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TRABAJO PRÁCTICO: MICROSCOPÍA

TEMAS PROPUESTOS
Microscopía: historia, generalidades, fundamentos. Conceptos de aumento, resolución,
apertura numérica, índice de refracción, ángulo de apertura. Magnitudes en la diversidad
biológica. Partes de un microscopio.

OBJETIVOS

• Comprender conceptos básicos de microscopía.

• Reconocer las partes del microscopio compuesto y su fundamento óptico.
• Adquirir nociones sobre la diversidad de tamaño de la materia viva.
• Resolver situaciones problemáticas en microscopía.

Bibliografía
✓ Solomon, E.P, Berg, L.R., Martin, D.W. 2013. Biología. Edit. Cengage Learning. 9na edición.
✓ Cooper, G.M. y otros.2014. La célula. Edit. Akadia, 6ta. Edición.
✓ Narvaez Armas, D.J. 2007. La microscopía: herramienta para estudiar células y tejidos.
[Link]/histologia/anexos/microscopweb/[Link]
✓ Alberts B., Johnson A., Lewis J., Morgan D., Raff M., Roberts K., Walter P. 2015. Molecular biology of the
cell. Garland Science, 6th edition.

Introducción

Se puede definir a la célula como un compartimento rodeado por membrana, que contiene una solución
acuosa concentrada de sustancias químicas, y es capaz de generar copias de sí misma mediante un proceso de
crecimiento y división.

Las células son pequeñas, translúcidas e incoloras, lo que hace imposible visualizarlas a simple vista. Y
para poder entender y explicar el funcionamiento de la célula, es necesario observar su estructura. Esto es
posible, gracias al uso de microscopios (el término “microscopio” proviene de las palabras griegas μικρός micrós,
‘pequeño’, y σκοπέω scopéo, ‘mirar’).

Los microscopios se construyen empleando lentes (lente: objeto transparente, generalmente de vidrio,
que se utiliza en los instrumentos ópticos para desviar la trayectoria de los rayos luminosos y formar imágenes).
Las lentes existieron durante cientos de años, hasta que alrededor de 1590 Hans y Zacharias Janssen crearon
el primer microscopio, que consistió en un tubo con lentes. Sin embargo, la palabra “microscopio” fue acuñada
por primera vez por Giovanni Faber en 1625, para describir un instrumento inventado por Galileo Galilei en 1609
(quien, básicamente, había diseñado un microscopio compuesto, conteniendo una lente objetivo y una lente
ocular). No obstante, no se realizaron publicaciones de las observaciones realizadas con estos instrumentos.
Por esto, podría decirse que los primeros en utilizar el microscopio como un instrumento científico fueron Robert
Hooke y Anton Van Leeuwenhoek, en el siglo XVII.

Robert Hooke fue el primero en acuñar el término “célula”, en un contexto biológico. En el año 1665
publicó Micrographia, donde describió una serie de observaciones realizadas bajo su microscopio. Analizando
láminas de corcho, logró ver una estructura perforada y porosa (Figura 1 a). Hooke empleó el término célula
porque los poros le recordaron a las habitaciones (llamadas cellula) donde vivían los monjes en los monasterios.
De esta manera, fue el primero en observar células bajo un microscopio (aunque, técnicamente, lo que vio fueron
paredes celulares). Algunos años después, Anton Van Leeuwenhoek fue el primero en realizar observaciones
microscópicas de células vivas (glóbulos rojos, espermatozoides, bacterias y protistas) (Figura 1 b).
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Figura 1 a - Dibujo de láminas de corcho observadas por R. Hooke. Micrographia, 1665.

Figura 1 b - Dibujos de bacterias observadas por A. Van Leeuwenhoek. Carta a la Royal Society of
London, 1683.

La teoría celular, que enuncia que la célula es la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos
y que toda célula proviene de una célula preexistente, no habría podido ser formulada por Schleiden, Schwann
y Virchow si no hubiesen utilizado un microscopio. De esta manera, podría decirse que la biología celular “nació”
en 1838, gracias a la microscopía.

