Tema Nº4

Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Tema Nº4

Genética: Fenómenos sexuales en bacterias

Los fenómenos de conjugación bacteriana más estudiados son los de Escherichia coli. La conjugación es la
unión de dos células seguida de la transferencia unidireccional, de F+ a F-,de material genético.

Este proceso de transferencia entre una célula procariota (bacteria o arquea) donadora y una receptora
se produce mediante el contacto directo o una conexión que las una.

A menudo se la consideraba un símil a la reproducción sexual debido a que implica el intercambio de

material génico, no obstante, a diferencia de ésta la transferencia es unidireccional. Durante la conjugación la
célula donadora provee un elemento génico móvil o conjugativo que generalmente es un plásmido o un
transposó[Link] mayoría de los plásmidos conjugativos tienen sistemas que aseguran que la célula receptora no
tenga ya un elemento similar.

La información genética transferida a menudo beneficia al receptor. Las ventajas pueden incluir
resistencia antibiótica, tolerancia xenobiótica o la capacidad de usar nuevos metabolitos. La conjugación de
plásmidos benéficos puede ser considerada una endosimbiosis procarionte.

Figura Nº1: Conjugación bacteriana

A la conjugación le sigue la recombinación. Ésta puede hacerse por:

a) Ruptura cromosómica e intercambio recíproco de segmentos:

Figura Nº2: Célula con cromosoma recombinante

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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

b) Copia alternativa:

Figura Nº3: Célula con cromosoma recombinante

Otras formas de obtener recombinantes

a) Plásmidos (plásmidos y algunas levaduras).

Algunas bacterias tienen más de un cromosoma, como por ejemplo la Pseudomonas cepacia que tiene
tres. Siguen siendo haploides. Pero tienen además ADN extra cromosómico: los plásmidos.

𝐶𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
𝑁𝑜 𝐶𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
𝑃𝑙á𝑠𝑚𝑖𝑑𝑜𝑠 {
𝐶𝑜𝑚𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
𝑁𝑜 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠

Los plásmidos bacterianos codifican mecanismos de resistencia (por ejemplo a antibióticos) o paquetes
enzimáticos que permiten la degradación de los más diversos substratos (sobre todo orgánicos y entre
ellos sustancias tóxicas o de alto poder contaminante).

Tamaños relativos
Organismo o estructura Número de genes
Plásmidos 10
Virus 102
Bacterias 103
Levaduras 104
Células animales 104 – 105
Células vegetales 104 – 105

b) Transformación
Son técnicas de Ingeniería Genética (manipulación de genes).

c) Transducción
Es un mecanismo que requiere de:
• Una cepa bacteriana lisógena.
• Un fago transductor.

Biotecnología 2
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Infección lítica Profago transductor

Infección lítica y
clonación del fago
transductor

Bacteria diploide parcial en el gen Infección de bacteria lisógena

transducido

Figura Nº4: Mecanismo de transducción

Cósmido

Es un plásmido que puede ser empaquetado dentro de un fago y ser transferido así a una bacteria.

Origen químico del material genético

• Los genes no sólo controlan la herencia de padres a hijos sino que controlan la función diaria de las
células y su reproducción.
• Los genes, segmentos constitutivos de los cromosomas, determinan cuales enzimas, cuales sustancias o
estructuras deben ser sintetizadas por la célula.

A CADA GEN, UNA ENZIMA

- Son las enzimas quienes regulan las reacciones oxidativas (catabolismo) que proporcionan energía a la
célula y regulan la síntesis (anabolismo) de los constituyentes celulares.

El gen

Está constituido por una doble hélice de ADN. Un gen es una MACROMOLÉCULA y su peso molecular es
del orden de 106 Dalton. En la formación del ADN intervienen:

- Ácido fosfórico (P):

- Desoxirribosa (D):

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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

- Bases purínicas:

Adenina (A)

Purina

Guanina (G)

- Bases pirimídicas:

Timina (T)

Pirimidina

Citosina (C)

- Cuatro nucleósidos (base nitrogenada + desoxirribosa):

Adenosina Guanosina

Timidina Citosina

- Cuatro nucleótidos:

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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Grupo fosfato

Pentosa-desoxiribosa

Figura Nº5: Nucleótidos del ADN

El ácido fosfórico (P) y la desoxirribosa (D) forman dos ramas helicoidales y las bases A, T, C, G las uniones
entre ellas.

Las conexiones se realizan de manera que:

𝐴↔𝑇
𝐶↔𝐺
De tal manera, que linealmente dispuestas, ambas ramas tienen el aspecto:

Figura Nº6: Aspecto del ADN

- AVERY, MAC LEOD y MAC CARTY establecieron en 1944 que es el ADN quien determinalas propiedades
de las células.
En la misma época se demostró que la secuencia de los nucleótidos es fundamental: cambios en la misma
determinan la pérdida de propiedades.
- WATSON y CRICK establecieron la estructura del ADN en forma de escalera caracol y que las bases por sus
dimensiones espaciales están condicionadas a unirse A con T y C con G.
La secuencia de bases nitrogenadas sigue siendo fundamental pero los trabajos de WATSON y CRICK
suministran una información adicional:
o Fijada la secuencia de una hebra, queda fijada la secuencia de la otra.
𝐺+𝐶
o La relación: 𝐴+𝑇 tiene un valor determinado para cada especie.

Biotecnología 5
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

FILAMENTOS
ANTIPOLARES DE ADN,
5-3 →3-5

NUCLEÓTIDO con un
fosfato en posición 5 y
un oxhidrilo en
posición 3

Figura Nº7: Estructura del ADN

Duplicación del ADN

En 1958, MESELSON y STAHL demostraron que se trata de una duplicación semiconservativa.

Biotecnología 6
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº8: Duplicación semiconservativa

En 1967, KORNBERG y colaboradores produjeron en tubo de ensayo trozos de ADN biológicamente

activo: lograron su expresión en células vivas.

El ARN

- El ADN está localizado en el núcleo y contiene la información para la ejecución de todas las funciones
celulares.
- Pero las actividades celulares se llevan en su mayor parte, a cabo en el citoplasma.
- La forma de controlar estas actividades se realiza por intermedio de otro ácido nucleico: el ARN.
La formación y estructura del ARN está codificada en el ADN.
- El ARN es transportado al citoplasma y allí, a su vez, es quien controla las actividades celulares basadas a
su vez en la BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS ya que cada reacción química debe estar catalizada por una
enzima (de estructura PROTEICA).

Composición del ARN

- Ácido fosfórico (P):

- Ribosa (R):

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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

- Bases purínicas:

Adenina (A)

Purina

Guanina (G)

- Bases pirimídicas:

Uracilo (U)

Pirimidina

Citosina (C)

Síntesis del ARN

El ARN tiene estructura LINEAL.

Hay tres tipos de ARN:

• ARN – m: ARN mensajero.
• ARN – r: ARN ribosómico.
• ARN – T: ARN de transferencia.

a) Formación de los cuatro nucleótidos:

Figura Nº9: Nucleótidos del ARN; Ác. Adenílico, Ác. Guanílico, Ác. Uracílico y Ác. Citosínico

Biotecnología 8
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

b) Activación de los nucleótidos:

Figura Nº10: Activación de los nucleótidos mediante enlaces de alta energía

c) Abertura del ADN: (que sirve de molde o plantilla)

Figura Nº11: Abertura del ADN a partir de un origen de replicación

d) Respetando: A→U
T→A
G↔C
Unión de los nucleótidos activados a las bases de la tira (una de ellas) de ADN.

Figura Nº12: Unión de nucleótidos activados

e) Hidrólisis de los enlaces de alto contenido energético y formación de enlaces RIBOSA-FOSFATO con la
liberación del ARN-m (ARN-polimerasa)

Figura Nº13: Hidrólisis de enlaces de alto contenido energético

Biotecnología 9
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

El ARN-m lleva la información de los genes (ADN) al interior del citoplasma.

Fueron JACOB y MONOD quienes le dieron a este ARN el nombre de MENSAJERO.

El código genético

El código genético fue establecido por NIREMBERG y MATTHAEI en 1961.

Sus principales características son:

• Es universal (desde virus, bacterias, plantas, animales al hombre).
• Las “palabras” del código son tripletes (o CODONES) ordenados de tres bases nitrogenadas.
• El código genético es para el ARN-m, las bases son A; G; U; C.
• Cada triplete o codón es responsable de la síntesis de un aminoácido
• La sucesión de tripletes del ADN es la que origina la sucesión de tripletes del ARN-m y ésta la sucesión de
aminoácidos constituyentes de una proteína (estructura primaria).
• Algunos aminoácidos están codificados por un solo triplete y otros por varios (el código está
“degenerado”.
• El código contiene tripletes “sin sentido” que son sus signos de puntuación.
• El número de codones es 64.
• JACOB y MONOD llamaron al pasaje de ADN a ARN-m TRANSCRIPCIÓN.
• Establecieron también el mecanismo de la biosíntesis de proteínas, de la que la transcripción es la
primera etapa:

Figura Nº14: Estructura de las proteínas

Biotecnología 10
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Figura Nº15: Código genético

Masa de un gen

• Sea el gen que codifica la síntesis de una proteína de 1.000 aminoácidos.

• Para codificarla se necesitan: 2 x 1.000 tripletes.
• Si cada triplete está codificado por 3 nucleótidos: 2 x 1.000 x 3 = 6.000 nucleótidos.
• Si la masa media de un nucleótido es de 300 Dalton: 2 x 3 x 1.000 x 300 = 1,8 x 106
• Masa del gen = 1,8 x 106Dalton.

El cromosoma de Escherichia coli capaz de codificar de 2.000 a 3.000 enzimas tiene una masa molecular
de:2 a 3 x 109 Dalton.

Traducción genética

Intervienen los tres tipos de ARN:

ARN-m
ARN-r
ARN-t

La síntesis de los ARN está codificada por el ADN:

• En los genes de estructura: ARN-m.
• En los genes ribosómicos: ARN-r.
• En los genes del ARN-t: ARN-t.

La enzima responsable de la transcripción de los diversos tipos de genes del ADN en los ARN
correspondientes es la ARN-polimerasa (WEISS – HURWITZ – STEVENS, 1961).

El ARN-t tiene por misión transportar moléculas de aminoácidos a las moléculas de proteínas que se
forman utilizando de soporte a los ribosomas.

Hay un ARN-t por cada aminoácido. El ARN-t es de estructura lineal y está formado por 75 nucleótidos.

Biotecnología 11
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº16: Estructura del ARN-t

El aminoácido se fija al sitio de unión por acción de una transferasa.

