PRACTICA # 1

Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Objetivo

Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de
vidrio y medios de cultivo de uso común en microbiología. Además, observará el efecto de las
condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio.

2. Introducción

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones
ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una
gran diversidad de hábitats incluyendo las condiciones extremas, sobre todo de tipo físico y
químico.

Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para

limpiar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo
de organismos y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la
desinfección, es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos.

La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en
Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye los microorganismos por
oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en un horno a 150-
180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de
inoculación y todo tipo de material quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y
cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es autoclave, que consiste en generar
vapor de agua a presión hasta alcanzar una temperatura de 121°C. El material se deja a esta
temperatura durante un tiempo de 15 minutos para asegurar la destrucción de endoesporas, que son
las estructuras microbianas (bacterias y hongos) más resistentes. El tiempo de esterilización
dependerá del material en cuestión.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor, como las soluciones
de nutrientes (vitaminas, aminoácidos, etc.), se procede a utilizar métodos alternativos, tales como:
filtración por membrana estéril de 0.2 µm de diámetro de poro, mientras que para el caso de
materiales plásticos es recomendable el uso de gases como: óxido de etileno o radicación gamma.
Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos con
forma líquida, dentro de los que tenemos: fenoles, compuestos cuaternarios de amonio
(alquildimetil bencilamonio), formaldehídos, alcoholes, halógenos y detergentes.

Cada uno de los procedimientos de esterilización y desinfección tiene ventajas y desventajas de

uso. Los sistemas de filtración son muy eficientes y muy rápidos, sin embargo se aplican para
volúmenes pequeños. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos, sin
embargo son muy corrosivos. Los detergentes y alcoholes tienen actividad limitada contra esporas
microbianas y algunos virus, por lo que sólo son desinfectantes.

3. Materiales y Equipos

3.1. Materiales

 7 tubos de ensayo con tapa de rosca

 1 gradilla
 1 mechero bunsen
 1 mechero Fisher
 2 matraces Erlenmeyer de 500 mL
 2 vasos de precipitado de 500 mL
 1 probeta de 500 mL
 5 pipetas de 1 mL
 5 pipetas de 5 mL
 5 pipetas de 10 mL
 1 pinza de disección
 10 cajas de Petri de vidrio
 Espátula
 Agar cuenta estándar (para preparar medio litro de medio)
 Agua peptonada (para preparar 100 mL de solución)

3.2 Equipos

 Horno de calor seco

 Autoclave
 Refrigerador
 Balanza
3.3 Material adicional por equipo

 Encendedor
 1 m de manta
 1 paquete de algodón grande
 Alcohol al 70° o 96° de 1 L
 Papel estraza
 1 atomizador
 1 marcador indeleble color negro
 1 tijeras
 1 cinta masking tape
4. Procedimiento

El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología,

enfatizando en la desinfección de áreas, así como en la preparación y desinfección de los materiales
y medios de cultivo necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará la
demostración necesaria para que el estudiante aprenda a preparar el material y manejarlo
correctamente en condiciones asépticas.

4.1. Preparación de material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar perfectamente el material de vidrio con la ayuda de un escobillón y detergente. Enjuagar

con abundante agua corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar escurrir el material.
3. Una vez seco el material, se procederá a envolver (cajas Petri y pipetas) con papel estraza. Para
los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con
holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel.
4. Preparar los medios de cultivo de acuerdo a las instrucciones indicadas en la etiqueta del
producto. Ajustar de ser necesario el pH con el uso de soluciones HCl o NaOH 0.1 N.

4.2. Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Los medios de cultivo se esterilizan a 120°C o 15 psig de presión por un tiempo de 15 minutos.
2. Antes de someter a esterilización el medio de cultivo sólido es recomendable fundirlo para evitar
aglomeraciones del agar a la hora del vaciado en caja.
3. Para medios de cultivo líquidos es recomendable adicionarlos previamente al recipiente de
interés (tubos de ensaye, etc.), para evitar manipulaciones adicionales posterior a la
esterilización que implique riesgo de contaminación (ej. Vaciar a tubos).
4. Respetar el tiempo de esterilización de os medios, pues un mayor tiempo implica reacciones o
degradación de nutrientes.

