SEMINARIO 1: IDENTIFICACIÓN Y SENSIBILIDAD DE GRAM +

IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM+

• Catalasa+/racimos: Staphylococcus

• S. coagulasa positivo: S. aureus. Tratamiento de elección siempre es meticilina salvo SARM

• S. coagulasa negativo: S. Epidermidis; Lugdunensis... à normalmente colonizan, pero pueden

hacer endocarditis

• Catalasa-/cadenas:

• Streptococcus:

- S. pneumoniae: neumonía(alfa hemolítico)

- S. pyogenes(beta hemolítico del grupo a): faringoamigdalitis;

- S. grupo viridans(alfa hemolítico): endocarditis

- S. agalactiae(beta hemolítico del grupo b): neonatos...

• Enterococcus: muy resistentes a atb.

- E. faecalis: infección urinaria

- E. faecium ...

STAPHYLOCOCCUS

Staphylococcus lugdunensis:

Mayor virulencia. Se parece al S. aureus. Produce

endocarditis grave. Es el único que produce la
ornitina descarboxilasa, que es una enzima que
descarboxila la ornitina. Convierte el medio amarillo
en un medio rojo debido a un indicador de color.

2 tipos de identificación una vez que hemos visto

cocos GRAM+ en racimos

1. Cuando tenemos una colonia

2. Cuando tenemos una muestra clínica o de un hemocultivoàpodemos saber si es aureus y si es resistente

1. TÉCNICA DE AGLUTINACIÓN à2-3 min

Si tenemos en el laboratorio un Staphylococo una COLONIA, hay formas de saber de qué tipo es. A veces lo S.
aureus no son tan amarillos ni los coagulasa- más blancos. La unión de S. aureus con látex unido a Ac anti-S.
aureus vemos un granulado. Si no es de este tipo no se producirá la unión Ag-Ac.

2. DETECCIÓN DE S. AUREUS MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL à1hora

Es importante si este S. aureus es resistente o no a la penicilina porque definirá si podemos usar beta- lactámicos
o no. La oxacilina se utiliza para tratar las infecciones por Staphylococo. Para esto hacemos una PCR en tiempo
real en el laboratorio, que amplifica el gen de la resistencia a la meticilina à metA o metC. Si lo tienen será
resistente.

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Si no sale el gen especifico de S. aureus puede ser un Staphylococo coagulasa- que sea resistente a meticilina.
Podemos hacerlo a través de una MUESTRA CLÍNICA àgotitas de hemocultivo, exudado de herida/respiratorio...
directamente en la máquinaàvemos si es [Link] y su resistencia

Otros métodos que se utilizan para buscar S. aureus en el laboratorio, generalmente para buscar PORTADORES
serán:

3. MEDIO MANITOL-SAL: detección S. aureus (único en crecer. De color amarillo)à crece en sal y fermenta
manitol—> con el ácido pasa de rosa a amarillo
4. MEDIO CROMOGÉNICO: detección de SARM (color verde o azul). Los que no son S. aureus crecen de
color blancoàcoagulasa- y no nos interesan. Lleva meticilina u oxacilina
Þ Se toma una muestra NASAL en estos dos últimos
Þ Muy importante AISLAR a los portadores. 30% de la población

*sensible a novobiocina el [Link]

BRC(Bacteriemia relacionada con infección de catéter)

• Estafilococos coagulasa negativa es el más frecuente que produce bacteriemia relacionada con infección
de catéter—> porque con más frecuencia forman parte de la piel
• Se diagnostica con hemocultivo. Hacemos hemocultivo diferencial. Sangre desde catéter y otro desde
donde no hay. La diferencia de tiempo es de más de dos horas entonces hay BRC. Los saco a la vez

CASO CLÍNICO

• Paciente de 58 años de edad que ingresa en el Servicio de Intensivos tras la realización de un trasplante
hepático

• A los 7 días el paciente presenta fiebre y se observa tumefacción e inflamación en el lugar de inserción
del catéter

• Ante la sospecha de una bacteriemia relacionada con el catéter (BRC) se extraen hemocultivos por una
vía periférica y también a través del catéter

¿Cuál de los siguientes microorganismos es el principal agente causal de BRC?

a) Staphylococcus aureus

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 b) Escherichia coli

c) Estafilococos coagulasa-negativa

d) Candida albicans

e) Pseudomonas aeruginosa

¿Cómo realizamos el diagnóstico de la BRC?

