UNIVERCIDAD NACIONAL

AUTONOMA DE MÉXICO

COLEGIO DE CIENCIAS Y
HUMANIDADES PLANTEL SUR

TECNOLOGIA DEL
ADN
RECOMBINANTE
Nombre del profesor: Jorge Shizuru Ledesma

Nombre del alumno: Tapia Reyes Katia

Grupo: 412B
Fecha: 9 de febrero 2023
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Desde de comienzos de la década de 1970 se han desarrollado técnicas de ingeniería genética que
permiten analizar y manipular el ADN, este tipo de ingeniería permite manipular la información
genética de un organismo y en consecuencia los productos de su expresión genética, todo este tipo
de procesos ha extendido su influencia fuera del ámbito de los laboratorios de investigación por ello
hoy en día influye sobre nuestra vida en forma cotidiana.
Nuestra época es una época muy interesante, está llena de descubrimientos tanto científicos como
tecnológicos, es por ello qué es muy importante estar atentos a los nuevos descubrimientos que se
producen. El desarrollo de la biotecnología moderna que existe hoy en día es impulsado por un
fuerte incentivo económico, lo que ocasiona que la ingeniería genética sea presentada como una
clave para resolver algunos de los problemas que requieren urgente solución, como por ejemplo, el
cáncer y el sida, pero no sólo para resolver enfermedades sino también para tratar el incremento de
población junto con la disminución de los espacios destinados a la agricultura o bien el aumento de
los desechos tóxicos por parte de las industrias, entre muchos otros.
A pesar de que la ingeniería genética aporta demasiadas herramientas que nos brindan soluciones
para enfrentar aspectos vinculados a estos problemas, también nos pone en aprietos ya que se
introducen problemas nuevos en ámbitos técnicos y éticos, que deben ser considerados por el
conjunto de la sociedad.
Como ya antes se mencionó, desde hace ya varias décadas se han venido desarrollando técnicas de
ingeniería genética para la manipulación y el análisis del ADN, se retiraron los procesos en los
cuales las células procesan, añaden,
eliminan y transfieren información genética,
por su parte los biólogos moleculares
desarrollaron sus propias técnicas de
manipulación genética; este conjunto de
técnicas es conocida como tecnología del
ADN recombinante, esto permitió investigar
algunos aspectos de la estructura y la
función de los genes, mas en concreto de
los genes eucariontes a los que
anteriormente no se tenia acceso por otros
métodos, pero no solo eso, también facilito
una nueva compresión de la genética
humana, ya que al ser una tecnología joven
permite realizar un diagnóstico preciso de
diversas enfermedades hereditarias, lo que da la posibilidad de que en un futuro esta tecnología
pueda contribuir a su tratamiento.
A continuación, hablaremos sobre las herramientas que se utilizan en esta técnica.

LAS HERRAMIENTAS MOLECULARES

 ENCIMAS
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Todo tipo de organismo contiene enzimas que copian, pegan, corrigen, cortan, degradan y
modifican las moléculas de ADN de maneras diversas, gracias a las enzimas cada célula puede
realizar sus funciones esenciales como replicar, reparar y expresar la información genética.

Los biólogos utilizan las mismas herramientas que utiliza la célula para manipular el material
genético, estoy conlleva aislar, copiar y transferir información genética de un organismo a otro.
En cuanto descubrieron las enzimas que participan en estos procesos, los investigadores las
aislaron y las caracterizaron para utilizarlas en el laboratorio. En la actualidad, los biólogos
moleculares cuentan con una batería de enzimas (polimerasas, enzimas de restricción, etc.) que
les permiten manipular los ácidos nucleicos con gran versatilidad.

o Enzimas de restricción

El descubrimiento de las enzimas de restricción fue fundamental desarrollo en el desarrollo

de tecnología de ADN recombinante. En este momento, cada uno una gran variedad de
diferentes tipos de enzimas de restricción uno con sus propias características, sigue
siendo de fácil acceso para los
estudiosos.

Por ejemplo, una enzima de

restricción exitosa como HindIII es
capaz de buscar un segmento de
ADN llamado sitio de restricción
Teclea 5´–AAGCTT–3´ y una vez
que lo encuentra lo trunca. Un lugar
de restricción es una cadena de
ADN que tiene el sitio para ser removido o cortado por una enzima de restricción
específica. La secuencia es 5´-GAATT C– 3´ cortado por otra enzima de restricción
conocida como EcoRI. Generalmente, los nombres de las enzimas de restricción se
derivan de los nombres de las bacterias en las que se alojaron originalmente. También lo
son HindIII y EcoRI derivado de Hemophilus influenzae o E. coli.

¿Por qué las bacterias producen estas enzimas? Durante la infección, un bacteriófago
inyecta su ADN en la célula bacteriana. La bacteria se puede defender a sí misma si tiene
enzimas de restricción que ataquen al ADN del bacteriófago. La célula bacteriana cuida
que su propio ADN no sufra algún daño, modificándolo después de la replicación. Para
ello, una enzima agrega un grupo metilo a una o más bases en cada sitio de restricción de
tal forma que la enzima de restricción no pueda actuar en el ADN bacteriano.

Las enzimas de restricción son una herramienta que permite a los científicos cortar, de
manera controlada, el ADN cromosómico en fragmentos más cortos. Muchas de las
enzimas de restricción empleadas para estudios de ADN recombinante cortan secuencias
palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones), lo que significa que la secuencia de
bases de una cadena se lee lo mismo que su cadena complementaria en la dirección 5´3
´.
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Así, en el ejemplo de la HindIII, ambas cadenas leen 5´–AAGCTT –3´; que, como una
molécula de doble cadena se diagrama como sigue:
5´--AAGCTT –-3´
3´--TT CGAA—5´

Al cortar ambas cadenas del ADN, pero en forma escalonada, esas enzimas producen
fragmentos con idénticos extremos complementarios de cadena simple:
5´--A AGCTT –3´
3´--TT CGA A—5´

Esos extremos se llaman extremos pegajosos porque se emparejan mediante enlaces de

hidrógeno con los extremos de cadenas complementarias, de otras moléculas de ADN que
han sido cortadas con la misma enzima. Una vez que los extremos pegajosos de las dos
moléculas se han unido de esta manera, entonces se tratan con ADN ligasa, una enzima
que une covalentemente a los dos fragmentos de ADN para formar una molécula de ADN
recombinante estable.