4.3 Vaciado de medio sólido en cajas de Petri

1. Posterior a la esterilización, dejar enfriar el medio e cultivo sólido a una temperatura
aproximadamente de 40-50°C, la cual puede determinarse empíricamente mediante la tolerancia
con la palma de la mano, sin sentir un excesivo calor.
2. Evitar vaciar el medio a temperatura mayor a la recomendada, de no respetar la indicación el
medio de cultivo presentará condensación de agua en la superficie y traerá problemas en el
análisis microbiológico.
3. Verter aproximadamente 25-30 mL de medio en condiciones asépticas, mediante el uso de un
mechero bunsen o campana de flujo laminar.
4. Dejar enfriar y colocar las cajas Petri invertidas (con la tapa hacia abajo).
5. Si las cajas no se usan inmediatamente, almacenar a 4°C.

4.4. Prueba de esterilidad (controles)

1. Una vez enfriados los medios, someter a incubación bajo condiciones aeróbicas a 30°C
durante 24h.
2. Transcurrido el tiempo, para medios líquidos checar ausencia de turbidez, mientras que para
medios sólidos presencia de colonias microbianas en la superficie.
3. Los controles se determinan de la siguiente manera:
a. Un control consiste en dejar abierta la caja al ambiente dentro del laboratorio por un
tiempo de 1 minuto.
b. Un segundo control consiste en abrir la caja dentro de las condiciones de esterilidad
en un tiempo de 30s.
c. Un tercer control es mantenerla sin abrir
d. Los tres procedimientos anteriores se someten a incubación a 30°C por 24 h. Su
crecimiento determina las condiciones de asepsia a que se someterá el proceso y su
posible influencia.

4. Observaciones
5. Resultados

6. Investigación documental complementaria

a) Elabora un mapa conceptual de los diferentes tipos de medios, realizando una breve
descripción y ejemplos de aplicación.
b) ¿Cuáles son los medios de esterilización más utilizados en microbiología? Y ¿En qué tipo
de materiales se aplica cada uno?
c) Explique ¿Cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y
asepsia? ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?
d) Elabora un mapa conceptual donde expliques el mecanismo de acción de los métodos de
esterilización por radiaciones ionizantes, radiaciones U.V y compuestos químicos
(halógenos, detergentes).

PRACTICA # 2

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

I.- Introducción

El aire contiene aproximadamente 20 % de oxígeno y en este entorno crecen los

microorganismos aerobios obligados. Los microorganismos microaerofílicos son aquellos
que requieren oxígeno pero a concentraciones inferiores al 20 % probablemente debido a
una toxicidad directa del oxígeno. Por otro lado los microorganismos facultativos son
capaces de crecer tanto en presencia de oxígeno como en ausencia del mismo, pudiendo
emplear como aceptores de electrones a los nitratos, sulfatos, carbonatos. etc.

En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran asociados, por lo que se

recurre a las técnicas de aislamiento para separarlos. Estas técnicas nos conducen a la
obtención de un cultivo puro o axénico, que es aquel que contiene una sola especie
microbiana. Los cultivos puros son útiles para identificar y estudiar las características de un
microorganismo dado.

Los métodos más comunes para el aislamiento de bacterias aerobias son: La técnica de la
estría cruzada y la técnica de las diluciones. La primera es una técnica cualitativa muy
sencilla, que requiere poco material y la segunda es un procedimiento cualitativo y
cuantitativo que nos permite conocer tanto el tipo como el número de microorganismos en
una muestra. Es un método más laborioso que requiere de mayor cantidad de material y
más habilidad.

En ambas técnicas los medios de cultivo utilizados y las condiciones de incubación

dependerán del tipo de microorganismo que se quiera aislar.

La técnica de las diluciones permite cuantificar con exactitud el número de

microorganismos o unidades formadoras de colonias (UFC) en una muestra. Para esto debe
seleccionarse aquella dilución en donde se presenten entre 20 y 200 colonias y multiplicar
por la Inversa de la dilución tomando en cuenta la alícuota depositada.

UFC
mL o gr
=( Numero de colonias ) ( 1
dilución )( alicuota
1
)
Se recomienda que la cuantificación de microorganismos se realice sembrando por
duplicado y para los cálculos hacer un promedio del número de colonias encontradas en la
dilución seleccionada.

II.- Objetivo.

El alumno aislará bacterias aerobias por las técnicas de diluciones, vertido en placa, estría
cruzada y sencilla.

III.- Material y Equipo.

• Tubos de tapa rosca 16 x 150 mm.

