PRÁCTICA: AISLAMIENTO DE SALMONELLA

Epidemiológicamente unos pocos serotipos de Salmonella tienen huésped específico siendo la

mayoría inespecíficos, en cuanto a especie animal que potencialmente pueden afectar. Las fuentes
de contaminación son muy amplias y las especificaciones en Microbiología de Alimentos exigen
ausencia de cualquier serotipo de Salmonella en 25 o 50 g de muestra.

El aislamiento de Salmonella a partir de alimentos se hace difícil por dos factores:

La población de Salmonella frente a la flora competitiva es muy baja y porque muchos alimentos
han sido sometidos a procesos que destruyen parte de la flora microbiana, quedando los que
sobreviven muy debilitados.

La metodología para el aislamiento e identificación de Salmonella comprende 5 pasos:

 Preenriquecimiento en medio no selectivo
 Enriquecimiento selectivo
 Siembra en medios selectivos
 Pruebas bioquímicas
 Pruebas serológicas

Materiales

 Recipiente estériles, boca ancha, de 500 mL con 225 mL de Caldo BHI o Caldo Tripticase Soya
 Incubadora a 35°C ± 1 °C
 Baño de agua a 45°C
 Pipetas estériles de 1 mL
 Asa bacteriológica
 Tubos serológicos 10 x 75 mm
 Portaobjetos
 Tubos con 10 mL de Caldo Tetrationato o Caldo Rappaport
 Tubos con 10 mL de Caldo Selenite Cistina
 Cajas con Agar Bilis Verde Brillante
 Cajas con Agar Bismuto Sulfito
 Cajas con Agar Hektoen
 Cajas con Agar XLD
 Tubos con Agar Hierro tres azúcares
 Tubos con Agar Lisina hierro
 Tubos con Caldo o Agar Urea
 Solución salina fisiológica
 Agar Tripticase Soya inclinado
 Antisuero polivalente

Procedimiento

Pre enriquecimiento no selectivo:

 Pesar asépticamente 25 g de la muestra
 Agregar la muestra a 225 mL de Caldo Cerebro Corazón en un recipiente de 500 mL
 Incubar a 35 - 37°C durante 2 - 6 horas
Enriquecimiento selectivo:
 A partir del medio de enriquecimiento
 Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Selenite Cistina (incubar a 35°C por 24 h)
 Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Tetrationato (blanco lechoso) o Caldo Rappaport
(incubar a 43°C por 24 h)

Siembra en Medios Selectivos:

De cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo sembrar con asa en:
 Agar Bismuto Sulfito
 Agar Bilis Verde Brillante
 Agar Hektoen o Agar XLD
 Incubar las cajas a 35°C por 24 horas. Si en Agar Bismuto Sulfito no aparecen colonias
sospechosas, reincubar por 24 horas más

Interpretación de las colonias:

Agar Bismuto Sulfito

Colonias Microorganismos

Centro negro, precipitado negro y con Salmonella (Excepto S. paratyphi y

con brillo metálico S. pullorum)

Pequeñas con color verde a pardo Coliformes, Proteus

(Solo presentes ocasionalmente)

Agar XLD

Colonias Microorganismos

Amarillas, opacas halo de precipitado E. coli, Enterobacter, Aeromonas

Amarillas, mucosas, halo de precipitado Klebsiella

Amarillas opacas, a veces con centro negro Citrobacter

Amarillas con halo amarillo Serratia, Hafnia

Amarillas, transparentes con centro negro Proteus

Rojizas a veces con centro negro Salmonella

Anaranjadas opacas Salmonella typhi

Rojizas transparentes Shigella, Providencia

Agar Hektoen

Colonias Microorganismos

Verde húmeda, plana transparente Shigella, Providencia

Azul verdosa con centro negro Salmonella

Azul verdosa sin centro negro Proteus

Azulada plana borde irregular Pseudomonas

Color salmón, con halo de precipitación Coliformes

Agar Bilis Verde Brillante

Colonias Microorganismos

Rojas con halo rojo Salmonella

Proteus

Amarillas con halo amarillo E. coli, Enterobacter, Citrobacter,

Klebsiella

Pruebas Bioquímicas:
 Seleccionar 2 o más colonias sospechosas de cada uno de los medios selectivos
 Inocular cada colonia en tubos con Agar hierro tres azúcares y Agar Lisina hierro y Agar
Urea, en el fondo y en la superficie. Después de sembrar el primer tubo inocular el
segundo sin flamear el asa
 Incubar los tubos de 35°C durante 24 horas.
Los cultivos sospechosos de en Agar hierro tres azúcares muestran el fondo amarillo
(formación de ácido) y la superficie inclinada rojo. Con o sin producción de H2S
(ennegrecimiento del medio).
En Agar Lisina hierro muestran una reacción alcalina (púrpura) del medio resultante
de la descarboxilación de la lisina con o sin H2S.
En Agar Urea no se produce cambio de color en el medio.
Si es necesario realizar las pruebas bioquímicas que se indican en la tabla.

Pruebas Serológicas:
Prueba para antígeno somático, polivalente O:
 Diluir y chequear el antisuero con cultivos conocidos
 Marcar 2 secciones de 1 x 2 cm en un portaobjetos
 Colocar una asada de cultivo de 24 horas de Agar Nutritivo o Agar Hierro tres azúcares en
la sección marcada
 Agregar una gota de solución salina fisiológica a cada sección
 Mezclar con asa limpia
  Agregar una gota de antisuero polivalente o a una sección y mezclar
 Agitar el portaobjetos por 1 minuto
 Observar sobre fondo oscuro

Interpretar:

Positivo: Cuando se presenta aglutinación en la mezcla cultivo salina suero y no aglutinación en la

mezcla cultivo salina.