El anticodón permite al ARN-t reconocer el codón del ARN-m que corresponde al mismo aminoácido que
transporta. Por ejemplo: el codón del ARN-m “UCG” codifica el aminoácido serina: Ser.

Figura Nº17: ARN-t

Biosíntesis de proteínas

En el ejemplo siguiente se observa cómo se produce la biosíntesis de proteínas mediante el proceso de

traducción genética, intervienen los tres tipos de ARN.

ADN ARN-m proteína ARN-t

Gen Codón Aminoácido Anticodón
ATT UAA comienzo -----
TAC AUG Met UAC
GGG CCC Pro GGG
CAG GUC Val CAG
TGG ACC Thr UGG
CGA GCU Ala CGA
CAA GUU Val CAA
ATC UAG fin -----

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Figura Nº18: traducción genética y biosíntesis de proteínas

Diferencias en la expresión genética

Figura Nº19: Diferencias en la expresión genética entre procariotas y eucariotas

Ingeniería genética (tecnología del ADN recombinante – CLONAJE)

a) Introducción

La información que determina las características observables de un organismo concreto (FENOTIPO) está
contenida en sus genes (GENOTIPO).

Un GEN es una molécula de ADN constituida por dos cadenas de nucleótidos cuyas bases son dos purinas
(A y G) y dos pirimidinas (T y C).

Biotecnología 13
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Las dos cadenas son complementarias de tal manera que cada purina está unida siempre a una pirimidina
determinada:

A↔T
G↔C

Los pares TA y AT y los GC y CG son imágenes invertidas una de otra. Al enlace N—H- -O en una
corresponde el O- -H—N en la otra.

5’

3’

Figura Nº20: Los pares TA y AT y los GC y CG.

Figura Nº21: numeración de los átomos de carbono en la desoxirribosa y ribosa

Biotecnología 14
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Las dos hebras de ADN son ANTIPARALELAS esto significa que una de ellas tiene polaridad 3 – 5 mientras
que la otra es 5’ – 3’.

Mecanismo de crecimiento (natural o sintético) de la cadena de ADN

El ADN crece por la incorporación de un desoxirribonucleótido trifosfato en el extremo 3 (oxhidrilo libre).

El crecimiento siempre es en el sentido 5 → 3. Los cuatro desoxirribonucleótidos que sirven como precursores
son:

Figura Nº22: Sentido de crecimiento del ADN

- dTTP desoxitimidina trifosfato

- dATP desoxiadenosina trifosfato
- dCTP desoxicitosina trifosfato
- dGTP desoxiguanidina trifosfato

La Biología Molecular tiene como fundamental objetivo el comprender cómo está organizada y cómo se
regula la expresión de la información contenida en el ADN. Estos conocimientos pueden permitir a la
BIOTECNOLOGÍA obtener entre otras cosas proteínas de interés: sanitario, agrícola, ganadero a costos más bajos
que por los métodos tradicionales.

Como un gen es sólo una mínima parte del ADN genómico, la tecnología del ADN recombinante (ADN-r)
que permite aislar un gen de la totalidad del ADN genómico, purificarlo y clonarlo es, sin lugar a dudas, más
eficiente que cualquiera de los métodos clásicos empleados antes de la década de los 80.

A continuación se intentará dar una visión que, sin perder el rigor técnico, permita comprender estas
técnicas de la biología que ya están cambiando el mundo y la imagen rígida que teníamos del mundo de los seres
vivos.

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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Clonación

El clonaje de un gen se basa en:

1. la fragmentación del ADN total del organismo que posee el gen de interés, para separar de él y sin que
resulte fragmentado, el gen elegido.
2. La unión del ADN correspondiente al gen elegido al ADN de un VECTOR GENÉTICO resultado de lo cual se
obtiene una molécula de ADN recombinante (ADN-r).
3. La introducción de este ADN-r en un hospedador adecuado que haga posible su CLONACIÓN o
propagación, o multiplicación.
4. La selección de células individuales del hospedador que hayan recibido (CLONES) de la molécula de ADN-
r.
5. Conseguir en esas células la expresión de ese ADN-r para obtener la proteína que él codifica.
6. Separar y purificar la proteína buscada.
7. Si el vector es resistente al CLORAMFENICOL (que inhibe la síntesis proteica celular) se pueden obtener
hasta 3.000 copias del vector (con su ADN-r incorporado) aumentando la productividad de la proteína
buscada.

Diferencias entre procariotas y eucariotas

El ADN de un organismo procariota está constituido por una secuencia continua de genes que se
expresan

El ADN de un organismo eucariota contiene regiones que no se expresan (INTRONES) dispuestas entre
regiones que sí se expresan (EXONES).

Otros problemas

Un gen puede estar regulado de tal forma que solo se exprese: a) en un determinado periodo de
desarrollo del organismo; b) sólo en un tipo determinado de células (tejidos).

Consecuencias

Las características especiales de esos tipos de genes hacen que pueda ser de interés la clonación a partir
de un ARN-m como material de partida, el cual, por acción de la TRANSCRIPTASA INVERSA o
RETROTRANSCRIPTASA puede dar lugar a un ADN-c (ADN complementario) que sólo contendrá las secuencias que
se expresan (EXONES). Este ADN-c puede clonarse, y bajo ciertas condiciones, expresarse en un hospedador
bacteriano.

Puede ser útil tener todo el genoma de un organismo clonado, es decir, construir un BANCO DE GENES o
GENOTECA para disponer de todas las secuencias del ADN que codifican proteínas.

El BANCO DE GENES puede ser también obtenido a partir de ARN-m en forma de ADN-c.

El banco de genes sólo estará completo cuando se haya conseguido una colección de células
hospedadoras de tal forma que cada categoría de ellas contenga un solo ADN o ADN-c inserto.

1. Obtención del ADN

El ADN que se pretende clonar puede obtenerse de dos maneras:

1. Por extracción desde la célula que lo contiene.

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2. Por síntesis, como ADN-c, a partir de ARN-m.

1.1. Obtención y purificación del ADN celular

El estudio de la estructura molecular de las células bacterianas ha sido posible gracias al

perfeccionamiento de diversos métodos de fragmentación celular tales como:

• La centrifugación
• La cromatografía
• La electroforesis

La primera operación a realizar consiste en la ruptura de las células lo que puede realizarse por:

• Sonicación
• Trituración
• Sometiendo las células a presiones del orden de 1.400 atm y liberando rápidamente la presión.

Cualquiera de los métodos permite obtener lo que genéricamente llamamos: EXTRACTO CELULAR. A
continuación, la suspensión de células rotas se somete a centrifugación.

1.1.1. Centrifugación

Ultracentrífuga

Figura Nº23: Ultracentrífuga para separar componentes celulares

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Figura Nº24: Centrifugación diferencial

Para la centrifugación se comienza a velocidades bajas para que sedimenten las células que no se han
roto y luego se pasa al orden de 1.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante de esta primera centrifugación
contiene fragmentos de membrana, ribosomas y todos los constituyentes solubles del citoplasma.

Este sobrenadante se somete ahora a una ULTRACENTRIFUGACIÓN. La ultracentrífuga opera en una

cámara al vacío (para reducir el ruido) y a través de refrigeración se hace un cuidadoso control de la temperatura.

El tratamiento de ultracentrifugación dependerá del tipo de células en estudio.

Por ejemplo, para células eucariotas:

Primera centrifugación: 1.000 g durante 10 min.

• Culote: núcleos y células intactas.
• Sobrenadante: se somete a una segunda centrifugación.

Segunda centrifugación: 20.000 g durante 20 min.

• Culote: mitocondrias y cloroplastos.
• Sobrenadante: se somete a una tercera centrifugación.

Tercera centrifugación: 100.000 g durante 1 h.

• Culote: membranas.
• Sobrenadante: se somete a una cuarta centrifugación.

Cuarta centrifugación: 150.000 g durante 3 h.

• Culote: ribosomas.
• Sobrenadante: extracto celular.

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1.1.2. Fraccionamiento de los componentes celulares

Del sobrenadante se pueden separar por varias técnicas las macromoléculas celulares, de las que las
proteínas son las más abundantes.

• Una de las técnicas más útiles es la ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa. En un tubo

de centrífuga se colocan, por ejemplo, tres concentraciones de sacarosa (la mayor en el fondo) y
se agrega la muestra (por ejemplo, con tres componentes). Se centrifuga durante varias horas.
Las proteínas migran hacia abajo hasta encontrar una densidad similar a la propia y ahí se
estacionan.

Figura Nº25: Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa

• Cromatografía de afinidad en columna.

• Electroforesis.

[Link]. Extracción y purificación del ADN celular

Si lo que se desea aislar es ADN, el primer requisito es que esté libre de otras sustancias. Para ello, lo
principal es tratar el sobrenadante de la última ultracentrifugación (si fueran células eucariotas, por ejemplo: 3 h
a 150.000 g) con ARN-asa. Esto elimina los ARN.

Las otras proteínas pueden eliminarse desnaturalizándolas selectivamente con fenol. Si estas etapas se
repiten varias veces puede obtenerse ADN puro pero, por supuesto, en fragmentos de varios tamaños al azar.

La longitud de estos segmentos nunca superará la centésima parte de un cromosoma completo.

• Si se partiera de CÉLULAS COMPLETAS, y sin pasar por la ultracentrifugación, el esquema básico

del tratamiento sería el siguiente.

Biotecnología 19
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Figura Nº26: Separación de ADN sin ultracentrifugación

[Link]. Electroforesis en gel

La forma rutinaria de analizar moléculas de ADN es la electroforesis en gel. El gel es una red compleja de
moléculas poliméricas. Se prepara y se vuelca fundido sobre un soporte (placa de vidrio).

La electroforesis consiste en aplicar un campo eléctrico continuo. El desplazamiento de una partícula

colocada sobre el gel de agar es inversamente proporcional a su talla. Para que pueda desplazarse deberá tener
carga eléctrica.

Figura Nº27: Esquema de preparación de un gel de electroforesis horizontal. La placa que se observa a la izquierda
se introduce en la cubeta rellena de tampón de electroforesis y conectada a los electrodos que se ve en la imagen
de la derecha.

Si se usa AGAROSA como gel se pueden separar moléculas de varios cientos hasta 20.000 pares de bases.

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Si se emplea POLIACRILAMIDA se puede elegir el grado de polimerización y obtener una malla que
permita la separación de trozos de ADN más pequeños.