• Pipetas de 1ml estériles.
• Pipetas de 10 ml estériles
• Micropipeta de 1000 µL y 100 o 200 µL.
• Puntas para micropipeta de 1000 y 100 o 200 µL.
• 2 Matraces Erlenmeyer 500 mL. (según el volume de agar).
• Agua destilada
• Cajas Petri
• Varilla de vidrio acodada
• Etanol en un frasco.
• Mechero de Bunsen.
• Muestra para analizar.
IV.- Métodos.

A) Aislamiento por el método de diluciones.

1. Preparar agua peptonada (ver instrucciones del proveedor) y esterilizarla.

2. Marcar del 1 al 10 una serie de 10 tubos de 16 x 150 mm.
3. Adicionar a cada tubo 9 ml de agua peptonada estéril en condiciones de esterilidad
(seguir las instrucciones del profesor).
4. Agregar al primer tubo 1.0 g ó 1.0 ml de la muestra.
5. Efectuar diluciones decimales de cada muestra, como se indica en la Tabla 1. (ver el
esquema).
 a) Homogenizar la suspensión en cada tubo antes de transferir el volumen al
siguiente tubo.
b) Cambiar de pipeta al efectuar cada dilución.
c) Introducir la pipeta usada en la envoltura original.
6. Seleccionar cinco diluciones según instrucciones del profesor.
7. Colocar 1 ml de cada dilución en la superficie de cada una de las cinco placas de
agar, marcadas previamente con la dilución correspondiente.
8. Homogenizar el inóculo en la superficie de la placa con una varilla de vidrio
acodada estéril. Tapar las cajas con la tapa hacia abajo, marcar el paquete.
9. Incubar a 37 ºC durante 24-48 horas.

Figura. 1 Preparación de diluciones empleada en el aislamiento de microorganismos.

B) Aislamiento por el método de la estría cruzada.

1. Rotular la base de la caja Petri al comenzar.

2. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.
3. Dejar enfriar el asa.
4. Tomar una asada de la muestra (tubo 1 de la serie de diluciones) y colocarla en el
agar al borde de la placa, haciendo estrías continuas hacia el centro de la caja.
5. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla en el agar.
6. Hacer una segunda serie de estrías tocando la porción final de la anterior, como se
indica en la Fig. 2.
7. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla.
 8. Repetir los pasos 5 y 6 para hacer las series de estrías que se indican en las Figs. 1-
5.
9. Esterilizar el asa.
10. Tapar las cajas con la tapa hacia abajo y marcar el paquete.
11. Incubar el material a 28 ºC durante 24-48 horas.

Figura 2. Descripción de la técnica de estría cruzada empleada en el aislamiento y

purificación de microorganismos.

PRACTICA # 3
MORFOLOGÍA COLONIAL Y CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO Y SÓLIDO

I. Introducción.

Los microorganismos que crecen sobre superficies sólidas, tienden a formar agrupaciones
que se denominan colonias. Las colonias suelen ser de características constantes para el
medio de cultivo usado, la temperatura de incubación, y el microorganismo del que se trate,
por lo que su estudio es de gran utilidad tanto en la clasificación como en la identificación.

Una colonia microbiana está constituida por individuos de la misma especie provenientes
de una célula o de un grupo de ellas, llamados unidad formadora de colonias (UFC).

Las características consideradas para la descripción de la morfología colonial de las

bacterias se representan en la Figura 1. Y se describen a continuación:
  Tamaño. Se da en milímetros, y puede variar desde colonias extremadamente
pequeñas que miden apenas unos mm de diámetro hasta aquellas que llegan a medir
10 mm o más.
 Color. Pueden ser de muy variados colores.
 Forma. Puntiforme, circular o irregular.
 Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos, filamentos,
proyecciones como dientes de sierra o enrollados.
 Elevación. Las colonias pueden ser planas, convexas, pulvinadas, umbonadas y
umbilicadas.
 Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granulada.
 Aspecto. húmedo o seco.
 Luz reflejada. Brillante o mate.
 Luz transmitida. Transparente, Translúcida y opaca.
 Consistencia. Suave y dura. Esta característica se determina tocando la colonia con
el asa y por lo tanto debe ser la última en describirse.
 Producción de pigmentos. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua,
que puede difundir al medio de cultivo.