Los principales descubrimientos sobre la estructura interna de las células (centríolo, 1875; mitocondria,
1880; cloroplasto, 1881; aparato de Golgi, 1898) dependieron del desarrollo de técnicas de preparación de los
materiales - mediante fijación, corte y tinción -, que proporcionaron el contraste suficiente para hacerlas visibles.
La fijación se realiza agregando sustancias fijadoras (glutaraldehído, formaldehído, alcohol, etc.), con el objetivo
de estabilizar y conservar las estructuras celulares. El corte es necesario porque las muestras de tejido son
demasiado gruesas. Para esto se emplean dispositivos denominados micrótomos, con los que se obtienen
piezas más delgadas, de 0,5-10 µm de espesor, mucho más convenientes para la observación microscópica.

Por último, para la tinción se pueden emplear:

✓ Colorantes. Se trata de sustancias químicas orgánicas que poseen color, que se unen de forma
específica a diferentes estructuras celulares. Ejemplos: Hematoxilina, Eosina.
✓ Marcadores o sondas fluorescentes. También llamados fluorocromos. Ejemplos: Fluoresceína,
Rodamina.
✓ Anticuerpos. Son moléculas capaces de reconocer cualquier componente subcelular. Es necesario
adherirles un colorante o un fluoróforo.
✓ Hibridación in situ (basado en los principios del apareamiento de bases de ácidos nucleicos). Se utiliza
ADN o ARN monohebra, unidos a colorantes o fluoróforos, capaces de hibridar (apareamiento de bases)
con ácidos nucleicos presentes en la muestra.
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Si bien estos procedimientos de preparación posibilitan estudios más detallados de la estructura celular,
tienen como desventaja que provocan la muerte de la célula y existe la posibilidad de pérdida o distorsión de
algunos componentes internos. Para evitar esto, se puede recurrir al empleo de tinciones supravitales o a
sistemas ópticos especiales. Las tinciones supravitales son aquellas donde la célula teñida se mantiene con vida.
Los sistemas ópticos especiales permiten la observación de células vivas mediante métodos como la
microscopía de campo oscuro, la microscopía de contraste de fases y la microscopía de contraste de interferencia
diferencial.

El perfeccionamiento del microscopio llegó a un grado tal que sólo se pudieron obtener aumentos de
hasta 1500-2000 veces el tamaño natural y límites de resolución mínimos de 0,2 µm (200 nm), ya que no existe
forma de mejorar aún más el microscopio óptico compuesto. Por lo tanto, en el 1900 se podía observar una célula
al microscopio tan bien como hoy en día. El factor limitante reside en la naturaleza de la luz.
Sin embargo, a fines del siglo pasado, surgieron las técnicas de superresolución para microscopia óptica.
Con este nuevo enfoque, se han alcanzado límites de resolución de 20 nm estudiando muestras biológicas, e
incluso menores en especímenes no-biológicos.

La mayor parte del conocimiento actual de la estructura celular se obtuvo con la ayuda de tres tipos de
instrumentos:

✓ el microscopio óptico compuesto,

✓ el microscopio electrónico de transmisión,
✓ el microscopio electrónico de barrido.

Con el microscopio óptico podemos distinguir las estructuras más grandes dentro de las células
eucariotas y también células procariotas individuales. Sin embargo, no podemos observar la estructura interna
de las células procariotas ni distinguir entre ciertas estructuras internas de las células eucariotas.

Considerando el tamaño de las estructuras que componen la materia viva y la capacidad de los
instrumentos ópticos para observarlas, aquellas se diferencian en: macroscópicas, microscópicas y
submicroscópicas.

Estructuras Poco aumento: lupa simple

Visibles a macroscópicas (hasta 20 X)
simple vista Mayor aumento: lupa
(mm)
DIMENSIONES binocular (30-50 X)
DE LAS Estructuras Gran aumento: microscopio
ESTRUCTURAS óptico compuesto (hasta
microscópicas (m)
No visibles a 1500-2000 X)
simple vista Estructuras Ultraestructura: microscopio
submicroscópicas electrónico de transmisión
(nm) (hasta 100.000 X)

MICROSCOPIOS

Se denomina así a todo aparato óptico, lente o sistema de lentes que interpuesto entre un
objeto próximo al ojo y éste, permite observar al objeto de un tamaño mayor (aumento) y percibir
detalles no visibles a simple vista (resolución).