En la INMUNOELECTROFORESIS después de someter una mezcla de moléculas (ANTÍGENOS) al campo

eléctrico, se hace correr los ANTICUERPOS específicos de las moléculas buscadas. La especificidad de la reacción
antígeno-anticuerpo y el empleo de anticuerpos que lleven adosados un compuesto fluorescente permite la
ubicación inmediata del fragmento de proteína (INMUNOFLUORESCENCIA) por observación usando luz U.V.

Figura Nº28 Inmunoelectroforesis

Normalmente, los fragmentos de ADN, después de correr sobre la placa de agarosa o poliacrilamida, se
tiñen (por simple rociado) con BROMURO DE ETIDIO y se observan también empleando luz U.V.

Las distancias que migran los trozos de ADN reflejan sus tamaños, que pueden estimarse haciendo correr
en forma paralela fragmentos de ADN de tamaño conocido como marcadores y referencia.

[Link]. Absorción de luz U.V. por el ADN

Un método muy empleado para detectar la presencia de ADN en una solución es por absorción de
radiación ultravioleta.

Debido a las bases de purina y pirimidina, el ADN presenta una absorbancia máxima a los 260 nm.

El ADN bicatenario absorbe con menor energía que el monocatenario. Esto se debe a que los enlaces de
puentes de hidrógeno entre las bases opuestas reducen la absorbancia de la radiación U.V.

Figura Nº29: Absorbancia del ADN monocatenario y de doble hélice.

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[Link]. Efecto de la temperatura sobre el ADN

La doble hélice de ADN se mantiene unida por gran cantidad de enlaces débiles (puentes de hidrógeno):
• Tres puentes en las uniones C-G.
• Dos puentes en las uniones A-T.

La separación de las dos cadenas provocada por el calor se denomina FUSIÓN. Cuanto mayor sea el
contenido de C-G tanto mayor será el punto de fusión.

Figura Nº30: Relación de la desnaturalización del ADN con la temperatura ºC.

El punto tm de transición de doble cadena a cadenas sencillas, punto de fusión, es una función del
contenido en C-G. Si se permite que el ADN fusionado se enfríe lentamente, se puede volver a formar el ADN
nativo de doble hélice.

2. Producción de ADN sintético

Si se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína (estructura primaria), la “traducción reversa”

de los tripletes correspondientes, utilizando el CÓDIGO GENÉTICO, nos permite deducir la secuencia de los pares
de bases que la codifican desde el ADN.

En 1985, KAPLAN presentó una máquina automática de síntesis de ADN que puede producir fragmentos
de ADN de 20 a 100 pares de bases. Estos pueden ser conectados para lograr una secuencia más larga. Por
ejemplo:

• Síntesis del gen de la SOMASTATINA (una hormona peptídica de crecimiento).

• Síntesis de los genes correspondientes a las cadenas A y B de la INSULINA que se consiguieron
hacer expresar en Escherichia coli.
• Producción de mutaciones altamente específicas por síntesis de genes en los que se cambian
unas por otras bases.

Biotecnología 22
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Oveja: Cys Cys Ala Gly Val Cys

Vaca: Cys Cys Thr Ser Ile Cys
Cerdo: Cys Cys Thr Ser Iso Cys
Ballena: Cys Cys Thr Ser Iso Cys
Caballo: Cys Cys Thr Gly Iso Cys

Figura Nº31: Insulina humana.

3. Síntesis de ADN-c

Se deberá tener en cuenta que:

• Debe haber una relación transcriptasa inversa / ARN-m alta de manera de asegurar un buen
rendimiento del proceso;
• Debe evitarse la presencia de ARN-asas, para lo cual entre otros métodos, pueden agregarse
inhibidores de estas enzimas como los vanadil-ribonucleótidos;
• El proceso de síntesis puede ser ligeramente diferente según se use como molde ARN-m
eucariota o ARN-m procariota.

a) Síntesis de ADN-c a partir de ARN-m eucariota

Los ARN-m eucariotas presentan en el extremo 3 un polímero A. La actividad de la transcriptasa inversa

se verá favorecida por el agregado de un polímero de TIMIDINA (oligo dT) complementario de ese (oligo dA).

Figura Nº32: Síntesis de ADN-c a partir de ARN (eucariota)

Biotecnología 23
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b) Síntesis de ADN-c a partir de ARN procariota

Los procariotas no presentan ARN-poliadenilado. Como posibilidades caben:

• Añadir poli-A en el extremo 3 mediante la enzima POLI-A-POLIMERASA de Escherichia coli.
• Si se conoce la secuencia 3-terminal del ARN, sintetizar un oligonucleótido complementario a
dicha secuencia y emplearlo como iniciador.

4. Fragmentación del ADN

Los procariotas poseen unas enzimas que se llaman ENDONUCLEASAS con las que por un par de
actividades enzimáticas pueden defenderse de los ADN exógenos tras infecciones virales, etc.
• METILASAS: protegen a las células mediante la metilación del ADN extraño;
• ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN: se conocen más de 600 endonucleasas en bacterias.

Las enzimas de restricción cortan el ADN bicatenario en sitios específicos. Se los ha clasificado en tres
tipos:

Tipo I: no cortan al ADN en un sitio específico sino a una distancia de varios nucleótidos de ese punto: son
poco útiles en Ingeniería Genética.
Tipo II: estas enzimas reconocen y rompen el ADN en secuencias específicas (de 4 a 11 nucleótidos),
dando lugar a fragmentos de ADN discretos en longitud y con secuencias terminales bien definidas.
Tipo III: su actividad está vinculada a la metilación del ADN aunque lo cortan a distancias definidas de las
secuencias de reconocimiento.

Las enzimas de restricción del Tipo II son las empleadas casi con exclusividad en Ingeniería Genética. Las
secuencias de reconocimiento para el corte (de 4 a 11 nucleótidos) poseen una SECUENCIA ROTACIONAL; por
ejemplo: Eco RI (del plásmido RI de Escherichia coli) tiene la siguiente secuencia de reconocimiento:

Con estas enzimas se obtendrá un número de fragmentos de ADN mayor cuanto menor sea el número de
nucleótidos en la secuencia de reconocimiento.

Ejemplo: para una secuencia de reconocimiento de 4 nucleótidos, se producirá un corte cada 44 = 256
pares de bases, suponiendo que las cuatro bases aparecen con la misma frecuencia den el ADN.

Si la secuencia de reconocimiento es de 6 nucleótidos, se producirá un corte cada 46 = 4.096 pares de

bases de ADN.

Por lo tanto, no es recomendable emplear endonucleasas de restricción de corte frecuente ya que se

corre el peligro de fragmentar la secuencia que se quiere clonar. Así, si tenemos en cuenta que un gen procariota
típico tiene de una a dos pares de kilobases (1 kilobase = 1 base), es probable que una endonucleasa de
restricción que reconoce 6 pares de bases no llegue a cortar tal secuencia.

Biotecnología 24
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Las enzimas de restricción del Tipo II, producen tres tipos de terminales:

a) Terminales 5 – 5 PROTUBERANTES. Ejemplo: Eco RI

b) Terminales 3 – 3 PROTUBERANTES. Ejemplo: Pst I

c) Terminales ROMOS. Ejemplo: Hae III (Haemophilus aegypticus)

En la tabla siguiente, se muestran las secuencias de reconocimiento de varias enzimas del Tipo II.

Biotecnología 25
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NUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (TIPO II) SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO

SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO
A G
ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ AΦΦΦΦT CΦΦΦΦG GΦΦΦΦC TΦΦΦΦA ΦΦNΦΦ
ΦΦTΦΦ ΦΦCΦΦ
AATT ------- ------ ------ Eco RI ------ ------ ------ ------
AGCT Alu I Hind III Pvu II Sac I ------ ------ ------ ------
ATAT ------ ------ Nde I Eco RV ------ ------ ------ ------
CATG ------ ------ Nco I Sph I ------ ------ ------ ------
CCGG Hpa II ------ Xma I Nae I ------ Scr FI Bst NI Nci I
CGCG Fnu DII Mlu I Sae II Bss HII Nru I ------ ------ ------
CTAG ------ ------ ------ ------ Xba I Dde I ------ ------
GATC Mbo I Bgl II Pvu Bam HI Bel I Hinf I ------ ------
GCGC Hha ------ ------ Nar I Mst I Fnu 4 HI ------ Nsp BII
GGCC Hae III Stu I Xma III Apa I Bal I Sau 96I Ava II ------
GTAC Rsa I Rru I ------ Kpn I ------ ------ ------ ------
TCGA Taq I Cla I Xho I Sal I Asu II ------ ------ ------
TGCA ------ ------ Pst I ------ ------ ------ ------ ------
TTAA ------ ------ Alf II Hpa I Aha III ------ ------ ------
N = nucleótido cualquiera
(Hind III: Haemophilus influenzae serotipo D)

Unión de fragmentos de ADN

Una vez disponible el ADN correspondiente a un gen de interés se puede proceder a tratar tanto este
ADN como el de un vector genético (generalmente un virus o un plásmido con una misma enzima de restricción).
Por ejemplo: Eco RI que produce extremos 5 – protuberantes de una sola cadena (extremos cohesivos). Las
moléculas heterólogas se unen por simple apareamiento de secuencias complementarias.

Figura Nº33: Unión de fragmentos de ADN y obtención de un plásmido recombinante

Biotecnología 26
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Otro método consiste en el empleo del agregado de nucleótidos complementarios sintéticos añadidos
tanto al ADN como al vector. Estos nucleótidos son moléculas con tres moléculas de ácido fosfórico:

Figura Nº34: Plásmido recombinante

Vectores genéticos

El ADN que participa en las recombinaciones genéticas puede formar parte de varias estructuras. El
número de genes da una idea del número de funciones que codifica cada tipo de ADN.

ORGANISMO O ESTRUCTURA Nº APROXIMADO DE GENES

De cósmidos < 10
De plásmidos 10
De virus, fagos 102
De bacterias 103
De levaduras 104
De células vegetales y animales 10 a 105
4

Es importante recordar que mientras que el ADN procariota está constituido por una secuencia continua,
el ADN eucariota contiene regiones que codifican funciones o proteínas (llamadas EXONES) entre las cuales hay
otras regiones que, por el contrario, no se expresan (llamadas INTRONES).

Un vector genético es una molécula de ADN con un origen de replicación distinto del ADN cromosomal y
que posee zonas de su genoma que no son esenciales para su multiplicación, donde pueden introducirse trozos
de ADN exógeno.

Estos vectores actúan como portadores de ese ADN permitiendo su replicación en forma de una molécula
híbrida vector-ADN exógeno dentro de la célula anfitriona del vector.