Por otra parte, el crecimiento de los microorganismos en medio líquido difiere a medio
sólido debido a la ausencia de la matriz de adhesión. Las características de crecimiento en
medio líquido al igual que medio sólido estará afectado por diversos factores tales como:
composición del medio y condiciones de incubación. El la Figura 2 se presentan diferentes
tipos de crecimiento presentados por microorganismos.

II. Objetivo.

El alumno aprenderá a describir las características de la morfología colonial de las bacterias

así como su crecimiento en medios líquidos.

III. Material y Equipo.

 10 tubos de ensayo con tapa rosca de 16 x 150 mm

 Asa bacteriológica
 2 mecheros de bunsen
 Medio de cultivo: Caldo nutritivo
 Espátula
 Vaso de precipitado de 500 mL
 Agua destilada

IV. Métodos.

A) Morfología colonial.
El procedimiento inicia con inoculación de la muestra en medio sólido mediante la técnica
de diluciones y siembra en superficie (Práctica 2), incubando en condiciones particulares de
los microorganismos de interés. Posteriormente, de las colonias desarrolladas se procede a
realizar un análisis visual de las características macroscópicas, las cuales se representan en
la Figura 1. Esta descripción permite establecer un primer criterio de diferenciación entre
diferentes microorganismos.

B) Crecimiento en medio líquido.

 Marcar correctamente un tubo con caldo nutritivo y sembrar con el asa cada una de
las colonias anteriormente descritas.
o
 Incubar su material a 37 C durante 24 horas.
 Identificar el tipo de crecimiento de cada microorganismo con base en el esquema.
 Resembrar las colonias descritas en tubos con Agar nutritivo inclinado.
o
 Incubar a 37 C durante 24 horas.
 Revisar los cultivos y conservarlos en refrigeración.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
 Fig 1. Características morfológicas de colonias microbianas desarrolladas en medio de
cultivo sólido.

Fig 2. Características microbianas de crecimiento en medio líquido

V.- Cuestionario.

1. Incluir en el informe una introducción acerca de la morfología colonial y crecimiento en

medio líquido y sólido.

2. Realizar un diagrama de flujo de los métodos utilizados en la práctica.

3.- Indicar cuántas colonias diferentes se observan aproximadamente por placa. ¿Tiene esto
algún significado?.

4.- Conteste el siguiente cuestionario:

5.- ¿Qué es una Unidad Formadora de Colonias (UFC)?

6.- ¿Existe alguna relación entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio liquido
con la tensión superficial del medio y los requerimientos de oxígeno del microorganismo?.

7.- ¿Qué es el fenómeno de “Swarning”?. Diga el nombre de un microorganismo que lo

presente.

8. Describir la morfología de las tres colonias seleccionadas en la tabla siguiente:

Características Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3

Tamaño (mm)

Color

Forma

Elevación

Superficie

Aspecto

Bordes

Luz reflejada

Luz trasmitida

Consistencia

Pigmento difusible

Medio de cultivo

9.- Describir el tipo de crecimiento que presenta en los tubos con caldo nutritivo

10. Elabora un mapa conceptual del artículo proporcionado, donde incluyas sus diferentes
apartados y lo más destacado.
VII.- Bibliografía [Link] por lo menos tres citas bibliográficas consultadas
(una en inglés, una de libros en la biblioteca y la última es libre).

Nota: Esta práctica fue tomada del manual Microbiología del Instituto de Ciencias
Agrícolas (UG) y modificada por los profesores Norma caudillo y Hugo Rosales adscritos
al Instituto Tecnológico Superior de Guanajuato.

PRÁCTICA 4
MÉTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

Objetivo
Que el alumno conozca las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivo sólido para la
obtención de cultivos puros.

Introducción
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de la bacteria para caracterizar su
crecimiento, hacer su identificación y determinar sus actividades metabólicas. Un medio de cultivo
es una solución acuosa de diferentes compuestos que contienen todos los elementos indispensables
que requieren los microorganismos para crecer.

Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos (caldos) o sólidos
(Agar) para su propagación y/o conservación, así como estudiar sus características de crecimiento.
En importante recordar que la inoculación de microorganismos en los medios de cultivo, siempre
deberán realizarse en una zona aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar,
condiciones que limiten la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.

Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras

complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como
para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están formados por un solo
tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las características morfológicas,
propiedades de tinción, actividad bioquímica, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos e
identificación de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en medió sólido
empleando la técnica de estría en placa o en medios líquidos. En el primer caso se considera que la
célula bacteriana que se separa dará origen a una población que formará una colonia característica,
visible a simple vista.