• Características clínicas (baja especificidad y sensibilidad)

• Hemocultivos (estafilococos y Candida spp.)

• Hemocultivos diferenciales: obtenidos por el catéter y de sangre periférica

• Tiempo de positividad: ³ 2 horas de los hemocultivos obtenidos de catéter y de sangre periférica (S: 80-
90% y E:75-90%)

CASO CLÍNICO

• Varón de 65 años con obesidad moderada, hipertensión y diabetes mellitus tipo II.

• Diagnosticado de enfermedad coronaria que requiere cirugía cardíaca (by-pass de la arteria coronaria)

• A las 24h de la cirugía ingresa en la planta de hospitalización convencional

• Al 4º día tras la cirugía: fiebre elevada, escalofríos, mal estado general, dolor torácico

¿Cuál sería la etiología más probable de esta mediastinitis?

a) Staphylococcus aureus

b) Enterococcus faecalis

c) Estafilococos coagulasa-negativa

d) Candida albicans

e) Pseudomonas aeruginosa

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 Þ Si es a los 4 días el más frecuente es el s. aureus—> mediastinitis post-quirúrgica. Además no es
coagulasa negativo porque es muy grave y los coagulasa negativo son más lentos.

¿Cómo realizamos el diagnóstico de esta mediastinitis postquirúrgica?

• Características clínicas

• Radiología de tórax

• Hemocultivos

• Toma de muestra de la herida esternal para tinción de Gram y cultivo

CASO CLÍNICO

• Varón de 12 años con historia de cardiopatía congénita y cirugía cuando tenía un año de edad

• Acude al cardiólogo-pediatra por fiebre de 39ºC durante 15 días y fatiga.

• Los días previos había recibido antiinflamatorios y tratamiento con antibióticos durante 1 semana con
leve mejoría de los síntomas

• El cardiólogo le realiza un ecocardiograma transtorácico y observa múltiples vegetaciones cardíacas

(endocarditis)

¿Cuál podría ser el microorganismo causal?

Podría ser cualquiera pero en este caso le hacen una prueba y es [Link]

a) Staphylococcus aureus En la boca, tubo digestivo

c) Streptococcus del grupo viridans

c) Enterococcus spp.

d) Staphylococcus lugdunensisà Descarboxila la ornitina hemocultivo y vegetación. Tiene mucha virulencia pero
poco a poco ha ido creciendo.

e) Staphylococcus epidermidis

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 Þ TODOS Siempre cualquiera de ellos. S. aureus suele aparecer antes porque es muy virulento
*Vegetaciones: crecimientos en las válvulas

¿Cómo realizamos el diagnóstico microbiológico de esta endocarditis?

Hemocultivo y ver si coincide con el de la vegetación

• Hemocultivos

- Imagen de identificación: En la izquierda hacemos aglutunación y en la derecha la PCR SARM/SAMS para

si ver si es un aureus

STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS

Todos Gram+ catalasa negativos:

- NEUMOCOCO: tenemos en cuenta que se produce hemolisis parcial de los hematíesàalfa-hemólisis y

que es sensible a la OPTOQUINA. Primera causa de neumonía en nuestro país.
- El STREPTOCOCCUS PYOGENES es beta-hemolítico del grupo A (hemolisis total) y es sensible a
BACITRACINA. Causa más frecuente de faringoamigdalitis.
- STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: beta-hemolítico del grupo B
- STREPTOCOCCUS del grupo VIRIDANS: alfa- hemolítico.y R a optoquina: bacteriemia y endocarditis.

