REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERAZA (PCR)

El descubrimiento de la estructura del ADN por Watson y Crick marcó un antes y un

después en el estudio de los ácidos nucleicos. A partir de entonces, se desarrollaron

métodos avanzados para investigarlos, destacando la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR), creada por Kary Mullis, que transformó la biología molecular al

facilitar el análisis del ADN.

FUNDAMENTOS

La PCR es una reacción enzimática in vitro usada para amplificar

(crear copias) fragmentos de ADN. Esta reacción permite que unos

pocos fragmentos de ADN se repliquen en millones o miles de

millones de copias.

Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde

(ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los

desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y

guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora

o buffer y H2O.

. Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados

termocicladores, permite calentar y enfriar los tubos de reacción para

controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.

ELEMENTOS QUÍMICOS NECESARIOS EN PCR

 ADN: elemento principal en la PCR

En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan como

molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan el gen de interés.

 ADN polimerasa: sintetiza las nuevas cadenas de ADN que llevan el gen de

interés

es una enzima que proviene de una bacteria llamada Thermus aquaticus.

puede soportar el calor necesario para separar las cadenas de ADN durante el

proceso, manteniendo su actividad para sintetizar nuevas hebras , Lo que la hace

termoestable.

 Primers: (dNTPs, Mg +, buffer y H2 O.)

son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que

se desea amplificar y son complementarios a ésta.

En la PCR, se usan dos secuencias diferentes de primers (cebadores):

Forward (sentido):

Se une a una cadena del ADN templado en dirección 3' → 5' para que la Taq polimerasa

pueda extender en dirección 5' → 3'.

Reverse (antisentido):

Se une a la otra cadena complementaria del templado en dirección 3' → 5', permitiendo

también la extensión en dirección 5' → 3'.

dNTP’s: adenina, timina, citosina y guanina son los ladrillos o bases nitrogenadas

con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN.

Buffer: es la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está

compuesta de Tris-HCL (pH = 8)

Magnesio: cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción, necesario

para que la Taq polimerasa funcione correctamente

ETAPAS PRINCIPALES

Cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalización,

hibridación y extensión.

1. Desnaturalización: en esta etapa se calienta el ADN a 95°C durante unos 20-30

segundos para separar sus dos cadenas.

El tiempo puede variar según la secuencia del ADN y la velocidad de

calentamiento del equipo. Las bases G-C necesitan más tiempo para separarse

que las bases A-T.

Al final, se obtienen dos cadenas separadas que servirán para la siguiente etapa

de la PCR.

2. Hibridación: es esta etapa, los primers se alinean con las cadenas de ADN

separadas en el extremo 3’ y se hibridan (unen) a las secuencias

complementarias.

Para que esto ocurra correctamente, la temperatura de hibridación debe ser

adecuada, generalmente entre 50-60°C.

Si los primers están bien diseñados y la temperatura es la correcta, el complejo

formado entre el ADN y los primers será estable y específico.

3. EXTENSIÓN: En esta etapa, la Taq polimerasa comienza a agregar los

dNTPs complementarios al complejo formado por el ADN y los primers,

creando nuevas cadenas de ADN.

La síntesis ocurre en dirección de 5’ a 3’.

 La temperatura óptima para esta reacción es de 72°C

Al final del ciclo, se habrán generado los amplicones (fragmentos de ADN

amplificados), cuyo tamaño depende del número de pares de bases que el

investigador quiere amplificar.

ANALÍSIS DEL PRODUCTO DE AMPLIFICACIÓN

Al final de la PCR, para verificar si la reacción fue exitosa, se utilizan geles de agarosa

en un proceso llamado electroforesis.

En la electroforesis, las moléculas grandes como los ácidos nucleicos se separan en un

gel, que actúa como un filtro. Las moléculas se mueven a través del gel cuando se aplica

un campo eléctrico, y se separan según su tamaño y carga eléctrica.