o Enzimas que agregan nucleótidos: las polimerasas

Estas enzimas catalizan la polimerización de nucleótidos usando un fragmento de DNA

como molde. Las polimerasas son las herramientas que permiten sintetizar in vitro nuevas
moléculas de DNA y de RNA, rellenar secuencias faltantes en el DNA de doble cadena o
agregar nucleótidos en el extremo de ácidos nucleicos. Existen varios tipos de
polimerasas; las que se usan con más frecuencia con fines biotecnológicos son las DNA
polimerasas de E. coli, las del fago T7 y la de la bacteria Thermus aquaticus que se utiliza
en la técnica de PCR. Todas ellas sintetizan cadenas de DNA en dirección 5’ a 3’ a partir
de una región de DNA del molde. Con estas enzimas también se pueden obtener
moléculas de DNA marcadas radiactivamente. Sólo hace falta incubarlas en un medio con
un molde de DNA y nucleótidos radiactivos.

o La transcriptasa inversa

Otro método para obtener fragmentos específicos de DNA se basa en la utilización de

retrovirus, que tienen RNA como material genético. En estos virus, el RNA genómico actúa
primero como molde para la síntesis de una cadena complementaria de DNA. Esta síntesis
es catalizada por la transcriptasa inversa, una DNA polimerasa viral que depende del
RNA. La transcriptasa inversa luego sintetiza una segunda cadena, complementaria a la
primera cadena de DNA sintetizada, que representa la secuencia del RNA molde original.
El resultado es una molécula de DNA de cadena doble que se inserta en el genoma de la
célula hospedadora. A partir de este DNA integrado se transcriben, subsiguientemente,
tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA que participa en la síntesis de proteínas
virales.
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La transcriptasa inversa de los retrovirus es una herramienta valiosa para la tecnología del
DNA recombinante, ya que permite sintetizar DNA de cadena doble usando como molde
cualquier molécula de RNA obtenida de una célula.
Como vimos, en eucariontes, cada molécula de mRNA transporta la información contenida
en un único gen. Las moléculas de DNA sintetizadas por la transcriptasa inversa a partir de
una molécula de RNA se conocen como DNA complementario o cDNA. Es interesante
señalar que, como la transcriptasa inversa usa como molde al mRNA ya maduro, el cDNA
resultante carecerá de intrones y, en consecuencia, en eucariontes, nunca será igual al
DNA genómico, con la sola excepción de aquellos genes que no poseen intrones.

Una limitación del uso de la transcriptasa inversa para aislar un gene que los mRNA
disponibles en una célula en un momento dado sólo representa los genes que se están
expresando en esa célula y en ese momento. Por lo tanto, esa población de moléculas no
representa la totalidad del genoma. Sin embargo, si queremos aislar cierto gen y sabemos
que éste se expresa de manera preponderante en un tipo de célula, la limitación se
transforma en una ventaja porque, en esa célula, una gran proporción de los mRNA
transcritos y de los cDNA generados por la transcriptasa inversa corresponderá al gen
buscado. Por ejemplo, para aislar el gen de la hemoglobina se utiliza como molde mRNA
extraído de los glóbulos rojos inmaduros que sintetizan hemoglobina en forma activa.

o Otras enzimas

Existen muchas otras enzimas que intervienen en el metabolismo de los ácidos nucleicos y
que son aprovechadas en los laboratorios de Ingeniería genética. Las DNA ligasas, como
la obtenida de las bacterias infectadas por el fago T₁, ligan fragmentos de DNA y resultan
fundamentales para la recombinación genética in vitro, ya que permiten unir secuencias de
DNA de distinto origen. Se pueden así diseñar y armar estructuras genéticas a partir de
fragmentos de DNA que se seleccionan según los requerimientos de la investigación.

Para modificar moléculas de DNA en el laboratorio es necesario contar con ciertos materiales
básicos. El DNA (DNA de origen), los nucleótidos y los oligonucleótidos (de oligo, “pocos”)
constituyen los sustratos utilizados con más frecuencia por las enzimas que intervienen en estos
procesos.
Un material clave para la manipulación in vitro del material genético son los oligonucleótidos
sintéticos. Estos fragmentos de DNA de cadena simple, en general de hasta 50 nucleótidos, se
pueden sintetizar químicamente en el laboratorio por unión sucesiva de nucleótidos en el orden
deseado por el investigador. Los oligonucleótidos sintéticos permiten, por ejemplo, sintetizar un gen
sintético o partes de un gen y también se usan como cebadores para la síntesis o la secuenciación
de fragmentos definidos de DNA.

Muchas veces se necesita aumentar la cantidad

de DNA con la que se trabaja, ya sea para
analizarlo o para estudiar el efecto de su
introducción en una célula. Para “amplificar” una
secuencia de DNA dada, ésta puede insertarse en un vector. Los vectores también son moléculas
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de DNA cuyas características les permiten que la secuencia de DNA de interés se mantenga y se
replique en las células Hospedadoras que reciben y procesan la información genética introducida.
Con estas materias primas, las enzimas específicas y la aplicación de las técnicas adecuadas, los
biólogos moleculares pueden aislar, analizar y manipular la información genética de manera casi
ilimitada.

 Células que se utilizan como hospedadores

De la multitud de células hospedadoras disponibles para la

manipulación genética, sin duda la más utilizada es la bacteria E.
coli. La elección de un hospedador depende del tipo de análisis o
producto que se desee obtener y de la facilidad de manipularlo y
mantenerlo en el laboratorio. E. coli es particularmente “popular”, no
sólo porque se ha estudiado en profundidad, sino porque su cultivo es muy sencillo y de bajo costo.
Se han desarrollado cepas de E. coli que aceptan secuencias de DNA exógeno, así como los
productos de esas secuencias. Muchos otros organismos son utilizados como hospedadores, entre
ellos, y por nombrar sólo unos pocos, se encuentran la bacteria Bacillus subtilis, la levadura
Saccharomyces cerevisiae y las células CHO obtenidas de ovario de hámsters chinos.

 Vectores para el transporte de secuencias de DNA

Los vectores, también llamados transportadores, permiten introducir el DNA de interés en las células
hospedadoras donde se realiza la replicación. Estos vectores deben cumplir con ciertas
características:

 Poseer un origen de replicación que le permita al DNA replicarse en la célula hospedadora.

 Ser de tamaño pequeño para facilitar su aislamiento.
 Contar con sitios únicos de clonado que permitan que una enzima de restricción actúe
cortando en un solo lugar específico. De esta manera, cuando se inserta un fragmento de
DNA, se vuelve a armar el vector, ahora con la nueva secuencia insertada.
 Tener marcadores de selección que permitan verificar su presencia en las células donde
se haya introducido. Por lo general, el marcador de selección es un gen que codifica una
proteína que le confiere a la bacteria resistencia a un antibiótico. Si se colocan las células
en un medio que contiene ese antibiótico, sólo las que han incorporado en su DNA los
genes de resistencia introducidos sobrevivirán a la acción del antibiótico.