La limitación principal de la técnica de diluciones, es que no es práctica para el aislamiento a partir

de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde
solamente se obtendrán las bacterias dominantes.

Para favorecer el crecimiento de cultivos de baja densidad, se aplican métodos de cultivo especiales,
en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones
de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo
de interés y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.

En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes, tales como: sangre,
colorantes, indicadores, etc. para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en que
metabolizan os sustratos que se manifiestan por cambios de apariencia o modificación de pH del
medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la
caracterización e identificación de especies bacterianas.

Materiales
Cajas de Petri con Agar nutritivo
1 Mechero bunsen
2 Asas de inoculación
Película plástica para sellado de cajas
Incubadora
Procedimiento
1. A partir del crecimiento microbiano generado en la Práctica # 3, se procederá a seleccionar
cinco colonias con diferentes características morfológicas, procurando sean colonias
completamente aisladas y en buen estado de desarrollo.
2. Posteriormente tomar con el asa de inoculación previamente flameada y fría, tomar una
pequeña cantidad de colonia bacteriana de interés y proceder a realizar la estría en placas de
Agar nutritivo estériles. La forma de la estría se representa en la Fig. 4.
3. Una vez realizada la estría, sellar las cajas con la película plástica e incubar a 35±2 °C por
24 h.
 4. El procedimiento de estriado se realiza de 2 a 3 veces consecutivas, con la finalidad de
asegurar la pureza del cultivo (cultivo axénico).
5. Adicionalmente, la pureza del cultivo se puede comprobar mediante tinción celular del
cultivo.

Observaciones
1. Realiza la descripción de las características coloniales de las colonias microbianas.
2. Realiza las observaciones pertinentes.
3. Realiza una investigación documental de técnicas de conservación de cultivos puros.
 PRACTICA 5

TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM Y TINCIONES SELECTIVAS

Objetivo

Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de
acuerdo a la tinción de Gram. Además observe estructuras bacterianas especiales, como
endoesporas y cápsulas con tinciones selectivas. Finalmente comprenda la importancia que tienen
estas técnicas en la caracterización e identificación bacteriana.

Introducción

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones
diferenciales más utilizada en bacteriología, que clasifica cultivos bacterianos de menos de 24 h en
Gram positivas o Gran negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el colorante primario
(cristal violeta) tiñe por igual todo tipo de bacteria, sin embargo con el proceso restante solo este
colorante permanece en los Gram positivos.

Para establecer la diferencia entre estos dos grupos, se aplica un disolvente de colorante primario
que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina
aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En
estas circunstancias, sería muy difícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro
colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los
microorganismos que habían retenido el colorante primario, pero tiñe a los microorganismos
decolorados.
Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y
estructura de las paredes celulares, que facilitan la retención o eliminación del colorante primario
después del proceso de decoloración.

Otras tinciones que permiten mayor información, son la negativa y selectiva. La tinción negativa
facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del
calor así como de las estructuras especiales, como cápsula de algunas especies bacterianas. La
cápsula también llamada glicocalix es una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o
polipéptidos, que confieren protección a las bacterias contra desecación y fagocitosis.

La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de bacterias con tinta china
o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que
aparecen como una zona clara que rodea a la célula bacteriana en un fondo oscuro.

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endoesporas de
Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia y localización son importantes criterios de
clasificación taxonómica.

Además, debido a la resistencia al color de las endoesporas y a que algunas especies son
microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y médica
adquiere gran interés.

Materiales

Solución de Colorante Cristal violeta

Solución de Colorante Safranina

Solución etanol-cetona en proporción 1:1

Solución de Lugol

Porta objetos

Agua destilada

Asa de inoculación

Verde de malaquita

Tinta china

Fenol al 2%
Aceite de inmersión

Microscopio óptico

Mechero

Asa de inoculación

Procedimientos

Tinción diferencial (Gram positiva y Gram negativa)

