Técnicas básicas de aislamiento y caracterización de ácidos

nucleicos. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Obtención, preparación y tratamiento de muestras
● El objetivo es acceder al material genético de nuestras muestras
● Para ello tengo que tener claro qué tipo de muestra tengo y como voy a acceder a su
material genético
● Tipo de muestra
○ Fluido biológico
○ Órgano
○ Tejido
○ Célula
■ Procariota
■ Eucariota: animal o vegetal
● Las muestras también pueden estar en distintos estados
○ En fresco
○ Recabadas transcurrido un tiempo
○ Tratadas anteriormente
● Debemos conocer: tipo de tejido, de célula, de genoma, estado de la muestra y tipo
de estudio
● Garantizar la calidad de la muestra
○ Muestreo adecuado
○ Condiciones de recogida
○ Esterilidad. Evitar contaminación cruzada
○ Refrigeración
○ Almacenamiento
○ Transporte
Aislamiento del material genético
● El estudio de los ácidos nucleicos debe estar dirigido para tener claro cómo se va a
acceder, cuánto se necesita...
● Dependerá de
○ Tipo de estudio
○ Tipo de muestra
● La accesibilidad al material genético
● La cantidad disponible de material genético en la muestra, etc...
 ● Vamos a seleccionar el protocolo de aislamiento: vamos a hacer una valoración
rendimiento-pureza. A veces prefiero tener mayor cantidad de material en detrimento
de su pureza
● Emplearemos otros estudios como fuente de información para establecer los
protocolos de acción. También las casas comerciales pueden ser fuente de
información buena
● Para poder acceder al material genético, tendré que aislarlo. Para ello tendré que
llevar a cabo distintos procesos
○ Disgregación del tejido
○ Separación de tipos celulares
○ Lisis celular
○ Fraccionamiento subcelular. En los casos en los que no me interese todo el
contenido de las células. Mediante una centrifugación diferencial podré
realizar esta separación
Protocolo
Disgregación del tejido
● Físicos
○ Temperatura
○ Fragmentación mecánica
■ Corte
■ Troceado
■ Triturado
■ Ultrasonido (sonicación)
○ Permite tener un homogeneizado que me permite el acceso al material
genético de las células
● Químicos: más encaminado a la lisis de las células
○ Homogeneización isotónica
○ Agentes quelantes
○ Detergentes iónicos y no iónicos
■ Dodecil sódico (SDS)
■ Tween-20
■ Tritón X-100
● Enzimáticos
○ Digestión enzimática de la matriz
○ Colagenasa
○ Proteinasa K
○ Pepsina
 ○ Tripsina
Ruptura de membranas
● Será imprescindible para llegar al material genético
● En muchos casos se puede promover por
○ Medio hipotónico
○ Detergentes, que desestabiliza la membrana
○ Acción de proteasas
○ Agentes que desestabilicen proteínas
■ Detergentes
■ Fuerza iónica elevada
■ Agentes caotrópicos: sales de guanidinio
■ Agentes reductores: 𝛽-mercaptoetanol
Preservación de la integridad de los ácidos nucleicos
● Añadimos sustancias que van a proteger de la degradación de los ácidos nucleicos
● Inhibidores de nucleasas
● Agentes quelantes: etilendiaminotetracético (EDTA)
● Inactivación de RNAasas: dietilpirocarbonato (DEPC)
● Vamos a liberar el contenido, teniendo disponibles los ácidos nucleicos
● Ahora tenemos que discernir si queremos cantidad o pureza
● Pureza: hay que llevar a cabo un proceso de purificación. Separación física el
DNA/RNA del resto de macromoléculas que están presentes en la muestra
Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos que facilitan su aislamiento

DNA ARN
● Alta estabilidad ● Menor estabilidad
● Carácter ácido (ionizado a pH ● Carácter ácido (ionizado a pH
fisiológico) fisiológico)
● Alta viscosidad ● Alta viscosidad
● Absorbe luz a 260nm ● Absorbe luz a 260nm
● Soluble en agua ● Soluble en agua
● Solubilidad variable por ● Solubilidad variable por
alcoholes, fuerza iónica, alcoholes, fuerza iónica,
cambios en pH… cambios en pH…
● No se hidroliza en medio alcalino ● Se hidroliza en medio alcalino

Métodos de aislamiento
● Podemos aislar en función de la solubilidad (DNA)
○ Una técnica muy clásica es la que emplea fenol y cloroformo para
homogeneizar
 ○ El cloroformo (disolvente orgánico apolar) desestabiliza las membranas,
