MECANISMOS DE RESISTENCIA DE
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
UNIDAD 9
MECANISMOS DE
RESISTENCIA BACTERIANA
• La resistencia antimicrobiana es un problema
continuo y en aumento. Se hace aún mayor
cuando un microorganismo presenta más de un
mecanismo de resistencia y cuando tiene la
facultad de transmitirlo, no sólo a su
descendencia, sino también a otras bacterias de
su misma o diferente especie.
• Los fenómenos de resistencia antimicrobiana son
variados, destacando entre ellos cuatro
mecanismos principales:
MECANISMOS DE
RESISTENCIA BACTERIANA
1) Enzimas
hidrolíticas
2) Modificación
del sitio activo
3) Disminución
de la
permeabilidad de
la pared celular
al ingreso del
antimicrobiano
4) Bombas de
eflujo
1) PRODUCCION DE ENZIMAS
HIDROLÍTICAS
• Las bacterias sintetizan enzimas que hidrolizan
al antibiótico, destruyendo su acción
antibacteriana, sin tener posibilidad de actuar
sobre el microorganismo.
• Beta-lactamasas: son enzimas que hidrolizan
la unión peptídica endocíclica del anillo
betalactámico. La producción de beta-
lactamasas es el mecanismo más frecuente de
resistencia antibiótica.
2)MODIFICACIÓN DEL SITIO ACTIVO
• La modificación de un aminoácido genera un blanco diferente y así
disminuye la afinidad de unión por el antimicrobiano.
• Modificación de PBP: El PBP (penicillin-binding-protein) (proteína
fijadora de penicilina) es un complejo enzimático que permite la
síntesis del peptidoglicano, un compuesto de la pared celular en
bacterias, principalmente en Gram positivas, si se produce
mutación del sitio de unión al antibiótico como los betalactámicos,
éstos no pueden actuar y se genera resistencia a ellos.
• Modificación ribosomal: Los genes erm A y erm B producen
modificación del sitio activo del ribosoma, mediante metilación.
Este mecanismo es importante en la resistencia a macrólidos en S.
pneumoniae y S. pyogenes.
3) DISMINUCIÓN DE LA PERMEABILIDAD DE LA
PARED CELULAR AL INGRESO DEL ANTIBIOTICO
• Cambios en el diámetro y/o número de
porinas pueden bloquear el ingreso del
antibiótico a la bacteria.
• Porinas: Existe disminución de la expresión de
porinas (downregulation) lo que disminuye la
susceptibilidad a betalactámicos y
fluorquinolonas en Pseudomonas".
4)BOMBAS DE EFLUJO
• Transporta al antibiótico hacia el exterior de la célula sin
modificaciones, pero sin acción antibacteriana.
• Existen bombas de eflujos multidrogas en la pared
bacteriana que permiten la expulsión de drogas como los
antibióticos.
• Los genes involucrados son MefA (Streptococcus
pneumoniae), NorA (Staphylococcus aureus) y Mex
(Pseudomonas aeruginosa). Estos genes explican la
resistencia a macrólidos en estos patógenos y a
fluoroquinolonas. Para combatir este tipo de resistencia se
encuentran en estudio la asociación de inhibidores de
bombas de eflujo junto con el antibiótico.
SENSIBILIDAD Y RESISTENCIA
Los microorganismos son naturalmente sensibles a unos
antimicrobianos y resistentes a otros. Además, la mayoría de
ellos pueden adquirir resistencia a antimicrobianos a los que
previamente eran sensibles.
Una de las actividades más relevantes que se realiza en el
laboratorio de microbiología clínica es la de determinar la
sensibilidad o resistencia de los microorganismos a los diferentes
antimicrobianos, para orientar el tratamiento. Estos estudios se
realizan mediante el «antibiograma».
CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA.
PUNTOS DE CORTE DE SENSIBILIDAD
La actividad de un antimicrobiano sobre un
microorganismo puede cuantificarse en el laboratorio
determinando la concentración inhibitoria mínima
(CIM), que se define como la mínima cantidad de
antibiótico por unidad de volumen del medio de
cultivo, que inhibe el crecimiento bacteriano y se
expresa en microgramos de antibiótico por mililitro de
medio de cultivo (ug/ml).
CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA.
PUNTOS DE CORTE DE SENSIBILIDAD
Constituye un parámetro de actividad, ya qué,
lógicamente, cuanto menor es la cantidad de un
antimicrobiano necesario para inhibir a un
microorganismo mayor es su actividad frente a él y
viceversa.