1. De las colonias seleccionadas y purificadas, elaborar un frotis de cultivo axénico colocando

una gota de agua destilada sobre la superficie de un porta objetos y posteriormente tomar
una pequeña cantidad de colonia microbiana de interés y dispersas con la gota de agua,
dejando secar a temperatura ambiente y finalmente fijándolo mediante el paso rápido en
tres ocasiones consecutivas a través de la flama del mechero.
2. A continuación se coloca 2 gotas de solución cristal violeta sobre la superficie del frotis y
dejar actuar por 1 minuto.
3. Lavar cuidadosamente el frotis con agua corriente para eliminar el exceso de colorante.
4. Agregar 2 gotas de solución de Lugol y dejar actuar por 1 minuto.
5. Lavar con agua corriente.
6. Inclinar ligeramente el portaobjetos y aplicar gota a gota la solución de alcohol-cetona
dejando actuar el tiempo que tarda en escurrir.
7. Lavar con agua corriente.
8. Aplicar 2 gotas de solución de safranina y dejar actuar por 1 minuto.
9. Lavar nuevamente con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.
10. Poteriormente adicionar 1 gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el
objetivo de 100X (objetivo de inmersión).

Tinción negativa (Cápsulas)

1. Colocar una gota de tinta china en un extremo del portaobjetos; colocar junto una gota del
cultivo líquido del microorganismo de interés. Si se trata de un cultivo sólido, hacer una
suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente
con tinta china.
 2. Distribuir la gota a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjetos perpendicular en
ángulod e 45° sobre la muestra.
3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa
fina de la mezcla.
4. Dejar secar al aire.
5. Observar con el objetivo de inmersión (100X).

Resultados

1. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo. Hacer los
dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos.
2. Discutir los resultados con los reportados en bibliografía.

PRACTICA 6
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

Objetivo.
El alumno conocerá y aplicará los principios básicos de crecimiento microbiano

Introducción.
El crecimiento celular se define como un aumento ordenado de la calidad de la cantidad de
los constituyentes y estructuras celulares, lo que lleva a un incremento del tamaño y peso de
las células; en la mayoría de los microorganismos esto conduce a la división celular, dando
por resultado el aumento en el número de células (crecimiento de la población).
En Microbiología, la mayoría de los estudios sobre crecimiento tratan de las poblaciones,
no de las células individuales.
Crecimiento Bacteriano.
Para determinar el crecimiento bacteriano se pueden utilizar diferentes métodos, ya sean
directos o indirectos. Entre los primeros se encuentran la cuenta directa al microscopio, la
cuenta viable, el volumen del paquete celular, la turbidez, etc; y entre los indirectos, la
medida de algún componente celular como el nitrógeno o las proteínas, consumo de la
fuente de carbono, o cambio de pH.
Si las bacterias se siembran en un medio de cultivo adecuado, pueden observarse cuatro
fases principales de crecimiento (ver figura) que son:
a) Fase de adaptación (Fase Lag): es un período en el que las bacterias se adaptan al medio
de cultivo; ocurre aumento en la masa celular sin haber cambio en el número de células.
b) Fase de crecimiento exponencial (Fase Logarítmica): se presenta el crecimiento óptico
de tipo exponencial, que es consecuencia de que cada célula se divide en dos células hijas,
las que a su vez producen dos nuevas células y así sucesivamente.
c) Fase estacionaria: como consecuencia del crecimiento, se producen cambios en el medio
de cultivo que llevan a condiciones adversas que reducen la velocidad de reproducción; y la
división celular sólo ocurre en algunas células, en tanto que otras mueren, presentándose un
equilibrio en la población.
d) Fase de muerte: Cuando el número de células que mueren supera al de las que aún se
dividen, la población disminuye notablemente.
Crecimiento diáuxico.
Cuando el medio de cultivo contiene dos fuentes de carbono en concentración limitante, se
presentan dos fases de crecimiento exponencial (Figura 1), separadas por una fase de
inducción (Figura 2), ver fi
FASES DE CRECIMIENTO DIAUXICO
Crecimiento de Hongos.
Cuando una espora germina emite un filamento o hifa que se alarga y ramifica rápidamente
a medida que va creciendo, formando así un sistema de hifas llamado micelio. El
crecimiento de los hongos se lleva a cabo en los ápices de las hifas, y continúa mientras
haya nutrientes en el medio, algunos pueden llegar a medir varios metros. El crecimiento de
los hongos filamentosos se puede poner de manifiesto por varios métodos, como son la
determinación del crecimiento radial, del crecimiento longitudinal, del peso seco y del peso
húmedo.