Existen dos tipos de microscopios ópticos: simples y compuestos.

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Microscopio simple

- Lupa Simple (o monocular): Está formada por una lente

biconvexa o planoconvexa o por varias lentes adosadas que
actúan como una sola. El objeto debe hallarse entre el foco
y la lente, formándose una imagen virtual, derecha y mayor.
El material en observación puede ser aumentado hasta 20
veces. Máximo aumento = 20 X. Son generalmente de uso
manual.

- Lupa Binocular: Está constituida por dos sistemas de lentes

con prismas que están montados en una estructura fija. Sus
cualidades son relieve, claridad y profundidad del campo.
Máximo aumento = 30-50 X. (Figura 2 a)
Figura 2 a – Lupa binocular

Microscopio compuesto

Llamado así porque posee dos sistemas de lentes, situados sobre el mismo eje:

Un sistema de lentes que produce una imagen (objetivo) y un par de sistemas de lentes que amplían
esa imagen (oculares) (Figura 2 b).

Regulador de intensidad de luz

Revólver
con
objetivos

Platina
Carro o
charriot
Condensador
y diafragma

Fuente
de
iluminación

Figura 2 b
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DESCRIPCIÓN DEL MICROSCOPIO
En el microscopio distinguimos un sistema óptico, destinado a la iluminación y obtención de
una imagen muy aumentada y detallada (“resuelta”) del objeto examinado; y un sistema
mecánico, cuya finalidad es sustentar los elementos ópticos y los preparados que se examinan.

❖ Sistema óptico

La parte óptica fundamental

del microscopio está formada por el
objetivo y el ocular (dos sistemas
centrados de lentes de aumento), y por
el aparato de iluminación, que facilita
y mejora la observación microscópica.
Los objetivos representan el
componente óptico más importante
del microscopio. Su principal función
consiste en colectar la luz proveniente
de la muestra y proyectar una imagen
nítida, real, invertida y aumentada
hacia el cuerpo del microscopio.
Figura 3
El objetivo

El objetivo es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y

diversas lentes colocadas en serie y alineadas. En la parte externa posee grabadas las
especificaciones y características (Figura 3).
Existen diversas clases de objetivos, que se diferencian por las características de su
composición, o por la manera de utilizarse: estos son el objetivo a seco y el objetivo de inmersión.
Difieren en la naturaleza del medio interpuesto entre la lente frontal del objetivo y la preparación.
En los objetivos a seco, el medio
es aire (índice de refracción n = 1). Los más
comúnmente usados en la práctica son de
4X, 10X, 40X y 45X (el signo “X” significa
aumento) (Figura 4).
En los objetivos de inmersión se
interpone un medio líquido con n próximo
al del vidrio, por ejemplo, aceite de
inmersión (n = 1,52). La distancia al
preparado utilizando estos objetivos es
muy pequeña y suelen tener un muelle
protector para evitar roturas (Figura 4).

Figura 4
El ocular

- El ocular es un sistema sencillo constituido por dos lentes convexas (que actúan como una
sola) sujetas por una montura metálica, que se introduce en la parte superior del tubo. El
ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, y esta
imagen la:

1. Aumenta.
2. Transforma en una virtual.
3. Mantiene derecha (de esta manera, la imagen continúa invertida con respecto al objeto).

- Además, el ocular aplana y aclara el campo óptico en el que aparece el objeto.

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La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del
objetivo; la lente inferior se denomina lente colectora y es la que aplana y aclara el campo.
Los oculares también tienen especificado su valor de aumento, que varía generalmente entre 5X y
15X.
Como se mencionara antes, el sistema óptico del microscopio está compuesto por una lente
objetivo,una lente ocular (ambas descriptas previamente) y un aparato de iluminación.

