UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE QUIMICA
CURSO: QUÍMICA ANALÍTICA – TEORIA
TAREA 16
Título: RESUMEN DE VIDEOS DE APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA
Grupo de teoría: E
Integrante: Shande Rosa Llanco Huaman 20210698
Especialidad: Ingeniería Ambiental
Horario (día y hora): miércoles de 8-11am
Apellidos y nombres del profesor de teoría: Juan Carlos Palma
1. DETERMINACIÓN DE CURCUMINA. POR HPLC.
La cúrcuma, es un pigmento picante que se extrae de la raíz de la planta Curcumae Longae,
tiene un intenso color por eso se usa de un aditivo alimentario, además tiene potencial
biomédico ya que juega un papel importante en enfermedades de cáncer, Alzheimer, etc.
Desde el punto de vista químico, La cúrcuma contiene tres compuestos polifenólicos
conocidos como curcuminoides: curcumina, desmetoxicurcumina y bisdesmetoxicurcumina
Fórmula química:
Para esta determinación se debe separar e identificar los tres compuestos curcuminoides
dentro de la cúrcuma comercial mediante la técnica de cromatografía líquida de alta
resolución con detector de fluorescencia (HPLC - FD), para luego cuantificarlas en
diferentes muestras de cúrcuma, mostaza y curry, utilizando el método del patrón externo.
La técnica de cromatografía líquida es una técnica de separación, en ella la fase móvil que
es el líquido (ácido acetonitrilo y ácido acético al 2%) estará contenida en un recipiente, se
va a inyectar la muestra y será arrastrada a través de una fase estacionario por una columna
en la cual mediante los mecanismo de reparto, adsorción, cambio iónico y afinidad se va a
producir la separación de los analito y será registrado por un detector que es un sistema de
espectrofluorímetro y luego ser pasado a un sistema de registro
Para que la eficacia sea apropiada y la fase móvil no demore se usa de una bomba presión a
100 - 200 atm
Se usará una columna de octadecilsilano C18 lo que lo hará apolar mientras que la fase
movió será polar, los analito avanzaran más rápido mientras mayor sea su polaridad
La resolución (Rs) es igual al doble de la diferencia de distancias de dos picos (tiempos de
retención) dividido entre las anchuras de los picos, se usa cuando los pucos no están bien
resueltos para luego cuantificar el pico de la curcumina
METODOLOGÍA:
- Calibrado: A partir de una disolución patrón de mezcla de curcuminoides pero conocemos
la concentración de la curcumina (25mg/L), se va a preparar por disolución con acetonitrilo
una serie de disoluciones de concentraciones entre 0.5 mg/L y 2.5 mg/L en matraces de 10
ml, donde:
El calibrado se hizo a partir de un patrón puro de curcumina
- Preparación de la muestra: la muestra se presenta en forma sólida
a) Se pesa 30 mg de cúrcuma, 30 mg de curry y 2.5 gr de mostaza y se les añaden 10 ml de
acetonitrilo
b) Se sumerge en un baño de ultrasonido durante 15 min para extraer los analitos
c) Se centrífuga durante 10 min a 4500 r.p.m. a temperatura ambiente
d) Se recogen 5 ml del sobrenadante
e) Se filtran a través de un filtro de nylon de 0.45 um y se llevan al cromatógrafo
nota: para el caso de la cúrcuma se hace una dilución de 1/10)
- Hacer su curva de calibración entre área y la concentración
2. DETERMINACIÓN DE TOXINAS EN VINO POR HPLC CON DETECCIÓN
FLUORIMÉTRICA
Reactivos:
- Acetonitrilo, ácido acético y metanol
- Patrón de OTA de 1ug/ml en metanol (a preparar)
- Muestra de vino contaminada
- Patrón de OTA (ocratoxina A) de 25 ug/ml en metanol (ya preparada)
- Muestra de vino no contaminada
1. Preparación de la fase móvil:
Se va a tomar 1 ml de ácido acético glacial se introduce a una probeta y se va a completar
hasta los 500 ml con agua, luego se filtrará a vacío a través de una membrana de nylon de
0.45 um y se transfiere a una fiola aforada de un litro para luego completar su volumen con
acetonitrilo, finalmente se va a desgasificar por 10 min mediante un baño de ultrasonido
2. Construcción de la curva de calibración:
se partirá de una disolución de 1 ug de oxitrocina A por ml preparada previamente. a partir
de esta disolución se añadirán volúmenes crecientes del patrón y obtener una curva de
calibrado lineal, finalmente se empezará a enrasar las disoluciones con metanol
3. Preparación de las muestras
Se prepara tres muestras aditivadas tomando tres alícuotas de vino que se introducirá en tres
fiolas de 10 ml, luego se añadieran de 0, 40 y 60 uL de una disolución con 1ug/ml de
ocratoxina A y luego completar el volumen con agua
Se prepara muestras de vino contaminado, tomando 5 ml de muestra a un aforado de 10 ml
y se enrasa con agua
4. Extracción en fase sólida (SPE)
5. Inyección en HPLC
Se procede a la inyección delos patrones y muestras, se tomará aproximadamente 1/2 ml en
la jeringa unido a un filtro y se pasara al inyector para llenar el bucle
conclusión se obtuvo el cromatograma de una muestra contaminada observándose el pico
de la ocratoxina A sobre los 3.9 m
3. DETERMINACIÓN DE QUININA POR HPLC
La técnica óptica se fundamenta en la interacción entre la radiación electromagnética (REM) y la
materia, donde dicha radiación puede presentarse en formas energéticas y no energéticas. La
fluorescencia se caracteriza por tener una energía inferior a la radiación absorbida, lo que resulta en
una longitud de onda mayor.