Los vectores utilizados con más frecuencia son los DNA en forma de plásmidos y los virales.

o Vectores para procariontes

Los plásmidos como vectores poco después del descubrimiento de las enzimas de
restricción, en 1973, el bioquímico estadounidense Stanley Cohen en la Universidad de
California y Herbert Boyer de la Universidad de Stanford, Estados Unidos, aislaron en E. coli
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una pequeña molécula de DNA extra cromosómico, a la que designaron PSC101 (nombre
que incluye las iniciales de su descubridor). El plásmido pSC101 contiene un Origen de
replicación para E. coli, un marcador de selección (un gen de resistencia al antibiótico
tetraciclina) y un sitio único de reconocimiento para la enzima EcoRI. Cuando la enzima
realiza el corte, el plásmido se abre y pasa a tener una estructura lineal. A partir de entonces,
y mediante diversas manipulaciones genéticas, se obtuvieron plásmidos más versátiles que
cuentan con ventajas adicionales. Entre otras:

 Tienen un tamaño pequeño, lo cual permite insertar fragmentos de DNA más grandes.
Cuanto mayor es el tamaño del plásmido, más difícil resulta su introducción dentro de
la bacteria. Por otro lado, plásmidos más pequeños dan por resultado un número
mayor de copias que plásmidos más grandes.
 Generan, al replicarse, un número mayor de copias por célula, lo cual aporta una
cantidad mayor de DNA para analizar el fragmento insertado o una cantidad mayor de
péptido codificado por ese gen, en el caso de que ese gen se exprese.
 Tienen múltiples sitios de clonado, es decir, secuencias que en un corto tramo poseen
múltiples sitios únicos de corte, cada uno para una enzima de restricción diferente.
Esto permite insertar distintos fragmentos de DNA.
 Llevan genes con funciones indicadoras, es decir, genes que producen un cambio de
fenotipo cuando un fragmento de DNA exógeno se inserta en su sitio múltiple de
clonado.

De esta manera, una vez introducido el plásmido en un cultivo de células, se identifica,

mediante el marcador de selección, a las células que incorporaron ese plásmido. Los genes
con funciones indicadores reportadoras permitirán reconocer aquellas bacterias que, además
del plásmido, hayan incorporado el fragmento de DNA exógeno que se quería insertar. La
inserción de este fragmento interrumpe un gen que provoca un fenotipo identificable con
facilidad, por ejemplo, cambia el color de las colonias de bacterias ante la presencia de un
sustrato.

o Los bacteriófagos lambda y los cósmidos como vectores

Cuanto más grande es un plásmido, más tiempo necesita para replicarse. Por esa razón,
aunque los plásmidos toleran la incorporación de secuencias cortas de DNA extraño, a lo
largo de las generaciones, tienden a eliminar los segmentos más largos. Los plásmidos son
vectores confiables sólo para segmentos de DNA de hasta 10.000 pares de bases de longitud.
Para clonar segmentos de DNA más grandes, de hasta 20.000 pare bases, se usan genomas
de bacteriófagos lambda como vectores. El proceso de clonado molecular involucra una serie
de pasos (obtener el DNA que se ha de clonar, unirlo a un vector, introducirlo en una Célula,
aislar las células, seleccionar el clon celular y luego cultivar el Clon) para obtener una
población de células idénticas que posean muchas copias idénticas del fragmento clonado.
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Cuando el DNA de doble cadena de virus como

el lambda se empaqueta en su cubierta
proteica, tiene forma lineal y sus extremos
están libres. Pero cuando ingresa en la célula
hospedadora, el DNA forma un círculo debido a
que en el extremo 5’ de las cadenas
complementarias de DNA sobresale una
cadena simple de 12 nucleótidos, un extremo
pegajoso. Esa secuencia cohesiva de
nucleótidos se conoce como región COS.
Cuando el DNA circular del bacteriófago lambda
se replica, forma numerosas copias unidas en
una única molécula larga. Una enzima luego
escinde la molécula en los sitios COS y
empaqueta el DNA de cada bacteriófago
lambda en las cubiertas proteicas previamente
sintetizadas.
El DNA de lambda se puede integrar al cromosoma de E. coli, ya que ambos DNA contienen
una secuencia idéntica de 15 nucleótidos. Una enzima codificada por un gen viral, la
integrasa lambda, reconoce ambas secuencias, reúne las dos hélices circulares de DNA e
inicia las reacciones de corte y sellado. Así, el DNA del bacteriófago se integra al cromosoma
bacteriano. Cuando el lambda va a comenzar un ciclo lítico, una enzima propia lo libera del
cromosoma bacteriano mediante un corte escalonado que deja extremos “pegajosos”. Estos
extremos rápidamente se reúnen y forman una vez más un
DNA circular que luego se empaqueta en el virus en la forma
lineal.
Ciertas cepas de lambda tienen sitios de reconocimiento para
enzimas de restricción que permiten eliminar la zona central del
DNA del Fago. Esta región contiene genes que intervienen en
la integración del DNA del lambda al cromosoma bacteriano y
no son necesarios para infectar a la célula ni para multiplicarse
dentro de ella. Por lo tanto, un segmento grande del genoma
de lambda puede ser reemplazado por el ADN foráneo que se
quiere incorporar. Si el DNA foráneo tiene una longitud similar
a la del DNA eliminado -alrededor de 20.000 pares de bases-,
se multiplicará junto con el genoma viral a medida que el virus
transite sus ciclos habituales de infección lítica.
Para clonar segmentos aún mayores de DNA, los biólogos han
empleado otra de las propiedades no habituales de lambda -en
este caso, sus extremos cohesivos- y han combinado esta
particularidad con las propiedades de los plásmidos. Todo lo
que se necesita para que ocurra el empaquetamiento son dos regiones cos separadas por
35.000 a 50.000 pares de bases, que es la distancia que separa estas secuencias en el
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genoma del fago lambda. Sabiendo esto, los investigadores desarrollaron vectores llamados
cósmidos que se utilizan para clonar segmentos de DNA de 35.000 a 50.000 pares de bases.
Los cósmidos contienen un origen de replicación de plásmido, un gen de resistencia a
antibiótico y las secuencias cos en sus extremos, lo cual permite la inserción de fragmentos de
DNA de gran tamaño. estos vectores son empaquetados convenientemente por la enzima viral
en un sistema in vitro, en el cual están presentes las cubiertas proteicas de lambda vacías,
que les permitirán entrar en la célula bacteriana. una vez en el interior, los cósmidos, con el
fragmento de DNA insertado, a semejanza del cromosoma lambda normal, adoptan una forma
circular y comienzan a multiplicarse como si fueran plásmidos.

o Vectores para eucariontes

Si bien en la mayoría de los experimentos

se usa E. coli como hospedador, en
ocasiones es necesario utilizar organismos
eucariontes tales como levaduras, otros
hongos, plantas o mamíferos, ya que estos
organismos, o sus células en cultivo,
procesan el material genético de una
manera diferente de las bacterias (por
ejemplo, realizan la maduración del RNA
antes de la traducción o glucosilan las
proteínas sintetizadas). Pero las células
eucariontes requieren otro tipo de vectores
que contengan las señales de origen de
replicación, regulación, selección y
marcadoras que ellas pueden reconocer.