Biotecnología 27
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

En general, puede separarse fácilmente el ADN cromosomal del ADN del vector, obteniendo así
cantidades importantes del ADN insertado (CLONACIÓN).

Como vectores para la transferencia y clonación de ADN más utilizados son:

• Los plásmidos.
• Los fagos atenuados o temperados.
• Los cósmidos.

Plásmidos

Son moléculas de ADN:

• Circulares.
• Extracromosomales.
• Autorreplicativas.

1,5 x 106 ≤ peso molecular ≤ 200 x 106

✓ Los plásmidos grandes son conjugativos y existen de 1 a 2 copias por cromosoma bacteriano;
✓ Los plásmidos pequeños no son conjugativos y existen más de 10 copias por cromosoma bacteriano;
✓ Algunos plásmidos exhiben el fenómeno de la INCOMPATIBILIDAD por el que 2 plásmidos relacionados no
pueden ser mantenidos a la vez dentro de la misma célula.
✓ Los plásmidos son incapaces de añadir ADN exógeno al ADN de la célula anfitriona (por ejemplo: por
intercambio recíproco de segmentos).
✓ Los plásmidos codifican para numerosas y variadas funciones celulares:

• FERTILIDAD: capacidad de transmitir material genético durante la conjugación;

• RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: son los plásmidos R que existen en más de 50 especies de
bacterias;
• RESISTENCIA A METALES PESADOS: Cd+2; Hg+2
• RESISTENCIA A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA;
• PRODUCCIÓN de sustancias que inhiben o matan células de la misma especie;
• PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS;
• UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO POCO FRECUENTES (ver cuadro a continuación);
• FORMACIÓN DE TOXINAS Y ANTÍGENOS DE SUPERFICIE;
• INDUCCIÓN DE TUMORES EN PLANTAS: Ejemplo: el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
(tumores en agallas);
• INFLUENCIA EN LA ESPORULACIÓN: (Streptomyces).

PLASMIDOS CATABÓLICOS DE Pseudomonas (SAUNDERS, 1987).

PLÁSMIDO Substrato que degrada CONJUGATIVO

NAH Naftaleno SI
SAL Ácido salicílico SI
CAM Alcanfor SI
OCT Octano, hexano, decano NO
TOL p-xileno; m-xileno o tolueno SI
pJP1 Ác. 2,4-diclorofenoxiacético SI
pAC25 3-clorobenzoato SI
pAC27 3 y 4-clorobenzoato SI

Biotecnología 28
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Aunque no puedan ser integrados al ADN cromosómico pueden conferir propiedades importantes a la
célula anfitriona y mantenerse dentro de la misma a través de su REPLICACIÓN AUTÓNOMA.

Un plásmido óptimo para ser utilizado como vector en Ingeniería Genética es aquel que:

a) Tiene un control relajado de replicación, o sea, puede replicarse independientemente del ADN
cromosómico: esto permite obtener grandes cantidades del ADN exógeno insertado en él;
b) La resistencia a antibióticos que confiere a la célula anfitriona debe permitir la identificación de las
células que lo contienen;
c) Posee secuencias de ADN con características tales que pueden ser reemplazados por ADN exógeno
sin que esta substitución altere las características de replicación;
d) Posee un amplio espectro de secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción;
e) Los sitios de restricción se encuentran en el plásmido de tal manera que la inserción de ADN exógeno
en cualquiera de ellos deje utilizable al menos un marcador fenotípico para su selección;
f) Por seguridad, a veces es preferible que no sea conjugativo.

Para Escherichia coli se han diseñado un gran número de plásmidos. Se ha podido insertar en algunos de
ellos hasta 5 ó 10 kilopares de bases.

ALGUNOS PLÁSMIDOS DE Escherichia coli EMPLEADOS EN INGENIERÍA GENÉTICA

PLÁSMIDO SITIOS DE RESTRICCIÓN MARCADORES AMPLIFICABLE*
Col EI Eco RI, Sma, Xma I, Hind II, Pst 1 Elimm +
pSC 101 Eco RI Tcr -
Kmr
pCR 1 Eco RI, Hind III, Sal I +
Elimm
Eco RI, Hind III, Sal I, Tcr
pMB 9 +
Bam HI, Sph Elimm
Eco RI, Hind III, Sal I Apr
pBR 322 +
Bam HI, Pst I, Pvu II Tcr
Eco RI, Hind III, Sal I Cmr
pBR 328 Bal I, Pvu II, Bam HI Apr +
Pst, Pvu I Tcr
Eco RI, Hind III, Sal I Apr
pAT 153 Xma III, Bam HI, Pst 1 Tcr +
Pvu I, Sph I
Eco RI, Hind III, Sal I,
Apr
pBR 327 Bam HI, Pst 1, Pvu I, +
Tcr
Sph I
*varios cientos de copias en presencia de cloramfenicol.
Elimm: producción de COLICINA; Tcr; Kmr; Apr; Cmr resistencia a tetraciclina, Kanamicina, Ampicilina y
Cloramfenicol

Un vector genético comúnmente empleado es el pBR 322 que contiene:

• Elementos necesarios para su replicación (del pMB 29); ORI representa el origen de replicación del
plásmido;
• El gen Apr (del pRSF 2124) que confiere resistencia a la ampicilina;
• El gen Tcr (del pSC 101) que confiere resistencia a la tetraciclina;
• Una secuencia de nucleótidos que puede cortarse con la enzima de restricción Bam HI;
• Secuencias de nucleótidos que pueden igualmente cortarse con Eco RI, Hind III, Sal I, Pvu II, Xma III, Sph I
y Pst I.

Biotecnología 29
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

• 4.363 pares de bases. Si el plásmido se corta con Bam HI para insertar el ADN exógeno se pierde la
resistencia a la tetraciclina (o Sal I). Si se corta con Pst I, a la ampicilina. Si se corta con Eco RI no pierde
ninguna de las dos.

Figura Nº35: Plásmido pBR322

Figura Nº36: Estructura completa del pBR322

Biotecnología 30
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Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

En la figura anterior se muestran los distintos sitios de ruptura.

• Las flechas de color celeste indican el sentido de transcripción de los genes Apr y Tcr.
• La flecha que dice “ori” indica el sentido de duplicación semiconservativa del ADN.

Los números corresponden al nucleótido 5` de cada secuencia de reconocimiento.

Bacteriófagos

Los fagos presentan algunas ventajas sobre los plásmidos y de ellas la principal es que pueden alojar
mayores fragmentos de ADN exógeno.

El más empleado es el BACTERIÓFGO LAMBDA DE E. coli

El genoma del fago λ es un ADN de doble cadena de un tamaño de 50 kb.

Se extrae de la cápside viral como una molécula circular, debido a que en sus extremos 5`posee 12
nucleótidos protuberantes de cadena sencilla y de secuencia complementaria (extremos cohesivos COS) cuya
hibridación permite la circularización de la molécula.
• Tan importante es el fago λ como vector de clonación, que A. D. HERSHEY ha escrito un libro para
ocuparse de él (“The bacteriofage lambda”).
• Sólo haremos referencia aquí a sus principales características.

Si consideramos al fago λ como una molécula lineal podemos esquematizarlo:

En la parte izquierda están los genes requeridos para la síntesis del virus:

1: Proteínas del CÁPSIDE

Estructura del fago
2: Proteínas de la COLA

En la parte derecha están:

5: genes implicados en la lisis de la célula anfitriona.

4: genes que codifican la síntesis del ADN del fago.

La parte central está constituida por:

3: genes que controlan la recombinación e integración de ADN exógeno.

-------------- xxxxxxx-----------: genes que no son esenciales para el desarrollo del fago (el ADN de esta zona
es el que se puede emplear para fabricar vectores de clonación).

La zona central puede ser utilizada para:

Biotecnología 31
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

• Reemplazar el ADN del fago por fragmentos exógenos de ADN que se pretende clonar (vector λ de
reemplazamiento).
• Insertar fragmentos de ADN exógenos (vector λ de inserción).
• Después de extraído de la cápside viral y de haber sido transformado en un vector λ de reemplazamiento
o en un vector λ de inserción, el ADN del fago se reempaqueta en la cápside obteniéndose un virus
infeccioso que contiene o porta fragmentos de ADN exógeno.
• Los vectores λ de reemplazamiento tienen una capacidad de hasta 25 kb.
• Los vectores λ de inserción tienen una capacidad de hasta 18 kb (hasta 10 kb en los plásmidos).

Cósmidos

Los cósmidos son vectores genéticos que pueden considerarse mezcla de plásmidos y fagos:

Extremos cos
(cohesivos del
fago λ)

Figura Nº37: Origen de replicación de un plásmido

• Posee genes que lo confieren resistencia a antibióticos, el origen de replicación de un plásmido, los
extremos cohesivos del fago λ, secuencias de corte por enzimas de restricción donde pueden colocarse
los fragmentos de ADN exógeno que se quiere clonar.
• Su tamaño es PEQUÑO: 5 kb.
• Tiene capacidad para fragmentos de ADN exógeno de hasta 45 kb.

Otros vectores

Si bien la bacteria Escherichia coli es la célula más empleada como anfitriona de ADN-r, se han creado
vectores que pueden funcionar en otros tipos de células.

1. Para procariotas

• Bacillus sp: sobre todo para producir enzimas;

• Streptomyces sp: para mejorar la producción de antibióticos;
• Pseudomonas sp: son recomendables para hospedar plásmidos recombinantes debido a su capacidad
para degradar muchos contaminantes.

2. Para eucariotas

• Levaduras: Las levaduras contienen el PLÁSMIDO 2μ. Se han construido plásmidos para levaduras para
obtener proteínas de mamíferos que pueden o no contener el plásmido 2μ.
Algunos de estos plásmidos por contener secuencias del ADN cromosómico de las levaduras pueden
replicarse dentro de ellas de manera autónoma y estar presentes en varias copias.
Las más empleadas son:
o Saccharomyces cerevisiae

Biotecnología 32
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

o Kluyveromyces fragilis
o Hansenula polymorpha

• Vegetales: Se han diseñado vectores de clonación de genes en vegetales empleando el PLÁSMIDO Ti de

Agrobacterium tumefaciens.
La bacteria Agrobacterium tumefaciens es inductora de tumores en forma de agallas en los vegetales al
incorporarse al ADN de las plantas.
Estos plásmidos se construyen cortando el plásmido Ti e insertando ADN con el objeto de mejorar el valor
nutritivo o las características de los frutos, incorporar la resistencia a herbicidas, y se busca poder
expresar en cereales los genes fijadores de nitrógeno RHIZOBIUM.

a. Células de mamífero: Se emplea el SV 40. El ADN de este virus tiene un peso molecular de 3 x 106 Dalton.
Posee dos sitios de restricción:
o Uno para Hpa II.
o Otro para Bam HI.
Estas enzimas permiten cortarlo en dos fragmentos:
a. uno que contiene un gen (GEN A) que codifica la proteína requerida para la replicación viral junto
al gen que codifica el origen de esta replicación;
b. Otro que contiene solamente los genes que codifican las proteínas estructurales del virus.

