.1.1 (1), P2.9.4, P2.9.3 (2), P5.5.1 (2) y P2.9.3
(1) con un nivel de similitud del 87%. Tanto en el grupo uno como el dos existe una
elevada heterogeneidad intra-especie.

Los aislados de F. verticillioides, F. proliferatum y F. equiseti fueron analizadas

de igual forma que los del complejo F. graminearum. Los perfiles genómicos
obtenidos por RFLP revelan una importante variación intraespecifica en la región
IGS. Igual que en caso anterior, los enzimas de restricción BsuRI, ALuI, Mbol, son
las que presentan mayor información discriminativa de los aislados en análisis
(fotografías 11A, 11B, 11C).

121
Resultados

M M’ C 1 2 4 5 6 8 9 12 13 14 15 16 17 M’ M
1500

1000

500

M M’ C 1 2 4 5 6 8 9 12 13 14 15 16 17 M’ M
1500

1000

500

Fotografía 10A. Perfiles generados después de la digestión con las enzimas de restricción A:
Alu I, B: Hha I, en la región IGS, en aislados de F. graminearum lineas 1-17 y
C:2150 CECT, M’: DNA marker (50 bp DNA ladder), M: DNA marker (100 bp DNA
ladder)

122
 Resultados

M M’ C 1 2 4 5 6 8 9 12 13 14 15 16 17 M’ M

3000

1000

500

M M’ C 1 2 4 5 6 8 9 12 13 14 15 16 17 M’ M

1500

1000

500

Fotografía 10B. Perfiles generados después de la digestión con las enzimas de restricción C:
EcoRI, D: MboI, en la región IGS, en aislados de F. graminearum lineas 1-17 y
C:2150 CECT, M’: DNA marker (50 bp DNA ladder), M: DNA marker (100 bp DNA
ladder)

123
124

CECT2150
V5.5.5(2)
V2.3.5(1)
F66.V.3-2a
V5.5.5(1)
P5.1.1
I
F51.V.3-2
F89-V-1-1a
F28.V-2-1
V2.3.5(2)
P5.4.1
F66.V.3.2b
V5.1.1(2)
V5.1.1(1)
P2.9.4 II
P2.9.3(2)
P5.5.1
P2.9.3(1)
F30P51

50 54 59 63 68 72 77 82 86 91 95 100
Coefficient

Resultados
Figura 20. Dendrograma de similaridad obtenido por UPGMA, utilizando las enzimas de restricción Mbo l, Xho I, Eco RI, Hin6 I, Hha I, Alu I, Bsu RI,
Hind III, HaeIII, en 18 aislados pertenecientes al complejo F. graminearum y F. graminearum 2150 de CECT.

124
 Resultados

M M` 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 M M`

M M` 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 M M`

Fotografía 11A. Perfiles generados por análisis de restricción de la región IGS de aislados de
F. verticillioides con A: AluI; B: BsuRI

125
Resultados

M M` 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 M M`

C
C

M M` 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 M M`

Fotografía 11B. Perfiles generados por análisis de restricción de la región IGS de aislados de
F. verticillioides con C: MboI; D: EcoRI

126
 Resultados

M M` 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 M M`

Fotografía 11C. Perfil generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de F.
verticillioides con E: HhaI

Se realizó el análisis numérico conjunto de los 78 perfiles obtenidos por RFLPS

para los aislados de este trabajo, junto a tres cepas de referencia de la CECT. El
dendrograma resultante (Fig. 21) revela una elevada heterogeneidad. Observando
los agrupamientos a un nivel de homología del 57%, se detecta la formación de once
grupos. Dentro de los grupos I, II, III, quedan agrupados los 3 aislados identificados
por secuenciación como F. proliferatum, junto con otros 13 aislados. En el grupo IV
se agrupa la cepa de referencia F. verticillioides CECT2892 con 52 aislados
pertenecientes a F. verticillioides, pero con una alta variación intra-especie. En el
grupo V se agrupan dos aislados procedentes de maíz experimental y maíz
almacén; en el grupo VI se encuentra un aislado procedente de maíz experimental.
La cepa de referencia de F. oxysporum queda como única en el grupo VII. El grupo
VIII lo componen cinco aislados, dos de ellos identificados por secuenciación como
F. equiseti. El grupo IX está formado por un aislado identificado como F.
proliferatum. El X grupo lo componen dos aislados procedentes de maíz campo y

127
Resultados

maíz experimental, y en el grupo XI queda la cepa de referencia perteneciente a F.

graminearum.

Para un mejor entendimiento elaboramos el dendrograma resultante del

análisis numérico de los perfiles de digestión de los 41 aislados que se agrupan con
la cepa de referencia F. verticillioides CECT 2982 (Fig. 22), observando una elevada
heterogeneidad intra-especie. A un nivel de similitud del 80% se distinguen ocho
grupos principales: el primero comprende ocho aislados de muestras de maíz
experimental y de maíz campo; el segundo grupo abarca 20 aislados provenientes
de las tres muestras de maíz, y agrupa a un nivel de homología del 100% a aislados
de diferente procedencia. El tercer y cuarto grupo comprenden 2 aislados cada uno,
procedentes de maíz almacén y el quinto grupo lo componen cinco aislados, tres
aislados procedentes de maíz almacén y dos de maíz campo. El sexto y séptimo
grupo están formados por un solo aislado y en el octavo grupo quedan dos aislados
procedentes de maíz almacén.

Cuando se analizaron los aislados de F. verticillioides teniendo en cuenta de

donde fueron aisladas, el dendrograma generado para los aislados procedentes de
maíz almacén permitía diferenciar 5 grupos a un nivel de similitud > 75% (Fig. 23),
sin que se apreciara una clara tendencia del lugar donde fueron aislados, aunque sí
se observaba una gran heterogeneidad dentro de la misma especie. Para los
aislados F. verticillioides procedentes de maíz campo, el dendrograma generado a
un nivel de similitud del 88% revela (Fig. 24) 3 grupos, compuestos por aislados de
muestras de las comunidades de Valencia y Castilla la Mancha. El primer grupo lo
componen aislados de muestras de Castilla la Mancha y dos de ellas tienen un nivel
de homología del 100%; el grupo dos lo componen tres aislados, dos aislados de
muestras de Castilla la Mancha con nivel de similitud del 100% y uno de la
Comunidad Valenciana, el tercer grupo lo compone un aislado procedente de una
muestra de Castilla la Mancha.

128
 N.1.P.5-5
N.1.P.6-4
P.2.V.3-2
C.1.P.5-3 I
P.2.V.1-5
P4.6.1
V.10.7.4.b
P.10.8.4.b
V.2.8.1
P.4.9.2
V.10.8.2. II
V.10.10.3
P.1.P1-2
V.2.6.2
V.2.1.2
P.8.3.1 III
N.1.P.3-4
N.1.P.6-5
C.2.P.5-2
P.5.2.4
F82-P-1-3
N.1.V.5-2
P.1.V.4-3
N.2.V.4-5
N.1.V.6-4
P.1.P.1-1
F88-V-2-1
C.2.V.3-1
C.2.V.5-2
N.2.V.4-2
F89-V-1-3
F81-P-5-1
V.5.8.2
F88-V-5-1
P.2.V.3-1
P.1.V.3-5
C.2.P.3.2
C.1.V.5-2
P.1.P.3-2
N.1.P.1-1 IV
P.2.V.4-4
C.2.V.3-3
P.1.P.3-3
N.2.V.2-1
P.2.V.2-5
N.2.P.3-2
F89-P-1-1
F100-V-1-1
C.2.V.4-2
N.1.P.5-4
F66-V-3-1
P.5.3.2
N.1.V.2-5
V.9.2.1
V.8.3.1
V.4.2.4
P10.8.4a
V.10.3.7
C.2.V.5-1
P.8.6.4
P.9.1.3
N.1.P.6-5
V.2.4.5.
N.1.P.5-5
F94-P-2-2
V.1.3.3.
V.1.9.5.
V.4.9.3.
CECT2982
N.1.P.4-3 V
P.2.6.4
V.2.1.1 VI
CECT2715 VII
F81-V-5-1
N.2.V.1-5 VIII
N.2.P.1-1
C.2.V.3-2
F81-P-1-1
P.1.P.4-3 IX
V.2.9.3 X
P.1.1.1.a
CECT2150 XI

Resultados
21 27 32 38 44 49 55 61 66 72 77 83 89 94 100
Coefficient
129

Figura 21. Dendrograma de similitud de aislados pertenecientes a F. verticillioides, F. proliferatum, F. equiseti y Fusarium sp.,
procedentes de granos de maíz y cepas de referencia CECT2982, CECT2715, CECT2150, en base a sus perfiles génicos de
amplificación
129
Resultados

F88-V-2-1
C.2.V.3-1
C.2.V.5-2
N.2.V.4-2 I
F89-V-1-3
F81-P-5-1
V.5.8.2
F88-V-5-1
P.2.V.3-1
P.1.V.3-5
C.2.P.3.2
C.1.V.5-2
P.1.P.3-2
N.1.P.1-1
P.2.V.4-4
C.2.V.3-3 II
P.1.P.3-3
N.2.V.2-1
P.2.V.2-5
N.2.P.3-2
F89-P-1-1
F100-V-1-1
C.2.V.4-2
N.1.P.5-4
F66-V-3-1
P.5.3.2
N.1.V.2-5
V.9.2.1
V.8.3.1 III

V.4.2.4
P10.8.4a IV
V.10.3.7
C.2.V.5-1
P.8.6.4
V
P.9.1.3
V.2.4.5.
N.1.P.5-5
F94-P-2-2 VI

V.1.3.3. VII

V.1.9.5. VIII
V.4.9.3.
CECT2982
59 64 69 74 80 85 90 95 100
Coefficient
Figura 22. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de F.
verticillioides procedentes de maíz campo, maíz almacén y maíz experimental y
cepa de referencia CECT 2982

130
 Resultados

Con los aislados de F. verticillioides procedentes de maíz experimental se

generó un dendrograma (Fig.25) que a un nivel de similitud del 75% permitía
distinguir cinco grupos, sin que en ninguno de ellos se observara una tendencia clara
en los agrupamientos según la variedad de donde fue aislado. De 36 aislados
analizados con un nivel de homología >52% (Fig. 26) se generan ocho grupos. El
primer grupo recoge los aislamientos N.1.P.3-4, N.1.P.6-5, C.2.P.5-2, P.5.2.4, F82-
P-1-3, N.1.V.5-2, P.1.V.4-3, N.2.V.4-5, N.1.V.6-4, P.1.P.1-1 y N.1.P.5-4; en el
segundo grupo están los aislados N.1.P.4-3 y P.2.6.4, que morfológicamente
presentan características muy similares a F. proliferatum. El tercer grupo está
formado por los aislados C.1.P.5-3, N.1.P.6-4, P.2.V.3-2, P.2.V.1-5, P4.6.1,
V.10.7.4.b, P.10.8.4.b, V.2.8.1, P.4.9.2, V.10.8.2, V.10.10.3, P.1.P1-2, V.2.6.2,
V.2.1.2 y P.8.3.1, cuatro de las cuales (V.10.7.4.b, P.1.P1-2, P.8.3.1, C.1.P.5-3)
están identificados por secuenciación como F. proliferatum. El grupo IV es un aislado
individual, V.2.1.1, el cual tiene una similitud del 45% con la cepa de referencia F.
verticillioides, que queda también como cepa individual en el grupo V. Los aislados
V.2.9.3 y P.1.1.1.a quedan agrupados en el grupo VI; éstas tienen un menor
porcentaje de similitud con los aislados pertenecientes a F. proliferatum. En el grupo
VII se agrupan los aislados F81-V-5-1, N.2.V.1-5, N.2.P.1-1, C.2.V.3-2, y F81-P-1-1,
dos de la cuales (F81-P-1-1, N.2.V.1-5) se identificaron como F. equiseti.

6. IDENTIFICACIÓN DE AISLADOS DE Fusarium spp., PRODUCTORES DE

TRICOTECENOS

Una vez identificadas por PCR los aislados como pertenecientes al género
Fusarium, se llevó a cabo la detección de aislados productores de tricotecenos,
empleando los iniciadores Tox5-1 y Tox5-2 (Bakan et al., 2002), que detectan y
amplifican un fragmento de 650 pb localizado en el gen tri5. Para demostrar la
eficacia de este tipo de PCR, se probaron las cepas de referencia F. graminearum y
F. culmorum, las cuales son productoras de tricotecenos, obteniendo la banda
correspondiente. De los 377 aislados seleccionados, se identificaron 26 productores
de tricotecenos, como se observa en la fotografia12.

131
Resultados

P.2.V.3-1

V.5.8.2
I
P10.8.4a

V.10.3.7

P.5.3.2

V.9.2.1 II

V.8.3.1

V.4.2.4

P.8.6.4
III
P.9.1.3

V.2.4.5.

V.1.3.3. IV

V.1.9.5.
V
V.4.9.3.

CECT2982

55 57 60 62 64 67 69 71 74 76 79 81 83 86 88 90 93 95 98 100
Coefficient

Figura 23. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de F.
verticillioides provenientes de maíz almacén y cepa de referencia CECT 2982

F88-V-2-1

F89-V-1-3
I

F81-P-5-1

F88-V-5-1

F89-P-1-1

II
F100-V-1-1

F66-V-3-1

F94-P-2-2 III

CECT2982

59 63 68 73 77 82 86 91 95 100
Coefficient

Figura 24. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de
F. verticillioides provenientes de maíz campo y cepa de referencia CECT 2982

132
 Resultados

N.1.P.3-4
I
N.1.P.6-5
C.2.V.3-1
C.2.V.5-2
II
P.2.V.3-1
N.2.V.4-2
P.1.P.3-2
N.1.P.1-1
P.2.V.4-4
C.2.V.3-3
P.1.P.3-3
N.2.V.2-1
P.2.V.2-5 III

N.2.P.3-2
C.2.V.4-2
N.1.P.5-4
P.1.V.3-5
C.2.P.3.2
C.1.V.5-2
N.1.V.2-5
CECT2982
C.2.V.5-1
IV
N.1.P.5-5
P.2.V.1-5 V

44.45 58.33 72.22 86.11 100.00

Coefficient
Figura 25. Dendrograma generado por análisis de restricción de la región IGS de aislados de F.
verticillioides provenientes de maíz experimental y cepa de referencia CECT 2982

133
Resultados

N.1.P.3-4
N.1.P.6-5
C.2.P.5-2
P.5.2.4
F82-P-1-3
N.1.V.5-2 I
P.1.V.4-3
N.2.V.4-5
N.1.V.6-4
P.1.P.1-1
N.1.P.5-4
N.1.P.4-3 II
P.2.6.4
C.1.P.5-3
N.1.P.6-4
P.2.V.3-2
P.2.V.1-5
P4.6.1
V.10.7.4.b
P.10.8.4.b
V.2.8.1 III
P.4.9.2
V.10.8.2.
V.10.10.3
P.1.P1-2
V.2.6.2
V.2.1.2
P.8.3.1
V.2.1.1 IV
CECT2982 V
V.2.9.3 VI
P.1.1.1.a
F81-V-5-1
N.2.V.1-5 VII
N.2.P.1-1
C.2.V.3-2
F81-P-1-1
P.1.P.4-3 VIII

22 27 32 37 43 48 53 58 63 69 74 79 84 90 95 100
Coefficient
Figura 26. Dendrograma generado con 36 aislados de Fusarium spp., provenientes de maíz,
por análisis de restricción de la región IGS y cepa de referencia CECT 2982

134
 Resultados

M C- 1 2 3 4 5 6 7

650 pb

Fotografía 12. Identificación de aislados productores de tricotecenos mediante PCR. 1: P 5.4.1,

2: P 5.1.1, 3: F81-P-1-1, 4: F93-V-3-1, 5: V 2.10.3, 6: F30-P-5-1, 7: F89-V-1-3, C-:
Blanco, M: marcador, C+: F. graminearum CECT 2150

La PCR realizada con los iniciadores ToxP1 y ToxP2 se utiliza para identificar
los dos quimiotipos de F. graminearum se distingue el quimiotipo DON productoras
de DON y quimiotipo NIV productoras de NIV, se diferencia en el tamaño del
fragmento obtenido. Nuestros aislados resultaron positivos todas con un fragmento
de 300 pb que identifica al quimiotipo DON.

7. COMPROBACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE Deoxinivalenol, 3-

Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-Acetildeoxinivalenol Y Nivalenol EN
AISLADOS DEL COMPLEJO F. graminearum POR CROMATOGRAFÍA DE
GASES CON DETECTOR DE MASAS

Los parámetros analíticos del método utilizado fueron puestos a punto en el

laboratorio de Microbiología de la Universidad Politécnica de Valencia. Para
determinar la producción de deoxinivalenol, 3-acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-
acetildeoxinivalenol y nivalenol en los medios de cultivo PDA, Czapeck y YES, el
proceso a seguir fué el de extracción, purificación y detección de micotoxinas
descrito en el apartado 5 de material y métodos.

Se utilizó como limites de cuantificación estimados 20.6 g/kg para

deoxinivalenol, 23.6 g/kg para 3-acetildeoxinivalenol, 15.2 g/kg para fusarenon X,
21.4 g/kg para 15-acetildeoxinivalenol y 19.4 g/kg para nivalenol. Para ello se
realizaron los ensayos de fortificación y recuperación ya descritos.

135
Resultados

Para conocer la exactitud del método experimental, el estudio se realizó sobre

los porcentajes de recuperación de micotoxina, mientras que la precisión se analizó
mediante los valores de las desviaciones estándar relativas. Los resultados de la
exactitud y precisión para los diferentes medios de cultivo del método se muestran
en la Tabla 22.

Tabla 22. Exactitud y precisión del método para las diferentes micotoxinas evaluadas
Recuperación ± RSD (%)a,b
Nivel de PDA CZAPECK YES
fortificación
(mg/kg)
DON 1 89.67 ± 6.57 82.28 ± 0.77 100.24 ± 3.94
3-AcDON 1 98.27 ± 6.30 90.13 ± 16.89 84.64 ± 2.74
15-AcDON 1 100.41 ± 4.00 100.53 ± 16.78 96.09 ± 6.08
FUS X 1 79.44 ± 5.97 79.77 ± 16.81 88.72 ± 9.44
NIVALENOL 1 83.39 ± 0.40 82.30 ± 7.93 87.20 ± 6.73
a
:Cuantificación por patrón interno: DON: deoxinivalenol; 3-AcDON: 3 acetil deoxinivalenol; 15-AcDON: 15
acetildeoxinivalenol; FX: fusarenon X
b
:desviación estándar relativa
Nivel de fortificación de las muestras 1 mg de toxina por kg de agar
Número de repeticiones = 3

Los porcentajes de recuperación para las cinco micotoxinas fue elevada

llegándose a obtener porcentajes máximos de 100.24% para deoxinivalenol en
medio de cultivo YES y 89.67% en PDA, 100.41% para 15-AcDON en PDA, la más
baja recuperación se presento para fusarenon X con 79.44% dicho porcentaje se
considera un porcentaje satisfactorio.

7.1. Presencia de Deoxinivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol, Fusarenon X, 15-

Acetildeoxinivalenol y Nivalenol, en los medios de cultivo PDA, Czapeck y
YES

Se analizaron un total de 15 aislados pertenecientes al complejo F.

graminearum, y una cepa control (CECT 2150), en los tres medios de cultivo. Todas
las muestras en estudio, excepto tres (P 5.9.1, P 2.9.2 y V 10.7.4 a) resultaron
positivas, produciendo alguna micotoxina en las diferentes condiciones. Por PCR en
todas ellas se analizó la existencia de los genes implicados en la producción de
tricotecenos: el fragmento localizado en el gen tri5, que codifica para la producción

136
 Resultados

de tricotecenos, y los genes tri5 y tri6 implicados en la síntesis de los tricotecenos

DON y NIV. La PCR que detecta la secuencia del gen tri5 resultó positiva en todas
los aislados analizados de F. graminearum. La PCR realizada con los iniciadores
ToxP1 y ToxP2 sobre los aislados analizados de F. graminearum resultó también
positiva para todas ellas, amplificando un fragmento de 300 pb que identifica al
quimiotipo DON.

Los estudios cromatográficos mostraron la producción de dos tricotecenos,

DON y 15-AcDON, en los doce aislados positivos y 6 de ellas produjeron también 3-
AcDON en cantidad cuantificable (Tabla 23).

Se empleó el método desarrollado en nuestro laboratorio para investigar la

producción de tricotecenos a partir de los aislados de F. graminearum encontrados
en este trabajo. Con este fin se sembraron los aislados en tres medios de cultivo
(PDA, Czapeck, YES) y se analizaron a los 7, 14 y 21 días de incubación a 20 ºC. Se
obtuvieron resultados muy dispares, dependiendo del medio de cultivo y del tiempo
de incubación. En las Tablas 24, 25 y 26 se muestran las concentraciones
detectadas expresadas en ppb (µg/kg) de micotoxina en medio de cultivo crecido.

Tabla 23. Detección de genes implicados en la producción de tricotecenos y DON y NIV.

Resumen de las cuatro micotoxinas producidas por aislados del complejo F.
graminearum provenientes de maíz, en los distintos medios de cultivo y distintos
tiempos de incubación
PCR Micotoxinas detectadas
Iniciadores
Aislados 217/170 Toxi5-1/ ToxP1/ToxP2 DON 3- 15- FX NIV
Tox5-2 DON y NIV AcDON AcDON
P 5.5.1 + + DON + - + - -
V 5.5.5 (2) + + DON + - + - -
V 2.3.5 (1) + + DON + + + - -
V 2.3.5 (2) + + DON + + + - -
P 5.4.1 + + DON + + + - -
V 5.5.5 (1) + + DON + - + - -
V 5.1.1 (1) + + DON + - + - -
V 5.1.1(2) + + DON + + + - -
P 2.9.3 (1) + + DON + + + - -
P 2.9.4 + + DON + - + - -
P 2.9.3 (2) + + DON + - + - -
P 5.1.1 + + DON + + + - -
Referencia + + + - + - -
DON
CECT 2150

137
Resultados

En el medio de cultivo PDA a los 7 días de incubación sólo hay tres muestras
positivas, la V2.3.5 (1) en la que se detectó una cantidad no cuantificable de 15-
AcDON, la muestra P 5.4.1., en la que se detectaron pequeñas cantidades de DON
y 15-AcDON y la muestra P 5.1.1., en la que se encontró una pequeña cantidad de
DON.

A los 15 días de incubación se detectó la producción de tricotecenos en 11

aislados y en la cepa de referencia CECT 2150. En 7 aislados se detectaron las
toxinas DON y 15-AcDON, en un aislado (V 5.1.1.(1)) se detectó una pequeña
cantidad de 15-AcDON, en la cepa de referencia sólo se detectó DON y en tres
aislados V 2.3.5.(1), V 2.3.5.(2) y P 5.1.1., se encontraron los tres tricotecenos DON,
3-AcDON y 15-AcDON, aunque 3-AcDON se detectó en una cantidad muy inferior a
los otros dos tricotecenos.

A los 21 días, se encontraron 10 aislados positivos además de la cepa de

referencia CECT 2150. En este caso son 7 los aislados en las que se detectaron las
tres micotoxinas, DON, 15-AcDON y 3-AcDON; en un aislado (P 5.4.1) se detectó
DON y 3-AcDON, en otro (P 2.9.4), DON y 15-AcDON y en el aislado V 5.5.5. (1)
una cantidad no cuantificable de DON. En la cepa de referencia sólo se encontraron
pequeñas cantidades de DON y 15-AcDON.

En el medio YES, sólo 5 aislados produjeron tricotecenos en alguna condición;

a los 7 días en el aislado P 5.1.1 se detectó 15-AcDON, a los 15 días en 2 aislados,
V.5.5.1.(1) y P.2.9.3.(1), se encontró DON y a los 21 días se detectó DON en 4
aislados P 5.5.1, P 5.4.1., V.5.5.1.(1) y P 5.1.1, los 2 de últimos también producían
15-AcDON. Con este tiempo de incubación la cepa de referencia produjo una
pequeña cantidad de 15-AcDON.

En el medio Czapeck a los 7 días de incubación se encontraron 4 aislados

positivos para DON, V 5.1.1.(1), P 5.5.1, P 2.9.3(1) y P 5.1.1, siendo uno de ellos, P
5.5.1, positivo para 15-AcDON, pero en cantidades muy pequeñas. A los 15 días se
detectaron 3 aislados positivos para DON, uno de las cuales también producía 15-
AcDON, P 5.1.1, y un aislado positivo para 15-AcDON, V. 5.5.5.(2). Con 21 días de
incubación se encontraron 8 aislados positivos para DON, de las cuales en 3, V 5

138
 Resultados

1.1.1 (1), P 5.5.1. y P 2.9.3.(1) también se detectó 15-AcDON y en dos, V 5.5.5(2) y

P 5.1.1. 15-AcDON y 3-AcDON detectado pero no cuantificable. En este medio de
cultivo las cantidades de tricotecenos cuantificadas son muy pequeñas y la cepa de
referencia no produce ningún tricoteceno.

El intervalo de concentraciones de deoxinivalenol en el medio PDA estuvo entre

25.83 y 3033.04 µg/kg; 3-AcDON entre 20.55 µg/kg y 153.62 µg/kg; y 15-AcDON
37.10 y 3634 µg/kg. La mayor concentración detectada de deoxinivalenol se
encontró en el medio de cultivo PDA con el aislado V 2.3.5 (2) a los 14 días de
cultivo y la menor con el aislado P 5.1.1 a los siete días de cultivo. Para 15-AcDON,
el aislado V 5.1.1 (2) alcanzó la más alta concentración de esta micotoxina a los 21
días de cultivo, mientras que la mayor concentración de 3-AcDON se detectó en el
aislado V 2.3.5. (1) a los 21 días de incubación. Cabe destacar que el medio de
cultivo donde se obtuvo mayor producción y en cantidades más elevadas de
micotoxinas fue PDA a los 21 días de cultivo.

En el medio YES las cantidades de DON oscilaron entre 271.04 y 64.52 µg/kg y
las de 15-AcDON entre 620.37 y 24.62 µg/kg, no detectándose en ninguna muestra
la producción de 3-AcDON.

En el medio Czapeck las concentraciones de los diferentes tricotecenos

varíaron entre 24.34 µg/kg y 234.31 µg/kg para DON; 37.81 µg/kg y 124.08 µg/kg
para 15-AcDON y dos muestras de cantidades no cuantificables para 3-AcDON.

139
 Resultados
140

Tabla 24. Micotoxinas detectadas (µg/kg) por CG-MS a partir de medio de cultivo PDA crecido con aislados de F. graminearum
incubadas durante 7, 15 y 21 días a 20 ºC

PDA
(T+7) ppb (T+15)ppb (T+21)ppb
DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV
V 5.1.1 (2) 1P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 170.1 n.d. n.d. 309.28 n.d. 2908.30 35.39 n.d. 3634.00 n.d.
F30PS1 2P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.9.1 (2) 3P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.1.1. (1) 4P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 41.57 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.5.1 5P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 244.92 n.d. n.d. 249.91 n.d. 530.24 n.c. n.d. 66.19 n.d.
P 2.9.3 (1) 6P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 56.78 n.d. n.d. 168.08 n.d. 1091.15 n.c. n.d. 285.83 n.d.
P 2.9.2 7P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.5.5. (2) 8P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 198.44 n.d. n.d. 72.18 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.4 9P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 404.32 n.d. n.d. 94.31 n.d. 209.9 n.d. n.d. 37.05 n.d.
V 10.7.4 a (1) 10P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.3 (2) 12P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2374.8 121.23 n.d. 95.46 n.d.
V 2.3.5 (1) 13P n.d. n.d. n.d. n.c. n.d. 1727.80 20.55 n.d. 1709.23 n.d. 1565.6 153.62 n.d. 170.01 n.d.
V 2.3.5 (2) 14P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3033.04 29.54 n.d. 1619.89 n.d. 702.01 n.c. n.d. 132.34 n.d.
P 5.4.1 15P 39.59 n.d. n.d. 37.10 n.d. 105.23 n.d. n.d. 62.52 n.d. 324.98 22.89 n.d. n.d. n.d.
V 5.5.5 (1) 16P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.c. n.d. n.d. 56.54 n.d. n.c. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.1.1 17P 25.83 n.d. n.d. n.d. n.d. 156.27 n.c. n.d. 504.55 n.d. 1379.3 99.41 n.d. 125.49 n.d.
Ref. 2150 R1P n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 68.31 n.d. n.d. n.d. n.d. 30.80 n.d. n.d. n.c. n.d.
n.c.: detectado no cuantificable
n.d.: no detectado
 Tabla 25. Micotoxinas detectadas (µg/kg) por CG-MS a partir de medio de cultivo YES crecido con aislados de F. graminearum
incubadas durante 7, 15 y 21 días a 20 ºC

YES
(T+7) ppb (T+15)ppb (T+21)ppb
DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV
V 5.1.1 (2) 1Y n.d.. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
F30PS1 2Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.9.1 (2) 3Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.1.1. (1) 4Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 64.52 n.d. n.d. n.d. n.d. 271.04 n.d. n.d. 83.22 n.d.
P 5.5.1 5Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 77.78 n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.3 (1) 6Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 154.49 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.2 7Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.5.5. (2) 8Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.4 9Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 10.7.4 a (1) 10Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.3 (2) 12Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 2.3.5 (1) 13Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 2.3.5 (2) 14Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.4.1 15Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 61.87 n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.5.5 (1) 16Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.1.1 17Y n.d. n.d. n.d. 620.37 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 72.16 n.d. n.d. 24.62 n.d.
Ref. 2150 R1Y n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 27.12 n.d.
n.d.: no detectado

Resultados
141
 Resultados
Tabla 26. Micotoxinas detectadas (µg/kg) por CG-MS a partir de medio de cultivo CZAPEK crecido con aislados de
142

F. graminearum incubadas durante 7, 15 y 21 días a 20 ºC

CZAPEK
(T+7) ppb (T+15)ppb (T+21)ppb
DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV DON 3-AcDON FX 15-AcDON NIV
V 5.1.1 (2) 1C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
F30PS1 2C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.9.1 (2) 3C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.1.1. (1) 4C 128.54 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 68.17 n.d. n.d. 112.72 n.d.
P 5.5.1 5C n.c. n.d. n.d. 78.1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 113.22 n.d. n.d. 37.81 n.d.
P 2.9.3 (1) 6C 108.43 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 88.96 n.d. n.d. 44.51 n.d.
P 2.9.2 7C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.5.5. (2) 8C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 46.51 n.d. 23.73 n.c. n.d. 124.08 n.d.
P 2.9.4 9C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 10.7.4 a (1) 10C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
P 2.9.3 (2) 12C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 113.52 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 2.3.5 (1) 13C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 64.70 n.d. n.d. n.d. n.d.
V 2.3.5 (2) 14C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 43.26 n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.4.1 15C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
V 5.5.5 (1) 16C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.c. n.d. n.d. n.d. n.d. 55.01 n.d. n.d. n.d. n.d.
P 5.1.1 17C 24.34 n.d. n.d. n.d. n.d. 116.38 n.d. n.d. n.c. n.d. 234.31 n.c. n.d. 75.37 n.d.
Ref. 2150 R1C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
n.c.: detectado no cuantificable
n.d.: no detectado
 Resultados

En la Fig. 27 observamos un cromatograma de iones totales de los patrones de

DON, 3-AcDON, FUS X, 15-AcDON y NIV a una concentración de 4 ppm. Con el
método optimizado en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Politécnica
de Valencia se consiguió la separación clara de las cinco micotoxinas.