Negativo: Cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo salina suero. Estos cultivos deben
probarse con el antisuero polivalente H

Inespecífico: Cuando las dos mezclas aglutinan. En este caso se requieren pruebas adicionales

Interpretación:

Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas y dan reacciones serológicas positivas se
consideran como Salmonella especies.

1. Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas pero no dan reacciones serológicas y
las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas pero dan reacciones serológicas
positivas pueden ser Salmonella

2. Las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas ni dan reacciones serológicas
positivas no se consideran Salmonella.

Las cepas aisladas en los casos 1 y 2 deben ser enviadas en Agar Cerebro Corazón inclinado en
tubo de tapa rosca a un Centro de referencia, adjuntando la información pertinente.

Expresión de resultados:

 Si no se aisló Salmonella en los medios de enriquecimiento y selectivos reportar:

No se aisló Salmonella en 25 g o 50 g de la muestra examinada.

 Si se encuentra Salmonella a partir de uno o los 2 caldos de enriquecimiento selectivo

reportar:

Se aisló Salmonella en 25 g de la muestra examinada.

 Reacción Porcentaje de
Serotipos que
producen la Reacción
Agar Hierro tres azúcares:

glucosa, con formación de ácido + 100

glucosa, con formación de gas + 91.9

lactosa -* 99.2

sacarosa - 99.5

H2S + 91.6

Urea - 100
Lisina + 94.6
 galactosidasa -* 98.5
Indol - 98.9
* Salmonella: subgénero III (Arizona) puede presentar reacciones positivas.
 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA SALMONELLA

MEDIOS DE CULTIVO
PRUEBA Y/O REACTIVOS SIEMBRA INTERPRETACION
Oxidasa A. Nutritivo Colocar 1 colonia sobre A los 20-60 segundos
+ Discos de Oxidasa la zona reactiva de la comparar con escala de
tira colores
Positivo: Azul o violeta
Indol Agua de Triptona Siembra ligera Agregar 0.3-0.5 mL de Reac.
+Reactivo de Kovacs Incubar 18-24 horas de Kovac
Positivo: coloración rosada
Rojo de Metilo Caldo MR VP + Siembra ligera Agregar 4-6 gotas de rojo de
Sol Rojo de Metilo Incubar 48 horas metilo
Positivo: color rojo
Voges Proskauer Caldo MR VP + Separa 1 mL del cultivo Agregar 0.6 mL de  naftol y
 naftol y KOH en caldo MRVP antes 0.2 mL de KOH. Agitar y
de hacer la prueba dejar reposar hasta 2 horas
Positivo: Coloración rojiza
Citrato Agar Citrato de Simonns Sembrar en estrías Positivo: Crecimiento en la
Incubar 24 horas superficie y cambio de color
a azul
Malonato Caldo malonato Incubar 24-48 horas Positivo: cambio de color a
azul

Fenilalanina Fenilalanina Incubar 24-48 horas

Agregar HCl 0.1N hasta
amarillo.
Agregar 3-4 gotas de
Cloruro férrico al 10%
Positivo: verde en 2-3
minutos
 Galactosidasa 0.25 mL de Solución Siembra densa + 1 gota Agregar 0.25 mL de
salina fisiológica de tolueno Reactivo de ONPG
Incubar 2-5 minutos a Positivo: coloración
37°C amarilla a los 20 minutos en
baño
Esperar hasta 3 horas
reacción lenta
PRÁCTICA: PRUEBA DE SALMONELLA 1-2 TEST

DIA 1:

PRE-ENRIQUECIMIENTO:

- Pesar 25 gramos de muestra y añadir a 225 ml de Agua Peptonada Buferada 2% o

Caldo de lactosa.
- Incubar 24 horas a 35°C

Agua Peptonada Buferada: Pesar 20 gramos y disolver en 1 litro de agua, dispensar en

alícuotas de 225 ml y autoclavar a 121°C por 15 minutos.

DIA 2:

PREPARACIÓN DE LA UNIDAD DE 1-2 TEST:

- Posicionar la unidad con la tapa negra hacia arriba.

- Abrir la tapa negra y agregar 1 gota del reactivo # 1 ( Sol. Yodo-yoduro de potasio),
cerrar y mezclar.
- Abrir nuevamente la tapa negra y con una pinza sacar el dispositivo plástico que se
encuentra al interior. Descartar.
- Adicionar 0.1 ml del pre-enriquecimiento y tapar.
- Posicionar la unidad con la tapa blanca hacia arriba.
- Abrir la tapa blanca y adicionar 1 gota del reactivo # 2. (Ac policlonales)
- Con unas tijeras cortar la punta de seguridad de la tapa blanca y cerrar la unidad.
- Incubar a 35°C con la tapa blanca hacia arriba y la negra hacia un lado de 14 a 30
horas.

DIA 3:

LECTURA DE RESULTADOS:

- Observar la unidad contra una fuente de luz con la tapa blanca hacia arriba. La
formación de una banda de inmunodifusión o menisco en la parte superior de la
cámara es indicativo de presencia de salmonella.