Para trabajar con levaduras pueden

utilizarse plásmidos propios de estos
organismos. Los plásmidos utilizados
habitualmente llevan un marcador genético
particular, por ejemplo, un gen que codifica
una enzima necesaria para la síntesis de un nutriente esencial. si se cultivan
levaduras incapaces de sintetizar ese nutriente en un medio mínimo en el que el nutriente está
ausente, sólo crecerán aquellas levaduras que reciban el vector.

Existen plásmidos que permiten aprovechar las ventajas de ambos tipos de organismos,
procariontes y eucariontes. se trata de los plásmidos shuttle. estos vectores tienen secuencias
de origen de replicación y marcadoras tanto para bacterias como para levaduras, por lo que
permiten realizar el clonado y la selección de la secuencia en bacterias y luego transferirlas a
levaduras para obtener el producto final deseado.
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Cuando se trabaja en plantas, los vectores más utilizados para introducir secuencias de DNA
son los provenientes del virus del mosaico de tabaco o del plásmido ti de agrobacterium
tumefaciens. Finalmente, para trabajar con células de mamíferos se utilizan como vectores
DNA viral o plásmidos con secuencias derivadas de DNA viral. DNA virales como los de sv40,
retrovirus, adenovirus y papilomavirus son los escogidos más a menudo.

o Cromosomas artificiales
Los cromosomas artificiales permiten la inserción de fragmentos mayores de 100 kilobases.
Estos vectores son de particular utilidad en los procedimientos de mapeo de cromosomas
debido a que el uso de fragmentos grandes de DNA como sondas permite obtener buenas
señales por fluorescencia. Al mismo tiempo, esta técnica es útil cuando se desea secuenciar
genomas completos, pues se facilita el empalme de fragmentos con secuencias superpuestas.
Los cromosomas artificiales de levaduras, YAC (del inglés, yeast artificial chromosomes),
permiten Clonar en estos organismos fragmentos mayores de 1.000 kilobases. En su
estructura poseen un centrómero, un telómero y una secuencia que permite su replicación,
además de un sitio de clonado múltiple y marcadores de selección metabólica. estos
cromosomas se replican junto con el resto de los cromosomas de la levadura cada vez que
ésta entra en mitosis.

Por otra parte, los PAC (P1-derived artificial chromosomes) son cromosomas artificiales
derivados de un bacteriófago de e. coli (el bacterófago p1). Estos cromosomas permiten la
incorporación de secuencias de DNA de alrededor de 200 kilobases y se replican en forma
independiente en este tipo de bacterias, comportándose como plásmidos de copia única. Se
han elaborado otros cromosomas artificiales, como por ejemplo los BAC (bacterial artificial
chromosomes), que actúan como el factor F de E. coli, transfiriéndose desde una bacteria F+
A una bacteria F mediante el proceso de conjugación. Estos cromosomas, que se han
utilizado para el secuenciamiento del genoma humano, permiten transportar Secuencias de
unas 300 kilobases.

TECNICAS PARA MANIPULAR DNA

o Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción de síntesis de DNA de síntesis

de DNA in vitro en la que una sección específica de DNA se replica una y otra vez para
amplificar el número de copias de esa secuencia. Es una técnica para generar muchas copias
idénticas de una sección concreta de DNA.

Aunque la PCR es mucho más rápida y tecnológicamente más simple que clonar genes en
una biblioteca de DNA, Si entiendes que...

 La base de la tecnología del DNA recombinante es cortar el DNA en fragmentos con

una endonucleasa de restricción, juntar secuencias específicas mediante el
emparejamiento de bases complementarias de los extremos adhesivos y la acción de la
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DNA ligasa, y finalmente insertar los genes recombinantes resultantes en una bacteria
(o levadura) de modo que los genes se expresen. Deberías ser capaz de...

1. Hacer un diagrama que muestre cómo ciertas endonucleasas de restricción crean

fragmentos de DNA con extremos cohesivos.
2. Hacer un diagrama que muestre cómo se puede usar la DNA ligasa para cortar y
empalmar secuencias con extremos cohesivos en un plásmido o en otro tipo de
secuencia de DNA.
3. Explicar cómo se construye una biblioteca de cDNA.
4. Hacer un diagrama que muestre cómo se sondea una biblioteca de DNA con una
secuencia conocida.

Estructura y expresión génica un problema: la PCR solo es posible cuando un investigado ya

tiene cierta información sobre las secuencias de DNA cercanas al gen en cuestión. La
información sobre las secuencias es necesaria porque
para hacer una reacción en cadena de la polimerasa,
hay que empezar con fragmentos cortos de DNA de
hebra simple que se emparejen con secuencias en uno
de los extremos del gen en cuestión. Estos fragmentos
cortos funcionan como cebadores para la reacción de
síntesis.

Como muestra la Figura 19.6a, las secuencias del

cebador deben ser complementarias a las bases en uno
de los extremos del gen en cuestión. Un cebador es complementario a una secuencia en una
hebra hacia arriba del DNA diana (la secuencia de interés); el otro cebador es complementario
a una secuencia en la otra hebra, hacia abajo del DNA diana. Si la molécula de DNA diana es
de hebra simple, entonces los cebadores se unirán o reasociarán a sus secuencias
complementarias como muestra la Figura 19.6b. Quizá recuerdes que la DNA polimerasa no
puede funcionar a no ser que una secuencia se cebe de esta forma.
Una vez unidos los cebadores, la DNA polimerasa puede elongar
cada hebra en la dirección 5’ → 3’.

Como muestra el paso 1 de la Figura 19.7, un procedimiento PCR

empieza con una mezcla de reacción que contenga un aporte
abundante de los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos, copias del
DNA plantilla (es decir, una muestra de DNA que incluya el gen de
interés) y una enzima llamada polimerasa Taq. La polimerasa Taq es
una DNA polimerasa encontrada en la bacteria Thermus aquaticus,
descubierta originalmente en una fuente termal en Yellowstone
National Park, Wyoming, EE.UU. La polimerasa Taq es la enzima de
elección en la PCR porque para la técnica es necesario calentar la
mezcla de reacción, y la polimerasa Taq es estable con el calor.
Aunque la mayoría de las DNA polimerasas se destruyen a alta
temperatura, la Taq polimerasa sigue funcionando normalmente
incluso cuando la temperatura llega a 95 °C.
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Como muestra el paso 2 de la Figura 19.7, la PCR empieza cuando la mezcla de reacción se
calienta a 94 °C. A esta temperatura, el DNA plantilla de doble hebra se desnaturaliza. Esto
significa que las dos hebras de DNA se separan, formando plantillas de hebra simple. A
continuación, se deja que la mezcla de reacción se enfríe hasta los 50-60 °C. En este intervalo
de temperatura, parte de las hebras de DNA desnaturalizadas vuelven a formar dobles
hélices. Pero algunos de los cebadores se unen, o emparejan, con los fragmentos
complementarios
del DNA plantilla de hebra simple (paso 3). Este paso se llama emparejamiento del cebador. A
continuación, se calienta la mezcla a 72 °C. A esta temperatura, la polimerasa Taq sintetiza la
hebra complementaria de DNA a partir de los dNTP, empezando en el cebador. Este paso se
llama extensión (paso 4). Los cambios de temperatura necesarios en cada paso están ahora
automatizados en las máquinas de PCR.