IDENTIFICACIÓN:

1. Por cultivos, sistemas automatizados: reactivos bioquímicos para saber qué fermenta…. también
tenemos Ab con las concetraciones: identificacion + sensibilidad para gram+ y gram –

2. TÉCNICAS DE PCR Y SECUENCIACIÓN DEL GEN16S ARNR.

Se amplifican los genes que codifican para esta subunidad de ARNr, se secuencia y luego tendremos el resultado
de qué bacteria es. Tarda un poco más. Te identifica cualquier bacteria que haya en la muestra clínica.
Puede utilizarse en hemocultivos. PCR y detección por hibridación reversa en tiras con sondas de ADN
inmovilizadas (aproximadamente 4h).

infecciones graves como absceso cerebral o endocarditis con vegetaciones de una válvula

específica de cada especie

tenemos que secuenciarlo, lo comparamos a unas universales

tarda pero lo hacemos cuando no crece hemocultivo, no sé que hacer….

48 horas

3. PCR MULTIPLEX en 2 h y 30 min—> buscan muchos genes a la vez como vanA o VanB en enterococcos
que hacen que sean resistentes a la vancomicina. MecA será staphylo RM
- Verigene Gram-positive blood culture test: microarray para Gram-positivos y algunos genes de
resistencia
- Genes de resistencia Gram+: mecA, vanA, vanB
- Filmarray: Gram-, Gram+, levaduras, genes mecA, vanA, vanB, KPC
- Real Cycler

4. MALDI-TOF MS. Espectrometría de masas

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Se hace directamente de la colonia aunque se puede hacer directamente del frasco del hemocultivo. Se ponen las
colonias en los pocillos y se meten en la máquina que tiene un láser que índice sobre ellos y da los espectros
distintos que nos dice qué bacteria es.

3 min y basada en ARNr. Pero hay que hacer previas centrifugaciones del HC para quitar hematíes y glóbulos rojos

33 min=30 de extracción+identificación

Picos específicos de cada especie

5. INMUNOCROMATOGRAFÍA
- [Link]
- S. pneumoniae: antígeno urinario en la orina

Basado en reacción Ag-Ac: Ac frente a Ag bacterianos àcuando echamos la muestra clínica si reacciona es que
hay Ag. Como consulta para ver si es bacteria o virus en una faringitis

Faringitis en niños es: o s. pyogenes o virus

Si queremos [Link] entonces necesitamos una muestra urinaria

CASO CLÍNICO

En un paciente que ingresa en la UCI con neumonía, ¿cómo se puede descartar en menos de 4h la presencia de S.
aureus-metiR?

a) Mediante tinción Gram del esputo y observar cocos Gram+ en racimos à solamente salemos que hay
racimos
b) Realizar una PCR en tiempo real para detectar el gen mecA à nos dice la resistencia pero no
descartamos la presencia de S. aureus
c) Realizar una PCR en tiempo real para detectar la presencia de S. aureus àno sabemos su resistencia
d) Todas las anteriores son falsas

BYC

En los hemocultivos de un paciente se observan cocos Gram+ en racimos, ¿cómo se puede saber en menos de 2h
de qué microorganismos se trata?

a) Realizar una PCR en tiempo real para detectar el gen mecA

b) Realizar una identificación mediante MALDI-TOF àmínima extracción y con mayor rapidez
c) Realizar una identificación mediante pruebas bioquímicasàsolo los catalasa + tendrían que crecer y
tarda 24 h como mínimo
d) Realizar una –PCR y secuenciación del producto amplificadoàrápido son 48 horasàamplificar,
secuenciar y consultar la nube

¿Qué podríamos hacer ante estas infecciones de piel y partes blandas para obtener un diagnóstico microbiológico
en el mismo día? Por ejemplo para una fascitis necrosante necesitamos urgencia

1. Gram
2. Dependiendo de:
2.1 PCR si es en racimo(1hora)
2.2 Inmunocromatografía si es en cadena (20 min)

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

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 • Resultados in vitro necesarios para evaluar la respuesta in vivo
• Orientar decisiones terapéuticas individuales
• Se debe monitorizar la evolución de la R bacteriana mediante:
- Seguimiento epidemiológico
- Revisión del espectro del antimicrobiano
- Hablamos de un interés individual y epidemiológico.