El primer segmento sirve para ligar el ADN que se quiere clonar obteniéndose un virus mutante capaz de
clonarse en las células anfitrionas del mono (las del riñón).

Introducción del ADN-r en la célula anfitriona

1. Caso de procariotas

Lo más usual es:

a. Introducir el ADN exógeno utilizando como vectores plásmidos y bacteriófagos previo
tratamiento de las bacterias con soluciones de Ca y Mg a bajas temperaturas.
b. El ADN-r si penetra con un bacteriófago puede hacerlo también según el mecanismo de la
TRANSDUCCIÓN que ya hemos descripto.
c. Moléculas de ADN-r pueden penetrar en una célula bacteriana mediante un mecanismo descripto
como TRANSFORMACIÓN cuyo mecanismo puede describirse como sigue:

TRANSFORMACIÓN
o El ADN-r sólo puede penetrar una bacteria en el momento de la división celular en el que se está
sintetizando la pared celular: en este estado del ciclo de crecimiento las células se dicen
COMPETENTES;
o El ADN-r s une a esos lugares accesibles de la pared celular; unido el ADN-r a la pared celular una
de las hebras del mismo es degradada por endonucleasas;
o La hebra no degradada ingresa a la célula bacteriana;
o Por la existencia de zonas de homología el ADN-r es integrado al ADN cromosómico. (por
ejemplo: por intercambio recíproco de segmentos).

d. Por fusión de PROTOPLASTOS, se llama PROTOPLASTOS a las células desprovistas de su pared

celular.
Esto puede conseguirse por digestión de la pared celular con la enzima LISOZIMA o bien por
tratamiento con PENICILINA que es un antibiótico inhibidor específico de la síntesis de la pared
celular.

Biotecnología 33
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

El polietilenglicol favorece la fusión de los protoplastos y la obtención de una célula híbrida viable
(capaz de dividirse).
La fusión de protoplastos permite recombinar ADN provenientes de cepas y hasta de especies
diferentes y obtener así una célula híbrida.
La recombinación de protoplastos se produce con la frecuencia superior al 20% (relativamente
alta).
Los protoplastos una vez fusionados reparan por recombinación su ADN y esto es muy
importante porque la recombinación puede hacerse entre segmentos de muy diferente
localización. Algunos productos obtenidos por BIOTECNOLOGÍA dependen de un gran número de
genes (rutas metabólicas de producción del metabolito, alteración de la permeabilidad celular,
etc.)
El rendimiento del proceso puede ser optimizado por irradiación con ultravioleta: ésta es LETAL
para los protoplastos que no han reparado por fusión y recombinación sus cromosomas.

2. Caso de células eucariotas

a. La fusión de protoplastos que comenzó aplicándose primero a células vegetales y animales.

Recordar que el producto de la fusión de dos protoplastos es una nueva célula, híbrida pero
viable, es decir, capaz de dividirse y formar colonias.
b. La transformación (introducción de ADN-r) de células eucariotas desprovistas de la pared celular,
tanto para células vegetales como animales.
c. La microinyección (sobre todo en caso de células de mamíferos).

Reconocimiento y selección de las células que contienen ADN-r

1. Por la presencia de genes marcadores

Figura Nº38: Utilización de genes marcadores

Biotecnología 34
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

El reconocimiento y selección de células que contengan ADN recombinante puede realizarse estudiando
la presencia de genes marcadores incluidos en la molécula del ADN-r.

Estos genes confieren a la célula anfitriona resistencia a algún antibiótico, lo que le permite crecer en
presencia del mismo.

Después de cortar, por ejemplo, el pBR 322 y el ADN que contiene el gen de interés, utilizando LIGASA se
obtiene el plásmido con el ADN-r. Luego se transforma un cultivo de Escherichia coli y se siguen los pasos del
esquema de la figura Nº38.

Hibridación de ácidos nucleicos

Cuando se tiene ADN de una sola hebra la hibridación consiste en la formación de la segunda hebra por
simple complementariedad de bases. Es lo que se denomina TRANSFERENCIA DE SOUTHERN. En este método, si
se parte de un ADN natural (de dos hebras), uno de los pasos intermedios será, necesariamente, su
desnaturalización, o sea, la obtención de un ADN de cadenas sencillas. Es decir, la TRANSFERENCIA SOUTHERN
describe el proceso de hibridación de una sonda de ADN sencillo con ADN complementario. Este ADN
complementario puede estar marcado, por ejemplo: con P32, de manera de poder obtener una radiografía con
rayos X.

La TRANSFERENCIA DE SOUTHERN puede realizarse a partir de una placa de electroforesis en agarosa o

bien a partir de un cultivo en cajas de PETRI.

La TRANSFERENCIA DE NORTHERN hibrida ADN de una sola hebra pero con ARN marcado, por ejemplo:
32
con P lo que permite la posterior obtención de una imagen radiográfica con rayos X.

Hibridación de colonias

Este es el método más útil. Debe disponerse de una SONDA que consiste en un ácido nucleico con una
secuencia complementaria y posee un marcador radioactivo (generalmente P32).

En este método se parte de las colonias cultivadas en agar y presumiblemente transformadas. A partir de
esta “placa madre” se hace una REPLICACIÓN EN PLACA. Esta consiste en hacer contactar una almohadilla estéril
de terciopelo con una “placa madre”.

Con la almohadilla de terciopelo se lleva una imagen especular de las colonias de la “placa madre” a una
membrana filtrante de nitrocelulosa que luego se deposita sobre otra caja de Petri que contiene un medio
nutritivo sólido. Los nutrientes difunden a través del filtro lo que permite obtener después de la incubación lo que
hemos dicho es la imagen especular de la “placa madre”.

A continuación, se lisan con un álcali las colonias que han desarrollado sobre la membrana filtrante. Esta
operación también desnaturaliza su ADN (lo corta en dos hebras) y este ADN se fija por calentamiento a 65ºC.

El resultado de estas operaciones es la sustitución de las colonias por ADN desnaturalizado y fijado en el
mismo sitio que ellas ocupaban.

A continuación, la membrana filtrante se incuba en una solución de la sonda marcada con P 32 a

temperatura también de 65ºC. La sonda marcada sólo se hibridará cuando haya complementariedad perfecta
entre las dos hebras de ADN.

Biotecnología 35
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Luego se procede a lavar el filtro para eliminar la sonda que no se ha unido. Una radiografía por
exposición a los rayos X del filtro permite conocer las posiciones de la sonda hibridada y a partir de ellas
seleccionar, recuperar y cultivar las colonias transformadas.

Figura Nº39: Hibridación de colonias

Reconocimiento y selección de células con ADN-r por electroforesis sobre gel.

✓ La TRANSFERENCIA DE SOUTHERN consta de los siguientes pasos:

• El ADN celular, de alto peso molecular se fragmenta con varias enzimas de restricción;
• Los fragmentos obtenidos en cada uno de los ataques se separan por tamaños empleando
electroforesis en gel de agarosa;
• Luego el gel de agarosa se coloca en una hoja de nitrocelulosa;
• Se hace pasar una solución amortiguadora para que los fragmentos de ADN pasen a la hoja de
nitrocelulosa;
• Sobre la hoja de nitrocelulosa queda una réplica de los fragmentos de ADN sobre el gel de
agarosa;
• Se desnaturaliza el ADN con álcalis (se obtiene ADN monofilar) y se fija a 65ºC;
• Se hibrida con una sonda de ADN monofilar marcado con P32;
• Los fragmentos de ADN que hayan hibridado con la sonda se harán visibles después de una
autorradiografía con rayos X.

✓ La TRANSFERENCIA DE NORTHERN sólo se diferencia de la de SOUTHERN en que la sonda empleada para

hibridar el ADN monofilar es una sonda, también marcada con P32, pero no de ADN sino de ARN.

Biotecnología 36
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

✓ (OPCIÓN) Como sólo el ARN-m se puede hibridar a un ADN monofilar, la primera operación es aislar ARN-
m.

Para aislar el ARN-m del ARN-r y del ARN-t se puede utilizar la propiedad, ya mencionada, de que el ARN-
m presenta una cola poli-A en el extremo 3’.

La separación se realiza haciendo pasar la mezcla de ácidos nucleicos a través de una columna de celulosa
con extremos poli-T.

El ARN-m se hace hibridar luego con ADN desnaturalizado total. Luego se lava, con lo cual el ARN-m no
hibridado es eliminado.

A continuación se libera el ARN-m hibridado y se lo traduce “in vitro”.

Se determina la estructura de la proteína y a continuación se selecciona el clon que contenía el ADN-r

buscado.

• ARN total
↓
• Aislamiento de ARN-m utilizando una columna de celulosa oligo-dT
↓
• Hibridación de todo el ARN-m con el total del ADN
↓
• Lavado de los ARN no hibridados
↓
• Liberación del ARN-m hibridado
↓
• Traducción “in vitro” del ARN-m hibridado
↓
• Determinación de la estructura de la proteína producida
↓
• Selección de los clones que poseen el ADN-r buscado

✓ La opción más sencilla, si se conoce la estructura de la proteína que debe codificar el ADN-r buscado, es
sintetizar el ARN-m correspondiente marcándolo con P32 (verdadera TRANSFERENCIA DE NORTHERN).

Biotecnología 37
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº40: Transferencia de Southern o Northern, la hibridación puede ser con ADN monofilar (Southern) o ARN-
m marcado con P32 (Northern)

Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN representa el paso último en la caracterización del gen. Debe destacarse que:

• Hay programas informáticos que permiten comparar secuencias de manera eficiente (FRISTENSKI et al.)
• Existen bancos de información sobre secuencias nucleotídicas que pueden ser consultados y que
contienen todas las secuencias de genes que han sido publicadas (GENBANK).

De todas maneras, la secuencia de nucleótidos en un gen sólo puede ser deducida parcialmente:

• Porque la secuenciación abarca sólo la parte codificadora del gen y deja de lado los sectores reguladores
y aquellos que no codifican (INTRONES).
• La secuenciación no tiene en cuenta que un aminoácido puede ser codificado por más de un codón.