Aparato de iluminación

El aparato o sistema de iluminación es un conjunto de elementos que producen radiaciones (luz visible
o no) y transmiten, reflejan y regulan la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espécimen. Los
componentes del sistema se encuentran situados debajo de la platina, y son: condensador, diafragma,
lámpara o fuente de iluminación, filtros de luz, accesorios y espejo.

- Condensador: sistema de lentes convergentes cuya función es concentrar sobre la

preparación (muestra) los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz. Normalmente se utiliza
en el tope superior.
Al emplear objetivos de gran aumento es necesario obtener grandes conos luminosos y por lo tanto
es necesario recurrir al empleo de condensadores, que producen un agrandamiento de la sección
del cono de luz, dando así mayor claridad a la imagen. El cono de luz que produce el condensador
debe ajustarse de manera apropiada para optimizar la intensidad y el ángulo de apertura. Cada vez
que se cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la
apertura numérica del nuevo objetivo.

- Diafragma: es un dispositivo dispuesto debajo del condensador, que sirve para graduar la
cantidad de rayos luminosos que llegan al objeto. Consta de un conjunto de pequeñas láminas de
acero que pueden acercarse o alejarse entre ellas, limitando un orificio de diámetro variabley
modificando así las dimensiones del cono luminoso. La finalidad es la de obtener conos luminosos
cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes.

- Fuente de iluminación: la fuente de iluminación puede ser directamente la luz natural, pero
es muy poco usada en microscopía, ya que no sirve para aumentos grandes. Las fuentes luminosas
artificiales deben enviar un cono luminoso homogéneo y ser capaces de cubrir todo el ángulo de
apertura del condensador. Algunos microscopios están iluminados con una lámpara independiente
y un espejo. Actualmente se emplean lámparas halógenas incluidas en el pie del microscopio.

- Filtros de luz: son vidrios coloreados, destinados a dejar pasar la longitud de onda que
conviene utilizar ( = 400-500 nm), absorbiendo las restantes.

- Accesorios: permiten extender las capacidades del instrumento (cámaras fotográficas, de

video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).

❖ Sistema mecánico

Es el conjunto de piezas que sirven de soporte al sistema óptico y a los especímenes a

observar. Consta de: base, brazo, tubo, mecanismos de enfoque, revólver, platina y subplatina.

- La base sirve de soporte a todo el microscopio, por lo que debe ser amplia, sólida y pesada.
Se articula con el brazo.
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- El brazo es un vástago habitualmente articulado con la base, destinado al sostén del tubo,
y a contener los mecanismos para su movimiento (tornillos micro y macrométrico). De ser
necesario desplazar el microscopio, éste debe tomarse por el brazo.

- El tubo es un cilindro hueco, unido al brazo por medio de una cremallera, destinado a llevar
el objetivo en su parte inferior y el ocular en la superior. Por lo general, está provisto de una
pieza metálica en forma de casquete (el revólver), que lleva enroscados dos o más
objetivos de distinto aumento.

- Los mecanismos de enfoque están contenidos en el brazo y son accionados por dos
cabezas de tornillo, llamadas de enfoque macrométrico y micrométrico, que sirven para
acercar o alejar el objetivo de la preparación (es decir, en sentido vertical) y así poder lograr
un enfoque óptimo. El tornillo macrométrico se utiliza para movimientos rápidos y de gran
desplazamiento, dando un enfoque aproximado. El tornillo micrométrico se emplea para
movimientos lentos, de desplazamiento corto, necesarios para un enfoque de precisión.

- El revólver es una pieza colocada en la parte inferior del tubo, que sostiene a los objetivos y
puede girarse para cambiarlos y seleccionar el objetivo deseado.

- La platina es la plataforma donde se ubican los preparados. Está dispuesta

perpendicularmente al eje óptico del microscopio, y lleva en su centro un orificio que permite
el paso de los rayos procedentes del aparato de iluminación sostenido por la subplatina en
el brazo. Puede ser fija o móvil. El preparado puede desplazarse sobre la platina en dos
sentidos perpendiculares entre sí, mediante el carro o charriot, accionado por dos tornillos
colocados lateralmente. Las pinzas sirven para sostener el preparado, y evitar que se
desplace. Una escala graduada permite ubicar con precisión un área de interés.