TIPOS DE ANTIBIOGRAMA

Para saber si es resistente o no y a qué concentración

1. Cualitativos: difusión (método de difusión con discos)

2. Cuantitativos:
• Gradiente de difusión O E-TEST. E-test: tira cargada con distintas concentraciones. CMI es de 3 mg/L
• Dilución (método de dilución en caldo) pocillos con difernetes concentraciones

Tener en cuenta:

- Necesitamos colonia para hacer dilución en agar—> laborioso y lento

- Dilución en caldo igual lento: vemos turbidez: mínima concentración de Ab capaz de inhibir el
crecimiento de la bacteria. Es importante saber que no lo mata.
- En pacientes graves es importante saber la CMI para saber si tenemos que dar dosis habituales o doble
dosis.
- Antibiograma directo mediante E-test en muestras respiratorio de NAVM en 18horas. Después ya
haremos un antibiograma mejor

COMITÉS DEL ANTIBIOGRAMA: Hay diferentes métodos de determinación de sensibilidad, y hay muchos comités
que determinan qué es sensible y qué es resistente en cuanto a sus valores obtenidos. Hoy en día usamos EUCAST
y CSLI. Un antibiótico que inhiba con 32 microgramos/mL no tiene que ver con que no sea 1microg/mL. Depende
de cómo se metabolice. Para cada Ab y cada MO hay unos valores, no vale lo mismo para todo. Qué antibiótico es
activo a qué concentración para qué MO. Nosotros seguimos EUCAST

CASO 1: Acido clavulánico es un inhibidor de la beta lactamasa. Vemos que el mecanismo de resistencia es
betalactamasa

CASO 2: Oxacilina y cefoxitina es lo mismo que meticiliina .Si R oxacilina o R a cefoxitina entonces tiene el Mec
Aà no funcionan los carbapenémicos o cefalosporinas

• PBP: donde los betalactámicos paran la construcción de la pared. Pero los genes MecA y MecC altera las
PBP y puede seguir trabajando.
• Además las betalactamasas no funcionan porque no es ese el mecanismo de resistencia
• Oxacilina y cefoxitina: Marcadores surrogados de todos los demás antibióticos betalactámicos

INTERPRETACIÓN DEL ANTIBIOGRAMA:

• Es importante realizar una interpretación del antibiograma. Analizar datos de sensibilidad y correlacionar
con posibles mecanismos de resistencia
• Siempre que tengamos un S. oxacilina resistente y nos salga sensible a todos los beta-lactámicos NO
podremos tratarlo con ellos. Hay que ver los marcadores de mecanismos de resistencia para la elección
del Ab.

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 • Hay que integrar microorganismo, antibiótico y paciente.

CASO 1: Si utilizamos D-test, buscaremos las posibles resistencias bacterianas que estén codificadas en el gen,
pero no expresadas de modo normal debido a que la dosis in vitro no sea suficiente para que se active. Es una
resistencia inducible y no puedo dar clindamicina. Puede haber desarrollo de resistencia durante el tratamiento

Si lo pongo alejado no se interpreta porque no veo el posible efecto inductor in vivo

CASO 2: Aunque la amicacina salga sensible, si la tobramicina es resistente, significa que hay un enzima
inactivante de aminoglicósidos y por tanto afectará también a la amicacina in vivo, aunque in vitro no. Hablamos
de una aminoglicósido nucleotidil transferasa. Si la bacteria tiene el gen de resistencia, a la larga lo va a expresar.
No lo expresa habitualmente porque no necesita utilizarlo.

Antibiograma del paciente con endocarditis

CASO 1: Hablamos de un Enterococcus faecium. Cuanto tenemos resistencia a la vancomicina, muchas veces no
podemos utilizar teicoplanina aunque salga sensible, ya que tenemos el gen vanB que induce la expresión de una
proteína vanB que hace que la teicoplanina no se una a su diana. Desarrollará la resistencia in vivo.