Material.
 Tubos de ensaye de 16 X 150 mm con 9 ml de agua peptonada estéril.
 Cajas de Petri con agar nutritivo.
 Pipetas estériles de 5 ml.
 Pipetas estériles de 1 ml.
 Tubos de Ryan con gelosa Sabouraud.
 Cajas de Petri con gelosa Sabouraud.
  Matraz Erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de Medio E + 0.25% de glucosa.
 Matraz nefelométrico con 20 ml de Medio E + 0.25% de glucosa.
 Klett Summerson con filtro azul.
 Cepas: Bacterias: Escherichia coli o Klebsiella [Link]: Penicillium
sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp., Zygorhynchus sp. u Otros.

Métodos.
A) Método de la cuenta viable para bacterias.
Inocular un matraz Erlenmeyer que contenga 50 ml de Medio E + 0.25% de glucosa, con 5
ml del inóculo.
Homogeneizar el inóculo en el medio y mantenerlo en incubación en baño maría a 37ºC.
Hacer una cuenta viable de las bacterias a los tiempos de incubación y diluciones indicadas
en la tabla siguiente:

 Marcar las cajas con tiempos y diluciones.

 Tomar 0.1 ml de la suspensión bacteriana de las cuatro últimas diluciones y
colocarlas por duplicado en las cajas previamente marcadas.
 Dispersar el inóculo en la superficie, con una varilla de vidrio acodada estéril.
 Incubar a 37ºC durante 27 horas.
 Contar las colonias de cada placa y determinar el número de bacterias por mililitro
de medio de cultivo, a los diferentes tiempos de incubación.

TIEMPO DE INCUBACIÓN (h)

DILUCIONES
 0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0 -1 -6
10 a 10
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
22.0
24.0

B) Método nefelométrico para bacterias.

1. Inocular un matraz nefelométrico que contenga 20 ml de medio E + 0.25% de
glucosa con el volumen de inóculo necesario para llevar la lectura a 15 unidades
klett-Summerson (U.K.) o a 0.03 de densidad óptica (D.O.).
2. Medir la turbiedad del cultivo en un fotocolorímetro Klett-Summerson desde el
tiempo 0 a 10 horas, como se indicó en la tabla anterior (A3), manteniendo el
cultivo a 37ºC. El cero del fotocolorímetro se ajusta con medio E sin inocular.

C) Crecimiento longitudinal de hongos.

1. Sembrar en un extremo del tubo de Ryan con gelosa Sabouraud una porción del
crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28ºC.
2. Medir la longitud del crecimiento a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación.

D) Crecimiento radial de los hongos.

1. Sembrar por punto el centro de una caja de Petri con gelosa Sabouraud con una
porción del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28°C.
2. Medir el diámetro de la colonia a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación.
Nota: Mover los tubos de Ryan y las cajas de Petri con gelosa Sabouraud inoculados lo
MENOS POSIBLE, para evitar la dispersión de las esporas.
Resultados
1.- Tabular los resultados de la curva de crecimiento de bacterias por el método de cuenta
viable y nefelométrico, como se indica en la siguiente tabla.

Cuenta Viable
Tiempo de Nefelométrico
Incubación (h) Log. del No.
No. bacterias/ml
bacterias UK
0.0
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0

2.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior, colocando en el eje de las
abscisas el tiempo de incubación y en el de las ordenadas, el logaritmo del número de
bacterias o las U.K., según el método. Escribir correctamente el título de cada gráfica.
3.- ¿Qué diferencias y semejanzas observa en las curvas de crecimiento obtenidas por
cuenta viable y por determinación nefelométrica?.
4.- Tabular los resultados del crecimiento lineal y radial de los hongos, como se indica en la
tabla siguiente.
Cepa: ___________________
5.- Hacer una gráfica con los resultados de la tabla anterior, colocando el tiempo de
incubación en el eje de las abscisas y el crecimiento en centímetros en el de las ordenadas.
Escribir correctamente el título de cada gráfica.

VI.- Glosario de términos desconocidos.

VII.- Bibliografía [Link] por lo menos tres citas bibliográficas consultadas

(una en inglés, una de libros en la biblioteca y la última es libre).

Nota: Esta práctica fue modificada del manual Microbiología del Instituto de Ciencias Agricolas
(UG) y modificada por los profesores Normal Angélica Caudillo y Hugo Rosales Bravo del
Instituto Tecnológico Superior de Guanajuato.