- La subplatina contiene al aparato de iluminación: condensador, diafragma, anillo para filtros

y soporte para espejo, si lo hubiere.

FORMACIÓN DE LA IMAGEN

Como se ha mencionado, el microscopio compuesto posee dos sistemas de lentes centradas

sobre un mismo eje óptico. La lente próxima al objeto se llama objetivo y posee una distancia focal
muy corta y da una imagen real, mayor e invertida. La lente próxima al ojo es el ocular, cuya función
es agrandar la imagen proporcionada por el objetivo y transformarla en una imagen virtual. Por lo tanto,
la imagen final obtenida con el microscopio es virtual, mayor e invertida respecto al objeto.

Imagen virtual del objeto: objeto o imagen cuyos puntos se encuentran en la

prolongación de los rayos luminosos.

¿Cómo se forma esta imagen?

Para responder a esta pregunta, primero hay que conocer la marcha de los rayos luminosos
a través de los sistemas de lentes (biconvexas convergentes) que posee el microscopio compuesto.
El objetivo actúa como una cámara fotográfica. Cuando un objeto se sitúa más allá del foco
F1 de su lente, se produce una imagen ampliada, real e invertida. (Figura 5)
El ocular actúa como una lupa que observa la imagen que ha formado el objetivo,
construyendo una nueva imagen (imagen final), mucho más ampliada, virtual y derecha en relación
a aquella, pero invertida con relación al objeto examinado. (Figura 5)
Como se observa, la imagen del microscopio compuesto resulta de la combinación de las
imágenes provocadas por una lente (objetivo) que actúa como una cámara fotográfica y, por otra
(ocular) que actúa como una lupa que observa la imagen formada por la primera.
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En resumen, estas son las características de las imágenes que se forman a medida que los
rayos luminosos provenientes de la muestra atraviesan el microscopio compuesto:

• Objetivo: ampliada, real e invertida.

• Ocular: ampliada, virtual y derecha.
• Final: ampliada, virtual e invertida.

FUENTE
DE
LUZ

Observador

Figura 5

CONCEPTOS IMPORTANTES EN MICROSCOPÍA (1, 2, 3, 4 y 5)

1. AUMENTO: es la relación entre el tamaño de la imagen observada al microscopio y el

tamaño real del objeto. Se designa con el símbolo “X”. El aumento total puede
calcularse como el producto del aumento del ocular por el del objetivo. Ejemplo:
ocular = 10X objetivo = 45X aumento total = 10 x 45 = 450X

2.1 PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad que tiene un sistema óptico de

individualizar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que
se puedan ver separados uno del otro, es decir, que se vean dos puntos.

Cuanto mayor es el poder de resolución (PR), menor es la distancia que separa dos puntos entre
sí sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto mayor es el poder de resolución del
microscopio, más detalles de la preparación podrán distinguirse.

El PR es adimensional (es decir, NO posee unidades), porque se lo define como una

“capacidad”, pero se lo puede conocer en forma indirecta calculando el “límite de
resolución”.

2.2 LÍMITE DE RESOLUCIÓN (LR): es la distancia mínima que debe existir entre dos
puntos del objeto para que puedan visualizarse separados. En otras palabras, se
define como la menor distancia que debe haber entre dos puntos para ser distinguidos
como dos entidades independientes (Figura 6).
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Aquí, debemos hacer una distinción entre resolución y detección. Una estructura cuyo tamaño
sea menor al límite de resolución podría ser detectada (o visualizada) si emitiese luz (ya sea natural
o artificialmente). Es decir, si bien no podríamos individualizar (o resolver) la estructura, podríamos
observarla.

El LR de un microscopio puede calcularse utilizando la siguiente ecuación:

0,61 = coeficiente de proporcionalidad.

λ = longitud de onda de la luz utilizada.

AN = apertura numérica.
μ

n = índice de refracción del medio interpuesto entre el objeto (muestra) y la lente objetivo.