Figura 27. Cromatograma de iones totales de patrón 4 ppm

NEO: neosolaniol (patrón interno); DON: deoxinivalenol; 3-AcDON: 3-acetildeoxinivalenol;
FX: fusarenon X; 15-AcDON: 15-acetildeoxinivalenol; NIV: nivalenol

En la Fig. 28 se observa el cromatograma de iones totales del aislado P2.9.3(2)

en medio de cultivo PDA en el que se destaca un pico correspondiente a
deoxinivalenol, a un determinado tiempo de retención. El espectro de iones de DON
al mismo tiempo de retención (Fig. 29) nos proporciona la abundancia del ión
cuantitativo (235), y la de los iones cualitativos (259, 295)

En las Fig. 30 y 31 se presentan los cromatogramas de iones totales del aislado

V.5.1.1(1) en medio de cultivo Czapeck a los 21 días, en los que se detecta los picos
correspondientes a DON y 15-AcDON.

143
Resultados

Figura 28. Cromatograma de iones totales de la muestra P2.9.3 (2) en medio de cultivo PDA

Figura 29. Cromatograma de iones cuantitativo y cualitativo de DON (parte superior) y espectro
de iones al tiempo de retención de DON (parte inferior) en la muestra P2.9.3(2) en
PDA a los 21 días

144
 Resultados

Figura 30. Cromatograma de iones totales del aislado V.5.1.1(1)

Neo: neosolaniol (patrón interno); DON: deoxinivlenol; 15-AcDON

Figura 31. Cromatograma de iones cuantitativo y cualitativo de 15-AcDON (parte superior) y

espectro de iones al tiempo de retención 15-AcDON (parte inferior del aislado
V.5.1.1(1)

De las 15 muestras analizadas, 12 son positivas de esas el 100% son

productoras de DON y 15-AcDON. Como se dijo anteriormente algunos aislados
producen una a varias micotoxinas a la vez.

145
V. DISCUSIÓN
 Discusión

V. DISCUSIÓN

La inocuidad de los alimentos utilizados por el hombre es un tema cada vez

más importante a nivel mundial. Es por ello que la comunidad científica dedicada a la
seguridad alimentaria, ha hecho grandes esfuerzos en la investigación de
contaminantes que pueden estar presentes en todo tipo de alimentos.

Este trabajo se ha dirigido hacia el estudio de los hongos del género Fusarium
que colonizan granos del maíz. Estos hongos, bajo ciertas condiciones, son capaces
de producir metabolitos secundarios en los medios de cultivo o sustrato donde
crecen, que pueden ser tóxicos para la salud humana y animal (micotoxinas).

En el presente estudio se ha analizado, en primer lugar, la contaminación

fúngica de diversos tipos de maíz que pueden alcanzar al consumidor. Los hongos
del género Fusarium detectados han sido identificados y caracterizados mediante
métodos fenotípicos y genotípicos, con el fin de obtener información taxonómica y
epidemiológica, y su capacidad para producir las micotoxinas tricotecenos se ha
valorado mediante análisis químicos, y mediante la detección de los genes que
codifican para su producción.

En general las muestras de maíz almacén presentan un alto porcentaje de

contaminación por hongos del género Fusarium ya que de los 1000 granos
analizados se aislaron 342 hongos pertenecientes al género Fusarium lo que
corresponde al 72% de la contaminación fúngica. Es de destacar que las especies
de este género están consideradas como uno del los mayores contaminantes de
cereales en países como España, Italia, Francia, Brasil, Argentina, China y África,
entre otros, y hay que considerar que este cereal es un componente primordial de
piensos para animales de granja, y pueden causar micotoxicosis secundaria en
humanos a través de la cadena alimenticia (Torondel, 2001; Bennett and Klich, 2003;
Jurjevic et al., 2005; Cvetnic et al., 2004; Qu et al., 2008;).

En el maíz campo se encontró que la contaminación por algún tipo de hongo es

del 38.96%, de los granos estudiados, porcentaje considerable teniendo en cuenta
que los granos proceden de mazorcas destinadas al consumo humano y que han

149
Discusión

sido cultivadas empleando técnicas agrícolas apropiadas para reducir y evitar el

ataque fúngico.

Básicamente la micobiota en estas muestras pertenece a los géneros

Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Cladosporium, Geotrichum y Fusarium,
siendo los géneros esperados ya que pertenecen a los llamados hongos de campo
(Torondel, 2001).

La distribución de la micobiota dentro de las comunidades fue variable, pero se

encontraron en común los géneros, Penicillium, Aspergillus y Fusarium como los
géneros con mayor incidencia. Se pudo observar algunas diferencias en lo que
respecta a la distribución geográfica de la contaminación fúngica: en las
comunidades de Castilla la Mancha y la Comunidad Valenciana predominan las
especies del género Penicillium, coincidiendo con los resultados obtenidos por
Cantalejo en 1995, mientras que en Extremadura predomina el género Aspergillus
no detectándose Penicillium. En el caso de las comunidades de Madrid y Murcia,
predominan las especies de Alternaria y Fusarium, respectivamente. En vista de los
resultados obtenidos en este trabajo, queda clara la incidencia del género Fusarium
en los granos de maíz campo, ya que de las 100 muestras estudiadas se han
hallado en 64 de ellas, en un total de 228 aislados, identificadas tanto macroscópica
como microscópicamente.

Con respecto a los valores medios de los aislados obtenidos del género
Fusarium, en todas las comunidades autónomas evaluadas se obtuvieron valores
similares, sin diferencias significativas excepto para los valores observados entre
Madrid y Murcia. Por tanto, los niveles de contaminación por el género Fusarium no
parecen estar influenciados por la zona geográfica estudiada.

La micobiota del maíz experimental lo componen básicamente los géneros

Aspergillus, Fusarium, Penicillium, y hongos del orden mucorales. El promedio de
contaminación de los granos corresponde al 93%, siendo el género Fusarium el
grupo con mayor incidencia en dos de las tres variedades (Cridor y Net). Si se
analizan el número de hongos totales, observamos que en la variedad Panamá se
han aislado el mayor número de hongos del género Aspergillus y el menor número

150
 Discusión

de aislados de Fusarium spp.; en la variedad Cridor encontramos mayor porcentaje

de Fusarium spp., y un porcentaje similar de Aspergillus spp., y Penicillium spp., y en
la variedad Net el mayor número de aislados de Fusarium spp., y el menor
crecimiento de Aspergillus spp.

Estadísticamente no existen diferencias significativas entre los valores medios

de Fusarium spp., obtenidos para cada variedad. Esto parece indicar que, al igual
que en el caso anterior, la contaminación por Fusarium spp., es general, y no
depende de variedades de maíz o de la zona de España donde se cultive. Después
de una revisión bibliográfica no hemos encontrado datos actuales comparativos
sobre la incidencia del género Fusarium en los cultivos de maíz de distintas zonas
de España.

Si comparamos los resultados obtenidos en los tres estudios realizados con

maíz, podemos concluir que el maíz donde obtenemos el mayor porcentaje de
aislados de Fusarium respecto a otros hongos es el maíz almacén, donde se
conforma como el género predominante con un porcentaje del 72 %. En los análisis
realizados al maíz campo el porcentaje fue del 22 % y en maíz experimental en
parcela de la Universidad Politécnica el 47%.

También cabe destacar que el porcentaje de granos contaminados en el maíz

experimental que no ha sido tratado con ningún producto funguicida, es
aproximadamente del 100%, mientras que en el maíz almacén es del 43% y en el
maíz de campo, corresponde al 38%.

Nuestros resultados coinciden con estudios realizados en otros países: Cvetnic

et al. (2005) en Croacia, encuentran que los hongos que más frecuentemente se
aíslan de maíz pertenecen a especies del género Fusarium, con un 85% de
incidencia en el año 2003. Otros géneros identificados por estos autores fueron
Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Absidia, presentes con
frecuencias de 3.6 a 12.5%. En México uno de los principales contaminantes
también es Fusarium spp., junto con A. flavus (Sánchez-Rangel et al., 2005).

151
Discusión

En los diferentes estudios sobre la presencia de micotoxinas en productos

agroalimentarios, los que se encuentran con mayor frecuencia son los producidos
por especies de los géneros Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Claviceps y en
menor medida la producida por hongos del género Alternaria y Acremonium
(Diekman and Green, 1992; Lugauskas, 2005). Todos estos géneros, excepto
Claviceps, fueron encontrados en las muestras analizadas.

En resumen, el total de aislados de Fusarium spp., obtenidas de las 206

diferentes muestras analizadas (maíz almacén, maíz campo y maíz experimental)
fue de 1198. Estos resultados corroboran lo encontrado en diferentes estudios a
nivel mundial, que destacan al género Fusarium como uno de los principales
patógenos del maíz (Munkvold and Desjardins, 1997; Mazzani et al., 2000;
Desjardins, 2006; Desjardins et al., 2008).

Respecto a los medios de cultivo seleccionados, tanto PDA-CL como AVM son
adecuados para aislar este tipo hongo de maíz. En el primero de ellos, por tratarse
de un medio con un alto contenido de carbohidratos en el cual pueden desarrollarse
la mayoría de hongos, se aislaron un gran número de géneros de hongos
filamentosos. El segundo medio de cultivo mostró mayor selectividad de crecimiento
para hongos del género Fusarium, al mismo tiempo que disminuyó la colonización
por otros hongos.

El valor medio de los aislados de Fusarium spp., en el medio AVM en los tres
tipos de maíz es mayor que los aislados en PDA-CL. Esto indica que el medio Verde
Malaquita es más adecuado para el aislamiento de hongos pertenecientes al género
Fusarium, datos que coinciden con los estudios realizados por Castella et al. (1997),
quienes evaluaron diferentes medios de cultivos para el aislamiento de hongos del
género Fusarium, llegando a la conclusión que el medio AVM inhibía el crecimiento
de otros géneros, favoreciendo el desarrollo del género Fusarium.

La identificación de especies pertenecientes al género Fusarium, tanto

macroscópica como microscópicamente, empleando claves taxonómicas, es
dificultosa, debido fundamentalmente a su alta plasticidad fenotípica, lo que
determina que su taxonomía esté en continua revisión (Knutsen et al., 2004). En

152
 Discusión

este contexto, las técnicas moleculares basadas en el análisis de secuencias de

ADN resultan ser rápidas y seguras para la detección e identificación. Además, la
amplificación de secuencias específicas mediante PCR es potencialmente más
eficaz que cualquier otra técnica microbiológica, no requiriendo la presencia de
organismos viables para que se realice con éxito, ni siquiera cuando los volúmenes
de la muestra son pequeños (Abd-Elsalam et al., 2003). El único inconveniente de
estas técnicas radica en la obtención de iniciadores específicos, así como en el
desarrollo de condiciones experimentales apropiadas para el proceso de
amplificación (Desjardins, 2006).

En este trabajo, se ha confirmado que la técnica de la PCR, es una herramienta

adecuada para la identificación de hongos pertenecientes al género Fusarium. En
nuestro caso, para la identificación de especies pertenecientes al género Fusarium,
se han empleado iniciadores que reconocen diversas secuencias de los genes que
codifican para el ADN ribosomal, incluyendo las regiones IGS, ITS de los genes
5.8S, 28S y 18S, así como para otras secuencias pertenecientes a los genes que
codifican para producción de la proteína calmodulina y los genes tri5 y tri6.

Con los iniciadores ITS-Fu-f y ITS-Fu-r utilizados por Abd- Elsalam, et al. (2003)
para la identificación del género Fusarium se obtuvieron buenos resultados en este
estudio: los 377 aislados identificados morfológicamente como pertenecientes a
Fusarium spp., presentaron el fragmento amplificado esperado, de 389 pb. Lo
contrario sucedió con los aislados de los géneros Penicillium, Aspergillus y
Acremonium, que se utilizaron en este trabajo como control negativo, lo que
demuestra la selectividad del método en la identificación del género Fusarium.

En lo referente a la identificación de especies del género Fusarium, cada vez

son más los estudios basados en el análisis de los ácidos nucleicos cuyo objetivo es
la obtención de nuevos iniciadores específicos para F. graminearum, F. culmorum, F.
oxysporum y F. verticillioides, por ser especies de un amplio interés como patógenos
de cultivos y productores de micotoxinas.

153
Discusión

Para la identificación de F. graminearum, los iniciadores 217Fg/170Fg,

utilizados por Hye-Seon et al. (2003), Fgr-F/Fgc-R (Jurado et al., 2005) y
FC01F/FC01R (Demeke et al., 2005) cumplen las expectativas en la identificación de
esta especie. Cabe anotar que, a pesar de que F. graminearum y F. verticillioides
son las especies que con más frecuencia son aisladas de maíz y están ampliamente
extendidas en los países mediterráneos (Cvetnic et al., 2005), la incidencia de F.
graminearum fue baja en las muestras analizadas, encontrándose un total de 19
aislados, catorce de ellas en maíz almacén y cinco en maíz campo.

F. graminearum producen principalmente las toxinas DON, ZEA, NIV, FUS, 3-

AcDON, Butenolida, 15-AcDON, y 4- acetilnivalenol. F. asiaticum, especie
relacionada estrechamente con F. graminearum, produce también todas las
anteriores, pero especialmente 3-acetildeoxinivalenol (3-AcDON) (Wolf-Hall et al.,
1999; Zhang et al., 2007). En humanos estas toxinas pueden causar diversas
patologías a nivel celular (Trenholm et al., 1989; Anadón et al., 2005).

Para F. verticillioides con los iniciadores VER1 y VER2 utilizados por Mulè et al.,
(2004b), se detectaron un total de 167 aislados (81 aislados de maíz almacén, 16
aislados de maíz campo y 70 aislados de maíz experimental), lo que corresponde a
un 44 % de los 377 aislados de Fusarium seleccionados. Ésta es la especie que se
ha encontrado con mayor frecuencia en las muestras analizadas. Moya et al.,
(2003), determinan por análisis morfológico que el principal contaminante de los
granos en maíz dulce en Chile era la especie F. verticillioides, resultado que
concuerda con los obtenidos por otros autores en otras variedades de maíz (Marín et
al., 1999; Sanchis et al., 2000).

F. verticillioides, junto con F. proliferatum, son los principales productores de

fumonisinas. La presencia de esta toxina en maíz ha sido relacionada en numerosos
estudios epidemiológicos con un aumento en la probabilidad de aparición de cáncer
del aparato digestivo y de hígado (Marasas et al., 2001; Hinojo et al., 2006).

154
 Discusión

La identificación de F. oxysporum se llevó a cabo utilizando los iniciadores

Clox1/Clox2 (Mulè et al., 2004a). El total de aislados detectadas fueron nueve, siete
en los granos de maíz provenientes del maíz experimental y dos en maíz almacén.
Esta especie se reconoce que es la fuente de micotoxinas como wortmanina y ácido
fusárico, además de la moniliformina, pero es uno de los principales causante de
enfermedades de tallos en plantas y pudriciones en flores y frutos (Di Pietro et al.,
2003; Kosiak et al., 2005).

En este trabajo no se detectaron las especies F. culmorum ni F.

sporotrichioides. La primera especie está asociada como patógeno de gran
importancia en cereales, atacando principalmente tallos y semillas. Produce
micotoxinas como DON, NIV, ZEA, MON, las cuales están catalogadas como
potencialmente toxicas para humanos y animales. La segunda especie se le asocia
principalmente con enfermedades de tallo y raíces en maíz y en granos de cereales
en Canadá, Estados Unidos y Europa. Produce micotoxicosis en humanos y
animales ya que sintetiza butenolida, fusarina C, moniliformina, escirpentriol,
esteroides, zearalenona y T-2 (Leslie and Summerell, 2006; Desjardins, 2006).