(Los productos de la PCR o amplicones están representados mediante bandas de un

tamaño específico)

Principales Características de la PCR

Especificidad:

 La PCR amplifica únicamente la secuencia de ADN que se desea,

Sensibilidad:

 Puede detectar cantidades extremadamente pequeñas de ADN, incluso una sola

molécula.

Rapidez:

 Los ciclos de amplificación (desnaturalización, hibridación y extensión) se

repiten muchas veces, lo que permite obtener una gran cantidad de copias de
ADN en un tiempo relativamente corto.

Versatilidad:

 Tiene múltiples aplicaciones en diversos campos, como la medicina forense, la

detección de enfermedades infecciosas, la investigación genética y la
biotecnología.
 Automatización:

 Los termocicladores permiten automatizar el proceso, lo que reduce la

intervención manual y aumenta la reproducibilidad de los resultados.

TIPOS DE MUESTRAS PARA PCR

Las pruebas buscan pequeñas cantidades de material genético de un patógeno (el

organismo que causa una enfermedad) o células anormales en una muestra de sangre,

saliva, mucosidad o tejido. El tipo de material genético puede ser:

 ADN: Contiene la información genética necesaria para que una persona y la

mayoría de los demás seres vivos se desarrollen y crezcan.
 ARN: Contiene información copiada del ADN. Algunos virus utilizan ARN en
lugar de ADN para transportar su información genética

Hay diferentes maneras de obtener una muestra para una prueba de PCR.
El tipo de muestra dependerá del patógeno o condición genética que se esté estudiando.

Muestras respiratorias

 Hisopado nasofaríngeo o orofaríngeo: Comúnmente utilizado para detectar

infecciones respiratorias virales o bacterianas, como SARS-CoV-2, influenza o
estreptococo.
 Esputo: Para infecciones pulmonares, como tuberculosis.

2. Sangre

 Se utiliza para detectar patógenos en el torrente sanguíneo, como en el caso de

infecciones virales (VIH, hepatitis) o bacteriemias.
 También para evaluar mutaciones genéticas o trastornos hereditarios.

3. Tejidos

 Se pueden tomar biopsias de tejidos sólidos para detectar mutaciones genéticas,

marcadores tumorales o infecciones localizadas.

4. Fluidos corporales

 Líquido cefalorraquídeo (LCR): Para detectar infecciones del sistema nervioso

central, como meningitis bacteriana o encefalitis viral.
 Orina: Para infecciones del tracto urinario o detección de enfermedades de
transmisión sexual (ETS), como el virus del papiloma humano (VPH) o
Chlamydia.
 Saliva: Utilizada en diagnósticos rápidos, por ejemplo, en pruebas de SARS-
CoV-2 o detección de enfermedades virales.
5. Muestras genéticas de células epiteliales

 Hisopado bucal: Frecuente para pruebas genéticas no invasivas, como pruebas

de parentesco o análisis de ADN para investigaciones forenses.

6. Heces

 Para detección de patógenos gastrointestinales como Clostridium difficile,

rotavirus o parásitos.

7. Otros tipos de muestras

 Seminal o vaginal: Para estudios relacionados con fertilidad, infecciones de

transmisión sexual, o análisis forense.
 Cabello, uñas o piel: Usado en análisis forenses o para detectar ciertas
enfermedades.

TIPOS DE PCR
Cada tipo de PCR tiene un uso especializado, dependiendo del objetivo de la
investigación, como amplificar secuencias específicas, cuantificar material genético
o analizar la expresión génica.

 PCR Anidada:

 Es una técnica muy sensible en la que el producto de una PCR se utiliza como
molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que están dentro
de la primera secuencia amplificada. Es útil para amplificar fragmentos muy
específicos del genoma.

 PCR In Situ:

 Se realiza sobre preparaciones de tejido fijado en un portaobjetos. Primero se

amplifica el ADN blanco, y luego se detecta mediante hibridación in situ con
sondas de ADN/ARN. Es útil para detectar secuencias de ADN dentro de las
células, que no pueden ser detectadas por otras técnicas.