µ = ángulo de apertura (ángulo del rayo de luz más oblicuo que puede entrar en la lente objetivo).

El poder de resolución de un microscopio aumenta cuando disminuye la distancia mínima que

debe haber entre dos puntos para que puedan distinguirse como dos objetos separados.
Por lo tanto, el límite de resolución es la inversa del poder de resolución, es decir que, a mayor
poder de resolución, menor límite de resolución.
Según la ecuación del límite de resolución, el PR entonces depende de la longitud de onda de
la luz empleada y de la apertura numérica del objetivo (el ocular actúa únicamente aumentando
la imagen del objetivo, no tiene incidencia sobre el PR).

Considerando la ecuación anterior, es evidente que existen dos maneras de modificar el

límite de resolución de una lente:

✓ variando la longitud de onda de trabajo (λ), o

✓ modificando la apertura numérica (AN), lo que puede lograrse
A. variando el índice de refracción (n), y/o
B. variando el ángulo de apertura (µ).

✓ Manipulación de la longitud de onda (λ)

Como se deduce de la ecuación de LR, cuanto menor sea la longitud de onda de los rayos
luminosos provenientes de la fuente de luz, menor será el LR y mayor el PR. Es decir, el LR es
directamente proporcional a la longitud de onda, mientras que el PR es inversamente
proporcional a la longitud de onda. De esta manera, el PR es máximo para la luz violeta ( =
400 nm) y mínimo para la roja ( = 700 nm) (Figura 7).
De esta manera, se concluye que, trabajando con longitudes de onda cercanas al violeta,
se logra el mejor poder de resolución, es decir valores de límite de resolución pequeños.
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Figura 7 – Espectro electromagnético

✓ Manipulación de la apertura numérica (AN)

La apertura numérica (AN) es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar la luz que
proviene del objeto. En otras palabras, describe la cantidad de luz que puede entrar en una lente
(en este caso, la lente objetivo). Es una característica propia de cada objetivo, y forma parte de las
inscripciones grabadas en los objetivos. De acuerdo con la ecuación de LR, se observa que la AN
surge de multiplicar el índice de refracción (n) y el seno del ángulo de apertura (μ).

A. Modificación del índice de refracción (n)

El índice de refracción (n) es la relación entre la velocidad de la luz en el vacío y la velocidad de la luz
en otro medio (Figura 8a). El n del agua es de 1,33, lo que significa que, en el agua, la luz se desplaza
1,33 veces más lento que en el vacío (Figura 8b). El n es característico de cada medio.

Figura 8a – Índice de refracción

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Distancia recorrida por la luz

en 1 segundo
Vacío
300.000 km

Agua
225.000 km

Vidrio
200.000 km

Diamante
125.000 km

Figura 8b – Velocidad de la luz, en distintos medios

Si el n del medio donde se encuentra el rayo luminoso es diferente al n del medio al cual el rayo
luminoso ingresa, éste será desviado de su trayectoria en la superficie entre ambos medios (por
ejemplo, aire y agua). Es decir, se refractará (Figura 9). Este fenómeno puede resultar perjudicial en
microscopía, porque los rayos provenientes del preparado traen información de la muestra y deben
penetrar en el objetivo para poder llegar hasta la retina.

Línea
“normal”

Figura 9 – Refracción de la luz al cambiar el “n”

Si el n del medio interpuesto entre el preparado (muestra) y el objetivo es distinto al del vidrio,
los rayos se refractarán y algunos de ellos no ingresarán al objetivo, perdiéndose información valiosa
de la muestra (Figura 10, objetivo seco). La solución a este problema es reemplazar la capa de aire
que se interpone entre el objetivo y el preparado, por algún medio que tenga un índice de refracción
similar al del portaobjetos (vidrio, n = 1,5), como por ejemplo el aceite de inmersión (n = 1,52), con lo
cual los rayos no sufrirán desviación o se desviarán poco. De esta forma, habrá un aumento en la
cantidad de rayos provenientes de la muestra que serán capturados por la lente objetivo y será mayor
la cantidad de rayos que formarán la imagen (Figura 10, objetivo de inmersión).
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Vidrio Aceite
Aire (contiene la
muestra)

Figura 10 – Desviación de los rayos, provenientes de la muestra, al pasar de vidrio a aire

(izquierda) o aceite (derecha).
Nótese cómo el aceite posibilita la llegada de una mayor cantidad de rayos a la lente objetivo.