Partiendo de la base de que la región ITS se ha propuesto como una

herramienta útil para constatar las posibles variabilidades interespecíficas e
intraespecíficas fúngicas (Konietzny and Greiner, 2003; Nicolaisen et al., 2005) y
para corroborar la eficacia de la PCR, se decidió confirmar la identificación de
algunos de estos aislados mediante secuenciación.

En este trabajo se ha podido constatar que la región ITS es apta en la

identificación fúngica para especies pertenecientes al género Fusarium. Además, es
capaz de mostrar diferencias intra e interespecíficas de las especies (Nicolaisen et
al., 2005).

Mediante la secuenciación se confirmó la identificación previa por PCR de todos

los aislados de F. verticillioides analizadas, confirmando la eficacia del ensayo de
PCR de Mulé et al., (2004 b) para la identificación de esta especie.

155
Discusión

De los aislados identificados previamente por PCR como F. graminearum, se

secuenciaron 15; de éstos se encontró un aislado atípico, que en la secuenciación
fue adscrita a la especie F. equiseti. Este aislado no producía ninguna de las
micotoxinas estudiadas en este trabajo. En estos momentos se trabaja sobre este
aislado para determinar sus características fenotípicas y moleculares.

Mediante el análisis de las matrices de similaridad de nucleótidos, se verificó

que los 13 aislados identificados por secuenciación como F. graminearum se
agrupaban en dos grupos principales: el primero presentaba un nivel de homología
entre el 99 y 100% con la cepa F. graminearum (linaje 7) NCBI AY188924; el
segundo grupo lo constituían otros 6 aislados que podrían pertenecer a la especie F.
asiaticum (linaje 6) (O’Donnell et al., 2004). Sería necesario realizar un estudio más
detallado de estos aislados para su identificación precisa, ya que esta especie es
morfológicamente indistinguible de F. graminearum (linaje 7) (Zhang et al., 2007)
Datos similares fueron encontrados por Carter et al., (2002) en Nepal y Li et al.,
(2005) en China al trabajar con F. graminearum.

También se encontró una elevada heterogeneidad intra-especie en los dos

grupos formados dentro el complejo Fusarium graminearum, debido posiblemente a
pequeños cambios en la composición genómica.

Entre los 14 aislados secuenciados que no pudieron ser identificados con

antelación por PCR, se encontraron cuatro aislados de F. equiseti, tres en maíz
campo y una en maíz experimental. Esta especie en particular es potencialmente
productora de toxinas, especialmente tricotecenos como 4-acetilnivalenol (FUS-X),
nivalenol, monoacetoxi y diacetoxi- eescirpentriol (MAS y DAS), zearalenona (ZEA),
equisetina (EQ), butenolida y fusarocromanona (FURSCHR) (Kosiak et al., 2005).
Los otros 10 aislados se identificaron como F. proliferatum. Esta especie se ha
encontrado en un amplio rango de hospedadores como banana, espárragos, palma,
higos, mango, maíz, pino, arroz, sorgo entre otros, causando daños
económicamente significativos. A nivel mundial esta especie esta catalogada como

156
 Discusión

gran colonizador de plantas de maíz y en Europa se asocia además a enfermedades

a nivel de las raíces de esta planta (Desjardins, 2006).

Dentro las especies identificadas como F. proliferatum y F. equiseti, al igual que

el caso anterior, encontramos una elevada heterogeneidad. Para F. verticillioides, sin
embargo, el nivel de homología entre todos los aislados era del 100%, indicando un
alto grado de conservación de esta secuencia entre aislados de distintos orígenes
(Healy et al., 2005).

La técnica PCR-RFLPs aplicada la región IGS del ADNr mediante su

amplificación con los iniciadores CNL12 y CNS1 y su posterior digestión con
enzimas de restricción, mostró su eficacia en la diferenciación de aislados del
género Fusarium, concretamente del complejo Fusarium graminearum (Fg) y del
complejo G. fujikuroi, identificados previamente en base a criterios morfológicos,
mediante PCR y algunos de ellos por secuenciación. El tamaño de los fragmentos
amplificados de la región IGS de los 96 aislados de Fusarium proveniente de las
diferentes muestras de maíz osciló entre 2600 y 2700 pb. Este resultado coincide
con el trabajo de Hinojo et al. (2004), quienes no aprecian una correspondencia
entre el tamaño de los amplificados y especies concretas; es decir, el tamaño de los
productos de amplificación no permite distinguir entre especies del género Fusarium.

Para los 18 aislados identificados como F. graminearum esta técnica resulto

muy eficaz en la separación de los aislados, distinguiendo un grupo de 11 aislados,
dentro del cual quedaban agrupadas las identificadas por secuenciación como F.
graminearum linaje 7 junto con la cepa de referencia CECT 2150, y un segundo
grupo, que incluye los 6 aislados identificadas por secuenciación como posibles F.
asiaticum. Con esta técnica se vuelve a encontrar que hay diferencias entre estos
aislados y cabe la posibilidad de que esta especie se encuentre presente en territorio
español. Aislados de F. asiaticum fueron encontrados en países como China, Corea,
Nepal y Brasil (O’Donnell et al., 2004). Laday et al. (2004) encontró dos aislados en
Hungría. Se debe tener en cuenta que esta especie tiene un alto potencial
toxigénico, produciendo toxinas como deoxinivalenol, 15-acetildeoxinivalenol (15-

157
Discusión

AcDON), nivalenol y 4-acetilnivalenol, y especialmente 3-acetildeoxinivalenol (3-

AcDON) (Zhang et al., 2007).

Respecto a los aislados pertenecientes al complejo G. fujikuroi, éstos se

dividieron en dos grandes grupos: en un primer grupo quedaban los aislados
pertenecientes a F. verticillioides (Sacc. Nirenberg) y en otro los aislados
pertenecientes a F. proliferatum, aunque un aislado perteneciente a la sección
Liseola quedó totalmente aislada (P.1.P.4-3), probablemente debido a la alta
variabilidad intraespecífica de esta sección. Estudios realizados por diferentes
autores revelan que cepas del complejo fujikuroi son grandes productoras de
fumonisinas, de ahí su gran importancia en su identificación en alimentos y
especialmente en granos. Un tercer grupo lo formaban aislados de F. equiseti, que
pertenece al sección Gibbosum y son productores de micotoxinas como
fusarochromanona (FUSCHR), zearalenona (ZEA) y tricotecenos: 15-monoacetoxi-
escirpentriol (MAS), diacetoxi-escirpenol (DAS), T-2 y HT-2, T2-triol, neosolaniol
(NEO), deoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV) and 4-acetilnivalenol (Fus-X) (Kosiak et
al., 2005).

La utilización de la región IGS ribosomal, mediante el estudio de RFLPs de las

especies en estudio, F. graminearum, F. verticillioides, F. proliferatum y F. equiseti,
mostró su diversidad genética dentro y fuera de la sección donde están ubicadas.
Nuestro estudio muestra que en las poblaciones del género Fusarium existe una alta
diversidad, encontrándose varios tipos genéticos aun dentro de la misma especie.
Estudios en F. graminearum, F. verticillioides y F. oxysporum han mostrado estas
mismas conclusiones (Desjardins, 2006; Lalay et al., 2004; Edel et al., 2001).

La última parte de este trabajo se dedicó a la detección de la producción de

micotoxinas por los aislados encontrados.

En nuestro laboratorio hemos desarrollado un método para el análisis de

deoxinivalenol, 3-acetildeoxinivalenol, fusarenon X, 15-acetildeoxinivalenol y
nivalenol, a partir del medio de cultivo sólido donde crece el hongo. Para ello
modificamos el método de Bragulat et al. (2001) para la extracción de micotoxinas a

158
 Discusión

partir de medio de cultivo sólido y lo adaptamos al método modificado de Eskola et

al. (2000) para la detección y cuantificación de tricotecenos por CG-MS.

Los parámetros analíticos del método son satisfactorios; se demuestra un

intervalo de linealidad en las concentraciones en las que esperamos encontrar la
micotoxina en el medio. El límite de cuantificación se encuentra entre 15 y 23 g/kg
para las diversas micotoxinas, lo que es comparable o incluso inferiores a los datos
de otros autores (Jestoi, 2004a; Milanez and Valente-Soares, 2006). Para conocer la
exactitud del método, el estudio se realizó sobre los porcentajes de recuperación de
micotoxina, obteniéndose valores de recuperación entre 79.44 y 100.53 %. La
precisión se analizó mediante los valores de las desviaciones estándar relativas, que
variaban desde 0.77 a 16.89 %.

Con estos valores consideramos el método como un procedimiento preciso y

rápido para evaluar la producción de tricotecenos por especies del género Fusarium,
utilizando los mismos medios de cultivo sólidos en los que se aíslan e identifican
fenotípicamente las cepas de este género, o de los que se puede extraer el micelio
para realizar los análisis de biología molecular. Además de todas estas ventajas,
representa un ahorro de material y disolventes considerable, al extraerse las
micotoxinas de una pequeña cantidad de agar, en contrapartida con los métodos en
los que se extraen las micotoxinas de caldo de cultivo líquido.

Con este método, se analizaron 15 aislados de F. graminearum y una cepa

control (CECT 2150) en tres medios de cultivo (PDA, Czapeck y YES) con
extracciones a tres tiempos de incubación: 7, 15 y 21 días. De los 15 aislados, tres
no produjeron ningún tipo de tricoteceno y el resto han producido al menos uno en
alguna condición. De los resultados obtenidos podemos concluir que el medio donde
se han producido más tricotecenos es el medio PDA con incubaciones de 15 y 21
días. En este medio, además, las cantidades producidas por algunos aislados se
pueden considerar elevadas, ya que nos encontramos con cantidades de 3033.04
g/kg de DON y 1619.89 g/kg de 15-AcDON para el aislado V 2.3.5.(2) a los 15
días de incubación.

159
Discusión

En los otros dos medios de cultivo, las cantidades de micotoxinas son mucho
menores en los pocos aislados que dan positivo en estas condiciones. En el medio
Czapeck los aislados que dan positivo lo hacen en mayor número a los 21 días de
incubación pero en cantidades muy bajas, de 15.78 g/kg a 234.31 g/kg de DON.
En el medio YES, sin embargo, son escasas las muestras positivas, con niveles muy
bajos y sólo a los 21 días. A pesar de que otros autores utilizan porciones de medio
YES crecido a los 14 días para la extracción de micotoxinas (Kosiak et al., 2005),
como conclusión de este estudio, nuestro medio de elección para estudiar la
producción de tricotecenos por cepas toxigénicas de Fusarium, sería PDA a extraer
a los 15 y/ó 21 días.

En el medio PDA a los 15 días de incubación 11 aislados son positivos para la

producción de algún tricoteceno: siete de ellos producen DON con valores desde
56.78 µg/kg hasta 404.32 µg/kg y 15-AcDON con valores desde 62.52 µg/kg hasta
504.55 µg/kg; otros dos aislados producen pequeñas cantidades de 15-AcDON. Y
por último dos aislados producen los tres tricotecenos DON, 3-AcDON, 15-AcDON,
en cantidades muy superiores (1727.89-3033.04 µg/kg de DON, 1709.23-1619.89
µg/kg de 15-AcDON y 20.55-29.54 µg/kg de 3-AcDON). La cepa de referencia F.
graminearum (CECT 2150), sólo produce DON 68.31 µg/kg.

A los 21 días de incubación, los dos aislados en los que sólo se detectaba una
pequeña cantidad de 15-AcDON a los 7 días, no producen ninguna micotoxina.
Como dato relevante, a los 21 días aparecen 8 muestras en las que se detecta 3Ac-
DON: en 3 de ellas se detecta, pero está por debajo del límite de cuantificación; en 5
aislados la cantidad de DON sobrepasa los 1000 µg/kg y también aumentan algunas
cantidades de 15-AcDON y 3-AcDON. La cepa de referencia sólo produce DON y
una cantidad no cuantificable de 15-AcDON a este tiempo de incubación.

Los resultados obtenidos del análisis de detección y cuantificación de

tricotecenos producidos por los aislados de F. graminearum estudiados coinciden
con el análisis realizado con PCR, que las identificaba como quimiotipos DON, ya
que todos los aislados producen DON en alguna condición. Estos resultados difieren
de otros trabajos similares, que señalan al quimiotipo NIV como el más prevalente
en Europa (Kim et al., 2003; Tóth et al. 2008). Trabajos previos realizados por

160
 Discusión

nuestro grupo de investigación (Cerveró et al., 2007; Castillo et al., 2008),

corroboran sin embargo que en productos derivados de maíz destinados al consumo
humano, se detecta DON con elevada frecuencia, mientras que la presencia de NIV
es notablemente inferior.

Las especies de Fusarium designadas como pertenecientes al quimiotipo DON

se subdividen a su vez en otros dos grupos: quimiotipo DON/3-AcDON si es capaz
de formar DON y su 3-acetil derivado, y quimiotipo DON/15-AcDON si puede
producir DON y 15-AcDON (Llorens et al., 2006). Los resultados obtenidos por CG-
MS nos conducen a pensar que nuestros aislados pertenecen al quimiotipo DON/15-
AcDON, ya que en la mayoría de los análisis de los aislados producen estas dos
toxinas. Sin embargo, en algunos casos en el mismo análisis o por separado en
distintas condiciones de cultivo, hasta 7 aislados han dado positivo para la detección
de 3-AcDON, a la vez que se detecta DON y 15-AcDON. En estos casos las
cantidades de 3-AcDON son inferiores a las de los otros tricotecenos. Estos
resultados coinciden con los de otros autores que obtienen en la mayoría de los
casos las tres micotoxinas (Szécsi et al., 2005, Tóth et al., 2005).

Esto es importante para los consumidores porque en los granos siempre puede
haber presencia de algún tricoteceno, los cuales tienen distinto grado de toxicidad,
siendo el 15-AcDON más tóxico que el 3-AcDON. Los efectos que producen estas
toxinas nos solo son importantes en la salud humana y animal, sino que también
juegan un papel importante en la capacidad patógena de F. graminearum en
cereales (Lori y Rizzo, 2007).

Con los resultados obtenidos, podemos concluir que algunos de los aislados de
Fusarium spp., estudiadas tienen un alto potencial de producción de las micotoxinas
evaluadas. Muchos estudios han demostrado que las micotoxinas de Fusarium spp.,
están muy distribuidas por la cadena alimentaria de la Comunidad Económica
Europea, siendo los productos hechos con cereales, especialmente trigo y maíz, las
principales fuentes de ingesta alimentaria de esas toxinas, aunque estas ingestas en
la población adulta suelen estar por debajo de la IDT aplicable de la toxina en
cuestión. Sin embargo, tratándose de grupos de riesgo como el de los lactantes y el

161
Discusión

de los niños pequeños, tales ingestas se acercan o incluso superan, en algunos

casos, la IDT (Reglamento (CE) nº 1126/2007).

Con relación a la detección de especies toxigénicas, los métodos tradicionales

de detección, que incluyen el crecimiento del hongo en un sustrato y condiciones
ambientales adecuadas, extracción de éstas del sustrato con disolventes orgánicos y
análisis mediante técnicas cromatográficas, tienen como desventaja el largo tiempo
necesario para obtener resultados, así como la alta sofisticación de los procesos de
limpieza y/o derivatización (Konietzny and Greiner, 2003). Por otra parte, las
técnicas de inmunoensayo, pese a ser más rápidas y sencillas, tienen como
inconveniente que se rigen por el concepto "una sustancia un ensayo". Es por ello
que la PCR se constituye como una alternativa rápida y precisa para este propósito.

La PCR para detectar cepas toxigénicas se lleva a cabo mediante iniciadores

que amplifican parcial o totalmente genes que codifican para la producción de
micotoxinas, como Tox5-1/Tox5-2 y ToxP1/ToxP2. El primero de ellos detecta el gen
tri5 implicado en la síntesis de tricotecenos (Fekete et al., 1997; Desjardins, 2006)
mientras que el segundo amplifica los genes tri5 y tri6, implicados en la síntesis de
tricotecenos como DON y NIV. Aunque la presencia de estos genes no asegura la
producción de tricotecenos como DON o NIV, su ausencia imposibilita la producción.

