Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas

Escuela Profesional de Ingeniería Biotecnológica

MICROBIOLOGIA I

Práctica N° 2: Técnicas de coloración I

 Identificación Bacteriana
• Características microscópicas
• Características macroscópicas (morfología y pigmentación)
• Cultivo en medios selectivos/ diferenciales
• Pruebas bioquímicas (Ureasa, citrato, nitratos, coagulasa, catalasa y ONPG)
Métodos fenotípicos
• Antibiogramas

• PCR, ARNr 5S, 16S, 23S

• Secuenciación masiva immunología (ELISA)
Métodos moleculares

• Caracteritzación del conjunto de proteínas expresadas per un genoma “PROTEOMA”

• MALDI-TOFF
Métodos proteómicas
Observación microscópica de los
microorganismos
• La morfología de los microorganismos puede examinarse usando un microscopio óptico.
• Los microorganismos se pueden observar directamente al microscopio (en fresco). Sin
embargo, dado que las bacterias son casi incoloras y su tamaño es muy pequeño, existe
muy poco contraste entre la célula y el medio que la rodea, lo que dificulta su
visualización usando un microscopio óptico normal.
• Para aumentar el contraste y distinguir mejor las células se pueden utilizar colorantes.
Algunos colorantes sirven también para distinguir distintos tipos de bacterias o revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares; tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
• Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen
estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben
tomarse precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al
creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
Colorantes
• Los colorantes son compuestos aromáticos solubles en agua
(generalmente en forma de sales), que contienen un ión orgánico
coloreado y otro ión inorgánico.
• El colorante es ácido si la porción coloreada tiene carga negativa, es decir,
si tiene un anión coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras
de la célula que presenten la misma carga, como es el caso de la
superficie bacteriana.
• El colorante se denomina básico si la porción coloreada es el
catión, cargado positivamente y con afinidad por estructuras de la célula
con carga negativa, como es la superficie celular.
• Las bacterias toman mejor los colorantes básicos, como son el
cristal violeta, el azul de metileno y la safranina. La eosina es un colorante
de tipo ácido, así como la nigrosina.
Examen al fresco
Observar los microorganismos vivos y la presencia de otros elementos.
• La muestra a examinar se sitúa entre un portaobjetos y cubreobjetos.
• Si la muestra proviene de una muestra sólida, se debe de emulsificar en
una gota de agua destilada o solución salina; si el material es líquido,
se deposita directamente entre el porta y cubreobjetos.
 Examen al fresco
Montaje húmedo Montaje en gota pendiente
• Depositar una gota de la • Depositar una gota de la muestra
muestra tomada con asa de en el centro de un cubreobjetos
siembra previamente flameada, limpio y colocarlo invertido sobre
en un portaobjetos y colocar el pocillo de un portaobjetos
sobre ella un cubreobjetos excavado, de manera que la gota
presionando suavemente. no se mueva ni tome contacto con
FRESCO SIMPLE los lados o el fondo de la
CÁMARA HÚMEDA depresión.
(LAMINA/LAMINILLA)
 PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA PENDIENTE
Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer:
• Motilidad de los microorganismos
• Agrupaciones naturales
• Reacciones en presencia de ciertas sustancias químicas.
✓ Son aquellas que se realizan por la acción de la tención superficial que
tienen las suspensiones de los microorganismos
✓ El espacio del líquido que mantiene el portaobjeto es mayor de manera que
la preparación tiene un mayor tiempo de vida
✓ Al no encontrar laminas excavadas, realizamos una, usando cera de vela y
con ayuda de un sacabocados.
✓ Se coloca una gota en el cubre objetos que previamente ha sido untada un
poco con vaselina cruda o cera.
✓ Se le coloca en forma invertida en el porta objetos que artesanalmente
fabricamos.
Tinción de los microorganismos
PREPARACIÓN DEL FROTIS:
• Puede prepararse a partir de productos
líquidos o sólidos.
• Si es líquido, se coloca sobre un
portaobjetos de vidrio limpio y seco, una
gota del material a estudiar y se extiende
con ayuda del asa de Kolle.
• Si es un cultivo en medio sólido, puede
prepararse una suspensión del material
en una gota de solución salina colocada
previamente en el portaobjetos,
extendiéndola con ayuda del asa de kolle.
PREPARACIÓN DEL FROTIS:
EXTENSIÓN
a) Frotis o película (extensión)
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
PREPARACIÓN DEL FROTIS
b) SECADO
• Debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la
superficie pasa de ser brillante a mate; para acelerar el secado se
puede calentar ligeramente la parte inferior del portaobjetos (sin
quemar).
PREPARACIÓN DEL FROTIS
c) FIJADO
• Último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir que la muestra de
estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción.
• Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave, pasando el portaobjetos
sobre una llama, tras la fijación es muy importante esperar que se enfríe antes de proceder a
realizar cualquier procedimiento de tinción. Permite la observación de la morfología de células
bacterianas.
• El propósito es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherir la
preparación al portaobjetos.
• El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin que
aparezcan estructuras que no existían en la célula original.
• El método químico, cuando además de los microorganismos interesa la observación de células
animales, se utiliza un método químico como la fijación por metanol y por formol, que altera
menos que el calor la morfología de las células.
Confección del frotis
 Tipos de fijación
• CON CALOR (O MÉTODO DE • FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol
KOCH) metílico, formalina al 5 % (v/v),
licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y éter)