favorece la lisis
○ El fenol desestabiliza las proteínas
○ Ambos homogenizan la muestra y si se centrifuga, consigo
■ Interfase: las proteínas precipitadas a causa de los fenoles
■ Fase oleosa: lípidos disueltos en el cloroformo
■ Fase acuosa: ácidos nucleicos
○ Si a la fase acuosa le añado distintas cantidades de etanol puede promover
la precipitación del DNA
○ Con un volumen de etanol absoluto (50%) puedo recoger el DNA con una
varilla o centrifugar separando físicamente
○ El DNA es insoluble en alcohol por la constante dielétrica del medio. Su
capacidad de separar cargas es más baja que la del agua y precipitan. El
agua solvata las moléculas
● Extracción de RNA por solubilidad
○ También podemos realizar la separación con altas concentraciones de
tiocinato de guanidinio
○ Este compuesto inhibe la actividad de las RNAasas y desnaturaliza las
proteínas
○ En cierto modo, puede generar un puente ente RNA y distintas matrices
○ Para aislar RNA y no tener DNA en el medio, trabajaremos a un pH
ligeramente ácido (4-5)
○ El DNA precipita, es insoluble en fase acuosa. Se queda junto con las
proteínas en la interfase
○ Para asegurar que en la extracción de RNA no hay DNA podemos añadir con
una DNAsa
○ También podríamos precipitar de forma específica el RNA y redisolver en
agua con DEPC
● Purificación de ácidos nucleicos por precipitación salina diferencial
○ Las proteínas precipitan a altas concentraciones salinas
○ Si centrifugo puedo separar físicamente de una disolución las proteínas del
resto de macromoléculas
○ Si añado cierta concentración de agua con unas concentraciones salinas no
muy altas, el DNA no solubiliza. Se va a producir el precipitado de DNA
○ Si centrifugo lo separado del resto de componentes del homogenado
○ Si le añado el etanol puedo resolubilizar
 ○ Para conseguir una purificación, haré uno de propiedades que tenga el DNA
y el RNA no
● Extracción directa. Adsorción en matriz de sílica: extracción y purificación en
columna
○ En términos generales homogeneizamos la muestra y fijamos el ácido
nucleico a una columna de sílica. Después de unos lavados, lo diluimos
○ El DNA es un proceso más directo: homogeneizamos y pasamos a la
columna. Lavamos y eluimos
○ Para el RNA podemos emplear una serie de pasos más específicos: cuando
tomamos una muestra hay una serie de soluciones que permiten mantener la
integridad del RNA y que me permiten su mantenimiento
○ En el caso de RNA para homogeneizar se emplea una solución formada por
sales de guanidinio, cloroformo y fenol
○ Con este compuesto conseguimos la lisis, disgregación homogenado y la
separación
○ Tendremos como resultado distintas fases. El RNA se encontrará en la fase
acuosa
○ Si el pH es ligeramente ácido, el DNA estará en la interfase
○ Cogeré la fase acuosa, que será donde esté el ARN y lo pasaré a la columna
○ La fijación del RNA a la columna se cree que se da con un puente gracias a
la sal de guanidinio
○ Este compuesto inhibe las RNAsas y favorecen la fijación del RNA a la
columna.
○ Normalmente se suele mezclar la fase acuosa con etanol. Esto es lo que
pasamos por la columna
○ Cuando añado etanol disminuye la constante dieléctrica del medio, motivo
por el que las moléculas se agregan
○ A lavar intentamos eliminar todas las moléculas que no nos interesan
○ Después eluyen por centrifugación obteniendo así el DNA y el RNA
○ El RNA es más delicado, se degrada más fácilmente
● Extracción directa. Adsorción en membrana
○ Aislamiento en tarjetas FTA que se emplean para la extracción del DNA
○ Las muestras fluidas, como la sangre, quedan depositadas en una matriz que
presenta un producto químico patentado
○ Permite la fijación de la muestra. Se espera a que se deshidrate
○ El producto desnaturaliza las proteínas y favorece la fijación del DNA y su
conservación durante el proceso de deshidratación
 ○ El DNA queda retenido hasta que se vaya a utilizar
○ Ventajas: no precisa de bajas temperaturas, es una técnica muy sencilla y
rápida, genera un almacenamiento de la muestra, garantiza la
conservación...