En este trabajo, de los 377 aislados analizados se identificaron 26 aislados

potencialmente productoras de tricotecenos. En todos los casos en que se realizó la
comprobación por métodos cromatográficos, los aislados en estudio, a excepción de
tres, demostraron ser productores de estas micotoxinas.

162
VI. CONCLUSIONES
 Conclusiones

VI. CONCLUSIONES

 Básicamente, la micobiota encontrada en este estudio pertenece a los

géneros Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Cladosporium,
Geotrichum y Fusarium.

 De acuerdo con los resultados obtenidos, el maíz con mayor porcentaje de

aislados de Fusarium spp., respecto a otros hongos es el maíz almacén,
seguido del maíz experimental cultivado en parcela de la Universidad
Politécnica y por último el maíz campo.

 En el maíz experimental que no ha sido tratado con ningún producto fungicida

la totalidad de los granos están contaminados, mientras se disminuye a casi la
mitad en el maíz almacén. En el maíz de campo, destinado al consumo
humano, se encuentra menor porcentaje de granos contaminados.

 En las Comunidades Autónomas evaluadas se han obtenido valores similares

en la contaminación por aislados del género Fusarium, sin diferencias
significativas excepto entre Madrid y Murcia. En cuanto la contaminación por
otros géneros, sí existen diferencias significativas entre los distintos orígenes
geográficos.

 Respecto a los medios de cultivo utilizados en los análisis, tanto PDA-CL

como AVM son adecuados para aislar este tipo hongo de maíz aunque el medio
AVM mostró mayor selectividad para el género Fusarium.

 En todos los tipos de maíz analizados, la especie de Fusarium más prevalente

es F. verticillioides.

 Se ha confirmado que la técnica de la PCR, es una herramienta adecuada

para la identificación de hongos como Fusarium spp., F. graminearum, F.
oxysporum y F. verticillioides.

165
Conclusiones

 Mediante la secuenciación de la región ITS1-5.8S–ITS2 de los aislados de

Fusarium spp., seleccionados, se confirmó la identificación previa por PCR de
aislados de F. verticillioides y F. graminearum y se identificaron aislados de F.
proliferatum y F. equiseti. Se comprueba que la región ITS es apta en la
identificación de especies pertenecientes al género Fusarium.

 Este estudio muestra que en las poblaciones de Fusarium spp., existe una
alta diversidad, encontrándose varios tipos genéticos aun dentro de la misma
especie. La utilización de la región IGS ribosomal, mediante el estudio de
RFLPs de las especies analizadas, F. graminearum, F. verticillioides, F.
proliferatum y F. equiseti, mostró su diversidad genética dentro y fuera de la
sección donde están ubicadas.

 El método para el análisis de tricotecenos a partir del medio de cultivo sólido

desarrollado en nuestro laboratorio es un procedimiento preciso y rápido para
evaluar la producción de tricotecenos por especies del género Fusarium. El
medio de elección sería PDA, a extraer a los 15 y/ó 21 días.

 Algunos de los aislados de Fusarium spp., estudiados tienen un alto potencial

de producción de las micotoxinas evaluadas. Los resultados obtenidos por CG-
MS conducen a pensar que los aislados de F. graminearum analizados
pertenecen al quimiotipo DON/15-AcDON, aunque también producen pequeñas
cantidades de 3-AcDON.

166
VII. BIBLIOGRAFÍA
 Bibliografía

Abd-Elsalam, K.A.; Aly, I.N.; Abdel- para la salud pública.

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186
ANEJOS
 Anejo I

MEDIOS DE CULTIVO

Composición de los medios de cultivo referida a un litro de agua destilada

AGAR PATATA DEXTROSA (PDA)

39 g de bacto-patata dextrosa agar (Difco)

1000 mL de agua destilada.

Se esteriliza en el autoclave durante 15 minutos a 121ºC y se reparte en placas

Petri.

AGAR PATATA DEXTROSA CON CLORANFENICOL (PDA-CL)

39 g de bacto-patata dextrosa agar (Difco)

0,5 g de cloranfenicol (Panreac)
1000 mL de agua destilada.

Para disolver el medio se lleva a la disolución de ebullición. Se esteriliza en el

autoclave durante 15 minutos a 121ºC y se reparte en placas Petri.

Nota: El medio PDA se emplea para el estudio general de hongos. Y el

cloranfenicol es un antibiótico que se utiliza para impedir el desarrollo de bacterias,
reduciendo así la contaminación.

AGAR VERDE DE MALAQUITA (AVM) (Castella et al., 1997)

Peptona Difco (BactoTM Peptona): 15 g

Fosfato potásico mono – básico (KH2PO4) 1g
Sulfuro magnésico heptahidratado (MgSO4 x 7H2O) 0,5 g
Disolución de verde malaquita 2,5 ppm 1 Ml
Agar 20 g
Cloranfenicol 0,5 g
Agua destilada 1000 mL.

189
Anejo I

La disolución de verde malaquita se prepara previamente y se mantiene a

temperatura ambiente. El medio se esteriliza en autoclave 15 minutos a 121ºC, y se
reparte en placas Petri.
Nota: El medio agar verde malaquita es específico para especies del género
Fusarium.

AGAR SACAROSA EXTRACTO DE LEVADURA (YES)

Extracto de levadura 20 gramos

Sacarosa 150 gramos
Agar 20 gramos
MgSO4 x 7H2O 0.5 gramos
Agua destilada 1000 ml

Se esteriliza por 15 minutos a 121°C

AGAR CZAPECK (CZ)

Sacarosa 30 gramos
NaNO3 3 gramos
K2HPO4 1 gramos
MgSO4 x 7H2O 0.5 gramo
KCl 0.5 gramos
FeSO4 x 7H2O 0.01 gramos
Agar 15 gramos
Agua destilada 1000 mL

Las sales se disuelven por separado, dejando por último el K2HPO4 se mezclan los
componentes. Se esteriliza por 15 minutos a 121°C.

2. Reactivos y soluciones

Electroforesis clásica

Gel de agarosa

Agarosa D-1 Media EEO (Pronadisa)

Agarosa D-1 Alta EEO (Pronadisa)
Solución de bromuro de etidio 10 mg/ml (Iberlabo)

Pesar la agarosa y transferir a un matraz, añadir el tampón TAE 1X, calentar hasta
que rompa a hervir, agitar y atemperar hasta 50ºC. Los geles son teñidos una vez
finalizada la electroforesis en una solución 800 ml de Tampón TAE 1X con 5 gotas

190
 Anejo I

de bromuro de etidio y dejando el gel entre 10-15 minutos para luego ser
visualizado.

Tampón de carga

Azul bromofenol 1% 2,5 ml

Ficoll 2,5 g
EDTA 0,5 M 1 ml
Agua MilliQ 4 ml

Marcadores de pesos moleculares.

100 bp DNA LAdder Plus (Fermentas SM0323) de 100 a 3000 pb

50 bp DNA Ladder (BioLabs 323-1S) de 100 a 1517 pb

100 mM Tris- HCl pH 7.2

Se toma 1,211 gramos de Tris base cuyo peso molecular es 121.1gr/mol y se afora
con agua destilada hasta 100 ml, el pH se condiciona con ácido clorhídrico.

100 mM EDTA pH 8

Se pesan 3.72 gramos de EDTA cuyo peso molecular es 372.2 g/mol y se afora con
agua destilada estéril hasta 100 ml.

10% SDS

Se pesan 10gramos de dodecil sulfato sódico (SDS), se adicionan 90 ml de agua

destilada estéril, se calienta a 68ºC, se ajusta el pH a 7.2 con HCl y se afora a 100
ml, no necesita ser esterilizado
Solución tampón:
100 mM Tris- HCl pH 7.2
100 mM EDTA pH 8
10% SDS pH 7.2

Se coloca en el tubo eppendorf 250 µl de cada uno y se mantiene todo en frío

Proteinaza K (20mg/ml).
Se pesan 20mg de proteinaza K y se le adiciona 1 ml de agua destilada estéril.

191
Anejo I

NaCl 5M
Para 100 ml se pesan 29.22 gramos de NaCl y se le adiciona 80 ml de agua
destilada estéril y se afora a 100 ml.

CTAB/NaCl
Se pesan 10 gramos de Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) y se le
adicionan 100 ml de NaCl al 0.7 M (pesar 4.09 gramos de NaCl y diluirlos en 100ml
de agua destilada estéril).

Cloroformo/Alcohol isoamílico 24:1

Se mide 24 partes de cloroformo por una de alcohol isoamilico.

Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico ([Link])

Se utilizo Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol [Link] Saturated with 10 mM Tris,
pH 8.0, 1 mM EDTA. de SIGMA.

TE
Pesar 121gramos de Trisma® base y 0.372 gramos EDTA disolver en 1000ml de
agua miliQ

Tampón TAE 50X

Trisma® base 2 M 242 gramos, ácido acético glacial 50mM 57.1 ml. y EDTA 1mM.
Llevar a 1000 ml con agua destilada.
TAE 1X
20 ml de TAE 50X en 980 ml de agua

RNAsa
25 mg/mL

192
 Anejo II

Tabla 1: Porcentaje de granos contaminados maíz campo

PDA-Cl AVM PDA-Cl AVM

Muestra Nº granos % granos Nº granos % granos Muestra Nº granos % granos Nº granos % granos
F1 25 100 11 44 F52 0 0 0 0
F2 13 52 17 68 F53 2 8 5 20
F3 11 44 15 60 F54 4 16 0 0
F4 17 68 11 44 F55 4 16 1 4
F5 15 60 7 28 F56 10 40 3 12
F6 16 64 11 44 F57 20 80 8 32
F7 8 32 14 56 F58 0 0 1 4
F8 10 40 10 40 F59 17 68 10 40
F9 15 60 4 16 F60 5 20 2 8
F10 21 84 18 72 F61 2 8 11 44
F11 19 76 17 68 F62 8 32 2 8
F12 25 100 25 100 F63 4 16 1 4
F13 23 92 12 48 F64 10 40 6 24
F14 14 56 21 84 F65 1 4 0 0
F15 15 60 17 68 F66 6 24 5 20
F16 20 80 9 36 F67 2 8 0 0
F17 9 36 2 8 F68 6 24 1 4
F19 15 60 3 12 F69 9 36 1 4
F20 13 52 6 24 F70 1 4 0 0
F21 24 96 11 44 F71 1 4 2 8
F22 9 36 8 32 F72 0 0 2 8
F23 4 16 4 16 F73 5 20 5 20
F24 23 92 23 92 F74 5 20 3 12
F25 1 4 1 4 F75 9 36 5 20
F26 4 16 2 8 F76 10 40 5 20
F27 13 52 8 32 F77 1 4 0 0
F28 0 0 10 40 F78 3 12 2 8
F29 20 80 12 48 F79 1 4 0 0
F30 25 100 24 96 F80 12 48 15 60
F31 25 100 25 100 F81 8 32 9 36
F32 24 96 24 96 F82 11 44 7 28
F33 20 80 11 44 F83 5 20 10 40
F34 12 48 11 44 F84 10 40 6 24
F35 11 44 3 12 F85 2 8 7 28
F36 9 36 10 40 F86 5 20 3 12
F37 18 72 12 48 F87 2 8 7 28
F38 16 64 9 36 F88 6 24 2 8
F39 17 68 13 52 F89 10 40 5 20
F40 20 80 15 60 F90 2 8 4 16
F41 17 68 13 52 F91 4 16 7 28
F42 13 52 9 36 F92 2 8 3 12
F43 14 56 4 16 F93 3 12 3 12
F44 15 60 1 4 F94 9 36 2 8
F45 14 56 7 28 F95 4 16 6 24
F46 4 16 0 0 F96 1 4 3 12
F47 5 20 4 16 F97 2 8 2 8
F48 3 12 2 8 F98 1 4 1 4
F49 4 16 2 8 F99 17 68 17 68
F50 2 8 0 0 F100 4 16 5 20
F51 11 44 16 64 F101 7 28 3 12
Total 974 38.96 732 29.28

193
 Anejo II

Tabla 2: Distribución de la contaminación fúngica en maíz campo

Medio Potato Dextrosa Agar con cloranfenicol (PDA-Cl)

NºGe
Muestra Total NºAlt %Alt NºAsp %Asp NºCla %Cla NºFus %Fus o %Geo NºMuc %Muc NºPen %Pen
F1 39 0 34 87,18 0 5 12,8 0 0 0
F2 17 1 5,88 12 70,59 0 4 23,5 0 0 0
F3 11 0 2 18,18 0 4 36,4 0 5 45,45 0
F4 17 0 16 94,12 0 0 0 1 5,882 0
F5 16 0 10 62,5 0 0 1 6,25 5 31,25 0
F6 17 0 2 11,76 0 8 47,1 0 7 41,18 0
F7 9 0 5 55,56 0 0 0 4 44,44 0
F8 10 0 1 10 0 6 60 0 3 30 0
F9 10 0 4 40 0 1 10 1 10 4 40 0
F10 12 0 3 25 0 0 0 9 75 0
F11 22 0 10 45,45 0 11 50 0 1 4,545 0
F12 33 0 21 63,64 0 0 0 12 36,36 0
F13 23 0 13 56,52 0 0 0 10 43,48 0
F14 16 0 6 37,5 0 0 0 8 50 2 12,5
F15 16 0 15 93,75 0 0 0 0 1 6,25
F16 16 0 14 87,5 0 0 0 0 2 12,5
F17 12 0 9 75 0 0 0 2 16,67 1 8,33
F19 26 0 0 0 2 7,69 0 0 24 92,3
F20 19 0 3 15,79 0 0 0 0 16 84,2
F21 20 0 3 15 0 0 0 13 65 4 20
F22 11 0 4 36,36 0 0 0 4 36,36 3 27,3
F23 4 0 0 0 0 0 3 75 1 25
F24 33 0 2 6,061 0 22 66,7 0 8 24,24 1 3,03
F25 1 0 0 0 0 0 0 1 100
F26 5 1 20 0 0 0 0 1 20 3 60
F27 16 0 2 12,5 0 8 50 0 0 6 37,5
F28 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F29 33 0 4 12,12 0 5 15,2 0 0 24 72,7
F30 55 0 1 1,818 0 15 27,3 0 0 39 70,9
F31 187 0 5 2,674 0 6 3,21 0 1 0,535 175 93,6
F32 72 0 0 0 3 4,17 0 5 6,944 64 88,9
F33 20 0 3 15 0 1 5 0 0 16 80
F34 5 0 0 0 1 20 0 0 4 80
F35 30 0 4 13,33 0 2 6,67 0 0 24 80
F36 11 0 6 54,55 0 2 18,2 0 0 3 27,3
F37 16 0 4 25 0 6 37,5 0 0 6 37,5
F38 18 0 2 11,11 0 9 50 0 0 7 38,9
F39 31 0 4 12,9 0 5 16,1 0 0 22 71
F40 28 0 12 42,86 0 6 21,4 0 0 10 35,7
F41 24 0 5 20,83 0 12 50 0 2 8,333 5 20,8
F42 15 0 3 20 3 20 6 40 0 0 3 20
F43 23 0 1 4,348 8 34,8 4 17,4 0 0 11 47,8