La desnaturalización, emparejamiento del cebador y la extensión constituyen un ciclo de PCR.

Si originalmente solo había una copia de la secuencia plantilla, entonces habrá dos copias al
final del primer ciclo (véase el paso 4 de la Figura 19.7). Las dos copias presentes en el inicio
del segundo ciclo funcionan entonces como plantillas para otro ciclo de desnaturalización,
emparejamiento del cebador y extensión, y hay cuatro copias del gen diana al final del ciclo
número 2 (paso 5). A medida que el ciclo se repite, la cantidad de secuencias plantilla se
dobla cada vez (paso 6). Esto sucede porque cada segmento de DNA sintetizado de novo
sirve de plantilla para el siguiente ciclo. Empezando con una sola copia, los ciclos sucesivos
resultan en la producción de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256... copias: n ciclos generan 2n copias;
así que en solo 20 ciclos, una secuencia se puede amplificar a más de un millón de copias.
Con menos de 20 ciclos, los investigadores obtienen un número enorme de copias de la
secuencia plantilla.

o Secuenciación de DNA por el método didesoxi

Una vez que los investigadores han clonado un gen de una biblioteca de DNA o mediante
PCR, determinar la secuencia de bases del gen suele ser una de las primeras cosas que
hacen.
Conocer la secuencia de un gen es útil por varias razones:

 Se pueden analizar las diferencias de secuencias entre alelo para entender por qué
algunas versiones del gen funcionan mejor o de forma distinta a otras. El alelo de la
enfermedad de Huntington, por ejemplo, tiene una secuencia de bases distinta de los
del mismo gen que no causan la enfermedad.
 Una vez que se conoce la secuencia de un gen, se deduce directamente la secuencia
de aminoácidos de su producto con el código genético. Conocer la estructura primaria
de una proteína, a su vez, suele ser útil para deducir su función.
 Se puede comparar la secuencia de un gen con secuencias de genes que tengan la
misma función en otras especies. Estas comparaciones suelen ser interesantes. Por
ejemplo, bacterias, levaduras y humanos son tan diferentes como lo puedan ser varios
organismos; sin embargo los tres contienen genes de la DNA polimerasa con secciones
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que son casi idénticas en su secuencia de bases. Los biólogos explican este parecido
proponiendo la hipótesis de que las bacterias que habitan en el intestino, la levadura
del pan que comemos y nosotros descendemos de un ancestro común que tenía DNA
polimerasa con la misma secuencia. Los genes que son similares porque se deben a la
descendencia de un ancestro común se llaman homólogos.
 Se pueden comparar secuencias génicas para inferir lo estrechamente relacionadas
que están distintas especies. Por ejemplo, el análisis de secuencias de DNA aisladas
de huesos fósiles permitió a los investigadores determinar si nuestra especie, Homo
sapiens, se mezcló alguna vez con la especie de humanos llamada Homo
neanderthalensis.
Puesto que las secuencias son importantes, ¿cómo puede obtenerlas los biólogos? En 1975,
Frederick Sanger desarrolló el método didesoxi como una ingeniosa variante de la reacción
básica de síntesis de DNA in vitro para determinar las secuencias exactas de bases. Pero
llamarla «ingeniosa» es subestimarla. Sanger tuvo que ligar tres importantes conceptos,
resumidos en la Figura 19.9, para hacer que su estrategia
de secuenciación pudiera funcionar:
1. Sanger eligió el nombre «didesoxi» porque
el método usa monómeros llamados
didesoxirribonucleósidos trifosfato, o
ddNTP, junto con desoxirribonucleótidos
trifosfato (dNTP). Estos ddNTP son
idénticos a los dNTP del DNA, excepto en
que carecen de un grupo hidroxilo en su
carbono 3’ (Figura 19.9a). Sanger se dio
cuenta de que, si se añadía un ddNTP a
una hebra creciente de DNA, terminaría la
síntesis. ¿Por qué? Un ddNTP no tiene
grupo hidroxilo en su carbono 3’ para unirse
al carbono 5’ del siguiente monómero
dNTP. Como resultado, la polimerización
del DNA finaliza en cuanto se añade un
ddNTP. Se usan cuatro tipos de ddNTP en
el método didesoxi, nombrados según la
base que contiene: adenina (ddATP), timina
(ddTTP), citosina (ddCTP), o guanina
(ddGTP).

2. Sanger ligó esta propiedad de los ddNTP

con el segundo concepto fundamental.
Imagina, razonó, que se pudiera unir un
cebador marcado a un DNA plantilla, y que
se pudiera añadir un gran número de copias
de este DNA plantilla con un cebador marcado a una mezcla de reacción.
Sigamos imaginando que esta colección de plantillas marcadas se incubara con
una DNA polimerasa, los cuatro
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dNTP y una pequeña cantidad de ddGTP. En estas condiciones, se sintetizaría

un conjunto de distintas hebras hijas. Cada una de las hebras hijas resultantes
tendría una longitud diferente, con cada fragmento de DNA distinto terminando
con un ddGTP. Para entender por qué, considera que la DNA polimerasa
sintetizaría una hebra complementaria de cada plantilla marcada de la mezcla de
reacción.

La síntesis de cada una de estas hebras complementarias empezaría en el

mismo punto (el cebador). Como hay muchos dGTP y relativamente pocos
ddGTP en la mezcla de reacción, los dGTP suelen incorporarse enfrente de las
C de la hebra plantilla. Pero ocasionalmente, uno de los pocos ddGTP presentes
sería incorporado a la hebra creciente, enfrente de una C de la plantilla. Qué C
de la hebra plantilla se empareja con un ddGTP sería aleatorio. La adición del
ddGTP en este lugar impediría la elongación de la hebra. Como esto sucedería
en cada hebra plantilla presente, la reacción total produciría una colección de
hebras recién sintetizadas de longitud variable, correspondiente a la localización
de cada C en la hebra plantilla (Figura 19.9b). Reacciones análogas utilizando
ddTTP, ddATP y
ddCTP darían las distancias entre las A, T y G sucesivas, respectivamente.