○ Se produce una lisis de la células de las sangre por deshidratación
○ Al producirse la deshidratación, la posibilidad de que se degrade es más
compleja
○ Posteriormente recortas un trozo de ese papel y lo pones en un tubo de PCR,
añades los reactivos, se libera el DNA y puedes empleado como molde
○ Inconvenientes: es para un tipo de tejido específico y el precio
● Extracción directa. Adsorción en bolas magnéticas
○ Tengo que favorecer la unión de las bolas magnéticas con el DNA de un
lisado de células
○ Si no conseguimos fabricar las bolas de manera que quede fijado el DNA, se
puede marcar específicamente el DNA y unirlo a la bola
○ Un ejemplo es el complejo biotina – estreptavidina. Es una reacción muy
utilizada. Ambas moléculas tienen una gran afinidad
○ Si tengo las bolas magnéticas tapizadas con estreptavidina y el DNA que
quiero aislar está marcado previamente con biotina y junto ambos
componentes, se unirán
○ Con un imán atraparé las bolitas llevándome con ellas el DNA
○ Extracción de RNA: con bolitas que presenten timinas, oligo(dT)
○ En este caso se va a unir a la cola poli-A de los RNA
○ Con el imán se fija y puedo eliminar el resto de los componentes celulares
que no se han unido a la bolita
Evaluación de calidad del material genético aislado
● Para evaluar la calidad podremos emplear un espectrofotómetro: puedo evaluar
concentración y pureza
● Para evaluar la integridad, haré uso de la electroforesis
● Tenemos dos opciones: evaluación cualitativa y cuantitativamente
● Cuantitativamente: con espectrofotómetros
○ Absorben luz a 260 nm
○ Midiendo la absorbancia podemos saber a qué concentración corresponde
gracias a la ley de Lambert-Beer
○ Cuando hago una determinación de la concentración de una muestra en la
que sólo he lisado, el valor de concentración no será 100% correcto. No es
una sustancia asilada
 ○ Si realizo los procesos de aislamiento y purificación, la medida que obtenga
del espectrofotómetro será real del ácido nucleico que hay en el tubo
○ Además la medida puede estar alterada por dos motivos
■ Las proteínas absorben luz a 280 nm, por lo que su espectro puede
solapar con el de los ácidos nucleicos
■ Al solapar los espectros, pueden interferir las medidas si hay
contaminación
■ Si tengo una contaminación con los reactivos, también puede dar
solapamiento con el espectro del fenol
○ Para saber si la pureza es buena, realizo el ratio
■ Ratio 260 / 280 = (1,8 – 2,0): ok
■ Ratio 260 / 280 < (1,8 – 2,0): contaminación con proteína
■ Ratio 260 / 230 = (2,0 – 2,2): ok
■ Ratio 260 / 230 < (2,0 – 2,2): contaminación con reactivos (fenol)
● Cualitativamente: con electroforesis
○ Podré ver cómo está esa molécula
○ Con un gel de integridad de DNA, si el DNA esta bien estará cerca del pocillo
y tiene que ser una banda nítida
○ Si el DNA está degradado, se verá como una especie de mancha: hay
fragmentos más pequeños que han ido migrando en función del voltaje etc
○ Puedo aislar y analizar el estado. Además, el cofienciente de extinción molar
de compuestos que están hidrolizados no son iguales a los que no están
hidrolizados
○ Cuando hacemos la separación, la hidrólisis y medimos en medio ácido, en
esta medición pondrá que es de DNA hidrolizado. Este no será igual que el
DNA no hidrolizado
○ Lo voy a ver como una onda nítida
○ Si hago una electroforesis principalmente veré las bandas de los RNA que
dan lugar a las subunidades ribosomales, y más abajo el tRNA
Electroforesis
● Técnica de separación basada en la capacidad de migración de las moléculas
cargadas sometidas a un campo eléctrico
● La velocidad de migración es directamente proporcional a la carga e inversamente
proporcional al tamaño
● Se puede llevar a cabo en dos soportes distinto
Gel de agarosa junto con tampón TAE
 ● Forma una matriz porosa a través de la que migra el DNA gracias a que está
cargado
● Vamos a someter a un campo eléctrico el DNA cargado
● La velocidad de migración es directamente proporcional a la carga e inversamente
proporcional al tamaño
● Todas las moléculas tendrán la misma carga
● Lo que ioniza la molécula será el pH, por lo que los tampones conseguirán
mantenerlo estable
● Pongo el gel en un extremo que es el polo negativo y aplico el campo eléctrico. Esto
hace que se vaya desplazando hacia el polo positivo
● La electroforesis está basada en la ley de ohm: el gel ofrece una resistencia. Yo
aplico una intensidad y un voltaje y en base a eso mi molécula vibra
Gel de poliacrilamida
● Formado por una mezcla de acrilamida:bisacrilamida
● Genera una membrana entrecruzada que polimeriza gracias a una reacción que se
produce entre el TEMED y el APS
● Se pone en contacto todo y se forma un gel que se corre en vertical
● También se emplea para proteínas
● En este caso también empleamos el tampón TAE
● El RNA migrará al polo positivo
Factores que afectan
● Concentración del gel: a mayor concentración más costará que traspase
● Característica de la muestra (tamaño y forma): cuanto mayor sean las partículas,
más les costará pasar y tardarán más tiempo en recorrer el mismo espacio
● Voltaje: a mayor voltaje mayor velocidad
● Tiempo de migración
Reactivos que son necesarios
● Tampón de carga
● Tampón TAE
● Marcador de peso molecular
● Agentes de revelado
Agentes de revelado
● Una vez que he separado y ordenado los fragmentos
● Colorantes que se unen al DNA, poliacrilamida y nitrato de plata, agarosa y bromuro
de etidio...