Las concentraciones del antibiótico que se obtienen en la sangre
y en los tejidos se denominan concentraciones plasmáticas y
tisulares respectivamente. Estas concentraciones varían ya que
dependen de tres factores:
1.- De la dosis del antibiótico
2.- De su difusión a los tejidos y al interior de las células
3.- De la rapidez de su metabolización y eliminación
ESTUDIO DE LA RESISTENCIA A LOS
ANTIMICROBIANOS
ASPECTOS GENERALES
Como se ha señalado previamente, la resistencia se
manifiesta por la elevación de la CIM. Para la
determinación de la CIM se utilizan técnicas diferentes
según se trate de una bacteria, un hongo o un virus.
Estas técnicas, en líneas generales, consisten en
enfrentar el microorganismo a diferentes
concentraciones de cada antimicrobiano para
determinar las concentraciones que inhiben o matan al
microbio.
ESTUDIO DE LA RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS
ASPECTOS GENERALES
Las técnicas genéticas poseen un valor universal para el
estudio de la sensibilidad y la resistencia, porque la
resistencia se produce siempre como consecuencia de
un cambio en el genoma del microorganismo.
Por ejemplo, si una bacteria sintetiza una enzima
inactivante de un antibiótico, como una betalactamasa ,
es porque la bacteria ha adquirido plásmidos o
transposones que acarrean los genes que codifican esas
enzimas. Disminuyendo su afinidad por esos
medicamentos, se produce resistencia.
TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS
BACTERIAS
En la mayoría de los casos el estudio de la sensibilidad
de las bacterias se efectúa por medio del
antibiograma.
El antibiograma puede realizarse mediante técnicas de
dilución o de difusión en gradiente que permiten
obtener directamente los valores de CIM o bien
mediante técnicas indirectas de difusión con discos.
TÉCNICAS DE DILUCIÓN
Las técnicas de dilución en medio líquido pueden
realizarse en tubos convencionales o bien en pequeños
pocillos contenidos en placas de poliestireno
(microdilución).
Se basa en la preparación de una serie de tubos
conteniendo cada uno 1 ml de caldo de cultivo
adecuado para el crecimiento de la bacteria.
Un tubo se deja como control de crecimiento (C). En los
otros se incorporan cantidades dobles progresivas del
antibiótico
TÉCNICAS DE DILUCIÓN
Tras 18 a 24 horas de
incubación en la
estufa, en el tubo de
control sin antibiótico
se observa la turbidez
propia del crecimiento
bacteriano. El tubo
con menor cantidad
de antibiótico de los
que no presentan
crecimiento es el que
indica la CIM.
TÉCNICAS DE DIFUSIÓN
DISCO-DIFUSIÓN
La técnica de disco difusión se realiza sembrando la
bacteria en la superficie de un medio de cultivo sólido
contenido en una placa petri y posteriormente
depositando sobre el medio discos de papel
impregnados cada uno de ellos con una cantidad
determinada de antibiótico.
El antibiótico difunde radialmente desde el disco en el agar,
estableciéndose un gradiente de concentración a su alrededor;
la mayor concentración se halla en la proximidad del disco y
disminuye hacia la periferia.
TÉCNICA DE DIFUSIÓN
DISCO-DIFUSIÓN
A continuación se incuban las placas durante 18 a 24
horas apareciendo un crecimiento homogéneo en la
superficie del agar, observándose halos de inhibición
alrededor de los discos que contienen antibióticos
activos frente a la bacteria estudiada.
Los diámetros de los halos se miden en milímetros y los
resultados se interpretan en las categorías de sensible,
intermedio o resistente según los puntos de corte
establecidos.
TÉCNICA DE DIFUSIÓN
DISCO-DIFUSIÓN
En estos casos los puntos de corte no se expresan en
ug/ml como valores de CIM, sino en milímetros, en
relación al diámetro de los halos de inhibición, aunque
lógicamente existe una correlación inversa entre ambos
valores: la CIM y el diámetro del halo.
En efecto para un mismo antibiótico, cuanto mayor es
el diámetro del halo de inhibición menor es la CIM para
el microorganismo, es decir, mayor es su sensibilidad ya
que se necesita menor cantidad de antibiótico para
inhibirlo.
TÉCNICA DE DIFUSIÓN EN
GRADIENTE
La técnica de difusión en gradiente es un método
alternativo a la microdilución para el estudio
cuantitativo de la sensibilidad, ya que permite
determinar la CIM por una técnica de difusión.