3. Por útlimo, Sanger se dio cuenta de que cuando los fragmentos producidos por
las cuatro reacciones se alinean por tamaño, revelan la secuencia de bases del
DNA plantilla. Para ordenar los fragmentos por tamaño, los separó mediante
electroforesis en gel. Como muestra el paso 4 de la Figura 19.9, la secuencia se
puede leer entonces directamente del gen resultante.

o La transferencia de ADN, ARN y proteínas permite identificar fragmentos

específicos

Los genetistas pueden identificar fragmentos específicos de ADN que se hibridan con una
sonda de ADN complementario. Sin embargo, es imposible hibridar una sonda con fragmentos
de ADN contenidos en un gel. Por esta razón, normalmente el ADN se desnaturaliza y luego
se
transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nylon,
que recoge el ADN de manera semejante a como el
papel secante absorbe la tinta. El registro resultante,
que esencialmente es una réplica del gel, se incuba
con una sonda de ADN, que se hibrida con cualquier
fragmento de ADN complementario.

Si la sonda es radiactiva, el registro se somete a una

autorradiografía. Los puntos resultantes en la película
de rayos X corresponden a las posiciones de los
fragmentos en el gel que son complementarios a la
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sonda. Actualmente, se detectan muchas sondas mediante luminiscencia química, que se

analiza por escáneres computarizados, sin necesidad de la autorradiografía. Este método
para identificar fragmentos de ADN, separándolos mediante electroforesis en gel y después
transfiriéndolos a una membrana de nylon o nitrocelulosa, se llama una transferencia de
Southern, en honor a su inventor, Edward M. Southern de la Universidad de Edinburgo,
Escocia (FIGURA 15-9). El procedimiento que tiene amplias aplicaciones, se emplea para
diagnosticar ciertos tipos de desórdenes genéticos. Por ejemplo, en algunos casos el ADN de
un alelo mutante se detecta porque éste emigra de modo muy diferente en el gel, de como lo
hace su contraparte normal.

Se emplean técnicas de transferencia similares para estudiar ARN y proteínas. Cuando las
moléculas de ARN separadas mediante electroforesis se transfieren a una membrana y se
detectan utilizando una sonda de ácido nucleico, al resultado se llama transferencia Northern
(Northern es un juego de palabras con el apellido del investigador Southern asociado con esta
técnica). En el mismo espíritu, la expresión transferencia Western se aplica a un registro que
contiene proteínas o polipéptidos previamente separados por electroforesis en gel. (Hasta la
fecha, nadie ha inventado un tipo de registro que pudiera llamarse transferencia Eastern).

En el caso de la transferencia Western, los científicos reconocen los polipéptidos de interés

mediante moléculas de anticuerpos marcadas que los unen específicamente. Por ejemplo, la
transferencia Western se emplea como diagnóstico para detectar la presencia de proteínas
específicas del HIV-1, el virus del SIDA.

APLICACIONES EN BIOTECNOLOGIA

El término biotecnología fue creado en 1917 por un ingeniero húngaro, Karl Ereky, para describir
procesos en los que se forman productos a partir de materiales crudos con la ayuda de la actividad
metabólica de cada organismo.

El término biotecnología engloba todo tipo de producción de hoy, “bienes y servicios” por medio de
procesos que utilizan organismos, sistemas o procesos biológicos.

El uso de microorganismos para la elaboración de pan, queso o vino son ejemplos clásicos de
procesos biotecnológicos. a medida que aumentó el conocimiento biológico, la biotecnología tomó
nuevo impulso, en particular durante el siglo xx, cuando se descubrió que ciertos microorganismos
producían antibióticos. En esa época, la biotecnología aprovechaba las propiedades de distintos
organismos para obtener productos de uso humano.

Con el advenimiento de la ingeniería genética fue posible modificar las propiedades de un organismo
para adecuarlo a las necesidades de una investigación o ponerlo al servicio de un proceso
productivo. Así nació la biotecnología moderna. En la actualidad, el empleo de proteínas
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recombinantes en la industria farmacéutica es moneda corriente. También está muy extendido el uso
de microorganismos para controlar problemas de contaminación ambiental y la modificación genética
de plantas de importancia agropecuaria. Día a día se va incrementando el desarrollo de técnicas
asociadas con la producción de animales transgénicos y la terapia génica aplicada a la medicina.

 Ciertas bacterias y levaduras genéticamente modificados se emplean como “fábricas” de

proteína importantes en el campo de la medicina. Los diabéticos fueron de los primeros
beneficiados por dichos organismos. La insulina para sus inyecciones antes se extraía de
animales, aunque provocaba reacciones alérgicas en algunas personas. La insulina humana,
que no provoca reacciones alérgicas, ha sido producida por E. coli transgénica desde 1982.
Leves modificaciones del gen también han producido insulina humana de acción rápida y
liberación lenta.

Los microorganismos obtenidos por ingeniería genética también producen proteínas que se
emplean para fabricar alimentos. Por ejemplo, el queso se elabora tradicionalmente con un
extracto de estómago de becerro, que contiene la enzima quimiotripsina. La mayoría de los
fabricantes de quesos emplean actualmente quimiotripsina derivada de bacterias obtenidas
por ingeniería genética. Otros ejemplos son enzimas obtenidas por OGM que mejoran el
sabor y la transparencia de la cerveza y el jugo de frutas, hacen que el pan se descomponga
más lentamente o modifican grasas. Agrobacterium tumefaciens es una especie de bacteria
que infecta muchas plantas, como guisantes, frijoles, papas y otras cosechas importantes. Su
plásmido contiene genes que provocan la formación de tumores en las plantas infectadas; de
ahí su nombre de plásmido Ti (inductor de tumores) como vector para transferir genes
extraños o modificados a las plantas. Retiran los genes de inducción tumoral del plásmido, e
insertan los genes que desean en él. Es posible obtener plantas enteras a partir de células
vegetales que captan el plásmido modificado.
Se emplean bacterias A. tumefaciens modificadas para aportar genes a algunas plantas de
cultivo, como frijol de soya, calabaza y papa. Los investigadores también transfieren genes a
plantas mediante choques eléctricos o químicos, o disparándoles con balas recubiertas de
ADN.

o Plantas obtenidas por ingeniería genética

A medida que se expande el cultivo de plantas para satisfacer el crecimiento de la población

humana, aumenta la presión de los ecosistemas de todo el mundo. La irrigación deja residuos
minerales y salinos en el suelo. El suelo labrado se erosiona, por lo que pierde la capa
superior, que es la fértil. La lixiviación escapa hacia los ríos, y el fertilizante que contiene
ocasiona que las algas crezcan tan rápido que los peces se sofocan. Los pesticidas pueden
ser dañinos para humanos, otros animales e insectos benéficos.