194
 Anejo II

Continuación tabla 2
Medio Potato Dextrosa Agar con cloranfenicol (PDA-Cl)
Muestra Total NºAlt %Alt NºAsp %Asp NºCla %Cla NºFus %Fus NºGeo %Geo NºMuc %Muc NºPen %Pen
F44 18 1 5,56 4 22,22 0 3 16,7 0 0 10 55,6
F45 5 0 0 0 0 0 0 5 100
F46 6 1 16,7 2 33,33 0 0 0 0 3 50
F47 6 1 16,7 0 1 16,7 2 33,3 0 0 2 33,3
F48 4 0 0 0 3 75 0 0 1 25
F49 4 0 0 0 4 100 0 0 0
F50 2 1 50 0 0 0 0 0 1 50
F51 11 0 0 0 10 90,9 0 0 1 9,09
F52 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F53 2 0 0 0 1 50 0 0 1 50
F54 5 1 20 0 0 0 0 2 40 2 40
F55 5 2 40 0 0 1 20 0 0 2 40
F56 5 2 40 2 40 0 1 20 0 0 0
F57 15 0 0 0 0 0 15 100 0
F58 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F59 20 12 60 1 5 0 4 20 1 5 2 10 0
F60 6 2 33,3 0 0 2 33,3 2 33,3 0 0
F61 3 0 1 33,33 0 1 33,3 1 33,3 0 0
F62 3 0 0 0 3 100 0 0 0
F63 5 1 20 2 40 0 0 0 1 20 1 20
F64 10 0 0 0 9 90 1 10 0 0
F65 1 0 0 0 0 0 0 1 100
F66 6 0 0 0 0 0 6 100 0
F67 2 1 50 0 0 0 0 0 1 50
F68 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F69 4 1 25 1 25 0 0 0 2 50 0
F70 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F71 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F72 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F73 5 4 80 0 0 0 0 0 1 20
F74 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F75 4 0 0 0 0 0 4 100 0
F76 5 1 20 0 0 4 80 0 0 0
F77 1 1 100 0 0 0 0 0 0
F78 3 2 66,7 1 33,33 0 0 0 0 0
F79 1 1 100 0 0 0 0 0 0
F80 7 0 0 0 6 85,7 0 0 1 14,3
F81 8 1 12,5 1 12,5 0 6 75 0 0 0
F82 6 2 33,3 0 0 4 66,7 0 0 0
F83 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F84 10 0 0 0 7 70 3 30 0 0
F85 2 1 50 0 0 1 50 0 0 0
F86 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F87 2 0 0 0 0 0 2 100 0
F88 6 0 0 0 6 100 0 0 0
F89 11 4 36,4 0 0 7 63,6 0 0 0
F90 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F91 4 0 0 0 3 75 1 25 0 0
F92 3 0 0 0 0 0 0 3 100
F93 3 2 66,7 0 0 0 0 0 1 33,3

195
 Anejo II

Continuación tabla 2
Medio Potato Dextrosa Agar con cloranfenicol (PDA-Cl)
Muestra Total NºAlt %Alt NºAsp %Asp NºCla %Cla NºFus %Fus NºGeo %Geo NºMuc %Muc NºPen %Pen
F94 4 0 0 0 4 100 0 0 0
F95 4 0 0 0 4 100 0 0 0
F96 1 0 0 0 0 1 100 0 0
F97 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F98 1 0 1 100 0 0 0 0 0
F99 17 0 2 11,76 0 15 88,2 0 0 0
F100 4 0 0 0 4 100 0 0 0
F101 7 0 0 0 7 100 0 0 0
Total 1273 47 263 12 283 12 142 515
Medio verde malaquita (AVM)
Muestra Total NºAlt %Alt NºAsp %Asp NºCla %Cla NºFus %Fus NºGeo %Geo NºMuc %Muc NºPen %Pen
F1 12 0 6 50 0 5 41,67 0 0 1 8,333
F2 17 0 0 0 17 100 0 0 0
F3 15 0 7 46,67 0 7 46,67 0 1 6,667 0
F4 11 0 10 90,91 0 0 0 1 9,091 0
F5 8 0 8 100 0 0 0 0 0
F6 11 0 3 27,27 0 5 45,45 0 3 27,27 0
F7 9 0 5 55,56 0 0 0 4 44,44 0
F8 10 0 4 40 0 6 60 0 0 0
F9 4 0 0 0 1 25 0 3 75 0
F10 18 0 0 0 0 0 17 94,44 1 5,556
F11 17 0 9 52,94 0 7 41,18 1 5,88 0 0
F12 38 0 11 28,95 0 0 0 20 52,63 7 18,42
F13 13 0 7 53,85 0 0 0 4 30,77 2 15,38
F14 22 0 19 86,36 0 0 0 1 4,545 2 9,091
F15 23 0 8 34,78 0 0 1 4,35 0 14 60,87
F16 9 0 5 55,56 0 0 0 4 44,44 0
F17 2 0 2 100 0 0 0 0 0
F19 3 0 0 0 2 66,67 0 0 1 33,33
F20 6 0 6 100 0 0 0 0 0
F21 11 0 2 18,18 0 0 2 18,2 7 63,64 0
F22 8 0 1 12,5 0 4 50 0 1 12,5 2 25
F23 4 0 1 25 0 3 75 0 0 0
F24 26 0 0 0 25 96,15 1 3,85 0 0
F25 1 0 1 100 0 0 0 0 0
F26 2 1 50 0 0 0 0 1 50 0
F27 8 0 0 0 8 100 0 0 0
F28 10 0 0 0 9 90 0 0 1 10
F29 20 0 0 0 4 20 0 0 16 80
F30 35 1 2,9 2 5,714 0 17 48,57 0 0 15 42,86
F31 71 0 0 0 1 1,408 0 0 70 98,59
F32 61 1 1,6 0 0 1 1,639 0 8 13,11 51 83,61
F33 15 0 0 0 4 26,67 0 0 11 73,33
F34 6 0 0 0 3 50 0 1 16,67 2 33,33
F35 5 0 2 40 0 2 40 0 0 1 20
F36 10 0 2 20 0 5 50 0 0 3 30
F37 12 0 2 16,67 0 8 66,67 0 1 8,333 1 8,333
F38 9 0 0 0 4 44,44 0 3 33,33 2 22,22
F39 18 0 1 5,556 0 3 16,67 0 0 14 77,78
F40 18 0 9 50 0 5 27,78 0 0 4 22,22

196
 Anejo II

Continuación tabla 2
Medio verde malaquita (AVM)
Muestra Total NºAlt %Alt NºAsp %Asp NºCla %Cla NºFus %Fus NºGeo %Geo NºMuc %Muc NºPen %Pen
F41 16 0 2 12,5 0 10 62,5 0 0 4 25
F42 9 0 0 0 7 77,78 0 0 2 22,22
F43 6 0 1 16,67 0 2 33,33 0 0 3 50
F44 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F45 7 0 0 0 3 42,86 2 28,6 0 2 28,57
F46 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F47 4 0 0 0 3 75 0 0 1 25
F48 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F49 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F50 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F51 16 0 0 0 16 100 0 0 0
F52 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F53 5 0 0 0 5 100 0 0 0
F54 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F55 1 1 100 0 0 0 0 0 0
F56 3 0 2 66,67 0 0 0 0 1 33,33
F57 8 0 0 0 0 6 75 2 25 0
F58 1 0 0 0 0 0 0 1 100
F59 11 2 18 0 0 9 81,82 0 0 0
F60 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F61 11 0 0 0 11 100 0 0 0
F62 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F63 1 0 0 0 0 0 1 100 0
F64 6 0 1 16,67 0 5 83,33 0 0 0
F65 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F66 5 0 0 0 3 60 2 40 0 0
F67 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F68 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F69 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F70 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F71 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F72 2 0 2 100 0 0 0 0 0
F73 5 5 100 0 0 0 0 0 0
F74 3 0 0 0 0 0 3 100 0
F75 5 2 40 0 0 3 60 0 0 0
F76 5 1 20 0 0 4 80 0 0 0
F77 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F78 2 1 50 0 0 0 0 1 50 0
F79 0 ------ ------ ------ ------ ------ ------ ------
F80 15 0 0 0 15 100 0 0 0
F81 9 1 11 0 0 8 88,89 0 0 0
F82 7 0 0 0 7 100 0 0 0
F83 10 0 0 0 0 9 90 1 10 0
F84 6 0 0 0 6 100 0 0 0
F85 7 1 14 0 0 6 85,71 0 0 0
F86 3 0 0 0 0 0 3 100 0
F87 7 0 0 0 7 100 0 0 0
F88 2 0 0 0 2 100 0 0 0
F89 5 3 60 0 0 2 40 0 0 0
F90 4 0 0 0 4 100 0 0 0
F91 7 0 0 0 5 71,43 1 14,3 1 14,29 0
F92 3 0 0 0 3 100 0 0 0
F93 3 0 0 0 3 100 0 0 0

197
 Anejo II

Continuación tabla 2
Medio verde malaquita (AVM)
Muestra Total NºAlt %Alt NºAsp %Asp NºCla %Cla NºFus %Fus NºGeo %Geo NºMuc %Muc NºPen %Pen
F94 2 0 0 0 1 50 0 1 50 0
F95 6 0 0 0 6 100 0 0 0
F96 3 0 0 0 0 3 100 0 0
F97 2 0 0 0 1 50 0 1 50 0
F98 1 0 0 0 1 100 0 0 0
F99 17 0 0 0 17 100 0 0 0
F100 5 0 0 0 5 100 0 0 0
F101 3 1 33 0 0 2 66,67 0 0 0
Total 870 21 141 0 351 28 94 235

198
 Anejo II

Recuento de hongos maíz experimental

1º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.1-1 4 6 6 4 7 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.1-2 2 8 6 7 6 Bacterias
Penicillium sp.
P.1.P.1-3 2 4 5 4 5 Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.1.P.1-4 3 2 2 6 7 Fusarium sp., Penicillium sp. Levaduras
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.1-5 1 2 3 4 2 Bacterias
Penicillium sp.
P.1.V.1-1 1 - 2 1 - Penicillium sp. -
P.1.V.1-2 - 2 1 1 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.V.1-3 1 2 3 4 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.V.1-4 2 1 2 1 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.V.1-5 2 3 3 1 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.1-1 2 2 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.1-2 4 2 1 1 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.1-3 3 2 3 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
Alternaria sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.2.P.1-4 4 3 3 4 4 Bacterias
Penicillium sp.
Alternaria sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.2.P.1-5 3 2 2 1 2 -
Penicillium sp.
P.2.V.1-1 2 2 1 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.1-2 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.1-3 2 1 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.1-4 3 3 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.V.1-5 2 1 1 2 2 Fusarium sp. -
C.1.P.1-1 - - - - - -
C.1.P.1-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
C.1.P.1-3 - - 1 - - Fusarium sp. Bacterias
C.1.P.1-4 - - - - - -
C.1.P.1-5 - - - - - -
C.1.V.1-1 - - - - - Levaduras
C.1.V.1-2 - - - - - -
C.1.V.1-3 - - - - - -
C.1.V.1-4 - 1 - - - Fusarium sp. -
C.1.V.1-5 - - - - - -
C.2.P.1-1 - - - - - -
C.2.P.1-2 - - - - - -
C.2.P.1-3 - - 1 - - Penicillium sp. -
C.2.P.1-4 - - - - - -
C.2.P.1-5 - - 3 - - Penicillium sp. -
C.2.V.1-1 - - - - - -
C.2.V.1-2 - - - - - -
C.2.V.1-3 - - - 1 - Alternaria sp. -
C.2.V.1-4 - - - - - -
C.2.V.1-5 - - - - - -

199
 Anejo II

1º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
N.1.P.1-1 2 - - - 1 Fusarium sp. -
N.1.P.1-2 - - 1 1 1 Aspergillus sp. -
N.1.P.1-3 1 - 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Levaduras
N.1.P.1-4 1 1 1 1 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.1-5 1 1 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Levaduras
N.1.V.1-1 1 1 2 1 - Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.V.1-2 1 1 - - - Fusarium sp. Levaduras
N.1.V.1-3 - - - - - -
N.1.V.1-4 - - - - 1 Aspergillus sp. -
N.1.V.1-5 - - - - - Levaduras
N.2.P.1-1 1 2 1 1 - Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.P.1-2 - - - - - Levaduras
N.2.P.1-3 - - - - - -
N.2.P.1-4 - - - 1 - Fusarium sp. Levaduras
N.2.P.1-5 - - - - - Levaduras
N.2.V.1-1 1 - - - - Fusarium sp. -
N.2.V.1-2 1 - - - - Fusarium sp. -
N.2.V.1-3 - - - - - -
N.2.V.1-4 - - - 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.1-5 1 1 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
2º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.2-1 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.P.2-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.P.2-3 1 3 1 1 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. Mucoral
P.1.P.2-4 2 1 2 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.P.2-5 2 1 1 2 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.V.2-1 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.V.2-2 2 1 1 1 1 Aspergillus sp., -
P.1.V.2-3 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., -
P.1.V.2-4 2 3 2 3 3 Aspergillus sp., -
P.1.V.2-5 2 2 2 2 3 Aspergillus sp.,
P.2.P.2-1 1 2 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.P.2-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.P.2-3 1 2 1 1 2 Aspergillus sp. -
P.2.P.2-4 2 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.P.2-5 2 1 2 2 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.2.V.2-1 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., -
P.2.V.2-2 2 3 3 2 3 Aspergillus sp., , Fusarium sp. -
P.2.V.2-3 3 3 3 2 2 Aspergillus sp., , Fusarium sp. -
P.2.V.2-4 2 2 2 3 3 Aspergillus sp., , Fusarium sp. -
P.2.V.2-5 2 2 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

200
 Anejo II

2º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
C.1.P.2-1 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.1.P.2-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
C.1.P.2-3 1 1 1 - 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.1.P.2-4 1 1 1 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. Levaduras
C.1.P.2-5 1 - - 1 1 Aspergillus sp. -
C.1.V.2-1 1 1 1 1 - Aspergillus sp. -
C.1.V.2-2 - 1 1 - 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.2-3 - - - 1 - Aspergillus sp. -
C.1.V.2-4 - - 1 - - Aspergillus sp. -
C.1.V.2-5 1 1 - - 1 Aspergillus sp. -
C.2.P.2-1 1 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.P.2-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
C.2.P.2-3 1 - 1 1 - Aspergillus sp. -
C.2.P.2-4 1 - 1 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.2.P.2-5 1 1 - 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.V.2-1 1 - - 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.2-2 2 1 - - 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.2-3 1 1 1 - 1 Aspergillus sp. -
C.2.V.2-4 - 1 - - - Aspergillus sp. -
C.2.V.2-5 1 1 1 2 - Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.2-1 2 1 1 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.1.P.2-2 1 - 1 - 1 Aspergillus sp. -
N.1.P.2-3 1 - - 2 - Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.1.P.2-4 1 2 2 2 - Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.1.P.2-5 1 1 2 - - Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.1.V.2-1 - 1 1 - 1 Aspergillus sp. -
N.1.V.2-2 1 1 - - 1 Aspergillus sp. -
N.1.V.2-3 - 1 - 1 1 Aspergillus sp. -
N.1.V.2-4 1 1 1 - - Aspergillus sp. -
N.1.V.2-5 1 1 1 1 - Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.2.P.2-1 - 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.2-2 1 1 1 - 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Levaduras
N.2.P.2-3 1 2 1 - 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Levaduras
N.2.P.2-4 2 - 1 2 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. Levaduras
N.2.P.2-5 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.2-1 2 1 2 - - Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.2-2 1 - 1 - - Fusarium sp. -
N.2.V.2-3 1 2 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.2-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. Bacterias
N.2.V.2-5 - 1 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