Se realiza mediante una tira de plástico de 5 cm de
largo por 5 mm de ancho que incorpora a lo largo de la
misma un gradiente predefinido de concentraciones
de un antimicrobiano.
TÉCNICA DE DIFUSIÓN EN
GRADIENTE
Tras la incubación de las placas, se puede observar una
zona de inhibición elipsoidal y simétrica a ambos lados
de la tira. La cantidad de antibiótico indicada en la tira
en el lugar de la intersección del halo de inhibición con
la tira corresponde a la CIM.
La gran ventaja de este método es que posee la
sencillez de la técnica de disco-difusión, pero ofrece
resultados cuantitativos de CIM y permite estudiar con
suficiente rigor bacterias que no se pueden estudiar por
la técnica de difusión convencional de disco.
¿ Cuándo hacer un antibiograma?
Cuando se aísla una bacteria que está causando un
proceso infeccioso, ha de hacerse un antibiograma para
establecer su sensibilidad y resistencia a los
antimicrobianos y poder instaurar el tratamiento
basándose en datos objetivos.
El enfoque es diferente cuando el microorganismo aislado no se
le puede atribuir la causalidad del proceso, por tratarse de una
bacteria que forma parte de la microbiota normal o es
contaminante accidental del cultivo. En este caso no debe
hacerse el estudio , debido a que la información del
antibiograma puede sugerir el uso innecesario de antibióticos.
MECANISMOS DE RESISTENCIA A
BETALACTAMASAS PRODUCIDAS POR
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
DETECCIÓN DE LAS BETALACTAMASAS
Uno de los principales mecanismos de resistencia a los
antibióticos betalactámicos es la producción de
betalactamasas.
Los antibióticos betalactámicos tienen en común su
estructura molecular con un anillo B-lactámico , el cual
es responsable en gran parte de su acción
antimicrobiana.
Las betalactamasas son enzimas capaces de romper
este anillo e inactivar estos antibióticos.
DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS
Las betalactamasas son ubicuas de las bacterias gram
negativas y representan una forma importante de
resistencia.
Los genes que codifican estas enzimas pueden
encontrarse en el cromosoma bacteriano o en
plásmidos, lo cual permite su fácil transferencia entre
diferentes bacterias, lo que representa un gran reto
para el control de las infecciones.
BETALACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO
(BLEA)
Dentro de las betalactamasas tenemos:
B-lactamasas de espectro ampliado (BLEA), las cuales
van a producir resistencia bacteriana a las
aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina) y
carboxipenicilinas (carbencilina, ticarcilina), pero con
sensibilidad a las cefalosporinas, monobactámicos y
carbapenémicos.
Las BLEA están mediadas por plásmidos más
comúnmente distribuidas en los bacilos gram
negativos.
BETALACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO
(BLEA)
Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae,Pseudomona
y Acinetobacter, son las
principales bacterias
productoras de BLEA. BLEA Sinergia entre AMP vs. AMC.
En el antibiograma si Debemos considerar en el reporte
como resistente a todas las
observamos resistencia a Penicilinas
la Ampicilina, amoxicilina
estamos frente a una
bacteria productora de
BLEA.
BETALACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO
(BLEA)
Las cepas productoras de BLEA son sensibles a las
cefalosporinas hasta la cuarta generación y
carbapenémicos
BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
(BLEE)
Las BLEE han sido reportadas en múltiples especies de bacterias
Gram negativas . Klebsiella spp y Escherichia coli son los
gérmenes más frecuentemente implicados.
Estas enzimas confieren resistencia: las penicilinas y
cefalosporinas de espectro reducido, cefalosporinas de 3era
generación , aztreonam. Por otro lado son incapaces de
hidrolizar cefamicinas (cefoxitina y cefotetan) y carbapenems.
Las BLEE son inhibidas por los inhibidores de betalactamasas
como el ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam, lo
que las diferencia de las betalactamasas tipo Amp C.
PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE (BLEE)
Realizar el antibiograma siguiendo las reglas de la CLSI
El uso de más de una cefalosporina de 3era
generación y aztreonam en el test, aumenta la
probabilidad de detección de BLEE.
El test inicial de tamizaje indica que halos menores o iguales a
27 mm en cefotaxima, 25 mm para ceftriazona o 22 mm para
ceftazidima, sugiere producción de BLEE.