● Agentes mutagénicos que se introducen entre las bases, se une. Cuando los excitas
con luz ultravioleta producen luz
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
● Técnica desarrollada por Kary Mullis en 1986
● Reacción en cadena de la polimerasa, sirve para amplificar
● Método para la amplificación selectiva de una región elegida dentro de un genoma
● Aprovechando la capacidad de la DNA polimerasa sintetiza una nueva hebra de
DNA copiando una hebra molde
● Permite el copiado in vitro de DNA y DNAc
● Producto de amplificación o amplicón:los productos suelen ser secuencias
comprendidas entre 50 pares de bases y 2,5 kilo pares de bases
Características
● Sensibilidad: cantidad mínima necesaria
● Especificidad: obtención de un solo producto amplificado, de una región concreta
● Eficiencia: cantidad máxima que se puede obtener. Con poca cantidad de muestra
puede obtener resultados
● Fidelidad: errores de la DNA polimerasa. La polimerasa que se emplea carece de la
actividad correctora. Hay mayor probabilidad de cometer errores, incluir nucleótidos
mal apareados. Como los fragmentos son muy pequeños, la probabilidad es menor
Método
● Método de clonación celular. Permite amplificar moléculas de ácidos nucleicos
○ Sin emplear célula
○ Partiendo de DNA o RNA
● Objetivo: acotar y amplificar
Reactivos
● Secuencia diana
● dNTPs en exceso (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
● Tampón
● Cofactores: cationes divalentes, Mg2+
● Cebadores
● Polimerasa
Cebadores
● Dos oligonucleótidos de DNA monocatenarios
● Secuencia conocida y complementaria. Para conocer la secuencia tendré que
buscar en las bases de datos. Sabiendo qué secuencia me interesa, podré buscarla
para posteriormente diseñar unos primers que sean complementarios y antiparalelos
al molde
● Necesitaré saber si la secuencia tiene una mutación en la región reguladora
● El primer tiene que estar perfectamente unido por complementariedad para que la
polimerasa pueda realizar su función
● Normalmente sintéticos y con un tamaño entre 18 y 25 nt
● Para un buen diseño de primer necesito que sea específico: necesito que acoten
perfectamente la región que quiero. Se hace mediante un alineamiento posterior.