La presión para producir más alimentos a un costo más bajo y con menos daño para el
entorno ha hecho que muchos granjeros comiencen a emplear plantas de cultivo
genéticamente modificadas. Algunas llevan genes que les otorgan resistencia ante
enfermedades devastadoras para las plantas. Otros ofrecen más rendimiento, como una cepa
de trigo transgénico que duplica el rendimiento respecto al trigo no modificado.
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Las cosechas de OGM, como el maíz Bt y la soya, contribuyen a que los granjeros empleen
menor cantidad de pesticidas tóxicos. Los granjeros orgánicos a menudo rocían sus cosechas
con esporas de Bt (Bacillus thuringiensis), especie bacteriana que fabrica una proteína tóxica
únicamente para larvas de insectos. Los investigadores transfirieron el gen que codifica la
proteína Bt a las plantas. Las plantas sometidas a ingeniería genética producen la proteína Bt,
pero son idénticas en otros aspectos a las no modificadas.
Las larvas de insectos mueren poco después de consumir su primer alimento de OGM (y el
único). De este modo, los granjeros emplean cantidades mucho menores de pesticidas en las
cosechas.

Las plantas transgénicas para cultivo también se desarrollan para regiones afectadas por
sequías severas, como en África. Los genes que confieren tolerancia a la sequía y resistencia
a los insectos se están transfiriendo a plantas de cultivo, como maíz, frijoles, caña de azúcar,
yuca, chícharo salvaje (Vigna unguiculata), plátano y trigo. Estas cosechas quizás ayuden a
las personas que obtienen alimentos e ingresos de la agricultura en regiones que
experimentan graves sequías a nivel mundial.

El Servicio de Inspección de Animales y Plantas (APHIS por sus siglas en inglés) de USDA
regula la introducción de OGMs al entorno. Mientras se escribía este libro la Agencian quitó
las reglamentaciones de setenta y tres plantas genéticamente modificadas, lo cual significa
que quedan aprobadas para uso no regulado en Estados Unidos. Cientos más
lo aguardan.

Las cosechas de OGM más ampliamente cultivadas incluyen maíz, sorgo, algodón, soya,
canola y alfalfa sometida a ingeniería genética para hacerla resistente al glifosfato, un
herbicida. En vez de arar la tierra para controlar las hierbas, los granjeros pueden efectuar
aspersión de sus campos con glifosfato, que elimina las hierbas, pero no las cosechas
sometidas a ingeniería genética. Sin embargo, las hierbas están adquiriendo resistencia al
glifosfato, de modo que su aspersión ya no suele matarlas en los campos de cultivo
resistentes a glifosfato. Este gen de ingeniería también ha aparecido en plantas silvestres y en
cosechas no sometidas a ingeniería genética, lo cual significa que los transgenes pueden
escapar al entorno, y que de hecho lo hacen.

La controversia que surge por el uso de estos OGM nos invita a leer acerca de las
investigaciones para formarnos una opinión propia. La alternativa es creer en los anuncios de
los medios (el término “Alimentos Frankestein”, por ejemplo), o en reportes de fuentes
posiblemente prejuiciadas, (como los fabricantes de herbicidas).

o Arroz dorado

Aunque casi la mitad de la población mundial depende de arroz como alimento básico, este
grano es una fuente extremadamente escasa de ciertas vitaminas y nutrientes esenciales.
Por ejemplo, el arroz no tiene vitamina A. Este asunto es muy serio. Además de provocar
ceguera en 250.000 niños del sureste asiático cada año, la deficiencia de vitamina A puede
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hacer que los niños sean más susceptibles a padecer diarrea, infecciones respiratorias y
enfermedades infantiles como el sarampión.

Para generar una variedad de arroz que produzca las tres

enzimas necesarias para sintetizar b-caroteno en el
endospermo, los investigadores expusieron embriones a
células de Agrobacterium que contenían plásmidos Ti
modificados genéticamente (Figura 19.18). A
continuación, se cultivaron las plantas transformadas en
un invernadero. Cuando los individuos transgénicos
hubieron madurado y producido semillas, los
investigadores descubrieron que algunos granos de arroz
contenían tanto b-caroteno que eran amarillos. Este
«arroz dorado se muestra al lado del arroz no modificado
en la Figura 19.19. Se están haciendo pruebas para
determinar si el arroz transgénico contiene el suficiente b-caroteno como para aliviar el déficit
de vitamina A en los niños.

Aunque la producción de arroz dorado en el laboratorio es prometedora, todavía queda mucho

por hacer antes de que este avance afecte a la salud pública. El arroz transgénico debe
cultivarse en condiciones normales del campo. Además, la mayoría o todas las variedades de
arroz cultivadas en distintas partes del mundo tendrán que ser cruzadas con suministros
transgénicos para que adquieran los genes adecuados. Por último, las variedades
transgénicas deben estar disponibles para los
cultivadores pobres a un precio razonable.

Además de la posibilidad de mejorar el déficit de

vitamina A, las variedades transgénicas de arroz
quizá podrían mejorar otros problemas nutricionales
de las personas que comen
arroz, en concreto el déficit de proteínas y de hierro.
Los primeros intentos de desarrollar variedades
transgénicas de arroz con mayor cantidad de
proteínas y hierro disponibles han sido
prometedores.

Como muestran los ejemplos revisados en este capítulo, los recientes avances en
biotecnología agrícola y médica prometen aumentar la calidad y cantidad de alimentos y
aliviar al menos algunas enfermedades hereditarias que asolan a las personas. Sin embargo,
cada solución ofrecida por la ingeniería genética plantea generalmente nuevas cuestiones.
Por ejemplo, investigadores y defensores del consumidor han expresado sus dudas acerca
del número creciente y los tipos de alimentos genéticamente modificados. Durante este
debate, los estudiantes de biología y otras personas bien informadas sobre las técnicas y
cuestiones implicadas serán una fuente importante de información y opinión para la sociedad.
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o Acerca de los ratones y los hombres

La cruza interespecífica tradicional ha producido

animales tan fuera de lo común que los animales
transgénicos podrían parecer mundanos en
comparación (fi gura 16.14a).

La cruza interespecífica es también una forma de

manipulación genética, pero los transgénicos que llevan
genes de otros géneros probablemente nunca se
formarían por sí solos en la naturaleza. Los primeros
animales transgénicos (ratones) fueron producidos en
1982. Los investigadores insertaron un gen que codifica
una hormona de crecimiento en rata a un plásmido, y después lo inyectaron en plásmido
recombinante para fertilizar óvulos de ratón.
Estos óvulos fueron implantados en ratonas madres sustitutas. Un tercio de los ratones que
nacieron de las sustitutas crecieron mucho más que sus compañeros de camada (fi gura
16.15). Los ratones de mayor tamaño eran transgénicos. El gen de rata se integró a sus
cromosomas y se expresó.
En la actualidad, los ratones transgénicos son comunes, e invaluables en investigaciones
sobre los genes humanos. Por ejemplo, los investigadores han descubierto la función de
muchos genes humanos al inactivar sus contrapartes en ratón (sección 16.5).