En el antibiograma se prueban otros antibióticos como
quinolonas, aminoglucósidos, cotrimoxasol e imipenem , para
ver otras opciones de tratamiento.
PROCEDIMIENTO PARA DETECCIÓN DE (BLEE)
El test de Jarlier, test confirmatorio de BLEE, utiliza la
técnica del efecto de doble disco para detectar esta
enzima.
Para realizar el test de Jarlier se inocula una placa de agar
Mueller Hinton con la cepa sospechosa, se coloca un
disco de Amoxicilina más clavulánico (20/10 mcg) en el
centro del agar y alrededor a 20 mm de distancia discos
de Ceftazidima (30 mcg) y Cefotaxima (30 mcg), se
incuba 24 h a 37 ⁰C .
La presencia de BLEE se manifiesta por el efecto sinérgico
del inhibidor y los discos de cefalosporinas. Esta sinergia
es llamada «efecto huevo» o cola de pez.
BLEE (CONFIRMATORIO)
Si un aislamiento produce un
halo de inhibición menor o
igual al diámetro del halo
especificado (por ejemplo 26
mm para cefotaxima) se
considera como potencial
productor de BLEE y se debe
realizar la prueba
confirmatoria
BLEE (CONFIRMATORIO)
Las cepas productoras de BLEE son analizadas con
discos de cefotaxima y ceftazidima solas y en
combinación con ácido clavulánico.
Si el aislamiento produce una BLEE, se espera
encontrar halos reducidos alrededor de los discos de
cefalosporinas de tercera generación, y halos más
amplios alrededor de los discos combinados con ácido
clavulánico, puesto que éste inhibirá la actividad de la
enzima, y por tanto la bacteria será susceptible al
antibiótico.
BLEE (CONFIRMATORIO)
Interpretación: Un incremento ≥5 mm en el diámetro
del halo para cefotaxima o ceftazidima cuando se
prueban en combinación con ácido clavulánico,
comparado con el diámetro del halo cuando se prueba
sin ácido clavulánico, confirma la producción de BLEE.
23 mm
15 mm
Ejemplo: CTX/CLAV = 23 mm, CTX= 15 mm, haciendo una resta
de 23 – 15 igual 8 mm. Se considera BLEE cuando la diferencia
de la resta es ≥ 5mm. El resultado de la diferencia es de 8 mm
por lo tanto la bacteria es productora de BLEE.
BLEE (CONFIRMATORIO)
Si los resultados de las pruebas confirmatorias son
positivos, el reporte debe mencionar claramente que
el aislamiento es productor de BLEE. Las cepas
productoras de BLEE deben incluir la siguiente
nota: "No se recomienda el uso de cefalosporinas ni
aztreonam. Se sugiere aislamiento de contacto y
consulta con el servicio de control de infecciones". Sin
importar el resultado in vitro.
BETALACTAMASAS TIPO AMP-C
• Las AmpC son serin-betalactamasas pertenecientes al
grupo 1 de la clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros,
presentes de forma natural en diversas enterobacterias
y en bacilos gramnegativos no fermentadores como
Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii.
• Estas enzimas son capaces de resistir la inhibición por
ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.
• Aunque para la detección de AmpC no existen métodos
estandarizados por el Instituto de Estándares de
Laboratorios Clínicos (CLSI), se han diseñado diversas
técnicas con elevada sensibilidad y especificidad.
BETALACTAMASAS TIPO AMP-C
• Las betalactamasas AmpC están asociadas a
elevada mortalidad y, a nivel de laboratorio,
con falsos reportes de susceptibilidad
antimicrobiana.
• Por lo tanto, es de vital importancia su
investigación de rutina en los laboratorios de
microbiología.
BETALACTAMASAS TIPO AMP-C
• Ciertas enterobacterias poseen de manera natural betalactamasas
tipo AmpC, tal es el caso de Enterobacter spp., Providencia spp.,
Morganella morganii, Serratia marcescens, Citrobacter freundii y
Hafnia alvei; al igual que bacilos gramnegativos no fermentadores
de importancia clínica como Pseudomonas aeruginosa.