Esto nos permite saber exactamente a qué se va a unir
● Temperatura de melting (fusión) conocida
○ Temperatura a la que el 50% de hebras están unidas y el otro 50% no está
unido
○ Depende de la secuencia: tamaño y contenido de CG
■ Cuantas más CG, mas fuerte estará unido
○ Cálculo aproximado, regla de Wallace: Tm = 2 (A+T) + 4 (C+G)
○ Determinan la temperatura de anillamiento (Ta) o de hibridación
○ Aproximadamente 5ºC más con respecto a Ta
● La temperatura de melting es importante porque me permite saber a que
temperatura estará unido por completo el primer con la hebra. Esta es la
temperatura de anillamiento óptimo
● En cualquier caso, lo más importante es optimizar la temperatura de anillamiento de
las PCR, que será lo que nos garantice que la hibridación es específica
● Si Ta está por debajo de la T óptima y trato de unir los primers, se favorecerán
uniones inespecíficas
● Si Ta es más alta que la T óptima, puede que ser que hibride un poco mal o que
directamente no hibride
● La temperatura de anillamiento es algo especifico
● Función
○ Delimitan la síntesis de DNA a la secuencia diana
○ Sirven de cebadores para la DNA polimerasa
● Selección de cebadores específicos
○ Especificidad de la secuencia
○ Tamaño adecuado
○ Tm sea similar para ambos primers
○ Contenido C y G aproximadamente del 50%
○ Complementariedad: debe ser lo más baja posible. Es la capacidad de un
primer de hibridar consigo mismo o con el otro primer. Esto hace que se
formen los dímeros de primer que hacen que haya señales erróneas y que
disminuya la eficiencia con la que el primer se une al molde
 ● Secuencia de primer forward y del primer rivers (que es complementaria). Siempre
estarán en sentido 5’ à 3’, por lo que a una habrá que darle la vuelta en un momento
determinado. Me dice el tamaño de los primers, donde hibrida.
● Me dice el tamaño que va a tener el amplicón porque se donde hibrida con uno de
los primers y donde termina el otro primer de hibridar
DNA polimerasa
● Se une al cebador y se encarga de realizar la copia del molde
● Activa a altas temperaturas altas (aprox 75ºC), es termoestable
● Coenzima: Mg+2
● Permiten el cocimiento de los dNTPs por la DNApol
● A 95ºC la enzima es inactiva, pero puede recuperar su actividad en su temperatura
óptima
● Se emplea la Taq polimerasa. Se llama así porque proviene de unos organismos
que se llaman Thermus aquaticus
○ Manantiales de agua caliente
○ Carece de actividad correctora exonucleasa 3’
● Sus proteínas soportan temperaturas muy altas sin desnaturalizarse y sin perder su
función
● Los errores durante el proceso de replicación en una PCR son mayores que durante
la replicación. No tiene actividad correctora
Etapas de una PCR
● Desnaturalización
○ Para poder llevar a cabo el proceso, se produce una desnaturalización por
temperatura (95ºC) durante un tiempo, 30-60 seg
● Hibridación
○ Específica entre la hebra sencilla y ambos oligonucleótidos o cebador
○ Poniendo la T a 5º por debajo de la temperatura de melting hago que los
primers hibriden por complementariedad con el molde
○ Incubamos de 30-60 segundos a 45-65ºC
○ Temperaturas demasiado bajas favorecen uniones inespecíficas
○ Una vez que está unido el primer, comienza la elongación
● Elongación
○ De la hebra sencilla por la polimerasa que usa el oligonucleótido como
segmento iniciador
○ Se incuba a 68-72ºC
○ La replicación transcurre en sentido 5’ à 3’
 ○ Necesito un primer forward y otro rivers porque la polimerasa siempre
sintetiza en el mismo sentido, es unidireccional
○ Para poder acotar en ambos lados, necesito tenerlos acotados en los
extremos
● Si el primer y todos los componentes necesarios están en el medio, se produce la
elongación durante X minutos
● Con esto se produce un amplicón. Vamos a repetir el proceso un número
determinado de veces consiguiendo la amplificación
● Normalmente, antes de que se produzcan los ciclos de PCR que se repiten, hay un
proceso de descondensación en el que se produce la descompactación de la
cromatina. AL finalizar los ciclos, hay otro proceso de elongación que permiten
alargar algunos de los fragmentos en el caso que sea necesario
● El producto que se genera en el primer ciclo es el molde para el segundo
● En el tercer ciclo es cuando se consigue un amplicón completo: secuencia de DNA
de doble hélice con todos los lados acotados
● El copiado es exponencial, de manera que el número de copias que se generan es
de 2 nª de ciclos
● Para el reconocimiento de individuos, podemos llevar a cabo un estudio de las
regiones polimórficas donde se producen inserciones de secuencias STR
● Estas secuencias se insertan en distintos puntos del genoma de los individuos. La
inserción se producirá un número determinado de veces
● Analizando el DNA de los individuos, amplificándolo, y en función del número de
repeticiones tenga insertadas tendré tamaños diferentes de amplificación
● Si un individuo tiene 4 inserciones, su amplicón tendrá un tamaño que será distinto si
tiene 6 repeticiones
● Tenemos dos alelos, y ambos pueden ser polimórficos. Tendrá inserciones
diferentes para un punto concreto determinado del genoma
● Estas aportan variabilidad interindividual