Se deberá recordar que el ADN crece siempre en el sentido 5→3 por incorporación de un
desoxirribonucleótido trifosfato en el extremo 3 (oxhidrilo libre). Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato son:

• dTTP: desoxitimidina-tri-P.
• dATP: desoxiadenosín-tri-P.
• dCTP: desoxicitosina-tri-P.
• dGTP: desoxiguanidín-tri-P.

Es evidente que, si alguno de los cuatro desoxirribonucleótidos-tri-P, no contiene el oxhidrilo en la

posición 3 (será entonces un di-desoxirribonucleótido-tri-P) se convertirá en un TERMINADOR DE LA CADENA.

Biotecnología 38
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº41: Crecimiento y terminación de la cadena de ADN

Uno de los métodos de secuenciamiento de ADN es el de SANGER-NICKEN-COULSON que consiste en lo

siguiente:

a. se parte de una hebra de ADN a la que se adosa un cebador o iniciador corto de ADN (esto implica el
conocer el extremo o desconocida esa secuencia “pegar” primero una conocida);

b. se divide en cuatro alícuotas iguales;

c. a cada una de ellas se agrega un desoxirribonucleótido-tri-P marcado radioactivamente y un di-
desoxirribonucleótido-tri-P (terminador); una porción con A, otra con C, otra con T y otra con G y además
ADN-polimerasa;
d. se hacen correr los compuestos de A, T, C y G por electroforesis sobre un gel de poliacrimida, cada una de
las mezclas por un camino;
e. en cada uno de los cuatro casos la ADN-polimerasa ha ido produciendo la cadena complementaria,
incorporando por lo menos una vez una de las cuatro bases nitrogenadas A, T, C y G;
f. cada una de las cuatro cadenas complementarias se cortará cuando se incorpore a la misma un di-
desoxirribonucleótido-tri-P (terminador).
g. Se hacen correr paralelamente cada una de las cuatro mezclas reaccionantes por electroforesis sobre un
gel poli-acrilamida;
h. La electroforesis separa los fragmentos sintetizados por la ADN-polimerasa;
i. La autorradiografía por exposición a los rayos X permite ubicar las bandas de cada producto de reacción;
j. El patrón obtenido puede leerse directamente.

A T C G
----- A
----- T
----- C
----- C Sentido de
----- G lectura
----- A
----- G
----- C
----- T
Figura Nº42: Secuenciamiento del ADN

Biotecnología 39
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Algunas aplicaciones de la ingeniería genética

Polimerización en cadena del ADN (PCR)

La ampliación “in vitro” del ADN (o PCR: Polymerase Chain Reaction) ha significado una auténtica
revolución en la Biología. Fue desarrollada en 1985 por K. B. MULLIS de la empresa norteamericana CETUS.

Permite obtener en un breve tiempo grandes cantidades de copias de un trozo de ADN a partir de muy
poco ADN (incluso el aportado por una sola célula).

La patente de la PCR fue comprada por la empresa HOFFMAN-LA ROCHE. Sus aplicaciones comprenden
desde la investigación de una mutación en un embrión (problema ético: podría así impedirse el nacimiento de un
niño a través de un diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias graves), descubrir una infección vírica o
bacteriana, seguir la evolución de un cáncer, establecer la paternidad o no de un niño e incluso, hasta identificar
un criminal.

En la práctica, el índice medio de ampliación de una PCR es de aproximadamente un millón.

Supongamos que deseara investigarse una anomalía de la hemoglobina en el marco de un diagnóstico

prenatal. El gen responsable, supongamos está compuesto de 1.500 nucleótidos. Una toma de sangre del feto a la
madre embarazada aportaría como mínimo unas 10.000 células. De estas 10.000 células se obtendrían 10 -6 g del
ADN genómico del feto y de estos sólo 10-12 g corresponden al gen investigado.

Después de la PCR, la multiplicación por 106 da 10-6 g del ADN de ese gen. Y esto, puede realizarse en
pocas horas mientras que las técnicas clásicas que hemos visto con el uso de enzimas de restricción y de los
vectores adecuados llevarían varias semanas.

10-6 g de ADN se analizarían rápidamente a través de una electroforesis, por ejemplo.

Veamos en un esquema en qué consiste la técnica de la PCR.

Figura Nº43: PCR

Biotecnología 40
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

En la Figura Nº43 se grafican los pasos que sigue esta técnica:

Primer ciclo:

a) Se utiliza la muestra original de doble cadena del ADN a amplificar.

b) Separación de las hebras por calentamiento a 94ºC.
c) Colocación de CEBADORES (oligonucleótidos complementarios de las secuencias de los extremos) a una
temperatura entre 40 y 60ºC.
d) Adición de polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus y de desoxirribonucleótidos-tri-P (replicación en
sentido 3→5) a una temperatura de 72ºC.

Cuando transcurren 25 ciclos, la amplificación es de 225 y solamente se requieren 3 horas. Ya que el ADN
se multiplica en forma exponencial.

Problema de los cebadores: Se necesita inexcusablemente conocer la secuencia de por lo menos los
extremos del ADN.

En la práctica, cuando se buscan determinadas contaminaciones, el equipo con un costo de U$S 30000,
contiene un “banco” de cebadores (para Salmonella, Shigella, virus de la hepatitis B, agentes de enfermedade3s
como lepra, tuberculosis, etc.)

Si se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína, a través del Código Genético, pueden
sintetizarse los cebadores correspondientes para ampliar y estudiar el gen que codifica su síntesis. Si se conoce
alguno de los dos extremos se puede sintetizar el cebador correspondiente y fijar en el otro un ANCLA constituido
por una serie de C o G. Cuando se desconocen ambos, se fijan ANCLAS en los dos extremos.

Las condiciones experimentales deben ser optimizadas para conseguir los máximos rendimientos.

Ventaja: pone en evidencia las formas “viables pero no cultivables” de microorganismos pero amplifica
también ADN de células muertas.

Problemas de contaminación: deben extremarse los cuidados pues una sola molécula de ADN intruso, por
la sensibilidad del método, puede llegar a falsear los resultados.

LOS PROBLEMAS ÉTICOS DE LA PCR:

✓ Podría llegarse a un abuso del diagnóstico prenatal y a que la sociedad sólo aceptara individuos que
gozaran de buena salud;
✓ La PCR podría generar una discriminación de individuos en el plano laboral;
✓ Pondría a los padres en la disyuntiva de aceptar o no tener hijos que pudiesen llegar a tener algún
defecto genético;
✓ Las huellas genéticas pondrían al descubierto que en Europa, por ejemplo, más del 10% de los hijos que
se presumen legítimos son en realidad adulterinos;
✓ En FRANCIA (en 1991) la ley estableció que al margen de los fines médicos o científicos, la identificación
genética de las personas, aún en casos judiciales, sólo puede realizarse con el acuerdo expreso de las
personas a quienes se toman muestras.

La identificación de personas a través de la PCR está basada en:

✓ Si bien el ADN humano presenta mínimas variaciones de un individuo a otro, existen en el genoma
regiones llamadas MINISATÉLITES y MICROSATÉLITES, variables y repartidas a lo largo de los cromosomas;

Biotecnología 41
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

✓ Para poder diferenciar una persona de otro sólo interesan las fracciones de ADN polimórficas, es decir
que sean muy distintas de una a otra persona;
✓ Los MINISATÉLITES son pequeñas secuencias de bases que se repiten. Por ejemplo, si una hebra de ADN
normal fuera: …AGGATGCTCAAT…; un MINISATÉLITE sería: …AGGACTCTCTCTCTCTCTTGCTCAAT… se
presenta como una sucesión de un par de bases nitrogenadas repetidas “n” veces, mientras un
MICROSATÉLITE no sobrepasa de un par de bases copiadas sucesivamente no más de cinco veces;
✓ Los genetistas han logrado identificar algunas de estas secuencias hipervariables de una persona a otra,
no sólo por su constitución sino por su longitud;
✓ Los genetistas han sintetizado a partir de estas secuencias sondas radioactivas capaces de identificar los
minisatélites que constituyen lo que llamaríamos una verdadera HUELLA GÉNICA: en una electroforesis se
obtiene para cada persona lo que sería equivalente al CÓDIGO DE BARRAS con que se identifican
productos de un supermercado;
✓ En la HUELLA GÉNICA de un individuo sólo aparecen dos bandas individuales: una heredada del padre y
otra de la madre:

Figura Nº44: Huella génica

Anticuerpos monoclonales

Para producir anticuerpos había que inyectar animales con los antígenos, esperar que éstos los
produjeran, extraer la sangre y separarlos del suero. El procedimiento, largo y tedioso, permitía obtener, en
cantidades limitadas, anticuerpos que variaban de un animal a otro en especificidad y afinidad, y que además
contenían proteínas contaminantes.

Con el descubrimiento de CÉSAR MILSTEIN se puede disponer ahora de anticuerpos absolutamente

homogéneos, que se pueden producir en forma continua y con la misma especificidad y afinidad.

En la década de los noventa, la venta de anticuerpos monoclonales superaba holgadamente los

[Link] de dólares anuales.

Las células productoras de los anticuerpos son los LINFOCITOS B que se extraen del BAZO y pueden
cultivarse “in vitro”, aunque no sobreviven más allá de algunas divisiones.

Biotecnología 42
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

El descubrimiento de MILSTEIN consistió en FUSIONAR los linfocitos B con células MIELOMATOSAS

(células cancerosas de un tumor de linfocitos) en un medio de cultivo adecuado al que además se agrega
POLIETILENGLICOL.

Como las células mielomatosas tienen la capacidad de vivir indefinidamente, las células que se obtienen
por fusión y se llaman HIBRIDOMAS, no sólo pueden crecer indefinidamente sino que además producen los
mismos anticuerpos que los linfocitos B.

Como sólo una de cada 2x105 células de linfocitos B logran fusionarse, deben eliminarse las células
mielomatosas no hibridadas.

Para ello se usan células mielomatosas genéticamente alteradas y por ello incapaces de sintetizar la
HIPOXANTINA-GUANINA-FOSFO-RIBOSIL-TRANSFERASA.

Como esta enzima sólo la producen los linfocitos B, sólo lograrán sobrevivir los HIBRIDOMAS.

Producción de anticuerpos monoclonales

Para producir anticuerpos monoclonales (figura Nº45), se inyecta una rata con el ANTÍGENO (aún cuando
no sea puro). Proliferan en el BAZO los linfocitos B que producen los ANTICUERPOS (al antígeno y a las
impurezas). Se espera unos días y se sacrifica al animal. Se extraen del bazo los LINFOCITOS B.