• Las AmpC producidas por los microorganismos antes mencionados,
son de naturaleza cromosómica inducible y explican la resistencia
natural a las aminopenicilinas, cefalosporinas de 1ra generación,
cefamicinas (cefoxitina, cefotetán) y aminopenicilinas combinadas
con inhibidores de betalactamasas (amoxicilina-ácido clavulánico,
ampicilina-sulbactam), expresada por estos agentes bacterianos. E.
coli, Shigella spp. y Acinetobacter baumannii, también poseen
betalactamasas AmpC cromosómicas pero constitutivas (no
inducibles)
Clasificación de las betalactamasas AmpC
según localización y expresión del gen AmpC
• AmpC cromosómicas inducibles: Se producen a bajos
niveles de manera natural y aumentan su síntesis en
presencia de inductores (betalactámicos). Como se
mencionó anteriormente, pueden derreprimirse, perdiendo
así la característica de inducción. Son ejemplos de bacterias
productoras: Enterobacter spp., M. morganii, Providencia
spp. P. aeruginosa, entre otras.
• AmpC cromosómicas no inducibles (constitutivas): Su
expresión es a niveles muy bajos sin mostrar resistencia.
Cuando se encuentran hiperproducidas pueden conferir
resistencia a todos los betalactámicos a excepción de
cefalosporinas de 4ta generación y carbapenémicos. La
bacteria representativa es E. coli.
Métodos de detección fenotípica de
betalactamasas AmpC
• Método de aproximación de discos: Propuesto por Sanders
y Sanders, es aplicable a betalactamasas AmpC inducibles.
• La técnica consiste en realizar un antibiograma
convencional, para luego colocar un disco de cefoxitina
(FOX) o cualquier otro antimicrobiano inductor (Tabla 1) a
una distancia de 27mm centro-centro de un disco de
cefamandol (MA), ceftazidima (CAZ), ceftriazona (CRO) o
cefotaxima (CTX) (antimicrobiano sustrato, revelador o
testigo).
• El microorganismo producirá una betalactamasa inducible
si se observa un halo de inhibición truncado del
antimicrobiano sustrato, testigo o revelador
Se observa el achatamiento
BETALACTAMASAS INDUCIBLES TIPO AMP-C
INDUCTOR SUSTRATO O REVELADOR
Cefamandol (MA)
Cefoxitina (FOX) Ceftazidima (CAZ)
Imipenem (IMP) Ceftriazona (CRO)
Cefotaxima (CTX)
• Ante una prueba positiva se debe alertar al clínico de la
presencia de una betalactamasa inducible, que puede
ocasionar un fracaso durante el tratamiento con
betalactámicos para los cuales la AmpC es activa, como
consecuencia de la selección de mutantes
derreprimidos.
• Detección de AmpC usando inhibidores específicos: El
método de aproximación de discos no es de ninguna
utilidad en cepas derreprimidas, hiperproductoras o
con betalactamasas AmpC plasmídicas constitutivas. En
estos casos, deben adicionarse técnicas que incluyan la
utilización de inhibidores de AmpC.
CARBAPENEMASAS
Las carbapenemasas son un grupo variado de
enzimas capaces de hidrolizar los carbapenemes
y que confieren, en la mayoría de las ocasiones,
resistencia a los antimicrobianos.
Pertenecen a 3 clases diferentes:
1) Clase A, principalmente enzimas del tipo KPC
2) Clase B o metalo- B-lactamasas (MBLs) y
3) Clase D, principalmente OXA- 48
CARBAPENEMASAS
Son ß-lactamasas capaces de hidrolizar todos los
antibióticos ß-lactámicos incluyendo carbapenems
como imipenem, meropenem y ertapenem. Se las
puede dividir en propias de especie y adquiridas
(potencialmente transferibles).
CARBAPENEMASAS
Las carbapenemasas han sido principalmente aisladas
en la familia Enterobacteriaceae, P. aeruginosa y A.
baumannii. Dentro de las enterobacterias, estas
enzimas se aíslan principalmente en K. pneumoniae y
en menor medida en E. coli y otras especies, con una
prevalencia más alta en el sur de Europa y Asia que en
otras partes del mundo
MÉTODO DE DETECCIÓN DE
CARBAPENEMASAS
En la actualidad no existe estandarización sobre
las técnicas más eficaces de detección y
caracterización preliminar de carbapenemasas
potencialmente presentes en las diferentes
especies; la detección de la presencia de los
genes codificantes es el método confirmatorio.
MÉTODO CON EDTA
Interpretación: Resultado positivo cuando se observa una sinergia entre los discos de
carbapenémicos y el disco de EDTA, lo que es interpretado como probable presencia de
carbapenemasa tipo MBL.
MÉTODO UTILIZANDO EL ÁCIDO
BORÓNICO
MÉTODO UTILIZANDO EL ÁCIDO
BORÓNICO