No exceder el tiempo de la fijación, para evitar que las bacterias se deformen o se rompan
 Coloración
Procedimiento para visualizar un tejido que puede implicar el uso de uno o varios colorantes de
modo simultáneo o sucesivo, para:
• Aumenta la resolución
• Acentúa las características morfológicas
• Conserva la muestra

MICROSCOPIA ÓPTICA: MICROBIOLOGIA

TINCIÓN con
Fluorocromos
Observación directa Tractamiento por TINCIÓN
delos microorganismos (objetivo: incrementar el contraste, optimizar la
“in vivo” observación)
✓ Morfologia
✓ Tamaño
✓ Color
✓ Motilidad ✓ Diferenciar cèlulas
viables/no viables
Tinciones simples Tinciones diferencials

*Tincions: A partir de suspensions microbianes, esteses a un

portabojectes (frotis), secades, i fixades
 Clasificación de las tinciones

• 1 Colorante • Más de 1 colorante • Más de 1 colorante

• Morfología y tipo de agrupación • Características de • Estructuras bacterianas, se colorea
• Azul metileno afinidad, diferencias en su únicamente una parte de la célula.
• Fucsina estructura y composición química. • Tinción de Flagelos
• Safranina • Diferencia entre estructura y • Tinción de esporas
composición química • Tinción de capsulas
• La tinción simple permite observar
morfología celular, tamaño • Tinción Gram • Tinción de corpúsculos
y agrupación de los • Tinción ácido-alcohol-resistente metacromáticos
microorganismos.

Simples Diferenciales Estructurales

Coloración Lavado Secado Observación

Puede emplear
Elimina exceso
1 o mas Al aire, T° amb 100X
de colorante
colorantes

Suavemente 1 o 2 gotas
• Muestra puede aceite de
ser arrastrada inmersión
COLORANTES
1.Grupos cromóforos
• Con dobles enlaces conjugados
• Dan al colorante su color.
2. Afinidad por los componentes
celulares por enlaces iónicos (más
comunes), covalentes o hidrófobos
b) COLORANTES LIPOSOLUBLES
• Se combinan con los componentes
lipídicos de la célula, usados para revelar
la localización de los depósitos de grasa.
• Indiferentes: Insolubles en el agua y
tiñen a aquellas sustancias que tienen un
poder de disolución superior al del
líquido empleado para preparar la
solución colorante.
• Sudán III : para teñir las grasas.
COLORANTES: Tipos
a) SALES COLORANTES: más usados
1. BÁSICOS:
• Consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Tiñen la célula
bacteriana uniformemente , Afinidad por las estructuras ácidas: (ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos ) (cromatina nuclear de pro y
eucariotas) (más usados en citología bacteriana). Ej: clorhidrato (-) de azul
de metileno (+). la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta
2. ÁCIDOS:
• Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No tiñen la célula
bacteriana, pueden usarse como color de contraste (coloración negativa).
Tiñen estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas, Afinidad por las
estructuras alcalina (hemoglobina) Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina
ácida y el rojo Congo.
3. NEUTROS:
• Sales de un ácido y de una base coloreados.
• Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
• Eosinato de azul de metileno.
COLORACIONES: Tipos
Vitales
• Son aquellas que se practican sobre células que están vivas, mediante
la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo.
• Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
Supravitales
• Son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que
están aislados del organismo del que proceden.
No vitales
• Se realizan sobre células muertas.
Según su estructura Química
Básicos Ácidos Neutros Indiferentes
Catiónicos Aniónicos Ambos -
Carboxilos (-COOH),
Sales de Cloruro Hidroxilos fenólicos (-
OH)
Une a moléculas cargadas Asociación de un
Une a moléculas
negativamente colorante básico con un Insoluble en agua
cargadas positivamente
Ac nucleicos y proteínas ácido
Estructuras
Superficie Bacteriana Ambas Solubles en alcohol
citoplasmáticas
Azul de Metileno, Fucsina
básica, Cristal Violeta, Eosina, Rosa de Wright, Giemsa,
Sudam III
Safranina, Verde de Bengala, Fucsina ácida Hematoxilina – Eosina
Malaquita
 TINCIÓN DE GRAM
• Ideada en 1884 por Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), un médico danés con
estudios en bacteriología y farmacología
• La coloración de Gram. tiene interés taxonómico ya que divide las bacterias en dos
grandes grupos:
• Bacterias Gram positivas que se tiñen de morado y
• Bacterias Gram negativas que se tiñen de rojo Christian Gram (1853-1938)
• La coloración de Gram es positiva compuesta y diferencial.
TINCIÓN DE GRAM
• La técnica revela diferencias constitutivas de la pared celular entre bacterias
Gram positivas y Gram negativas.
• La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano (*) , la cuál impide que escape el complejo cristal violeta-lugol.
• Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se
encuentra unida a una membrana externa lipídica, susceptible a la decoloración
con el alcohol-acetona, el que actúa como un solvente orgánico.
• Los lípidos se disgregan con el alcohol acetona y el decolorante penetra a la célula
bacteriana decolorándola.
• * El peptidoglicano (PG) es una macromolécula única, con enlaces altamente
entrecruzados, forma una bolsa que rodea a la membrana celular bacteriana y
que concede rigidez a la envoltura.
 GRAM (+) GRAM (-)