 PCR Múltiple:

 Permite amplificar varias secuencias de ADN simultáneamente en un solo tubo

de reacción. Se combinan múltiples pares de cebadores para amplificar
diferentes segmentos de ADN al mismo tiempo.

 PCR con Transcriptasa Inversa (RT-PCR):

 Utiliza ARN como molde en lugar de ADN. Primero se retrotranscribe el ARN

en ADNc (ADN complementario) y luego se amplifica. Es útil para estudiar la
expresión de genes o para genotipar virus de ARN como el SARS-CoV o el
VIH.
 PCR en Tiempo Real o PCR Cuantitativo (qPCR):

 Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN en la muestra original. Se basa

en la medición de la temperatura de fusión (Tm) del ADN amplificado y se
usa frecuentemente para analizar la expresión génica. Puede ser no específico
(con fluorocromos) o específico (con sondas).

OPTIMIZACIÓN DE PCR
La optimización de la PCR es un proceso clave para asegurar que la reacción sea
eficiente, específica y produzca una amplificación de ADN de alta calidad.

Las claves para optimizarla son:

1. Evitar la contaminación con ADN extraño, ya que la PCR es muy sensible y

amplifica incluso pequeñas cantidades de ADN.
2. Manejo adecuado de las muestras antes de la amplificación (recolección,
envío y procesamiento).
3. Limpieza y esterilización de superficies de trabajo y uso de cabinas de
seguridad biológica para reducir riesgos de contaminación.
4. Separar áreas de trabajo en laboratorios de diagnóstico genético para evitar
contaminación cruzada.
5. Protección adecuada del personal al manipular muestras e instrumentos.

PROEVA DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO

Una prueba de diagnóstico rápido (PDR) es una prueba médica fácil y rápida de
hacer.

Se usa para detectar problemas de salud de manera rápida, especialmente en

emergencias o en lugares con pocos recursos.

También permite hacer pruebas en el mismo lugar de atención, sin necesidad de un

laboratorio.

Los resultados se obtienen el mismo día, normalmente en 20 minutos o máximo en 2

horas.

Según la Unión Europea, estas pruebas son dispositivos que dan resultados rápidos sin
procesos automáticos, y se usan individualmente o en pequeñas cantidades.
ejemplos de RDT:

Prueba rápida de COVID-19 Los resultados se obtienen en 5 a 30 minutos. Estas

pruebas tienen una alta especificidad (98%-99%), lo que significa que los falsos
positivos son raros. Sin embargo, su sensibilidad (capacidad para detectar
correctamente a los infectados) es del 70%-72%, que es menor que la de las pruebas
PCR de COVID-19, que tienen una sensibilidad del 88%-96%.

APLICACIONES

son muy diversas y abarcan varios campos de la medicina, la biología, las ciencias
forences y la investigación.

INVESTOGACIONES

La PCR convencional es una técnica rápida y confiable que se usa en investigaciones

de laboratorio.

clonación de ADN, que consiste en copiar una secuencia de ADN e insertarla en un

plásmido o vector para estudiarla.

recombinación dirigida, donde los cebadores permiten que una enzima especial inserte
el ADN en el vector.

MEDICINA

La PCR se usa en medicina para detectar enfermedades genéticas e infecciones:

1. Enfermedades genéticas: Ayuda a identificar mutaciones en el ADN que

causan enfermedades hereditarias, analizando el ADN de los padres o los hijos,
y también en pruebas prenatales y embrionarias.
2. Infecciones: Se usa para identificar bacterias y virus, como el VIH, y medir la
carga viral para conocer el avance de la enfermedad.
3. Donantes de sangre: Detecta infecciones (como VIH o Hepatitis B) en
donantes, incluso en etapas tempranas.
4. Trasplantes: Ayuda en pruebas de compatibilidad y detección de infecciones en
personas que reciben un trasplante.
5. Tratamientos personalizados: Se usa para adaptar tratamientos médicos según
el perfil genético de cada paciente.
CIENCIAS FORENCES

En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o para
obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como
saliva, semen u otros restos de tejidos