201
 Anejo II

3º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.3-1 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.P.3-2 2 2 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.P.3-3 1 2 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.3-4 2 2 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.1.P.3-5 2 1 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.3-1 1 2 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.3-2 3 2 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.3-3 3 1 1 3 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.3-4 2 1 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.3-5 1 1 3 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.P.3-1 1 1 1 1 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp. -
P.2.P.3-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. Mucoral
P.2.P.3-3 1 1 1 2 1 Aspergillus sp. Mucoral
P.2.P.3-4 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. Mucoral
P.2.P.3-5 1 1 1 1 2 Aspergillus sp. Mucoral
P.2.V.3-1 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.3-2 1 2 2 1 2 Aspergillus sp., -
P.2.V.3-3 2 1 2 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.3-4 3 2 1 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.3-5 3 2 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.1.P.3-1 2 1 2 1 1 Aspergillus sp. -
C.1.P.3-2 1 1 - 1 - Aspergillus sp. -
C.1.P.3-3 1 - - 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. Levaduras
C.1.P.3-4 1 1 - - - Aspergillus sp. Levaduras
C.1.P.3-5 1 1 1 1 - Aspergillus sp. Bacterias
C.1.V.3-1 1 - - - - Fusarium sp. -
C.1.V.3-2 - - 1 - 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.3-3 1 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.3-4 1 - 2 - 1 Fusarium sp. -
C.1.V.3-5 1 - - - - Aspergillus sp. -
C.2.P.3-1 2 1 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.3-2 2 3 1 1 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. Levaduras
C.2.P.3-3 1 1 1 1 2 Aspergillus sp. Levaduras
C.2.P.3-4 2 2 1 1 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp. -
C.2.P.3-5 2 2 2 1 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.3-1 3 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.3-2 3 2 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.3-3 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Mucoral
C.2.V.3-4 1 2 1 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.3-5 - 1 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Mucoral

202
 Anejo II

3º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
N.1.P.3-1 - - - - - Levaduras
N.1.P.3-2 1 1 1 - 1 Fusarium sp. Levaduras
N.1.P.3-3 1 2 - 1 1 Fusarium sp. Levaduras
N.1.P.3-4 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
N.1.P.3-5 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
N.1.V.3-1 1 2 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
N.1.V.3-2 1 1 1 - 1 Fusarium sp. -
N.1.V.3-3 1 1 1 2 1 Fusarium sp., , Penicillium sp. -
N.1.V.3-4 1 1 1 2 - Fusarium sp., -
N.1.V.3-5 1 2 2 - 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.P.3-1 - - - - - Mucoral
N.2.P.3-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.P.3-3 1 1 1 1 2 Aspergillus sp. -
N.2.P.3-4 1 1 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
N.2.P.3-5 1 1 1 3 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.2.V.3-1 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.3-2 1 2 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.3-3 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.3-4 1 1 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.3-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
4º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.4-1 3 5 3 2 5 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.4-2 4 4 3 3 4 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.4-3 4 3 2 3 4 Bacterias
Penicillium sp.
P.1.P.4-4 - - - - - Mucoral
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.4-5 3 2 3 6 4 Bacterias
Penicillium sp.
P.1.V.4-1 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.4-2 1 2 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.4-3 1 2 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.4-4 2 1 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.4-5 3 1 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.4-1 2 1 1 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.4-2 1 1 2 1 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.4-3 - - - - - Mucoral
P.2.P.4-4 3 1 1 2 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.4-5 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp. -
P.2.V.4-1 1 3 3 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.4-2 1 2 2 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.4-3 2 4 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.4-4 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.4-5 2 3 2 3 2 Fusarium sp., -

203
 Anejo II

4º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
C.1.P.4-1 - - - - - Mucoral
C.1.P.4-2 2 1 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.1.P.4-3 1 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.1.P.4-4 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.1.P.4-5 1 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.1.V.4-1 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.4-2 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.4-3 2 2 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.4-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.4-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.P.4-1 - - - - - Mucoral
C.2.P.4-2 - - - - - Mucoral
C.2.P.4-3 - - - - - Mucoral
C.2.P.4-4 - - - - - Mucoral
C.2.P.4-5 1 2 2 2 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.V.4-1 2 1 1 2 1 Fusarium sp. -
C.2.V.4-2 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.4-3 - - - - - Mucoral
C.2.V.4-4 - - - - - Mucoral
C.2.V.4-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.P.4-1 1 2 - - 1 Penicillium sp. Levaduras
N.1.P.4-2 1 1 - 1 - Fusarium sp., Penicillium sp. Levaduras
N.1.P.4-3 1 1 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
N.1.P.4-4 4 - 6 2 - Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bact.,levaduras
N.1.P.4-5 2 4 4 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.1.V.4-1 2 - - - - Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.V.4-2 1 - - - 1 Fusarium sp. -
N.1.V.4-3 - 2 - 1 - Fusarium sp. -
N.1.V.4-4 2 - - - - Fusarium sp. -
N.1.V.4-5 1 - - 1 1 Fusarium sp. -
N.2.P.4-1 2 2 1 2 2 Aspergillus terreus, Fusarium sp. Bacterias
N.2.P.4-2 1 2 2 2 1 Aspergillus terreus, Fusarium sp. Bacterias
N.2.P.4-3 2 3 1 1 2 Aspergillus terreus, Fusarium sp. Bacterias
N.2.P.4-4 1 2 1 1 1 Aspergillus terreus, Fusarium sp. Bacterias
N.2.P.4-5 1 1 1 1 2 Aspergillus terreus, Fusarium sp. Bacterias
N.2.V.4-1 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
N.2.V.4-2 2 1 2 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.4-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.4-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.4-5 1 1 1 1 2 Fusarium sp. -

204
 Anejo II

5º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.5-1 1 1 3 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.5-2 1 1 2 1 1 Aspergillus sp., Aspergillus terreus -
P.1.P.5-3 2 1 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.P.5-4 1 1 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.P.5-5 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.5-1 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.5-2 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.5-3 2 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.5-4 3 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.5-5 2 2 2 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.P.5-1 1 1 2 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.2.P.5-2 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.P.5-3 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.2.P.5-4 1 2 2 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.2.P.5-5 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.V.5-1 3 1 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.5-2 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.5-3 2 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.5-4 2 3 2 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.5-5 3 3 7 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.1.P.5-1 2 2 2 1 2 Aspergillus terreus, Fusarium sp. -
C.1.P.5-2 3 2 2 1 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.5-3 2 2 2 3 2 -
Penicillium sp.
C.1.P.5-4 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.5-5 3 1 2 3 2 -
Penicillium sp.
C.1.V.5-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.5-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.5-3 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.5-4 1 1 3 2 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.5-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.P.5-1 1 1 1 2 2 Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.5-2 2 2 2 3 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.5-3 1 2 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.5-4 3 1 1 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.5-5 2 1 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.V.5-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.5-2 1 2 2 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.5-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.5-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.5-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -

205
 Anejo II

5º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
N.1.P.5-1 1 1 3 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.5-2 1 2 1 1 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.5-3 1 2 1 3 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.5-4 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
N.1.P.5-5 1 1 2 1 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
N.1.V.5-1 1 1 1 1 2 Fusarium sp. -
N.1.V.5-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.5-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.5-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.5-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.P.5-1 1 - - - 1 Penicillium sp. Bact.,levaduras
N.2.P.5-2 - - 1 1 - Aspergillus terreus, Penicillium sp. Bact.,levaduras
N.2.P.5-3 - - - - 1 Aspergillus terreus Levaduras
N.2.P.5-4 1 1 - - - Penicillium sp. Levaduras
N.2.P.5-5 - - 2 2 - Aspergillus sp., Penicillium sp. Levaduras
N.2.V.5-1 - - - 2 - Fusarium sp. -
N.2.V.5-2 - - - - - -
N.2.V.5-3 - 1 - - - Penicillium sp. -
N.2.V.5-4 - - 1 - - Penicillium sp. -
N.2.V.5-5 - - - - - -
6º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.6-1 2 2 3 3 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.6-2 1 1 2 1 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.6-3 2 1 1 2 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.6-4 3 1 1 2 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.6-5 3 1 2 2 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.V.6-1 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.V.6-2 2 1 1 1 2 Aspergillus sp. -
P.1.V.6-3 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.V.6-4 1 1 2 1 1 Aspergillus sp. -
P.1.V.6-5 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.P.6-1 1 1 1 1 1 Aspergillus sp. -
P.2.P.6-2 2 1 1 1 1 Aspergillus sp. Mucoral
P.2.P.6-3 1 2 2 1 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp. -
P.2.P.6-4 1 1 2 2 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp. -
P.2.P.6-5 2 2 2 3 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. Mucoral
P.2.V.6-1 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.6-2 3 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.6-3 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.6-4 2 2 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.6-5 2 3 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

206
 Anejo II

6º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
C.1.P.6-1 - - - - - Mucoral
C.1.P.6-2 2 2 1 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.6-3 - - - - - Mucoral
C.1.P.6-4 - - - - - Mucoral
C.1.P.6-5 - - - - - Mucoral
C.1.V.6-1 2 1 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.6-2 1 2 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.6-3 3 2 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.6-4 2 2 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.6-5 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.P.6-1 - - - - - Mucoral
C.2.P.6-2 - - - - - Mucoral
C.2.P.6-3 - - - - - Mucoral
C.2.P.6-4 - - - - - Mucoral
C.2.P.6-5 - - - - - Mucoral
C.2.V.6-1 1 1 2 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.6-2 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.6-3 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.6-4 2 2 1 1 2 Fusarium sp. -
C.2.V.6-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.P.6-1 1 2 3 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.1.P.6-2 1 1 1 2 1 Fusarium sp. Bacterias
N.1.P.6-3 1 3 2 1 1 Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.1.P.6-4 1 2 1 3 1 Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.6-5 3 4 1 1 3 -
Penicillium sp.
N.1.V.6-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.6-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.6-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.6-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.6-5 2 1 1 2 1 Fusarium sp. -
N.2.P.6-1 2 4 3 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.2.P.6-2 1 4 5 5 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.6-3 3 2 3 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.2.P.6-4 5 5 7 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.6-5 3 2 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.6-1 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.6-2 1 1 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.6-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.6-4 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
N.2.V.6-5 1 1 1 2 5 Fusarium sp. -

207
 Anejo II

7º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.7-1 1 1 1 1 2 Aspergilus flavus -
P.1.P.7-2 1 2 3 3 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Mucoral
P.1.P.7-3 1 2 3 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.7-4 2 1 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.7-5 3 2 4 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.V.7-1 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.7-2 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.7-3 2 2 2 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.7-4 2 2 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.7-5 3 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.7-1 2 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.7-2 1 1 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.7-3 3 4 2 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.7-4 3 2 4 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.7-5 3 3 3 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.V.7-1 2 2 3 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.7-2 4 4 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.7-3 3 2 3 4 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.7-4 3 3 5 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.7-5 2 2 3 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.1.P.7-1 2 2 2 3 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.7-2 1 5 1 3 3 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.7-3 2 2 1 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.7-4 3 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.7-5 2 4 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.V.7-1 2 - 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.7-2 1 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.7-3 1 2 - 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.1.V.7-4 1 3 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.7-5 1 3 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.2.P.7-1 2 2 2 1 2 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.2.P.7-2 2 3 3 2 3 Bacterias
Penicillium sp.
C.2.P.7-3 2 1 4 2 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.7-4 - - - - - Mucoral
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusariums sp.,
C.2.P.7-5 4 4 5 2 1 Bacterias
Penicillium sp.
C.2.V.7-1 2 2 1 1 1 Fusarium sp., -
C.2.V.7-2 1 2 2 1 1 Fusarium sp., -
C.2.V.7-3 4 1 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.7-4 2 1 5 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.7-5 1 2 3 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -

208
 Anejo II

7º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.7-1 3 3 4 5 2 Bacterias
Penicilium sp.
N.1.P.7-2 4 1 4 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.7-3 2 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.7-4 3 2 2 3 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.7-5 2 5 3 4 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.V.7-1 2 2 3 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.V.7-2 2 1 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
N.1.V.7-3 3 3 3 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
N.1.V.7-4 2 1 2 3 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.V.7-5 2 1 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.2.P.7-1 4 4 3 1 4 -
Penicillium sp.
N.2.P.7-2 5 3 3 4 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Levaduras
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Aspergillus sp.,
N.2.P.7-3 3 5 3 1 1 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Aspergillus sp.,
N.2.P.7-4 4 3 1 4 2 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Aspergillus sp.,
N.2.P.7-5 5 2 6 5 3 Bacterias
Penicillium sp.
N.2.V.7-1 1 2 2 1 3 Penicillium sp. -
N.2.V.7-2 3 2 1 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.7-3 3 1 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.7-4 2 2 3 1 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.7-5 3 3 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
8º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.8-1 4 3 5 4 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.8-2 3 4 3 5 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.1.P.8-3 3 2 3 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.8-4 4 2 3 4 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.8-5 4 4 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.V.8-1 2 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.8-2 2 3 3 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.8-3 4 3 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.8-4 2 3 4 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.8-5 3 1 1 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.P.8-1 3 3 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.8-2 4 4 3 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.2.P.8-3 3 3 4 2 3 Bacterias
Penicillium sp.
P.2.P.8-4 4 3 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.8-5 3 3 3 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.V.8-1 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
P.2.V.8-2 1 2 1 1 2 Fusarium sp. -
P.2.V.8-3 1 2 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.8-4 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.8-5 1 1 2 1 1 Fusarium sp. -

209
 Anejo II

8º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
N.1.P.8-1 2 2 3 4 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.1.P.8-2 2 2 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.8-3 3 2 2 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.1.P.8-4 6 4 3 4 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.8-5 5 4 3 3 4 -
Penicillium sp.
N.1.V.8-1 - - 1 1 2 Fusarium sp., -
N.1.V.8-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.8-3 2 1 1 2 1 Fusarium sp., -
N.1.V.8-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.8-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.P.8-1 2 2 4 3 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
N.2.P.8-2 1 2 2 1 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.2.P.8-3 2 3 1 2 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.2.P.8-4 3 2 2 2 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
N.2.P.8-5 2 2 2 4 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.2.V.8-1 3 2 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.8-2 2 3 2 2 2 Fusarium sp., , Penicillium sp. -
N.2.V.8-3 2 2 3 3 1 Fusarium sp., , Penicillium sp. -
N.2.V.8-4 3 3 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
N.2.V.8-5 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
9º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.9-1 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Aspergillus sp. Mucoral
P.1.P.9-2 - - - - - Mucoral
P.1.P.9-3 2 2 3 2 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.9-4 1 2 2 2 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.9-5 2 2 2 3 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.V.9-1 2 3 2 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.9-2 1 3 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.9-3 2 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.9-4 3 3 1 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Mucoral
P.1.V.9-5 1 2 3 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.9-1 - - - - - Mucoral
P.2.P.9-2 - - - - - Mucoral
P.2.P.9-3 - - - - - Mucoral
P.2.P.9-4 - - - - - Mucoral
P.2.P.9-5 - - - - - Mucoral
P.2.V.9-1 1 2 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.9-2 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.9-3 2 1 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.9-4 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.9-5 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

210
 Anejo II

9º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.9-1 6 4 5 4 2 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.9-2 5 4 4 6 5 -
Penicillium sp.
C.1.P.9-3 4 4 3 4 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.9-4 2 3 1 3 3 Aspergillus sp., Penicillium sp. Mucoral
C.1.P.9-5 - - - - - Mucoral
C.1.V.9-1 5 6 6 6 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.9-2 5 8 5 7 6 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.9-3 5 6 3 5 4 , Penicillium sp. -
C.1.V.9-4 4 6 6 5 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.9-5 3 4 6 5 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.2.P.9-1 2 3 2 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.9-2 2 3 3 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.9-3 3 2 4 1 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.9-4 2 2 1 2 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.9-5 3 4 2 2 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.V.9-1 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
C.2.V.9-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.9-3 2 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.9-4 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
C.2.V.9-5 1 2 2 1 1 Fusarium sp. -
N.1.P.9-1 5 3 3 6 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.9-2 2 2 1 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.9-3 2 3 1 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.9-4 2 2 1 1 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.9-5 3 2 4 1 2 Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.1.V.9-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.9-2 1 1 2 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.9-3 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
N.1.V.9-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.9-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.P.9-1 2 2 2 4 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.9-2 3 3 1 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.9-3 2 2 1 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.9-4 2 3 2 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.9-5 1 2 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
N.2.V.9-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.9-2 1 1 2 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.9-3 2 1 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.9-4 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.9-5 1 1 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