Es muy resistente a cefalosporinas, algunas penicilinas, si es resistente a gentamicina es resistente a todos los
aminoglicósidos

CASO 2: Genta sola no puede entrarà actúa en el ribosoma. No puede usar amoxiC porque no tiene
betalactamasa luego no haría nada. Sí vancomicina.

Endocarditis por enterococo siempre efecto bactericida sinérgicoà1 mata pero no atontaàen este caso
usaríamos genta+vancomicina

Antibiograma: linezolid

• Aparentemente sensible, pero una CMI tan elevada hace pensar en un mecanismo de resistencia
transferible.
• Se debe comprobar si tiene algún mecanismo de resistencia mediante métodos moleculares antes de
iniciar tratamiento con este antimicrobiano.
• Llega muy bien al pulmón y entonces si es SARM está muy bien
• Lo normal es 4

Paciente con meningitis por NEUMOCOCO y la siguiente información:

OXACILINA: S (disco 1 µg/halo de 20 mm)

ERITROMICINA: S

Con esta información puedo saber que el neumococo es:

1. Sensible a MEROPENEM

2. Sensible a AMOXICILINA/CLAVULANICO y a PENICILINA

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3. Sensible a CEFOTAXIMA

4. Sensible a AZITROMICINA

• Oxacilina sensible en neumococo signifca s a carbapenems, cefalosporinas, penicilinas.

• Un neumococo sensible a oxacilina es sensible a todos los beta-lactámicos
• Si fuera resistente a oxacilina habría que determinar la CMI de penicilina y de cefotaxima
• Resistencia a oxacilina en un neumococo no te informa de nada
Þ CUIDADO que staphylo conque sea R a uno vale. Pero neumococ si es R a uno tebemos que ver
lo otro
• Eritromicina S nos informa de sensibilidad a todos los macróglidos

Antibiograma S pyogenes

NO SE HA DESCRITO PRODUCCIÓNDE BETALACTAMASA

Ni R a penicilinaàsiempre sensible a penicilina

Antibiograma S pyogenes: faringoamigdalitis aguda en niño de 3 años.

R a penicilina, R acl indamicina y R a eritromicina. Posibilidades:

1) No es S. pyogenes
2) No es resistente a penicilina
3) No descritos en el mundo S. pyogenes resistentes a PENICILINA (algunas cepas sensibilidad disminuida)
4) Puede estar contaminado el antibiograma
Þ Mencionamos los macróglidos porque es lo que se le da a un niño alérgico a penicilina

IDENTIFICACIÓN Y SENSIBILIDAD DE COCOS GRAMPOSITIVOS

Grampositivos de mayor importancia clínica:

- S. aureus, enterococo, neumococo, estreptococo grupo A

Antimicrobianos activos*:

• Beta-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas

• Macrólidos y lincosamidas: eritromicina, clindamicina
• Aminoglucósidos: gentamicina, tobramicina, amicacina
• Glucopéptidos: vancomicina, teicoplanina
• Lipopéptidos: daptomicina, dalbavancina
• Oxazolidinonas: linezolid, tedizolid

* enterococo con excepciones

Antimicrobianos activos frente a enterococo:

• Beta-lactámicos: penicilinas y carbapenemas (frente a la mayoría de cepas de E. faecalis (99%); y sólo

frente a 10-20% de E. faecium)

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 • Todos los enterococos son resistentes a cefalosporinas, macróglidos y lincosamidas
• Aminoglucósidos: solamente activos en asociación con penicilinas o con glucopéptidos (y siempre que no
presenten resistencia de alto nivel)
• Glucopéptidos: vancomicina, teicoplanina
• Lipopéptidos: daptomicina, dalbavancina
• Oxazolidinonas: linezolid, tedizolid

Nuevos antimicrobianos activos frente a grampositivos:

• Cefalosporinas: ceftarolina, ceftobiprol (no activos frente a enterococo, activos frente a SARM)
• Glucolipopéptidos: oritavancina
• Derivados de tetraciclinas: tigeciclina, eravaciclina

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