Se incuban linfocitos con células de mieloma en presencia de POLIETILENGLICOL.

Los linfocitos no hibridados mueren al cabo de algunas divisiones. Simultáneamente, las células de
mieloma carecen de hipoxantina-guanina-fosfo-ribosil-transferasa (vital para sintetizar ADN) y si no se hibridan,
también mueren.

Se fija el antígeno al fondo de pocillos plásticos y se les agrega el líquido con los hibridomas. Los que
producen el anticuerpo reaccionan con el antígeno y quedan fijados. El resto se elimina por lavado.

Para aislar el hibridoma buscado se agrega un segundo anticuerpo radiactivo del anticuerpo monoclonal.
El hibridoma buscado está en el pocillo con radioactividad.

Para producir industrialmente los anticuerpos monoclonales se emplea un método denominado EN

CAPEL.

Los hibridomas se colocan en una solución de ALGINATOS (sustancia derivada del alga GRACILARIA).

Luego, se vuelcan por gotas en otra solución de polímeros de ALMIDÓN y quedan así finalmente
encapsulados.

Encapsulados los hibridomas, como el almidón polimerizado permite el pasaje de gases y nutrientes, se
reproducen a la vez que también a través de la cápsula eliminan los productos de desecho.

Cuando se alcanza la concentración adecuada de anticuerpos monoclonales, éstos se recuperan por

ruptura de la cápsula, tal como se ve en la figura Nº46.

Biotecnología 43
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº45: Producción de anticuerpos monoclonales

Figura Nº46: Método En Capel

Biotecnología 44
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Algunos usos de los anticuerpos monoclonales

Diagnóstico de:
• Embarazo.
• Hepatitis.
• Virus del SIDA, bacterias, parásitos.
• Cáncer.
Terapéutica de:
• Leucemia.
• Cáncer.
• Prevención de rechazos de trasplantes.
Industriales:
• Purificación en columna de:
o Interferón.
o Insulina.
o Hormona de crecimiento,
o Etc.

MILSTEIN no patentó su descubrimiento: su modestia no le permitió imaginar el cambio que producirían

los anticuerpos monoclonales en la ciencia.

Tratamiento del cáncer con anticuerpos monoclonales

Hasta hoy, el tratamiento del cáncer sigue siendo un problema sin solución. Aunque hay drogas que
sirven de inhibidores de las células cancerosas y pueden matarla, y es lo que se llama QUIMIOTERAPIA DEL
CÁNCER, muchas veces estas sustancias también son tóxicas para las células normales: aún a dosis moderadas
generalmente producen efectos secundarios muy desagradables. Lo mismo puede decirse del tratamiento con
RADIACIONES.

En los últimos años se trabaja sobre una idea que podría denominarse BALA MÁGICA.

Dentro de este concepto, un antibiótico puede ser considerado como una bala mágica. Se sabe que los
antibióticos matan e impiden la proliferación de células bacterianas sin afectar mayormente células de tejidos
animales o vegetales. Esto sucede porque la mayor parte de los antibióticos sólo inhiben procesos metabólicos
propios de las células procariotas. Más difícil es el combate de hongos y más aún de enteroparásitos que por ser
células eucariotas tienen metabolismos muy semejantes a las células de los mamíferos por lo cual las sustancias
que son tóxicas para ellos también lo son para las células hospedadoras.

Hoy se sabe que las células cancerosas llevan sobre su membrana ANTÍGENOS diferentes a los de las
células normales. La idea de una bala mágica para combatir células cancerosas está sustentada en el hecho de
preparar anticuerpos monoclonales específicos para esos antígenos y que a su vez estos lleven adherida alguna
sustancia tóxica capaz de destruir células cancerosas. Esta puede, a su vez, provenir de bacterias, plantas o
síntesis química.

Como antecedentes de proyectos en marcha sobre este fundamento pueden citarse los llevados a cabo
por:

• Instituto Nacional del Cáncer ([Link].)

• Clínica SCRIPPS (California, [Link].)
• Citogen ([Link].)
• Carlo Erba (Italia)

Biotecnología 45
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

• Laboratorios LILLY ([Link].)

• Etc.

Figura Nº47: Tratamiento del cáncer a través de Anticuerpos Monoclonales

Insulina Humana

Uno de los primeros objetivos de la Ingeniería Genética fue la de poder producir a bajo costo sustancias
caras y aplicación médica de limitada producción. La primera de estas sustancias de importancia terapéutica en
producirse fue la insulina humana.

Como ya era conocida la secuencia de aminoácidos de las dos cadenas (A y B) de la insulina, a través del
código genético se sintetizaron los ARN-m por separado y de ellos los dos ADN-c complementarios
correspondientes.

Biotecnología 46
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

A cada uno de los ADN-c se unió el gen de producción de la β-galactosidasa. Luego en los lugares ECO RI Y
BAM HI del vector genético pBR 322 se introdujeron los ADN en forma independiente. Se obtuvo así dos líneas de
Escherichia coli por transformación.

Las dos líneas de bacterias se cultivaron por separado en un medio que contenía tiogalactósido
induciéndose así la producción de dos proteínas híbridas: cada una contiene β-galactosidasa unida a través de
metionina a la respectiva cadena de insulina.

Las proteínas así obtenidas se separan y purifican.

Se tratan luego con BrCN que corta las proteínas a nivel de las metioninas. Se purifican las cadenas sin
metionina. Se purifican las cadenas sin metionina y luego se oxidan juntas obteniéndose insulina humana activa.

Esta producción de insulina humana no sólo abarató los costos y los problemas de disponibilidad de
páncreas de animales (vacunas) sino que por su elevada pureza eliminó las reacciones inmunológicas de algunos
pacientes.

Figura Nº48: Producción de insulina humana

Biotecnología 47
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº49: Producción de insulina humana (detalle)

Producción de aspartamo

El aspartamo es el L-α-aspartil-L-fenilalanina éster.

Ácido Aspártico Fenilalanina ASPARTAMO (dipéptido Asp-Phe)

Figura Nº50: Aspartamo

Biotecnología 48
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

El aspartamo es un producto importante como EDULCORANTE en los denominados productos

DIETÉTICOS. En solución acuosa, el dulzor del aspartamo es 200 veces superior al de una solución de sacarosa al
4% (40 g/l).

Para producción industrial de aspartamo se utilizan L-aspártico y L-fenilalanina, cuyas producciones

pasaron desde 1981 (50 toneladas) a mas de 4.000 en 1997.

El aspartamo es el dipéptido Asp-Phe.

El aspartamo está contraindicado en aquellos individuos que padecen FENILCETONURIA o IDIOTEZ

FENILPIRÚVICA.

La fenilcetonuria es una enfermedad hereditaria de carácter recesivo y del tipo metabólico y no ligada al
sexo. Algunos ejemplos (que se podrían haber citado antes):

Figura Nº51: Enfermedades hereditarias

La fenilcetonuria, por defecto de genes recesivos, se traduce en la ausencia de la enzima que transforma
la fenilalanina en tirosina (una HIDROLASA), por lo cual la fenilalanina se convierte en ácido fenilpirúvico:

Biotecnología 49
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº52: Fenilcetonuria y albinismo

Mediante las técnicas de la Ingeniería Genética, ha sido posible obtener un polímero o polipéptido que
por acción enzimática puede ser convertido en el dipéptido aspartil-fenilalanina o aspartamo (comercializado
bajo la marca NUTRASWEET).

¿Cómo se ha conseguido? Si consultamos el CÓDIGO GENÉTICO veremos que los codones:

➢ Para Phe son: UUU

UUC
UUA

➢ Para el ác. Asp: GAU

GAC

Estos codones, en al ADN serán los tripletes:

➢ Para Phe: AAA

AAG
AAT

Biotecnología 50
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

➢ Para Asp: CTA

CTG

Por lo tanto, habrá que sintetizar los tripletes correspondientes al ADN. Estas estructuras, pueden
corresponder, por ejemplo, a las siguientes para este OLIGONUCLEÓTIDO:

Figura Nº53: Producción de aspartamo

Hormona de crecimiento humano

Es un polipéptido de 191 aminoácidos producida por la glándula pituitaria. Regula el crecimiento

corporal. Su escasez puede llevar a la baja estatura de algunas personas con enanismo.

Para obtenerla se combinó la síntesis química del ADN que codifica los aminoácidos de 1 al 24,
anteponiéndole el triplete ATG (que codifica METIONINA), esto asegura la iniciación correcta de la traducción, y
se unió este ADN al gen productor de la β-galactosidasa de Escherichia coli.

Para los aminoácidos de 25 a 191, se copiaron los ARN-m de la glándula pituitaria humana, que por
retrotranscripción se convirtió en el ADN-c para el segmento 25 a 191.

Con la enzima de restricción Hae III (GG ↑CC) se lo cortó justo delante del triplete correspondiente al
aminoácido Nº25 y se pegó al extremo del fragmento resultante un triplete de terminación.

Se clonaron por separado los dos ADN. Se unieron con una ADN-ligasa, a través del gen de la β-
galactosidasa, y se lo incorporó al pBR-322.

Biotecnología 51
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Se transformó Escherichia coli con este pBR modificado.

Se clonó el gen de la bacteria.

Se obtuvo su expresión y grandes cantidades de la hormona de crecimiento humano unida a β-

galactosidasa de Escherichia coli a través del aminoácido metionina.

Se hidrolizó “in vitro” el producto así obtenido utilizando BrCN (bromuro de cianógeno o cianuro).

Se intenta representar los pasos de la técnica seguida en la figura Nº54.

Figura Nº54: Producción de hormona humana de crecimiento

Aplicaciones de la Ingeniería Genética en la agricultura

Con seguridad, la manipulación genética de plantas y animales produjo una verdadera revolución en la
producción de alimentos hacia fines del siglo pasado.

Fue el tercer gran cambio del siglo XX:

a) El primero, se produjo entre 1920 y 1950 con la mecanización, o sea, el reemplazo del hombre y del
animal por las máquinas;

Biotecnología 52
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

b) El segundo, que se llamó revolución verde, se produjo entre 1950 y 1980 con el empleo de fertilizantes y
de productos químicos para combatir las plagas;
c) Con la manipulación genética y la obtención de plantas y animales transgénicos se está produciendo un
gran impacto y a esto debemos agregar la posibilidad de clonar animales, como los mamíferos, con una
mejora sustancial de las razas y resistencia a las enfermedades.