211
 Anejo II

10º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.10-1 - - - - - Mucoral
P.1.P.10-2 - - - - - Mucoral
P.1.P.10-3 - - - - - Mucoral
P.1.P.10-4 - - - - - Mucoral
P.1.P.10-5 1 2 2 2 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.V.10-1 1 3 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.10-2 1 2 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.10-3 1 1 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.10-4 1 1 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.10-5 3 4 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.P.10-1 5 4 5 7 6 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.2.P.10-2 5 4 5 4 3 Penicillium sp. -
P.2.P.10-3 3 4 5 4 6 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.10-4 3 5 3 2 4 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.10-5 - - - - - Mucoral
P.2.V.10-1 3 2 2 3 2 Penicillium sp. -
P.2.V.10-2 2 4 2 3 2 Penicillium sp. -
P.2.V.10-3 2 3 1 4 2 Penicillium sp. -
P.2.V.10-4 3 4 2 3 3 Aspergillus sp., -
P.2.V.10-5 3 4 2 1 3 Aspergillus sp., Bacterias
C.1.P.10-1 - - - - - Mucoral
C.1.P.10-2 - - - - - Mucoral
C.1.P.10-3 - - - - - Mucoral
C.1.P.10-4 - - - - - Mucoral
C.1.P.10-5 - - - - - Mucoral
C.1.V.10-1 1 2 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.10-2 1 3 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.10-3 1 2 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.10-4 2 2 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.10-5 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.P.10-1 4 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.10-2 1 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.10-3 3 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.10-4 3 2 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.P.10-5 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. Bacterias
C.2.V.10-1 4 3 1 2 3 Fusarium sp., -
C.2.V.10-2 2 2 3 2 4 Fusarium sp., -
C.2.V.10-3 4 4 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.10-4 2 2 3 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.10-5 3 2 4 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -

212
 Anejo II

10º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
N.1.P.10-1 2 3 4 2 2 Acremonium sp., Fusarium sp. -
N.1.P.10-2 3 2 3 2 2 Acremonium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.10-3 3 4 3 3 3 Acremonium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. -
Acremonium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.10-4 2 4 3 3 4 -
Penicillium sp.
Acremonium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.10-5 5 2 3 3 4 -
Penicillium sp.
N.1.V.10-1 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.10-2 1 1 1 2 2 Fusarium sp. -
N.1.V.10-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.10-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.10-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.P.10-1 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.P.10-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.P.10-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. Bacterias
N.2.P.10-4 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.P.10-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. Bacterias
N.2.V.10-1 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.10-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.10-3 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
N.2.V.10-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.10-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. Bacterias
11º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.11-1 2 3 2 2 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.11-2 - - - - - Mucoral
P.1.P.11-3 - - - - - Mucoral
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.11-4 3 4 3 3 3 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.1.P.11-5 3 3 4 3 3 Mucoral
Penicillium sp.
P.1.V.11-1 3 2 3 2 1 Fusarium sp., -
P.1.V.11-2 2 2 2 4 3 Fusarium sp., -
P.1.V.11-3 3 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.11-4 3 3 3 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.11-5 3 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.P.11-1 - - - - - Mucoral
P.2.P.11-2 3 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.11-3 2 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.11-4 3 3 3 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.11-5 4 1 2 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.V.11-1 3 3 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.11-2 5 3 4 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.11-3 3 3 2 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.11-4 3 3 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.11-5 1 2 2 4 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -

213
 Anejo II

11º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
Acremonium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.11-1 5 6 5 4 3 -
Penicillium sp.
C.1.P.11-2 5 4 6 5 7 Acremonium sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.11-3 7 8 5 7 5 Acremonium sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
Acremonium sp., Aspergillus sp, Fusarium sp.,
C.1.P.11-4 5 4 6 7 6 Bacterias
Penicillium sp.
Acremonium sp., Aspergillus sp, Fusarium sp.,
C.1.P.11-5 3 6 7 4 4 Bacterias
Penicillium sp.
C.1.V.11-1 1 2 3 1 2 Fusarium sp., -
C.1.V.11-2 1 2 3 2 3 Fusarium sp., -
C.1.V.11-3 2 2 1 1 1 Fusarium sp., -
C.1.V.11-4 2 2 2 2 1 Fusarium sp., -
C.1.V.11-5 3 3 1 1 2 Fusarium sp., -
C.2.P.11-1 3 2 2 2 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.2.P.11-2 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.2.P.11-3 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.2.P.11-4 3 2 2 2 3 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.2.P.11-5 1 1 2 2 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.2.V.11-1 1 1 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.11-2 2 2 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.11-3 1 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.11-4 1 2 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.V.11-5 1 2 1 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.P.11-1 1 2 4 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp, Penicillium sp. -
N.1.P.11-2 3 3 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp, Penicillium sp. Mucoral
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.11-3 2 2 3 2 3 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.11-4 2 3 3 3 3 -
Penicillium sp.
N.1.P.11-5 2 2 2 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.V.11-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.11-2 1 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.V.11-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.11-4 1 2 2 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.11-5 2 1 1 1 2 Fusarium sp. -
N.2.P.11-1 3 2 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.11-2 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.11-3 1 2 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.11-4 2 2 4 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.11-5 4 2 2 2 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.11-1 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.11-2 2 1 1 2 1 Fusarium sp. -
N.2.V.11-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.11-4 1 1 3 1 2 Fusarium sp. -
N.2.V.11-5 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -

214
 Anejo II

12º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.12-1 - - - - - Mucoral
P.1.P.12-2 - - - - - Mucoral
P.1.P.12-3 - - - - - Mucoral
P.1.P.12-4 - - - - - Mucoral
P.1.P.12-5 - - - - - Mucoral
P.1.V.12-1 3 2 4 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.12-2 2 3 3 4 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.12-3 3 3 3 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.12-4 2 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.12-5 3 2 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.2.P.12-1 4 4 3 5 6 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.2.P.12-2 5 4 4 6 4 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Aspergillus sp.,
P.2.P.12-3 4 3 3 3 4 Mucoral
Fusarium sp, Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
P.2.P.12-4 4 5 6 3 4 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Aspergillus sp.,
P.2.P.12-5 4 4 4 5 4 -
Fusarium sp, Penicillium sp.
P.2.V.12-1 1 2 1 1 2 Fusarium sp., -
P.2.V.12-2 3 2 2 1 4 Fusarium sp., -
P.2.V.12-3 2 3 2 2 1 Fusarium sp., -
P.2.V.12-4 2 3 2 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.V.12-5 2 2 2 3 1 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.1.P.12-1 5 4 3 4 5 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.12-2 5 4 6 4 6 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.12-3 5 4 3 5 6 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.12-4 4 4 8 5 4 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.12-5 5 6 6 5 4 -
Penicillium sp.
C.1.V.12-1 2 3 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.12-2 2 3 2 3 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.12-3 2 3 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.12-4 2 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.12-5 3 4 2 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.12-1 4 3 4 4 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.12-2 3 5 4 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.12-3 3 2 4 6 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.12-4 3 2 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.12-5 3 3 2 3 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.V.12-1 1 2 2 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.12-2 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.12-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.12-4 2 2 2 2 1 Fusarium sp. -
C.2.V.12-5 2 2 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

215
 Anejo II

12º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
N.1.P.12-1 5 3 4 4 5 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.12-2 7 5 7 4 8 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.12-3 3 5 4 4 5 Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.12-4 5 4 6 7 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.P.12-5 3 3 4 5 7 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.V.12-1 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.12-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.12-3 1 2 1 1 2 Fusarium sp. -
N.1.V.12-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.1.V.12-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.2.P.12-1 5 5 4 7 8 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.2.P.12-2 5 6 4 5 4 -
Penicillium sp.
N.2.P.12-3 4 7 8 6 7 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.P.12-4 5 4 5 7 - Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.2.V.12-1 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.12-2 2 1 1 1 2 Fusarium sp. -
N.2.V.12-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
N.2.V.12-4 3 4 2 1 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -
13º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.13-1 4 3 4 5 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Mucoral
P.1.P.13-2 3 4 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Mucoral
P.1.P.13-3 - - - - - Mucoral
P.1.P.13-4 3 4 3 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.P.13-5 - - - - - Mucoral
P.1.V.13-1 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.13-2 2 1 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.13-3 2 2 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.13-4 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.13-5 2 2 1 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.P.13-1 3 2 5 4 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.13-2 5 3 4 2 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.13-3 3 5 4 4 6 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.13-4 2 4 3 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.13-5 3 2 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.V.13-1 2 2 2 3 1 Fusarium sp. -
P.2.V.13-2 1 2 1 2 1 Fusarium sp. -
P.2.V.13-3 1 1 1 2 1 Fusarium sp. -
P.2.V.13-4 2 3 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.13-5 3 1 1 1 1 Fusarium sp. -

216
 Anejo II

13º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
C.1.P.13-1 3 2 3 2 4 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
C.1.P.13-2 3 2 4 3 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.13-3 2 2 3 4 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.13-4 3 2 3 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.P.13-5 2 3 2 3 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.1.V.13-1 1 1 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.13-2 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.13-3 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.13-4 3 3 1 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.1.V.13-5 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.P.13-1 6 5 7 6 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.13-2 3 5 6 4 7 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.13-3 5 7 4 6 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.13-4 3 5 5 5 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.13-5 3 3 5 4 5 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.V.13-1 1 2 1 1 3 Fusarium sp. -
C.2.V.13-2 2 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.13-3 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.13-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.13-5 2 2 1 1 1 Fusarium sp. -
14º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
P.1.P.14-1 4 3 4 3 3 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.14-2 3 4 3 5 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. Mucoral
P.1.P.14-3 2 3 2 2 3 Aspergillus sp., Penicillium sp. Mucoral
P.1.P.14-4 3 3 5 4 2 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
P.1.P.14-5 2 3 4 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.1.V.14-1 1 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.1.V.14-2 2 2 3 1 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.14-3 2 2 2 5 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.14-4 3 2 2 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.1.V.14-5 3 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
P.2.P.14-1 2 3 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Bacterias
P.2.P.14-2 2 2 4 4 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.14-3 3 3 4 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
P.2.P.14-4 3 3 4 3 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Mucoral
P.2.P.14-5 3 2 4 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. Mucoral
P.2.V.14-1 2 2 3 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.14-2 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
P.2.V.14-3 1 1 2 2 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
P.2.V.14-4 1 1 1 1 3 Fusarium sp. -
P.2.V.14-5 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -

217
 Anejo II

14º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
C.1.P.14-1 - - - - - Mucoral
C.1.P.14-2 - - - - - Mucoral
C.1.P.14-3 5 4 4 5 7 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.14-4 7 4 6 5 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.14-5 7 5 6 7 4 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.14-1 2 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.14-2 2 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.14-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.14-4 2 1 1 2 1 Fusarium sp. -
C.1.V.14-5 2 1 1 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
C.2.P.14-1 3 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.14-2 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.14-3 2 3 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.14-4 3 3 3 3 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.P.14-5 2 2 2 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.V.14-1 3 2 2 2 4 Fusarium sp., -
C.2.V.14-2 2 2 1 1 2 Fusarium sp., -
C.2.V.14-3 2 3 1 2 2 Fusarium sp., -
C.2.V.14-4 3 1 1 1 1 Fusarium sp., -
C.2.V.14-5 3 2 2 2 1 Fusarium sp., -
N.1.P.14-1 - - - - - Mucoral
N.1.P.14-2 - - - - - Mucoral
N.1.P.14-3 - - - - - Mucoral
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
N.1.P.14-4 3 4 3 3 3 -
Penicillium sp.
N.1.P.14-5 2 2 3 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
N.1.V.14-1 2 1 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.V.14-2 1 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.V.14-3 2 2 1 2 1 Fusarium sp. -
N.1.V.14-4 2 2 2 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.1.V.14-5 2 2 3 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.P.14-1 2 2 3 1 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.2.P.14-2 1 2 1 1 2 Aspergillus sp. -
N.2.P.14-3 2 2 1 1 1 Aspergillus sp. -
N.2.P.14-4 2 1 2 2 2 Aspergillus sp. -
N.2.P.14-5 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
N.2.V.14-1 2 3 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
N.2.V.14-2 2 2 2 2 3 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
N.2.V.14-3 2 2 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp. -
N.2.V.14-4 3 3 2 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
N.2.V.14-5 2 1 2 1 1 Aspergillus sp., Fusarium sp. -

218
 Anejo II

15º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
C.1.P.15-1 2 3 3 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.15-2 3 2 2 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.15-3 1 1 2 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.P.15-4 1 1 1 2 1 Penicillium sp. -
C.1.P.15-5 2 2 1 1 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.15-1 3 3 2 2 3 Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.15-2 2 2 1 1 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.15-3 2 4 2 3 2 Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.1.V.15-4 2 1 2 2 2 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.1.V.15-5 3 3 4 3 4 Fusarium sp., , Penicillium sp. -
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.2.P.15-1 4 3 3 3 2 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.2.P.15-2 5 4 3 3 6 Bacterias
Penicillium sp.
C.2.P.15-3 5 4 4 2 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.15-4 4 3 7 3 3 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.P.15-5 4 2 3 2 2 Aspergillus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. Bacterias
C.2.V.15-1 3 4 2 2 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.15-2 1 2 1 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., -
C.2.V.15-3 2 2 1 3 2 Aspergillus sp., Fusarium sp., , Penicillium sp. -
C.2.V.15-4 1 2 1 1 1 Fusarium sp., Penicillium sp. -
C.2.V.15-5 1 2 1 1 1 Aspergillus sp., Penicillium sp. -
16º MUESTREO
PLACA G1 G2 G3 G4 G5 HONGOS OTROS
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.16-1 3 2 2 4 1 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.16-2 3 3 3 4 3 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.16-3 6 3 3 2 2 Bacterias
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.16-4 2 3 2 1 2 -
Penicillium sp.
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.1.P.16-5 1 3 2 3 3 -
Penicillium sp.
C.1.V.16-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.16-2 1 2 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.16-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.16-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.1.V.16-5 1 2 2 2 1 Fusarium sp. -
C.2.P.16-1 - - - - - Mucoral
C.2.P.16-2 - - - - - Mucoral
C.2.P.16-3 - - - - - Mucoral
Aspergillus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp.,
C.2.P.16-4 4 4 3 3 5 Bacterias
Penicillium sp.
C.2.P.16-5 - - - - - Mucoral
C.2.V.16-1 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.16-2 1 1 2 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.16-3 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.16-4 1 1 1 1 1 Fusarium sp. -
C.2.V.16-5 2 1 1 1 3 Fusarium sp., Penicillium sp. -

219
Anejo III

Figura 32. Electroferograma obtenido mediante programa CHROMAS. Secuencia

“hacia delante” (forward). Aislado F30P51

220
 Anejo III

Figura 33. Electroferograma obtenido mediante programa CHROMAS. Secuencia “hacia

atrás” (reverse) Aislado F30P51

221
Anejo III

Figura 34. Electroferograma obtenido mediante programa CHROMAS. Secuencia “hacia

delante” (forward). Aislado P 5.5.1

222
 Anejo III

Figura 35. Electroferograma obtenido mediante programa CHROMAS. Secuencia “hacia

atrás” (reverse). Aislado P 5.5.1

223
Anejo III

Figura 36. Electroferograma obtenido mediante programa CHROMAS. Secuencia “hacia

delante” (forward). Aislado P.2.V.4-4

224
 Anejo III

Figura 37. Electroferograma obtenido mediante programa CHROMAS. Secuencia “hacia

atrás” (reverse). Aisldo P.2.V.4-4

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 Yo vengo de montañas que se abrazan,
de selvas y montes que cantan,
de ríos y quebradas que ríen;
donde se disfruta bien,
lo bueno que es ser hombre, Colombia.

Gracias a Dios

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