Es visualitzen de color rosa o grosella

Color morado
 Gram (-) Gram (+)
❑ Escherichia coli ❑ Staphylococcus aureus
❑ Enterobacter cloacae ❑ Bacillus sp.
❑ Pseudomonas fluorescens ❑ Micrococcus luteus
❑ Proteus hauseri ❑ Enterococcus faecalis
❑ Salmonella sp.
❑ Serratia marcescens
❑ Aeromonas hydrophila
TINCIÓN DE GRAM

OBJETIVO:
✓ Distingir entre tipos celulares

Etapa crítica/diferencial
Coloración
secundaria

2. Decoloració 3. Colorante de
1.Colorante primario:
diferencial contraste
Retienen colorant
Coloración De Ziehl-Neelsen
• Es una coloración diferencial, útil
en la identificación de algunas
bacterias (Micobacterias),
aunque no permite la
diferenciación de distintas
especies.
• Estas bacterias resisten la
decoloración y se llaman ácido
alcohol resistentes (AAR) la
capacidad de resistir a la
decoloración, es gracias al alto
contenido de lípidos complejos
(ácidos micólicos) y ceras que
poseen en su pared celular
METODOLOGÍA
 Tinción simple de Azul de Metileno

Poner una gota de agua en un porta Tomar la muestra con el asa de siembra Extender sobre el agua y fijar a la
llama del mechero Cubrir la preparación con Azul de
Metileno 5’

Bacillus -> ZN
S. aureus -> Gram o simple
E. coli-> simple o Gram

Lavar con agua, dejar secar y observar al

microscopio
 Tinción de Gram

Poner una gota de agua en Tomar la muestra con el asa de Extender sobre el agua y fijar Añadir Lugol (mordiente)
Cubrir la preparación con
un porta siembra a la llama del mechero durante 1’
Cristal Violeta 2’

Decolorar con Alcohol 96º

Lavar con agua Teñir con Safranina 1’ Lavar con agua, dejar secar y
hasta que no suelte
colorante observar al microscopio
Tinción de ácido-alcohol-resistente

Poner una gota de agua en un porta Tomar la muestra de un cultivo de Extender sobre el agua y fijar a la llama del Cubrir la preparación con Fuchina fenicada
Mycobacterium mechero

Calentar con un hisopo de algodón empapado en Teñir con Azul de Metileno 1’

alcohol y prendido con la llama del mechero Lavar con agua, dejar secar y observar
Lavar con agua y decolorar con al microscopio
hasta la emisión de vapores. Mantener durante 5
alcohol ácido
minutos.
Cuestionario
• ¿Qué es un frotis y cuáles son las fuentes de error más frecuentes en una preparación?

• ¿Cuál es el principio básico o fundamento de la tinción gram? (propias palabras)

• ¿La tinción gram sirve para la tinción de hongos filamentosos? ¿Por qué?

• ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la tinción gram

• Realice una tabla con 1 imágenes por especie según morfología

• Realice una tabla con las diferencias entre grampositivas y gramnegativas