FUNDAMENTO:
COMPONENTES DEL EQUIPO:
- Monocromador de excitación: para seleccionarla longitud de onda con el cual se excitará las
moléculas
- Superficie absorbente: donde las moléculas se convierten en fuente de radiación emitiendo en
diferentes direcciones
- Monocromador de emisión: Se registra la radiación emitida perpendicular a la radiación incidente
- Detector: donde señal eléctrica de la fluorescencia lo convertimos a corriente eléctrica
- Medidor: donde se registra los datos
METODOLOGIA:
1) Obtener los espectros de excitación y emisión: sabiendo las longitudes de onda óptimas de
excitación y emisión ; para obtener la longitud de emisión se coloca la muestra seleccionando una
longitud de onda al azar entre los 400 nm y 600 nm y se varia la longitud de onda de excitación
registrando la intensidad de fluorescencia esto nos va a generar un espectro de excitación dándonos
una longitud de onda óptima, luego variamos la longitud de onda de emisión registrando la
intensidad de fluorescencia lo que nos genera el espectro de emisión dándonos una longitud de onda
óptima
2) Obtener la curva de calibración: Preparamos las soluciones patrones de quinina en ppm según lo
indicado, haciendo una gráfica de la intensidad de fluorescencia frente a las concentraciones
estándares dela quinina, dándonos una línea recta
3) Preparación de la muestra (agua tónica): Primero se debe desgasificar la muestra poniéndolo en
baño de ultrasonido o por agitación. Segundo se debe diluir la muestra con ácido sulfúrico (0.05M)
ya que el contenido de quinina (50 - 100 ppm) en la muestra es superior a las concentraciones
estándares dadas anteriormente
4) Método de Adiciones patrón: Otra forma de operación para evitar efecto de matriz; se prepara
una serie de disoluciones en donde se coloca la misma cantidad de muestra diluida poniendo los
reactivos correspondientes y las cantidades crecientes de la disolución patrón luego enrasándolo al
volumen indicado de la fiola y lo mismo para la prueba en blanco solo que sin la muestra; luego se
hace una curva de calibración generando una línea recta
La extrapolación de la recta de la muestra con respecto a la recta de la muestra en blanco
correspondería al volumen equivalente que se necesitara para los cálculos
CALCULOS:
4. DETERMINACIÓN DE GRASA POR GC –FID
a) EXTRACCIÓN DE SOXHLET
Tomar 3 gr de muestra alimentaria (papitas fritas) y se coloca en un cartucho comercial o en un
papel filtro que sea permeable al disolvente (éter) en una balanza analítica, luego colocarla en la
cámara de extracción de Soxhlet, el disolvente se coloca en el matraz de fondo plano y el
refrigerante. Se une todo para proceder a la extracción que comienza cuando el disolvente alcanza
su punto de ebullición se produce una destilación del éter limpio y llega al refrigerante
condensándolo para luego caer en gotas sobre la muestra y se produce una lixiviación, cuando la
cámara central de destilación alcanza su volumen máximo por efecto del sifón todo el disolvente
junto con la grasa será llevada al balón. Este proceso se repite según el tipo de alimento.
b) DESTILACIÓN
Este proceso nos va a servir para eliminar los excedentes de disolvente que pudo quedar en la
muestra y ahora para asegurarnos de eliminar las ultimas porciones de excedentes se lleva el
matraz con la muestra a la estufa a 100C°, luego se enfría a temperatura ambiente en un
desecador para luego pesarlo. Para pesar la cantidad de grasa que contenía la muestra, se resta el
peso del matraz con la grasa con sola el peso del matraz
PMATRAZ + GRASA - PMATRAZ = PGRASA
c) PREPARACIÓN DE LOS ESTERES METILICOS
Obtener 0.3gr de muestra de grasa que se obtuvo de la destilación, se le añade 6ml de metilato de
sodio (CH3ONa) y se calienta a reflujo durante 15 min hasta obtener una solución homogénea,
luego se le añade trifloruro de boro (BF3) en metanol para provocar el proceso de metilación, se
calienta durante 10 min y luego se enfría.
Pasamos a un matraz de cuello largo recogiendo las ultimas porciones con 6ml de hexano y
agregando cloruro de sodio saturado hasta situar el hexano al cuello del matraz para extraer los
esteres metílicos de los ácidos grasos limpios para pasar al siguiente paso.
d) CROMATOGRAFIA DE GASES
Es una tecnica de separación donde los analitos son
arrastrados por una fase móvil (gas) a través de una
fase estacionaria que va a estar retenida en una
columna de horno con suficiente temperatura para
volatizar los analitos donde se producen diferentes
procesos que provocan la separación de los analitos,
luego de ser separados pasa por un detector de
ionización de llama para verificar cuando un analito
abandona la columna pasa por una pirolisis en llama
donde se provocan iones para luego ser registrados por
una corriente donde el pico máximo determina la
concentración del analito
e) CONCLUSIONES
A través de los resultados obtenidos de la cromatografía se obtuvieron los porcentajes y el tipo de
ácidos graso en la muestra alimentaria de papitas fritas obteniendo los porcentajes más altos de:
40.54% palmítico, 42.13% oleico y 11.23% linoleico. Concluyendo que por los tipos de ácidos
grasos obtenidos hace referencia que las papitas fritas fueron freídas por el aceite de palma.