B. Modificación del ángulo de apertura (µ)

El ángulo de apertura (µ) puede definirse como la mitad de la anchura del cono de luz (A)
recogido por la lente objetivo (Figura 11). El valor máximo posible teórico de µ es de 90º.

Lente
objetivo

Muestra
Preparado
(contiene la
muestra)

Figura 11 – Ángulo de apertura

En la figura 11 se observa que si aumenta el ángulo µ (acercando la lente objetivo al

preparado) aumenta la AN. Esto se debe a que al aumentar el ángulo µ, aumenta el seno del ángulo
µ (sen µ) (AN = n x sen µ). Así, el LR disminuye (mirar ecuación de LR, página 9).
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Nótese que, al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellas lentes de gran
apertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre la muestra
y el extremo inferior de la lente objetivo (distancia frontal) es muy pequeña (Figura 12). En otras
palabras, el ángulo de apertura aumenta cuando la distancia frontal disminuye.

Figura 12 - Relación entre el ángulo de apertura y la distancia frontal.

µ1< µ2, d1>d2.

En definitiva, podemos afirmar que el mayor poder de resolución del microscopio óptico se logra
al emplear luz violeta (λ = 400 nm) y objetivo de inmersión (AN ≈ 1,4), con lo que se alcanza un LR de
aproximadamente 0,2 µm (500 veces menor al LR del ojo humano, que es de unas 100 µm).

3. DISTANCIA FRONTAL: Es la distancia entre el objeto observado y la lente frontal del objetivo
cuando el preparado se encuentra enfocado correctamente. Si es mayor, se facilita el enfoque. Es
inversamente proporcional al aumento del objetivo, es decir, que a medida que se utilizan objetivos
de mayor aumento, disminuye la distancia frontal, y por lo tanto crece el riesgo de romper el
preparado. Véase Figura 12.

4. PROFUNDIDAD DE FOCO o PODER DE PENETRACION: es el espesor del preparado que se

observa con nitidez (en foco), es decir, el espacio comprendido entre el primer y último punto nítido
reproducidos en el mismo plano de enfoque vertical. Guarda relación inversa con el aumento del
objetivo, es decir, que cuanto mayor es el aumento del objetivo menor será la profundidad de foco
alcanzada. Ejemplo: en inmersión, la profundidad de campo es muy escasa (menor que 1 µm).
Recuerde que las muestras que se observan bajo microscopio poseen un espesor o grosor (no son
bidimensionales), aunque muy pequeño (ver página 3). El concepto de profundidad de foco implica
que no es posible ver con claridad o nitidez la muestra en todo su espesor. A modo de ejemplo (los
valores son ilustrativos): si una muestra tuviese un espesor de 5 µm y la profundidad de foco alcanzada
con un objetivo de 40X fuese de 3 µm, significa que de las 5 µm de espesor de la muestra, sólo podrían
observarse con nitidez 3 µm en cada enfoque (no siempre las mismas 3 µm).

5. CAMPO OBSERVADO: Es la porción del preparado incluida en la imagen. El tamaño del campo
observado es inversamente proporcional al aumento total del microscopio. Si cambiamos de un
objetivo a otro de mayor aumento, observaremos una imagen más aumentada pero que incluirá sólo
una parte de lo que observábamos con el objetivo menor.
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Concluyendo, la función de un microscopio será entonces generar una imagen
aumentada del objeto, esto es una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita
apreciar los detalles del mismo, es decir que debe tener resolución. Es importante comprender
entonces las diferencias entre aumento (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en la
imagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, ésta no aportará
información adicional al observador. Por ejemplo: si fotografiamos con el microscopio óptico
dos líneas que están a menos de 0,2 µm de distancia entre sí, esta fotografía podría ampliarse
indefinidamente y, sin embargo, ambas líneas siempre se verían como una sola.
Vale aclarar que el LR de un microscopio no es un valor único. Dependerá de las
condiciones de observación del momento, dado que el LR está determinado por la longitud de
onda de la luz empleada (λ) y por la apertura numérica (AN), las cuales pueden cambiar. No
obstante, lo que sí es único es el mínimo LR, que se obtiene con la menor λ posible y la mayor
AN posible (mirar ecuación de LR, página 9).