Micropropagación de vegetales

La micropropagación de vegetales, basada en una reproducción ASEXUAL, es un procedimiento

relativamente sencillo que, entre otras ventajas, presenta las siguientes:

- Acortamiento de los plazos naturales de desarrollo de los vegetales, sobre todo cuando se reproducen
sólo por semillas que tardan muchos días en germinar (caso de árboles de maderas preciosas; palmeras
como las que producen cocos; dátiles o aceite de palma);
- Obtener un cultivar de plantas exactamente iguales en su resistencia a enfermedades, calidad y cantidad
de los frutos, etc.;
- Producir en poco tiempo un número, prácticamente tan grande como se quiera, de plantas exactamente
iguales (ejemplo: las necesarias para implantar un viñedo de varietales finos).
- Entre las propiedades de las plantas obtenidas por esta metodología se pueden conseguir aumentar sus
contenidos en aminoácidos esenciales o vitaminas.

Figura Nº55: micropropagación de vegetales

Aparte de poder producir miles de plantas al mismo tiempo, esto posibilita el poder someterlas luego a
variables adversas como la sequía, la salinidad del terreno, alguna enfermedad en particular, etc. para
recomenzar con la/s sobreviviente/s y obtener el cultivar que cumple con todas las expectativas.

Biotecnología 53
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Se ha logrado obtener así zanahoria, alfalfa, arroz, maíz, etc. ricas en determinado ácido aminado o
vitamina.
Aplicaciones de la Ingeniería Genética a la ganadería

Animales transgénicos

La cría convencional de animales ha conducido a razas adaptadas a un clima o fin determinado. La

posibilidad de transferir material genético de una a otra raza puede acelerar enormemente este proceso.

El aumento del tamaño incorporando al cigote el gen de la hormona humana de crecimiento ha tenido
éxito en salmones y vacas. En aves de granja, ha reducido sensiblemente la tasa de reproducción.

Otros objetivos han sido el aumento de la lactación en vacas, e incluso la producción de leche
conteniendo proteínas medicamentosas, la mejora de las calidades del cuero y de la lana, etc.

Hasta ahora, la técnica de obtención de animales transgénicos tiene muy bajo rendimiento.
Probablemente la clonación permita resolver este problema.

La producción de leche por vacas transgénicas proporcionaría una leche libre de productos alergénicos y
con proteínas humanas lo que la haría ideal para alimentar bebés prematuros.

Clonación de animales

Desde hace varias décadas, las multinacionales de Biotecnología compiten en dos frentes:

➢ La mejora de la productividad y de la calidad de la cabaña ganadera;

➢ La explotación de animales transgénicos, es decir que portan genes extraños, destinados a producir en su
leche proteínas de interés terapéutico.

El concepto de clonación no es nuevo, sobre todo para los veterinarios.

Una “historia” de lo ocurrido desde 1950 podría ayudar a ubicarse a algunos:

➢ 1950: se logra congelar con éxito semen de toro a -79ºC para su transporte e inseminación de vacas;
➢ 1952: a partir de células indiferenciadas, Thomas KING y Robert BRIGGS logran clonar ranas;
➢ 1962: John GOURDON logra clonar ranas a partir de células de renacuajos;
➢ 1978: nace el primer bebé engendrado mediante “fecundación in vitro”; ese mismo año, la película “Los
niños de Brasil” plantea la posibilidad de obtener replicas clónicas de Adolf Hitler;
➢ 1982: científicos de las Universidades de Seattle (San Diego) y California obtienen el primer ratón
transgénico, portador del gen de la hormona de crecimiento de la rata;
➢ 1984: Primer nacimiento de un bebé a partir de un embrión congelado.
➢ 1985: Ralph BRINSTER obtiene cerdos que producen en su leche la hormona de crecimiento humano.
➢ 1987: Primera cepa de ratones transgénicos que portan genes humanos.
➢ 1992: Primera inyección intracitoplasmática nuclear de espermatozoides.
➢ 1993: Steven SPIELBERG produce la película “Parque Jurásico” (dinosaurios clónicos).
➢ 1995: Ian WILMUT y Keith CAMPBELL obtienen dos corderos engendrados por transferencia nuclear de
células embrionarias.
➢ 1995: nace el primer bebé a partir de un ovocito (óvulo) y de una espermátida (célula precursora del
espermatozoide).
➢ 1997: Don WOLF (de Oregón) presenta los macacos NETI y DITTO, clones de células de embriones
diferentes

Biotecnología 54
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

➢ 1997: Ian WILMUT presenta a DOLLY, primer mamífero clonado a partir de una CÉLULA ADULTA.
➢ 1998: el Dr. Richard SEED anuncia su intención de clonar humanos.
➢ 2002: El laboratorio Argentino Bio Sidus logró clonar con éxito a la ternera Pampa que produce hormona
del crecimiento humano en su leche.

Figura Nº56: Clonación de la oveja Dolly

Biotecnología 55
Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

Figura Nº57: Ternera Pampa y oveja Dolly

¿Qué representa DOLLY?

➢ La cordera DOLLY fue “concebida” por Ian WILMUT y su equipo de investigadores del Instituto ROSLIN, de
Edimburgo (Escocia).
➢ DOLLY es la prueba viviente de la resolución de uno de los mayores desafíos de la Biología moderna: no
sólo la clonación de mamíferos, sino la manipulación genética de una célula de un individuo adulto para
obtener una copia idéntica de él.
➢ DOLLY representa la culminación de más de cinco décadas de investigaciones, con más fracasos que
éxitos. Ya en las postrimerías de la Primera Guerra Mundial, el embriólogo alemán fue tildado de loco al
proponer sustituir el núcleo de un óvulo de rana (N) por el de una célula de embrión (2N) de este
batracio. Recién en 1952, los norteamericanos Thomas KING y Robert BRIGGS consiguen llevar a cabo
esta experiencia y demostraron además que las primeras divisiones celulares que acontecen después de
la fecundación son células indiferenciadas (células TOTIPOTENTES). Hasta ese momento no ha
comenzado la diferenciación tisular. Cuando este proceso comienza, los científicos no consiguieron, hasta
DOLLY, la clonación a partir de una célula diferenciada o somática.
➢ El esquema de la figura Nº56 muestra someramente como nació DOLLY con un éxito sobre 277
embriones obtenidos por la técnica empleada.
➢ A DOLLY siguieron GEORGE y CHARLEY, dos terneros engendrados en Inglaterra (pero a partir de células
embrionarias y la ternera MARGARITA, clonada por Jean Paul RENARD (del INRA, Francia) a partir de
células musculares extraídas de un feto bovino de 60 días.

Algunas de las posibles aplicaciones de la clonación

➢ Estudios sobre el envejecimiento: Como DOLLY contiene por un lado el ADN de las células mamarias
adultas de la oveja blanca y mitocondrias de la oveja con las manchas negras, se podrá estudiar el papel
de las mitocondrias en el proceso de envejecimiento.
➢ Fármacos puros y baratos: La producción de animales transgénicos como vacas y ovejas permite producir
leche con proteínas humanas de uso terapéutico. Como la obtención de animales transgénicos tiene muy
bajos rendimientos, la clonación podría resolver este problema.
➢ Terapia celular: Si se consiguiera clonar células humanas sin tener que fusionarlas con óvulos enucleados,
se podrían producir células sanas para tratar patologías como algunos cánceres, la diabetes o el mal de
Parkinson.
➢ Animales “humanizados” para obtener órganos para trasplante: La clonación de animales portadores de
genes humanos podría proporcionar animales que “donen” sus órganos para hacer trasplantes (ejemplos:
cerdos para trasplantes de corazón, un corazón de cerdo “humanizado” fue trasplantado a un mono en
1996). Se alejaría así el fenómeno indeseable del rechazo.
➢ Solución a la infertilidad humana: Las parejas estériles podrían recurrir a la clonación para tener hijos. Por
ejemplo, los espermatozoides podrían ser sustituidos por otras células o un óvulo (N) ser enucleado para
inyectarle un juego de cromosomas (N) de la madre.

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Tema Nº4
Subtema Nº1: Elementos fundamentales de genética.

➢ Solución a la extinción de especies animales o vegetales: Como se dispone de células congeladas de

especies en vías de extinción (como el oso panda, el rinoceronte de Sumatra, etc.) se podría utilizar la
clonación como una solución posible.
➢ Leche para niños prematuros: Vacas transgénicas podrían suministrar leche libre de sustancias
alergénicas y con proteínas ideales para bebés prematuros.
➢ Experimentación con animales modelo: La clonación de primates modelo podría, por ejemplo, servir para
estudiar algunas enfermedades graves de los humanos, como la fibrosis quística que es de origen
hereditario.

Desafío para los países en vías de desarrollo

Hay que aclarar en primer lugar que los científicos de los países desarrollados no trabajan por la
humanidad, y si lo hacen en verdad, quienes los patrocinan esperan resarcirse de sus inversiones a través del
pago de patentes de invención.

Así, para descubrir los productos transgénicos de los naturales, una de las maneras más sencillas ha sido
incorporar con los genes de interés el gen de la LUCIFERINA.

La LUCIFERINA es una proteína responsable de la bioluminiscencia, fenómeno biológico difundido en

protozoos, algunos peces y ciertas bacterias.

En presencia de ATP y de oxígeno, la enzima LUCIFERASA cataliza la reacción:

La luciferasa viene en un pequeño frasco, un trozo del vegetal o leche transgénica o carne de animal
transgénico o bacteria transgénica, proporcionan el ATP. La luz emitida es captada por un sensor, como “luz fría”,
como los empleados para dilucidar si un billete es falso o no.

Este ensayo, tan sencillo, pone al descubierto el uso de un ser transgénico y el correspondiente y debido
pago de patentes.

En segundo lugar, debemos tener muy presente, que en particular la República Argentina, tiene un
potencial enorme de recursos naturales para desarrollar la BIOTECNOLOGÍA y otro tanto en recursos humanos.
Recordemos que este desarrollo de la BIOTECNOLOGÍA DE AVANZADA no sólo tenemos a Bernardo HOUSAY, Luis
LELOIR y César MILSTEIN, si no toda una escuela argentina representada entre otras por la Fundación Campomar,
el I.N.T.A., el INGEBI, BIOSIDUS.

Sólo hacen falta el conocimiento de los jóvenes para emprender una tarea estratégica para el desarrollo
nacional, y sobre todo, la DECISIÓN POLÍTICA.

Sería muy ingrato olvidar al Dr. Atanasio QUIROGA, descubridor de la ARGININA (conferencia de París
25/04/1896).

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