Los animales genéticamente modificados también se emplean como modelos de muchas

enfermedades humanas. Por ejemplo, los investigadores inactivaron las moléculas que
participan en el control del metabolismo de la glucosa, una a una, en ratones. El estudio de los
efectos de esta anulación nos ha permitido avanzar muchísimo en el campo de desarrollo de
la diabetes en humanos. Los animales genéticamente modificados como estos ratones
permiten a los investigadores estudiar enfermedades humanas (y sus curas potenciales) sin
experimentar
en humanos.

Los animales obtenidos por ingeniería genética también fabrican proteínas con aplicaciones
médicas e industriales. Diversas cabras transgénicas producen proteínas que se emplean
para tratamiento de fibrosis quística, ataques cardiacos, trastornos de la coagulación
sanguínea e incluso exposición a gas nervioso. La leche de cabras transgénicas contiene
lisozima, proteína antibacterial en la leche humana, que podría proteger a infantes y niños de
países en desarrollo contra diarreas agudas. Las cabras transgénicas para un gen de la seda
de araña, producen esa proteína en su leche. Una vez que los investigadores determinen
cómo tejer la seda a semejanza de las arañas, podría emplearse para fabricar telas, chalecos
a prueba de balas, equipo deportivo y suministros médicos biodegradables.
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Los conejos transgénicos fabrican interleucina-2

humana, una proteína que desencadena la división
de células inmunes. La ingeniería genética también
nos ha proporcionado cabras lecheras que producen
leche saludable para el corazón, cerdos con bajo
contenido de grasa, cerdos que producen estiércol
bajo en fosfatos y amistoso para el ambiente, ovejas
de tamaño extragrande y vacas resistentes a la
enfermedad de las vacas locas.

Intervenir en los genes de los animales da lugar a

dilemas éticos. Por ejemplo, muchos consideran que
es poco ético realizar investigaciones transgénicas en animales. Muchos otros lo ven como
una simple extensión de miles de años de prácticas aceptables de ganadería. Las técnicas
han cambiado, pero no la intención de las mismas. A los humanos aún nos interesa mejorar
nuestro ganado.

o Microorganismos recombinantes

Aplicaciones más inesperadas del uso de microorganismos recombinantes aumentan día a

día. Estos usos novedosos incluyen bacterias que producen polímeros biodegradables,
microorganismos que sintetizan combustibles como el hidrógeno o aminoácidos y vitaminas
que se utilizan en la industria de la alimentación. La biorremediación, es decir el empleo de
microorganismos recombinantes para el tratamiento de problemas ambientales, es otro campo
potencialmente importante: el impacto sobre el medio ambiente de elementos tóxicos
provenientes de la industria puede atenuarse con el uso de microorganismos que degradan
hidrocarburos o participan en otros procesos de degradación de los desechos industriales. La
degradación química de sustancias como pesticidas y el procesamiento de metales pesados
completan un cuadro de interés en la utilización de microorganismos.

o La secuenciación de genomas completos

El desarrollo de nuevos vectores que permiten el clonado de largos fragmentos de DNA, los
métodos automatizados de secuenciación, la creación de bancos de secuencias de genes y la
generación de herramientas de bioinformática permitieron el análisis y la descripción de los
genomas de distintos organismos. Desde que se empezó a contar con técnicas de
secuenciación del DNA, la descripción de las secuencias de una enorme cantidad de genes
fue creciendo, e incrementando las bases de los bancos de datos. En la actualidad, decenas
de miles de organismos están representados en el banco gene bank. mediante la
comparación con secuencias de funcionalidad conocida se podrá avanzar en la interpretación
del significado biológico de la enorme cantidad de información que se obtiene.

De esta forma, el advenimiento de técnicas de identificación molecular de secuencias junto

con la bioinformática ha podido definir con mayor precisión la existencia de genes en muchos
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genomas complejos. No hace muchos años se infería que, por su complejidad, el genoma
humano estaría compuesto por unos 100.000 genes. la secuenciación permitió observar que
este número era significativamente menor. en la actualidad, gracias a utilización combinada
de programas de bioinformática, se sabe que el genoma humano contiene alrededor de
25.000 genes.

o Silenciamiento del RNA

Un descubrimiento relativamente reciente ha puesto a disposición de la biotecnología una

potente herramienta. se trata del fenómeno de silenciamiento de RNA, un mecanismo de
represión de la expresión basado en la destrucción de RNA. Este mecanismo está muy
difundido y conservado en la naturaleza, tanto en hongos unicelulares como en eucariontes.
Es posible que haya evolucionado como un mecanismo de defensa frente a infecciones
virales. De esta manera, si experimentalmente se introduce RNA de doble cadena en una
célula, se produce la degradación de los RNA mensajeros con complementariedad hacia el
RNA administrado. Este proceso Constituye un mecanismo muy específico de destrucción de
RNA y por ello se denomina silenciador de RNA o siRNA.

Los pequeños fragmentos de RNA de doble cadena se pueden sintetizar o se pueden

introducir en las células utilizando plásmidos como vectores. En este caso, llevan un gen que,
al expresarse como mRNA, forma una estructura de hebilla que posee regiones de doble
cadena.

Las aplicaciones de este fenómeno no se hicieron esperar. De inmediato se comenzó a

estudiar el alcance que tenía la manipulación de este proceso mediante una tecnología que
posibilitara la represión de genes específicos. Así, mediante siRNA se realizó el silenciamiento
in vitro de genes asociados con determinadas funciones celulares o con procesos
relacionados con el cáncer y se estudió su eficacia para controlar infecciones. En la actualidad
son muchas las aplicaciones que se le están encontrando al uso de sirna. potencialmente, su
empleo en terapia génica prevé la supresión de genes asociados con tumores, así como la
infectividad de virus como el causante del sida u otros parásitos. La producción de animales
transgénicos permitirá el análisis in vivo de la función de genes particulares, como también la
generación de plantas transgénicas con resistencia a agentes infecciosos. Una gran
aplicación del siRNA es la denominada genómica funcional. Como vimos, una cantidad
creciente de genomas se están secuenciando en su totalidad. Como consecuencia de esto, se
está descubriendo una enorme cantidad de genes cuya función se desconoce. El uso de la
Tecnología de siRNA permite el análisis puntual de la funcionalidad de estos genes mediante
la generación de fragmentos de RNA de doble cadena basados en las secuencias
descubiertas. De esta manera, se han llevado a cabo estudios de supresión de genes en el
nematodo Caenorhabditis elegans y en Drosophila. Por el tema de interferencia de RNA-
silenciamiento génico por RNA de doble cadena, los investigadores estadounidenses Andrew
Fire y Craig Mello recibieron el Premio Nobel en 2006.
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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Buenos Aires, Medica Panamericana, 266-273,280-282,284-286
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 Freeman S. (2010). Fundamentos de la biología tercera edición, Madrid,
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