UNIDADES DE MEDIDA DEL SISTEMA MÉTRICO

Micrómetro (µm): Unidad de medida del microscopio óptico. Equivale a la milésima parte del
milímetro:
1 µm = 10-3 mm = 10-4 cm = 10-6 m

Nanómetro (nm): Equivale a la millonésima parte del milímetro:

1 nm = 10-3 µm = 10-6 mm = 10-7 cm = 10-9 m

Angström (Å): Unidad de medida del microscopio electrónico. Equivale a la diezmillonésima parte
del milímetro:

1 Å = 0,1 nm = 10-4 µm = 10-7 mm = 10-8 cm = 10-10 m

LÍMITES Y DIMENSIONES EN BIOLOGÍA

Los niveles de organización de la materia viva están interrelacionados de manera

compleja.

Los límites o fronteras entre estos niveles están determinados por el poder resolutivo de:

a- El ojo humano: puede diferenciar dos puntos separados hasta 0,2 mm = 200 µm.

b- El microscopio óptico: su límite de resolución es 0,2 µm.

c- El microscopio electrónico: su límite resolutivo puede variar entre unos pocos nanómetros y 0,1 nm.
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Se puede comparar el tamaño relativo desde el nivel químico hasta el nivel de organismo
utilizando una escala logarítmica (en múltiplos de 10). La longitud celular, en la mayoría de las
bacterias, oscila entre 1 y 10 µm. La mayoría de las células eucariotas alcanza entre 10 y 30 µm de
diámetro. Las mitocondrias tienen, aproximadamente, el tamaño de las bacterias más pequeñas,
mientras que los cloroplastos son, en general, más grandes (que las mitocondrias), con unas 5 µm
de longitud. Los óvulos están entre las células más grandes. Aunque microscópicas, algunas células
nerviosas son muy largas. Las células que se muestran aquí no están dibujadas a escala.
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Guía de estudio

¿Cuál es la diferencia entre el tornillo micrométrico y el tornillo macrométrico?

¿Qué tornillo de enfoque se recomienda para cada objetivo?

¿Cuál es la diferencia entre el condensador y el diafragma?

¿Por qué con un objetivo de inmersión se observan más detalles de la muestra que con
un objetivo a seco?

¿Cómo se relaciona el poder de resolución con el límite de resolución?

¿Qué significa que un objetivo tenga mayor apertura numérica?

¿Cuál imagen tiene mayor “calidad”: una observada con un objetivo de 10X y ampliada
10 veces, o una obtenida al pasar de un objetivo de 10X a 100X? ¿Por qué?

¿En qué dirección es necesario mover el tornillo macrométrico para que la platina se
aleje del objetivo? ¿Hacia el observador o en dirección contraria?

¿Cómo varían la profundidad de campo, la distancia frontal y el campo observado al pasar

a mayores aumentos?

¿Cuáles son los pasos necesarios para obtener una muestra biológica para ser observada
bajo el microscopio óptico? ¿Es posible observar células o tejidos vivos? Si fuera posible,
¿cómo?

¿Cuáles son las condiciones en las cuales se debe encontrar el microscopio óptico antes
de usarlo?

Suponiendo el resto de las condiciones constantes, ¿con que tipo de luz se logra una mayor
resolución, amarilla o azul? ¿Por qué?

¿Cuál es el diámetro mínimo que debe tener una estructura u organela celular para que
pueda ser resuelta por el microscopio óptico? Mencione, al menos, 2 ejemplos.